JP2017517571A - エンテロウイルス感染に対する免疫原としてのウイルス粒子およびその生産 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)ヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞の第一培養物においてコクサッキーウイルス(Coxsackievirus)A6(CVA6)のウイルス粒子を生産し、第一培養物からCVA6ウイルス粒子を収集するステップ、または
(b)ヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞の第二培養物においてコクサッキーウイルスA10(CVA10)のウイルス粒子を生産し、第二培養物からCVA10ウイルス粒子を収集するステップ、または
(c)ステップ(a)および(b)を行うステップ
を含む、方法を提供する。
(a)ヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞の第一培養物においてコクサッキーウイルスA6(CVA6)のウイルス粒子を生産し、第一培養物からCVA6ウイルス粒子を収集するステップ、または
(b)ヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞の第二培養物においてコクサッキーウイルスA10(CVA10)のウイルス粒子を生産し、第二培養物からCVA10ウイルス粒子を収集するステップ、または
(c)ステップ(a)および(b)を行うステップ
を含む方法を提供する。
(a)HEK293細胞の第一培養物においてCVA6のウイルス粒子を生産し、第一培養物からCVA6ウイルス粒子を収集するステップと、
(b)HEK293細胞の第二培養物においてCVA10のウイルス粒子を生産し、第二培養物からCVA10ウイルス粒子を収集するステップと、
(c)HEK293細胞の第三培養物においてCVA16のウイルス粒子を生産し、第三培養物からCVA16ウイルス粒子を収集するステップと、
(d)HEK293細胞の第四培養物においてEVA71のウイルス粒子を生産し、第四培養物からEVA71ウイルス粒子を収集するステップと、
(e)多価免疫原性組成物を形成するために、CVA6ウイルス粒子、CVA10ウイルス粒子、CVA16ウイルス粒子、およびEVA71ウイルス粒子を組み合わせるステップと
を含む方法を提供する。
倫理的記載
全ての実験を、NHRIのLaboratory Animal Centerのガイドラインに従って行った。動物使用プロトコルは、NHRI Institutional Animal Care and Use Committeeによって検証、承認されている(承認プロトコルNo.NHRI−IACUC−098033−A、NHRI−IACUC−101042−AおよびNHRI−IACUC−101050−AC)。
ヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞は、Life Technologies(商標)によって得る。アフリカミドリザル腎臓(ベロ)、MDCKおよび横紋筋肉腫(RD)細胞は、Taiwan Centers of Disease Control(Taiwan CDC)またはNHRI Vaccine Centerから提供を受けた。オリジナル細胞系は、American Type Culture Collection(ATCC)から得る。これらの細胞系を培養するために、本発明者らは、VP−SFM、ダルベッコ改変イーグル培地+10%FBSおよび他の適切な無血清培地を使用する。Taiwan CDCから、EV71ウイルスの臨床単離株、E59株(遺伝子型B4)を得た。Taiwan CDCまたはJen−Ren Wang教授(NCKU)からCVA6、CVA10およびCVA16単離株を得た。感染RD細胞の上清から感染後3日(DPI)でCVA6、CVA10およびCVA16ウイルスストックを収集する。TCID50アッセイによりウイルスストックの力価を決定し、これらのストックを−80℃で保管する。RD細胞はヒト用ワクチン生産用でないため、ベロおよびMDCK細胞系に感染できなかったCVA6およびCVA10を増殖させるためにGMPグレード認定HEK293細胞系を用いた。抽出したウイルスRNAを、ワンステップRT−PCR(Promega、米国ウィスコンシン州マディソン)を使用して増幅した。本発明において使用されるオリゴヌクレオチドプライマ配列は、合理的に設計され、テキストで利用できる。増幅したDNAを、ABI3730XL DNA Analyzer(Applied Biosystem Inc.、米国カリフォルニア州フォスターシティ)を用いて配列決定した。VP1のヌクレオチド配列および本明細書に報告される4つ全ての構造ウイルスタンパク質のアミノ酸配列が、テキストで報告されている。
エンテロウイルス(EV71、CVA16、CVA6およびCVA10)を、ベロ細胞またはHEK293細胞で、無血清VP−SFM培地、ダルベッコ改質イーグル培地+10%FBSおよび他の適切な無血清培地を使用してTフラスコ(T−flak)内で培養した。細胞密度は、培養6日後に1〜2.5×106細胞/mLに達した。細胞を、10−2〜10−5のMOIでウイルスに感染させた。感染後6日(DPI)で培養上清からウイルスを採取および収集した。
ウイルス培養上清を、Tフラスコ培養物から採取した。0.65μmフィルタ(Sartorius、ドイツ)を通して細胞デブリを除去し、上清を100K TFFカプセル(Pall)で20倍に濃縮した。Hitachi CP80超遠心機内のゾーナルロータを用いてウイルス粗濃縮物(約50mL)を10〜60%の連続ショ糖勾配上にロードし、32,000rpmで3時間遠心分離した。10〜60%のショ糖の画分を収集し(画分あたり50mL)、pH7.4で1LのPBSを3回交換して個別に透析し(Gibco/Life Technologies、台湾、台北)、4℃で保管した。精製ウイルス画分の感染力を、組織培養感染量(TCID50)アッセイによって評価した。画分に、SDS−PAGEおよびウエスタンブロット分析も行った。ウイルスを含むと特定された画分をプールし、Amicon100Kチューブ(Millipore、米国マサチューセッツ州ビレリカ)を用いてダイアフィルトレーションによって濃縮し、3,000xgで遠心分離し、4℃で保管した。精製ウイルス画分の全タンパク質濃度を、BCAタンパク質アッセイによって決定した。精製ウイルス画分の半分(15mL)を−80℃で0.5mLアリコートにて保管し、もう半分は1/4000(v/v)ホルマリンにより37℃で3日間不活性化し、4℃で保管した。
TCID50終末点(median endpoint)を用いてウイルス力価を決定した。段階希釈したウイルスサンプル(10−1〜10−8)を96ウェルプレートで成長させたRD細胞に加え、各希釈に6つの反復試験サンプルを使用した。96ウェルプレートを、37℃で6日間インキュベートし、感染RD細胞の細胞変性効果(CPE)をカウントすることによりTCID50値を測定した。Reed−Muench法を用いてTCID50値を計算した。
精製ウイルス画分のSDS−PAGE分析を、NuPAGE4〜12%Bis−Trisゲル(Invitrogen、米国カリフォルニア州)において、製造者により推奨されるプロトコルにしたがって行った。ドットブロッティングでは、4つのホルマリン不活性化ウイルス粒子(CVA6、CVA10、CVA16およびEV71)を、BA85ニトロセルロースメンブレン(Whatman)上に直接落とした。その後メンブレンを、4℃でPBS中5%の脱脂乳に一晩浸漬した。MAB979(Millipore、米国)およびマウス抗ウイルス血清を、2時間室温で結合させた。その後メンブレンを、15mLのアッセイバッファで5回洗浄した。1:5,000の希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ロバ抗マウス二次抗体(Jackson ImmunoResearch)を含む1mLのPBSバッファを加えることにより、ウイルス粒子に対する各抗体の結合を検出した。室温で1時間インキュベート後、メンブレンをアッセイバッファで6回洗浄し、ドライブロットした。TMB基質溶液(KPL)を加えることによってドットを明らかにした。
異なる量の不活性化ウイルス粒子を、免疫化の前に、リン酸アルミニウムにより室温で3時間吸着した。6匹の雌BALB/cマウス(生後6〜8週)の群を、0.2mL(0.5μg+60μgミョウバン)のいずれかで筋肉内(i.m.)免疫化した。ウサギを、0.5mL(2.5μg+300μgミョウバン)で筋肉内(i.m.)免疫化した。全ての動物を、プライミングの後2週間間隔で同じ用量で2回ブーストした。免疫化したマウスおよびウサギを、最終ブーストの1週後に放血させ、血清を収集してウイルス中和を分析するために用いた。
免疫マウスから血清サンプルを収集し、56℃で30分間不活性化した。各血清サンプルをマイクロチューブに加え、新鮮な細胞培養培地で2倍に段階希釈した。それから400μLの200−TCID50ウイルス懸濁液を、400μLの段階希釈した血清を含む各チューブに加えた。4℃で18〜24時間インキュベート後、100μLの段階希釈したサンプルを、RD細胞を含む96ウェルプレートに加えた。96ウェルプレート中の培養物を37℃で7日間インキュベートし、感染細胞のCPEをカウントすることによりTCID50値を測定した。Reed−Muench法を用いてウイルス力価の50%減少を生じた血清希釈の逆数として50%中和阻害量(ID50)を計算した。
不活性化したウイルス粒子を、ホルムバール被覆およびカーボン蒸着200−メッシュ銅グリッド上に堆積させた。サンプルを15分間室温で銅グリッド上に保ち、それから濾紙を用いて余分のサンプルを除去した。ddH2Oで2回洗浄後、銅グリッドを2%のリンタングステン酸溶液で2分間染色し、それから濾紙を用いてリンタングステン酸溶液を除去した。染色したグリッドを3〜7日間乾燥させ、JEM−2100F透過型電子顕微鏡下で観察した。
無血清のベロ細胞ベースのホルマリン不活性化全ウイルスEV71ワクチンが開発、生産され、ヒト臨床試験で試験されている(Wu他、2004年;Liu他、2007年;Liu他、2011年;Chang他、2012年;Chou他、2012年;Li他、2012年;Cheng他、2013年;Zhu他、2013年)。驚いたことに、予想外の結果により、EV71ワクチンが細胞培養アッセイにおいてCVA16感染を防げないことが示された(Chou他、2013年)。本発明者らによるCVA16ワクチン候補の最近の研究からも、マウスおよびウサギ抗CVA16抗血清がいずれもEV71を中和できないことが示された(Chong他、2012年)。これらのウイルス株(EV71、CVA6、CVA10およびCVA16)のタンパク質配列を並べて分析すると、P1ペプチドに基づく類似率は、P1配列の65〜80%の類似率であることが分かる(表1)。CVA6およびCVA10等の他の最も一般的なエンテロウイルス株によって引き起こされるHFMDを克服するために、異なるエンテロウイルス株を含むHFMDワクチンの多価免疫原性成分が緊急に必要である。
ヒト多価HFMDワクチン開発のための製造バイオプロセスを調査した。文献(Liu 他、2007年;Chou他、2012年)に公開されたEV71ワクチン開発のための現在のバイオプロセスに基づくと、驚いたことに、CVA6およびCVA10はRD細胞においては感染および複製するが、無血清培地で成長させたベロ細胞においては感染および複製しなかった(図1)。しかし、RD細胞はヒト用ワクチン生産用にはHEK293細胞ほど優れていない。表2および表3も参照。
CVA6およびCVA10はベロ細胞に感染できず、RD細胞はヒト用ワクチン生産用ではないため、MDCK、MRC−5、CHOおよびHEK293等の他の考えられるGMPグレード認定細胞系をCVA6および/またはCVA10を増殖させるために試験し、使用した。驚いたことに、CVA6およびCVA10のいずれも、HEK293細胞のみに感染した(図3)。
7DPIまたは8DPIで培養上清からウイルスを採取および収集した。0.65μmおよび0.22μmメンブレンを通じたマイクロフィルトレーションによって細胞デブリを除去し、タンジェンシャルフローフィルタ(TFF)カセット内の100kDaカットオフダイアフィルトレーションメンブレンを用いてウイルスバルクを20倍に濃縮した。それから濃縮されたウイルスバルクを、ゾーナルロータを用いて10〜60%の連続ショ糖勾配上にロードし、Hitachi CP80超遠心機において32,000rpmで3時間遠心分離した。ショ糖勾配画分を収集し、図4および5に示すように、感染力RD細胞(ウイルスTCID50)アッセイおよびSDS−PAGEを用いて分析した。図4Aおよび5AにCVA6およびCVA10につきそれぞれ示すように、ウイルス抗原を含む第一領域は画分10〜16にあり、これは25〜35%のショ糖を含み、感染力が低いかまたは無いことがTCID50アッセイで決定された。生化学的特性、ウイルス特性、免疫学的特性に基づき、これらのウイルス粒子を偽/欠損ウイルス粒子または空粒子と定義した。ウイルスタンパク質を含む第二領域は、感染性ウイルス画分17〜22内に同時に存在することが分かった。生化学的特性、ウイルス特性、免疫学的特性に基づき、これらの感染性ウイルス粒子を真正ウイルス粒子または完全粒子と定義した。25〜35%ショ糖勾配の空ウイルス粒子画分および35〜45%ショ糖勾配の完全粒子画分を特定した。精製ウイルス画分の感染力を、ウイルスTCID50アッセイ、SDS−PAGEおよびウエスタンブロット分析によって再び評価した。ゾーン遠心分離精製CVウイルス粒子をプールし、Amicon100Kチューブを用いたダイアフィルトレーションによって濃縮し、3000×gで遠心分離した。各プールされたウイルス粒子画分を、PBSで個別に透析した。精製ウイルスバルクの全タンパク質濃度を、BCAタンパク質アッセイで決定する。精製ウイルスを、4℃で0.5mLアリコートにて保管する。
CV空粒子および完全粒子の物理構造を、TEM分析により明らかにした。バイオセイフティのため、精製ウイルス溶液をホルマリン溶液(v/v1:4000希釈)によって37℃で3日間個別に不活性化した。材料および方法にて説明したような調製の後、両サンプルをTEMで分析すると、CVA6およびCVA10の空粒子にいくつかの不規則な二十面体粒子構造を有することが分かった(図6Aおよび6B)。ホルマリン不活性化完全粒子(図6Cおよび6D)は類似し、ホルマリン不活性化によって両方のウイルス完全粒子の二十面体構造が破壊されたことが考えられる。両CVウイルス粒子は直径が約30〜35nmであることが分かり、これはピコルナウイルス(Piconaviridae)科のEV71およびCVA16[30〜35]に非常に類似する。
ショ糖勾配ゾーン超遠心分離およびTEM生物物理学的分析の両方から、2つのタイプのCVウイルス粒子が存在することが示された。空粒子は、異なる分子量(MW)の多数のタンパク質バンドを含むことが示された(図7、レーン1および3)。一部の高分子量タンパク質は、ウイルス組み立ておよびパッケージングの間にP1ポリペプチドが完全にプロセシングされなかった可能性が高いことを示す。興味深いことに、EV71およびCVA16空粒子には見られない低いMW<17kDaの多数のタンパク質バンドが観察された。完全粒子ウイルスタンパク質を分離し、SDS−PAGEによって分析すると、EV71感染性粒子に見られるものと類似するMWを持つ4つの主要タンパク質バンドを含むことが分かった(図7、レーン2および4)。これらの4つの主要タンパク質バンドは、その予測タンパク質配列に基づきヒトエンテロウイルスカプシドタンパク質VP1(32〜35kDa)、VP2(24〜28kDa)、VP3(24〜28kDa)、およびVP4(6〜8kDa)に対応する(図7、レーン2および4)。まとめると、これらの結果は、2つのウイルス粒子が異なるタンパク質組成を有することを示す。さらに、完全にプロセシングされていないウイルスタンパク質によって構築された未熟カプシドもなお粒子構造を形成することができる(以下参照)。
これらの2つのタイプのホルマリン不活性化CVウイルス粒子が強力かつ有効な免疫応答を生成できるか否かを調査することが重要である。異なる量の不活性化CV粒子を、免疫化の前に、リン酸アルミニウムにより室温で3時間吸着した。6匹の雌BALB/cマウス(生後6〜8週)の群を、0.2mL(0.5μg+60μミョウバン)のいずれかで筋肉内(i.m.)免疫化した。4匹のウサギを、0.5mL(2.5μg+300μgミョウバン)で筋肉内(i.m.)免疫化した。全ての動物を、プライミングの後2週間間隔で同じ用量で2回ブーストした。免疫化したマウスおよびウサギを、最終ブーストの1週間後に放血させ、血清を収集してウイルス中和を分析するために用いた。
EV71およびCVA16ウイルス粒子を配合したホルマリン不活性化CVA6およびCVA10完全粒子が、4つのウイルス全てに対して強力かつ有効な免疫応答を生成できるか否かにを調査することが重要である。異なる量の不活性化粒子を、免疫化の前に、リン酸アルミニウムにより室温で3時間吸着した。6匹の雌BALB/cマウス(生後6〜8週)の群を、0.2mL(0.5μgの各ウイルス粒子+60μgのミョウバン)のいずれかで筋肉内(i.m.)免疫化した。4匹のウサギを、0.5mL(2.5μgの各ウイルス粒子+300μgのミョウバン)で筋肉内(i.m.)免疫化した。全ての動物を、プライミングの後2週間間隔で同じ用量で2回ブーストした。免疫化したマウスおよびウサギを、最終ブーストの1週後に放血させ、血清を収集してウイルス中和を分析するために用いた。
ドットブロット分析を用いて、ウイルスと抗血清との間の認識を確認した。5つの群のマウス抗血清を用いて、CVA6、CVA10、CVA16およびEV71ウイルス粒子を検出した。対照群では2つのモノクローナル抗体(EV71およびCVA16のVP1およびVP2に対してそれぞれ特異的なN1およびMAB979)を用いてウイルス成分を検出した。結果を図8に示す。CVA6空粒子で免疫化したマウスの抗血清は、CVA6およびCVA10ウイルス粒子を認識した。しかし、CVA6完全粒子で免疫化したマウスの抗血清は、CVA6ウイルス粒子だけを認識した。CVA10においても類似の結果が観察された。CVA10空粒子で免疫化したマウスの抗血清は、CVA6およびCVA10ウイルス粒子を認識し、CVA10完全粒子で免疫化したマウスの抗血清は、CVA10ウイルス粒子だけを認識した。多価完全粒子で免疫化したマウスの抗血清は、CVA6、CVA10、CVA16およびEV71ウイルス粒子を認識した。しかし、このマウス抗血清はCVA16ウイルス粒子の認識が弱かった。N1モノクローナル抗体は、EV71ウイルス粒子を強く認識し、他の株は認識しなかった。MAB979モノクローナル抗体は、EV71およびCVA16ウイルス粒子を強く認識した。これらの結果から、異なるウイルス粒子で免疫化したマウスの抗血清の認識が、非常に異なる特徴を示すことが分かった。
>CVA6_M0746(870A.A.)(配列番号1)
MGAQVSTQKSGSHETKNVATEGSTINFTNINYYKDSYAASASRQDFAQDPAKFTRPVLDTIREVAAPLQSPSVEACGYSDRVAQLTVGNSTITTQEAANIVLSYGEWPEYCPSTDATAVDKPTRPDVSVNRFYTLSTKSWKTESTGWYWKFPDVLNDTGVFGQNAQFHYLYRSGFCMHVQCNASKFHQGALLVAAIPEFVVAASSRAMKPNGQGLYPDFAHTNPGKNGQEFRDPYVLDAGIPLSQALVYPHQWINLRTNNCATIIMPYVNALPFDSALNHSNFGLVVIPISPLKYCNGATTEVPITLTIAPLNSEFSGLRQAIKQGFPTELKPGTNQFLTTDDGTSPPILPGFEPTPLIHIPGEFTSLLDLCQIETILEVNNTTGTTGVSRLLIPVRAQNNVDQLCASFQVDPGRNGPWQSTMVGQICRYYTQWSGSLKVTFMFTGSFMATGKMLIAYTPPGSAQPATREAAMLGTHIVWDFGLQSSVTLVIPWISNTHFRAVKTGGVYDYYATGIVTIWYQTNFVVPPDTPTEANIIALGAAQKNFTLKLCKDTDEIQQTAEYQNDPITNAVESAVSALADTTISRVTAANTAASTHSLGIGRVPALQAAETGASSNASDENLIETRCVMNRNGVNEASVEHFYSRAGLVGVVEVKDSGTSLDGYTVWPIDVMGFVQQRRKLELSTYMRFDAEFTFVSNLNNSTTPGMLLQYMYVPPGAPKPDSRKSYQWQTATNPSVFAKLSDPPPQVSVPFMSPATAYQWFYDGYPTFGEHKQATNLQYGQCPNNMMGHFAIRTVSESTTGKNVHVRVYMRIKHVRAWVPRPLRSQAYMLKNYPTYSQTITNTATDRASITTTDYEGGVPANPQRTS
>CVA10_M2014(862A.A.)(配列番号2)
MGAQVSTQKSGSHETGNVATGGSTINFTNINYYKDSYAASATRQDFTQDPKKFTQPVLDSIRELSAPLNSPSVEACGYSDRVAQLTVGNSSITTQEAANIVLAYGEWPEYCPDTDATAVDKPTRPDVSVNRFYTLDSKMWQENSTGWYWKFPDVLNKTGVFGQNAQFHYLYRSGFCLHVQCNASKFHQGALLVAVIPEFVIAGRGSNTKPNEAPHPGFTTTFPGTTGATFHDPYVLDSGVPLSQALIYPHQWINLRTNNCATVIVPYINAVPFDSAINHSNFGLIVIPVSPLKYSSGATTAIPITITIAPLNSEFGGLRQAVSQGIPAELRPGTNQFLTTDDDTAAPILPGFTPTPTIHIPGEVHSLLELCRVETILEVNNTTEATGLTRLLIPVSSQNKADELCAAFMVDPGRIGPWQSTLVGQICRYYTQWSGSLKVTFMFTGSFMATGKMLVAYSPPGSAQPANRETAMLGTHVIWDFGLQSSVSLVIPWISNTHFRTAKTGGNYDYYTAGVVTLWYQTNYVVPPETPGEAYIIAMGAAQDNFTLKICKDTDEVTQQAVLQGDPVEDIIHDALGNTARRAISSAANVESAANTTPSSHRLETGRVPALQAAETGATSNATDENMIETRCVVNRNGVLETTINHFFSRSGLVGVVNLTDGGTDTTGYATWDIDIMGFVQLRRKCEMFTYMRFNAEFTFVTTTENGEARPYMLQYMYVPPGAPKPTGRDAFQWQTATNPSVFVKLNDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGQHPETSNTTYGLCPNNMMGTFAVRVVSREASQLKLQTRVYMKLKHVRAWVPRPIRSQPYLLKNFPNYDSSKVTNSARDRSSIKQANM
>CVA16_5079(862A.A.)(配列番号3)
MGSQVSTQRSGSHENSNSASEGSTINYTTINYYKDAYAASAGRQDMSQDPKKFTDPVMDVIHEMAPPLKSPSAEACGYSDRVAQLTIGNSTITTQEAANIVIAYGEWPEYCPDTDATAVDKPTRPDVSVNRFFTLDTKSWAKDSKGWYWKFPDVLTEVGVFGQNAQFHYLYRSGFCVHVQCNASKFHQGALLVAVLPEYVLGTIAGGTGNENSHPPYATTQPGQVGAVLTHPYVLDAGIPLSQLTVCPHQWINLRTNNCATIIVPYMNTVPFDSALNHCNFGLLVVPVVPLDFNAGATSEIPITVTIAPMCAEFAGLRQAVKQGIPTELKPGTNQFLTTDDGVSAPILPGFHPTPPIHIPGEVHNLLEICRVETILEVNNLKTNETTPMQRLCFPVSVQSKTGELCAAFRADPGRDGPWQSTILGQLCRYYTQWSGSLEVTFMFAGSFMATGKMLIAYTPPGGNVPADRITAMLGTHVIWDFGLQSSVTLVVPWISNTHYRAHARAGYFDYYTTGIITIWYQTNYVVPIGAPTTAYIVALAAAQDNFTMKLCKDTEDIEQTANIQGDPIADMIDQTVNNQVNRSLTALQVLPTAADTEASSHRLGTGVVPALQAAETGASSNASDKNLIETRCVLNHHSTQETAIGNFFSRAGLVSIITMPTTGTQNTDGYVNWDIDLMGYAQLRRKCELFTYMRFDAEFTFVVAKPNGELVPQLLQYMYVPPGAPKPTSRDSFAWQTATNPSVFVKMTDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHLQANDLDYGQCPNNMMGTFSIRTVGTEKSPHSITLRVYMRIKHVRAWIPRPLRNQPYLFKTNPNYKGNDIKCTSTSRDKITTL
Claims (31)
- エンテロウイルス感染に対する免疫原を生産する方法であって、
(a)ヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞の第一培養物においてコクサッキーウイルスA6(CVA6)のウイルス粒子を生産し、前記第一培養物から前記CVA6ウイルス粒子を収集するステップ;または
(b)ヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞の第二培養物においてコクサッキーウイルスA10(CVA10)のウイルス粒子を生産し、前記第二培養物から前記CVA10ウイルス粒子を収集するステップ;または
(c)ステップ(a)および(b)を行うステップ
を含む、方法。 - 多価免疫原性組成物を形成するために前記CVA6ウイルス粒子および前記CVA10ウイルス粒子を組み合わせるステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 多価免疫原性組成物を形成するために前記CVA6ウイルス粒子もしくは前記CVA10ウイルス粒子または両方をCVA6およびCVA10以外のエンテロウイルスAの追加的なウイルス粒子と組み合わせるステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記CVA6およびCVA10以外のエンテロウイルスAは、コクサッキーウイルスA2(CVA2)、コクサッキーウイルスA3(CVA3)、コクサッキーウイルスA4(CVA4)、コクサッキーウイルスA5(CVA5)、コクサッキーウイルスA7(CVA7)、コクサッキーウイルスA8(CVA8)、コクサッキーウイルスA12(CVA12)、コクサッキーウイルスA14(CVA14)、コクサッキーウイルスA16(CVA16)、エンテロウイルスA71(EVA71)、エンテロウイルスA76(EVA76)、エンテロウイルスA89(EVA89)、エンテロウイルスA90(EVA90)、エンテロウイルスA91(EVA91)、エンテロウイルスA92(EVA92)、エンテロウイルスA114(EVA114)およびエンテロウイルスA119(EVA119)からなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記CVA6およびCVA10以外のエンテロウイルスAは、CVA16およびEV71ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記追加的なウイルス粒子は、HEK293細胞の第三培養物から生産および収集される、請求項3に記載の方法。
- 前記CVA6またはCVA10ウイルス粒子は、精製もしくは不活性化または両方がさらに行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記精製は、ショ糖勾配ゾーン超遠心分離によって行われる、請求項7に記載の方法。
- 前記不活性化は、ホルマリン処理によって行われる、請求項7に記載の方法。
- 前記追加的なウイルス粒子は、精製および/または不活性化される、請求項6に記載の方法。
- エンテロウイルス感染に対する多価免疫原性組成物を調製する方法であって、
(a)HEK293細胞の第一培養物においてCVA6のウイルス粒子を生産し、前記第一培養物から前記CVA6ウイルス粒子を収集するステップと;
(b)HEK293細胞の第二培養物においてCVA10のウイルス粒子を生産し、前記第二培養物から前記CVA10ウイルス粒子を収集するステップと;
(c)HEK293細胞の第三培養物においてCVA16のウイルス粒子を生産し、前記第三培養物から前記CVA16ウイルス粒子を収集するステップと;
(d)HEK293細胞の第四培養物においてEVA71のウイルス粒子を生産し、前記第四培養物から前記EVA71ウイルス粒子を収集するステップと;
(e)前記多価免疫原性組成物を形成するために、前記CVA6ウイルス粒子、前記CVA10ウイルス粒子、前記CVA16ウイルス粒子、および前記EVA71ウイルス粒子を組み合わせるステップと
を含む方法。 - 前記CVA6ウイルス粒子、前記CVA10ウイルス粒子、前記CVA16ウイルス粒子、および前記EVA71ウイルス粒子は、精製および不活性化される、請求項11に記載の方法。
- CVA6ウイルス粒子もしくはCVA10ウイルス粒子または両方を含む、エンテロウイルス感染に対する免疫原性組成物。
- ヒトに使用するための、請求項13に記載の免疫原性組成物。
- 前記エンテロウイルス感染は、CVA6もしくはCVA10または両方によって引き起こされる、請求項13に記載の免疫原性組成物。
- 前記ウイルス粒子は、HEK293細胞の培養物から生産および収集される、請求項13に記載の免疫原性組成物。
- CVA6およびCVA10以外のエンテロウイルスAの追加的なウイルス粒子をさらに含む、請求項13に記載の免疫原性組成物。
- 前記CVA6およびCVA10以外のエンテロウイルスAは、コクサッキーウイルスA2(CVA2)、コクサッキーウイルスA3(CVA3)、コクサッキーウイルスA4(CVA4)、コクサッキーウイルスA5(CVA5)、コクサッキーウイルスA7(CVA7)、コクサッキーウイルスA8(CVA8)、コクサッキーウイルスA12(CVA12)、コクサッキーウイルスA14(CVA14)、コクサッキーウイルスA16(CVA16)、エンテロウイルスA71(EVA71)、エンテロウイルスA76(EVA76)、エンテロウイルスA89(EVA89)、エンテロウイルスA90(EVA90)、エンテロウイルスA91(EVA91)、エンテロウイルスA92(EVA92)、エンテロウイルスA114(EVA114)およびエンテロウイルスA119(EVA119)からなる群より選択される、請求項17に記載の免疫原性組成物。
- 前記エンテロウイルスAは、CVA16およびEV71ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項17に記載の免疫原性組成物。
- 前記追加的なウイルス粒子は、HEK293細胞の培養物から生産および収集される、請求項17に記載の免疫原性組成物。
- CVA6ウイルス粒子、CVA10ウイルス粒子、CVA16ウイルス粒子、およびEVA71ウイルス粒子を含む、エンテロウイルス感染に対する多価免疫原性組成物。
- 前記ウイルス粒子は、HEK293細胞の培養物から生産および収集される、請求項21に記載の多価免疫原性組成物。
- エンテロウイルス感染またはそれによって引き起こされる疾患に対するヒト用ワクチンを製造するための、請求項21に記載の多価免疫原性組成物の使用。
- 前記エンテロウイルス感染は、CVA6、CVA10、CVA16もしくはEVA71またはこれらの任意の組み合わせによって引き起こされる、請求項23に記載の使用。
- 前記引き起こされる疾患は、手足口病(HFMD)である、請求項23に記載の使用。
- エンテロウイルス感染に対する免疫応答を誘導する方法であって、CVA6ウイルス粒子もしくはCVA10ウイルス粒子または両方を含む有効量の免疫原性組成物を必要な対象に投与するステップを含む方法。
- 前記免疫原性組成物は、CVA6およびCVA10以外の追加的なエンテロウイルスAのウイルス粒子をさらに含む、請求項26に記載の方法。
- 前記ウイルス粒子は、HEK293細胞の培養物から生産および収集される、請求項26に記載の方法。
- 前記ウイルス粒子は、HEK293細胞の培養物から生産および収集される、請求項27に記載の方法。
- 前記対象は、ヒトである、請求項26に記載の方法。
- HEK293細胞の培養物から生産される、エンテロウイルスAのウイルス粒子に対する抗体。
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