CN103841993A - 人肠道病毒特异性抗体及其在诊断中的应用 - Google Patents

人肠道病毒特异性抗体及其在诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供至少一种分离的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段能特异地结合至少一种EV71衍生肽。

Description

人肠道病毒特异性抗体及其在诊断中的应用
技术领域
本发明主要涉及检测和/或治疗肠道病毒71型（EV71）和与EV71有关的疾病的免疫介导治疗领域，以及准备该种治疗的方法。特别地，免疫介导治疗可以是以EV71特异性单克隆抗体的形式。
背景技术
肠道病毒是造成广谱性的人类和非人类疾病的一组异质病原体。肠道病毒属于小核糖核酸病毒科中的一大属，这个科中的其他属包括鼻病毒、肝病毒、心病毒和***病毒。肠道病毒属包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A病毒（CAV）、柯萨奇B病毒（CBV）、埃可病毒和肠道病毒68-71型，以及一些从人类和其他灵长类动物中分离出来的非典型性肠道病毒。与其他小核糖核酸病毒类似，肠病毒体包括一个无包膜的二十面体衣壳包围含有感染性的单链基因组正义RNA（ssRNA）（大小约为7～8.5kb）的核。通过其在酸和其通过和传播的粪口途径中的稳定性，肠道病毒与小核糖核酸病毒的其他成员区分开来。病毒进入细胞被认为涉及特异性的细胞受体。病毒颗粒蛋白质包括四种衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4）的多种拷贝。小量蛋白VPg（Mr约为24×103），共价连接到该基因组RNA的5′末端。其它肠道病毒蛋白包括占优势地位的非结构蛋白，P2和P3。
肠道病毒71型（EV71）属于肠道病毒属的人类肠病毒A种。EV71不是人畜共患媒介物，而是包括无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林-巴利综合征和脊髓灰质炎样综合征的许多神经***疾病的病原体。
这种病毒也与人类手足口病（HFMD）的大爆发相关。与EV71有关的疾病的爆发是普遍的，尤其是在亚洲国家，例如台湾、马来西亚、新加坡、日本、韩国、泰国、越南、香港以及甚至在澳大利亚。
最大的EV71爆发于1975年在保加利亚发生，44人死亡；匈牙利于1978年，45人死亡；马来西亚于1997年，30人死亡；以及在台湾于1998年、2000年和2001年，分别造成78、25和26人死亡。1998年在台湾的爆发涉及超过130,000报告病例，包括超过400例严重的神经病例和78例死亡，其中，91％是五岁以下儿童。更新近的爆发于2005年初在香港、越南和台湾，其中，相加总数的31人死亡，马来西亚在2006年初死亡8人。由于其死亡率高发，且因为其的受害者通常是幼儿，引起相当多的关于EV71的公众关注。
EV71表现出的临床症状差异很大。由于临床症状这一巨大差异以及与EV71相关的增大的公共健康忧虑和其极大的神经毒性的潜在性，在HFMD爆发期间能够快速地识别EV71的特异性毒株并能够快速地在EV71和CA16（导致HFMD手足口病大爆发的另一种主要媒介物）之间进行区分。由于对于EV71或CA16的不同种感染的有关手足口病的早期症状是相似的，目前病因诊断是依赖于病毒分离和血清分型。标准血清型包括以单特异性抗血清的中和值测定，其可用性相当有限。此外，由于凝聚作用，抗原分型通常受非中和病毒阻碍。目前，市场上有两种诊断试剂盒，一种基于实时RT-PCR，而另一种病人血清中的抗EV71 IgM检测。这两种方法都有很大的弊端。例如，实时PCR需要保持良好的实验室和昂贵的设备，而检测血清抗体在感染几个星期后才是可能的，当EV71的严重疾病具有快速的发病和发展时，这是一个缺点。
发明内容
本发明解决了上述问题，特别是提供了至少一种新的抗体，该抗体对于至少一种EV71和/或与EV71相关的疾病是特异性的。
根据第一方面，本发明提供至少一种分离的单克隆抗体或其片段，所述抗体或其片段能够特异性地结合EV71的至少一个构象表位和/或线性表位。特别地，该抗体可以选自：
(a)由杂交瘤细胞系CBA20110001、CBA20110003或CBA20110002产生的抗体；
(b)具有由杂交瘤细胞系CBA20110001、CBA20110003或CBA20110002产生的抗体的免疫结合特性的抗体；以及
(c)与能够结合由杂交瘤细胞系CBA20110001、CBA20110003或CBA20110002产生的抗体的抗原相结合的抗体。
根据另一个方面，本发明提供至少一种分离的杂交瘤细胞系，其于2011年7月27日保藏于ATCC（弗吉尼亚州20110马纳萨斯市，10801大学大道），保藏编号为CBA20110001、CBA20110003或CBA20110002。
根据其它方面，本发明提供一种检测EV71的存在和/或确定EV71存在的量的方法、一种治疗EV71和/或至少一种与EV71有关的疾病的方法、用作药物的本发明的抗体或其片段、本发明的抗体或其片段在制备药物中的用途、试剂盒、核酸及其用途。
正如通过以下的描述将是显而易见的，本发明的优选的实施方式允许分离的抗体的最佳使用以利用其对于EV71的至少一个表位的准确性和特异性的优势。对于本领域技术人员来说，通过以下的描述，这一优点和其他相关的优点将是显而易见的。
附图说明
图1显示通过IFA的单克隆抗体1C6（Mab 1C6）的特征描述的结果。用单克隆抗体1C6标记细胞，之后是抗小鼠FITC第二抗体。（A）用EV71-B5（NUH0083）感染的Vero细胞。（B）未被感染的Vero细胞。（C）表达EV71病毒样颗粒的昆虫细胞（VLPs）。
图2示出了关于单克隆抗体7C7（Mab 7C7）的特征描述的结果。使用单克隆抗体7C7的EV71病毒的IFA（A）、蛋白质印迹（B）、斑点印迹（C）。（A）感染EV71的Vero细胞的IFA。用单克隆抗体7C7标记细胞，之后是抗小鼠FITC第二抗体。上图：感染EV71-B5（NUH0083）的Vero细胞。下图：未被感染的Vero细胞。（B）蔗糖纯化的EV71-C4毒株（75-Yamagata-03）的蛋白质印迹。用第一抗体和HRP结合的第二抗体标记斑点，条带用ECL显影。泳道1：多克隆抗EV71（B5毒株）抗体检测所有四种衣壳蛋白。泳道2：单克隆抗VP1抗体特异性标记VP1带。泳道3：单克隆抗体7C7识别在约26kD的VP2及其在约40kD的前体VP0（箭头）。（C）在斑点印迹中7C7的灵敏度。EV71B5病毒在每点TCID50单位的10倍稀释液中点样，用单克隆抗体7C7标记，以及通过结合HRP的第二抗体进行检测。H7N1病毒作为阴性对照。检测界限为约105TCID50单位。
图3示出了关于单克隆抗体4B12（mAb 4B12）的特征描述的结果。使用抗3CD单克隆抗体4B12的EV71病毒的IFA（A）和蛋白质印迹（B）。（A）以多克隆抗3CD血清或单克隆4B12抗体标记的感染与未被感染的Vero细胞的IFA。使用EV71 C4亚基因型感染细胞。（B）EV71感染的（泳道2）和未被感染的RD的细胞（泳道3）的全细胞裂解物的蛋白质印迹。4B12单克隆抗体能够检测到在73kDa的3CD蛋白酶的线性表位，以及在52kDa的3DRNA依赖性RNA聚合酶（箭头）。这两种蛋白也可以在蔗糖梯度纯化的EV71病毒颗粒（泳道4）中检测到。
图4为单克隆抗体7C7的表位作图。（A）VP2蛋白分段为7个连续重叠的部分。用抗-GST的片段的蛋白质印迹显示了所有结构的表达，而用7C7的印迹不识别片段F和G，表明该表位位于VP2的第130位氨基酸和第162位氨基酸之间。（B）VP2的氨基酸第1-159位分段为6个连续重叠的部分。再次，用抗GST印迹证实蛋白的表达，而用7C7印迹表明该表位位于VP2的第145位氨基酸-第159位氨基酸之间的片段“d”上。（C）“d”分段为6个连续的重叠肽。抗-GST印迹显示表达而7C7的表位被限制为对应于表位EDSHPP的肽“4”。（D）7C7表位的突变分析。突变表位被表达为GST融合蛋白，并且通过用抗GST抗体的蛋白质印迹证实表达。存在于CA16病毒中的最小表位EDSHP和天冬氨酸至天冬酰胺的置换（ENSHPP）可以通过我们的单克隆抗体7C7来识别。然而，某些C4毒株的苏氨酸到丝氨酸的突变（EDTHPP）和人埃可病毒的双突变（EDNAPP）无法识别。
图5是4B12的表位作图。（A）3CD蛋白分段为5个连续重叠的部分。用抗-GST的片段的蛋白质印迹显示所有结构的表达，而用4B12的印迹没有识别出3C，表明该表位位于3D1段上。（B）3D1分段为4个连续重叠的部分。再次，用抗GST的印迹证实蛋白的表达，而用4B12的印迹表明该表位位于片段3D1.2上。（C）3D1.2分段为8个连续重叠肽。抗-GST印迹显示表达，而4B12表位被限制为肽“H”。
图6是4B12表位的最终形式。（A）推荐的6个（EQALFS）和8个（DFEQALFS）氨基酸长的表位肽“H”被表达为GST融合蛋白。用抗GST抗体证实表达。（B）用4B12的蛋白质印迹仅检测到EV71聚蛋白的第1784-1791位的更长的8aa表位（泳道2），而不是较短的推定的6aa表位（泳道1）。（C）4B12表位的突变分析。将两种天然存在的EV71突变引入到所识别的表位。由4B12单克隆抗体检测D到E和Q到H的突变。（D）对EV713D表位针对甲型肝炎病毒和脊髓灰质炎病毒1进行blast程序，并且其相应的表位在大肠杆菌中表达为GST融合蛋白。用抗GST抗体通过蛋白质印迹证实融合蛋白的表达。（E）甲型肝炎表位和脊髓灰质炎1表位不能由单克隆抗体4B12来识别，确认其特异性。加样之前描述的特征化的EV713D表位作为阳性对照。单独的GST被表达为阴性对照。
图7显示了7C7和1C6对于EV71亚型基因组的特异性。用EV71野生型毒株A（BrCr）、B2（7423-MS-87）、B4（NUH-HFM41）、B5（NUH0083-SIN-08）、C1（Y90-3761）、C2（NUH0075-SIN-08）、C4（75-Yamagata-03）和C5（3437-SIN-06）感染Vero细胞。IFA的进行使用单克隆抗体7C7或1C6以及FITC标记的第二抗体。所有测试毒株均被识别。
图8示出了4B12对于EV71亚型基因组的特异性。用EV71野生型毒株B5（NUH0083-SIN-08）、A（BrCr）、B2（7423-MS-87）、B4（NUH）、B5（＃363，马来西亚，未发表的序列）、C1（Y90-3761）、C2（NUH0075-SIN-08）、C4（75-Yamagata-03）、C5（3437-SIN-06）和RG病毒C4（Fuyang-08）感染Vero细胞。IFA的进行使用单克隆抗体4B12以及FITC标记的第二抗体。用4B12识别出所有测试毒株。
图9示出了4B12对于EV71亚型基因组的特异性。蔗糖纯化的来自亚型基因组A（BrCr）、B2（7423-MS-87）、B5（＃363，马来西亚，未发表的序列）、B5（NUH0083-SIN-08）、C1（Y90-3761）、C2（NUH0075-SIN-08）和C4（75-Yamagata-03）的EV71颗粒的蛋白质印迹（A）和斑点印迹（B）。ECL试剂用于显影。在斑点印迹中流感病毒毒株H7N1的浓缩制品作为阴性对照。
图10示出了在斑点印迹测定法中4B12对于EV71的灵敏度。（A）以从1000pg到10pg逐渐降低浓度点加纯化的重组3D蛋白，并用单克隆抗体4B12，随后是结合HRP的第二抗体，以及ECL显影（ECL），或者用结合红外线的第二抗体，然后通过Odyssey读出器（IR）扫描来检测。对于两种方法，检测界限为10pg。（B）IR法被用来建立以TCID50单位的EV71的连续稀释的检测界限。对于病毒颗粒的检测界限为104TCID50单位。使用重组3D蛋白作为阳性对照。
图11是显示EB-ELISA的灵敏度和特异性的图表。用来自以不同毒株EV71免疫的豚鼠或以不同的柯萨奇病毒免疫的小鼠的血清进行EB-ELISA。在第二次免疫后几天采集血清，并回归到EB-ELISA前的病毒中和滴度。30％封闭的截断值以上的抑制被认为是阳性；即针对EV71的抗体存在。将结果表示为百分比封闭值的算术平均值（每个组中的n=4，每个误差棒代表平均值的标准误差）。NS：正常的免疫前血清；GP：豚鼠；MS：小鼠。虚线：截断值。
图12是显示EB-ELISA与微量中和测定的比较的图表。使用在第二次免疫后14天采集的豚鼠免疫血清来确定抑制的终点，比较EB-ELISA法和微量中和测定法的EV71抗体检测灵敏度和特异性。在EB-ELISA滴度被确定为单克隆抗体滴度≥30％封闭。中和测定法使用B5 NUH0083 EV71病毒进行。该结果被表示为几何平均滴度（每组n=4，每个误差棒代表平均值的标准误差）。
具体实施方式
为了方便起见，本说明书中提及的参考文献以参考书目列表的形式列出，并附于实施例之后。所述参考文件的全部内容在此通过引用并入本发明。
释义
为了方便起见，此处收集在本说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语。
本发明所用的术语“抗体”是指任意的免疫球蛋白或完整分子及其结合到特定表位的片段。所述抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、整个抗体的Fab、Fab′、F（ab）′片段和/或F（v）部分。术语“单克隆抗体”也可以称为“mAb”。例如，与“1C6”互换使用的抗体“1C6mAb”，能够特异性结合到包括但不限于含有EV71的至少一个衣壳蛋白的构象表位的EV71上，并且包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体及其片段，其保留了母源抗体的抗原结合功能。类似地，与“7C7”互换使用的抗体“7C7mAb”，能够特异性结合到EV71，包括但不限于EV71的VP2，并且包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体及其片段，其保留了母源抗体的抗原结合功能。此外，与“4B12”互换使用的抗体“4B12mAb”，能够特异性地结合到EV71，包括但不限于包括EV71的非结构蛋白的至少一个表位，例如3CD和/或3D，并且包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体及其片段，其保留了母源抗体的抗原结合功能。
本发明所用的术语“抗体片段”是指抗体的完整序列的不完整的或分离的部分，其保留了母源抗体的抗原结合功能。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F（ab′）2和Fv片段；双特异性抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。本发明包含1C6、7C7和4B12的片段，只要它们保留了全长抗体的所需要的亲和力即可。特别是，它可以较短至至少一个氨基酸。例如，1C6抗体的片段包括使其能够结合EV71衣壳蛋白的构象表位的抗原结合功能，7C7抗体的片段包括使其能够结合EV71衣壳蛋白VP2或其片段的抗原结合功能，以及4B12抗体的片段包括使其能够结合非结构蛋白（例如EV71的3CD和/或3D）或其片段的抗原结合功能。
本发明所用术语“抗原”是指促使抗体的产生并能引起免疫反应的物质。在本发明中，它可以与术语“免疫原”一词互换使用。在严格意义上讲，免疫原是引发免疫***的反应的那些物质，而抗原被定义为与特异性抗体结合的物质。抗原或其片段可以是与特定抗体接触的分子（即表位）。当蛋白质或蛋白质的片段用于使宿主动物免疫时，蛋白质的许多区域可诱导抗体的产生（即引发免疫反应），所述抗体特异性地与抗原（蛋白质上的给定区域或三维结构）结合。抗原可以包括但不限于EV71的衣壳蛋白和/或非结构蛋白。特别是，术语“表位”指的是形成抗体结合位点的6～13个氨基酸的连续序列。以结合mAb或结合蛋白的形式的表位可以是实质上没有三级结构的变性蛋白。所述表位可以是构象表位。“构象表位”在本发明中定义为构成与免疫***的受体直接接触的抗原的亚单位（通常为氨基酸）的序列。每当受体与未消化的抗原相互作用时，如果蛋白质解开，接触的表面氨基酸可能不是彼此连续的。这种在三维构象中聚集并且与受体互补位相互作用的不连续的氨基酸被称为构象表位。与此相反，如果抗原被消化，形成称为肽的小片段，它与主要组织相容性复合物分子结合，然后通过在线上连续的氨基酸再与T细胞受体结合。这些被称为线性表位。
本发明所用的术语“包括”（″comprising″）定义为，在实施本发明时，各种组分、成分或步骤可以结合使用。因此，术语“包括”包含了更严格的术语“基本上由......组成”（″consisting essentially of″）和“由......组成”（″consisting of″）。
本发明所用的术语“衍生的”是指至少一个EV71表位的化学修饰。多聚核苷酸序列的化学修饰可以包括，例如，由烷基、酰基或氨基取代氢。衍生的多核苷酸编码保留了天然分子的至少一种生物学功能或免疫功能的多肽。衍生的多肽是一种由糖基化、聚乙二醇化或者保留了由其衍生的多肽的至少一种生物学功能或免疫功能的任何类似的方法来修饰。
本发明所用的术语“人源化抗体”是指在非抗原结合区域的氨基酸序列已经被改变以使该抗体更类似于人抗体并仍保留其原有结合能力的至少一种抗体分子。
本发明所用的术语“杂交瘤”指的是已被制造用来生产大量的所需抗体的细胞。例如，为了生产至少一种杂交瘤，从已经用相关抗原激发的动物的脾脏中取出B细胞并与至少一种无限增殖细胞融合。这种融合是通过使细胞膜渗透性更强来进行的。融合的杂交细胞（称为杂交瘤）会迅速并无限地繁殖，并将产生至少一种抗体。
本发明所用的术语“无限增殖细胞”，也称为变异细胞，即细胞生长性质已经改变的细胞。这并不一定意味着这些是“癌”或“肿瘤”细胞，即，如果被引入到实验动物中则能够形成肿瘤，虽然在某些情况下它们可以做到这样。无限增殖细胞系包括但不限于NS1、Jurkat、HeLa、HepG2、SP2/0和Hep-3b等。
本发明所用的术语mAb或相关结合蛋白的“免疫结合特性”，在其所有的语法形式中，是指mAb或相关结合蛋白对其抗原的特异性、亲和力和交叉反应性。
术语“分离的”一词在此定义为在组分自然产生的生物体细胞中从其他生物组分（即其他染色体和染色体外的DNA和RNA）中基本分离、生产或纯化的一种生物组分（例如核酸、肽或蛋白）。由此分离的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组体表达生成的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。
本发明所用的术语“样品”，在其最广泛的意义上使用。怀疑含有编码至少一种EV71衍生肽或其片段的核酸或EV71本身的生物样品可以包括体液、细胞的提取物、染色体、细胞器或者从细胞中分离的膜、细胞；基因组DNA、RNA或cDNA（在溶液中或结合到固体支持物上）、组织、组织印迹(tissue print)等。
本发明所用的术语“特异性结合（specific binding）”或“特异性地结合（specifically binding）”是指蛋白质或肽与激动剂、抗体或拮抗剂之间的相互作用。特别地，该结合是在抗原与抗体之间。这种相互作用依赖于由结合分子（即抗原或表位）识别的蛋白的特定结构的存在。例如，如果抗体对于表位“A”是特异性的，则在含游离的标记的A与抗体的反应中，含有表位A的多肽的存在，或者游离的未标记的A的存在，会降低与抗体结合的标记的A的量。例如，1C6可以特异性地结合衣壳上的构象表位，7C7可以特异性地结合线性表位VP2，以及4B12可特异性结合线性表位3CD和/或3D。
术语“受试者”在此处限定为脊椎动物，特别是哺乳动物，更特别地为人类。为了研究的目的，受试者可以特别地是至少一种动物模型，例如小鼠，大鼠等。
本领域技术人员将会理解的是，根据本文所给出的方法，本发明可以无需过度的实验而实施。所述的方法、技术和化学物质在给出的参考文献中描述或来自标准生物技术和分子生物学教科书中的实验方案。
根据第一方面，本发明提供与EV71特异性结合的分离的单克隆抗体和相关结合蛋白。单克隆抗体（也称为“mAb”）可以是衍生自产生单一抗体的细胞的实质上同种的抗体群。因此，在该群中所有的抗体可以是相同的，并且对于给定的表位具有相同特异性。mAb反应的特异性为有效的诊断剂提供了基础。单克隆抗体和由其衍生的结合蛋白还具有作为治疗剂的用途。
特别是，本发明所述的分离的单克隆抗体或其片段，可以能够特异性结合肠道病毒71型（EV71）的至少一个构象表位。因为表位在自然界中通常以三维构象存在，因而，抗体可以在检测EV71中的存在时更加高效且有用，这是有利的。因此，这些抗体能够结合并识别病毒抗原，而无需进行在前的组织切片处理。构象表位可以包含至少一种衣壳蛋白和/或至少一种非结构蛋白。衣壳蛋白可以是完整的病毒衣壳蛋白。衣壳蛋白可以包括选自VP1、VP2VP3、VP4和VP0前体中的一种或多种蛋白。
特别地，根据本发明的任何方面的抗体可以包含单克隆抗体1C6的免疫结合特性。mAb 1C6的这些免疫结合特性是由杂交瘤1C6产生的，根据布达佩斯条约的规定，杂交瘤1C6于2011年7月27日保藏于澳大利亚威斯特米德新南威尔士州2145霍克斯伯里路214号(214 Hawkesbury Road,WestmeadNSW 2145)的澳大利亚细胞库（CellBank Australia），并指定登记号CBA20110001。杂交瘤提供了本发明的mAb和结合蛋白的连续源。
根据本发明的一个方面的抗体可以选自：
(a)由杂交瘤细胞系CBA20110001产生的抗体；
(b)具有由杂交瘤细胞系CBA20110001产生的抗体的结合特性的抗体；以及
(c)与能够结合由杂交瘤细胞系CBA20110001产生的抗体的抗原相结合的抗体。
根据另一个方面，本发明提供一种能够特异性地结合至少一个线性表位的分离的单克隆抗体或其片段。特别地，该表位可以是从EV71衍生的衣壳蛋白和/或非结构蛋白。更特别地，该衣壳蛋白可以是VP2和/或该非结构蛋白可以是3CD和/或3D。
特别地，根据本发明的一个方面的抗体可以包含由杂交瘤7C7产生的单克隆抗体7C7的免疫结合特性，按照布达佩斯条约的规定，杂交瘤7C7于2011年7月27日保藏于澳大利亚威斯特米德新南威尔士州2145霍克斯伯里路214号的澳大利亚细胞库，并指定登记号CBA20110003。杂交瘤提供了本发明的7C7mAb和结合蛋白的连续源。
根据本发明的一个方面的抗体可以选自：
(a)由杂交瘤细胞系CBA20110003产生的抗体；
(b)具有由杂交瘤细胞系CBA20110003产生的抗体的结合特性的抗体；以及
(c)与能够结合由杂交瘤细胞系CBA20110003产生的抗体的抗原相结合的抗体。
特别地，根据本发明的一个方面的抗体可以包含由杂交瘤4B12产生的单克隆抗体4B12的免疫结合特性，根据布达佩斯条约的规定，杂交瘤4B12于2011年7月27日保藏于澳大利亚威斯特米德新南威尔士州2145霍克斯伯里路214号的澳大利亚细胞库，并指定登记号CBA20110002。杂交瘤细胞提供了本发明的4B12mAb和结合蛋白的连续源。
根据本发明的一个方面的抗体可以选自：
(a)由杂交瘤细胞系CBA20110002产生的抗体；
(b)具有由杂交瘤细胞系CBA20110002产生的抗体的结合特性的抗体；以及
(c)与能够结合由杂交瘤细胞系CBA20110002产生的抗体的抗原相结合的抗体。
根据本发明的任何方面的抗体可以能够识别任何基因型的EV71。特别地，该抗体可以能够识别选自A、B2、B4、B5、C1、C2、C4和C5中的基因型的EV71。
根据另一个方面，本发明提供一种通过用EV71-B5毒株使动物免疫来制备具有mAb1C6或mAb7C7的结合特性的单克隆抗体，或者通过用纯化分离的抗原，EV71的3CD和/或3D，使动物免疫来制备具有mAb4B12的结合特性的单克隆抗体的方法。任何所述的抗原可以用来作为免疫原产生具有所需的免疫结合特性的抗体。这样的抗体包括但不限于含有mAb1C6、7C7或4B12的抗原结合序列的单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和蛋白质。
本发明的mAb还可以通过由培养的连续传代细胞系提供抗体分子的产生的任何技术来产生。这些方法包括但不限于，最初由Kohler和Milstein（Nature 256：495-497）于1975年开发的杂交瘤技术，以及三源杂交瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术来产生人单克隆抗体（Cole等人，单克隆抗体和癌症治疗，艾伦R.利斯公司，第77-96页（1985））。可以使用人抗体并且可以通过使用人杂交瘤来获得人抗体（Cote等人，1983，美国国家科学院学报，80：2026-2030）。
可以使用开发的用于通过剪接来自适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因和来自适当生物活性的人抗体分子的基因来产生“嵌合抗体”的技术（莫里森等人，1984，通过引用将其全部并入本文）。例如，可以剪接来自小鼠抗体分子（例如mAb1C6、7C7或4B12）的基因和来自适当生物活性的人抗体分子的基因。嵌合抗体是不同部分衍生自不同动物物种的分子，例如具有源于鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白的恒定区的分子。嵌合抗体还可以是包含人Fc部分和鼠（或其他非人）Fv部分的分子。
已经开发了用于生产人源化抗体的技术（例如，US5,585,089和/或US5,225,539，通过引用将其全部并入本文）。免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个被称为互补决定区（CDR）的高变区中断的“框架”区组成。简而言之，人源化抗体是来自具有来自非人生物种的一个或多个CDR的非人生物种和来自人免疫球蛋白分子的框架区的抗体分子。嵌合抗体和人源化抗体都可以是单克隆的。这样的人或人源化嵌合抗体可以优选地用于体内诊断或治疗人类疾病或病症。
可以通过已知的技术产生含有抗体分子的个体基因型的抗体片段。例如，其可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化而产生；Fab片段可通过还原F(ab)2片段的二硫键而产生，该Fab片段可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生。所述抗体片段可以由本发明的多克隆或单克隆抗体中的任意一种生成。
在抗体的生产中，可以通过本领域中已知的技术来实现对所需抗体的筛选。例如，这些技术可以包括但不限于放射免疫测定、酶联免疫吸附测定（ELISA）、“夹心（sandwich）”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定（使用胶体金、酶、放射性同位素标记等）、蛋白质印迹法、沉淀反应、凝集测定法（凝胶凝集测定、血凝测定等）、免疫荧光测定、免疫电泳测定等。例如，抗体结合可以通过检测第一抗体上的标记来检测。在另一个实例中，可以通过检测第二抗体或其他试剂与第一抗体的结合来检测第一抗体。第二抗体可以被标记。
为了提高在至少一种诊断和/或治疗能力中在体内对EV71的靶向作用，所述抗体可以用至少一种放射性核素和/或荧光染料来标记。例如，可以使用通过正电子发射断层扫描法（PET）来检测EV71。用放射性核素标记的抗体可以确保在检测和/或治疗中更好地靶向EV71。该抗体可进一步用至少一种用于治疗EV71的药物、抗病毒药物和/或毒素标记。特别地，所述抗体可用于将药物递送到具有高度特异性的受感染细胞来抑制病毒感染。该药物可以包括但不限于利巴韦林和/或其他的EV71感染的强效抑制剂，例如牛或人乳铁蛋白等。与至少一种抗病毒药物关联的本发明的抗体，可以增加药物对于EV71感染的细胞的有效性，其可以提高药物的效率并减少通常由抗病毒药物引起的副作用。这可能会产生可能减少与EV71感染有关的其他并发症的针对EV71的新疗法。
mAb1C6、7C7和/或4B12可以连接有至少一种可示踪剂，并且可以有潜力地用于在体外或体内定量EV71感染的细胞。可示踪剂可以是任何可示踪的生物或化学组分。可示踪剂可以包括但不局限于环境剂、血液标记、抗原、农药、药物、化学物质、毒素、PCBS、PBBS、铅、神经毒素、血电解质、代谢物、分析物、NA+、K+、CA+、尿素氮、肌酸酐、生化血液标记及组分、ChE、AChE、BuChe、肿瘤标记、PSA、PAP、CA125、CEA、AFP、HCG、CA19-9、CA15-3、CA27-29、NSE、羟丁酸盐、乙酰乙酸酯、抗疟疾药物（例如阿莫地喹、蒿甲醚、青蒿素、青蒿琥酯、阿托伐醌、辛可宁、金鸡纳啶、氯喹、强力霉素、卤泛曲林（halofanthne）、甲氟喹、伯氨喹、乙胺嘧啶、奎宁、奎尼丁和磺胺多辛）；抗生药物，例如氨苄青霉素、阿奇红霉素、强力霉素、红霉素、青霉素和四环素；抗逆转录病毒药物，例如阿巴卡韦、阿德福韦、地达诺新、恩替卡韦、印地那韦、拉米夫定、奈韦拉平、瑞莫夫韦(remofovir)、利托那韦、甲磺酸噻喹努佛、替比夫定、替诺福韦、扎西他滨和齐多夫定。
根据本发明的任何方面的抗体可以用于与EV71的检测或定位相关的本领域已知的方法中。例如，这些方法可以包括但不限于蛋白质印迹法、ELISA、放射免疫测定法、免疫荧光法、免疫组织化学测定法等等。根据本发明的任何方面的检测和/或定量方法可以是一种非侵入性的方法，可能对于研究EV71的多个免疫学方面是有用的。
特别地，本发明提供一种检测受试者中至少一种EV71感染的细胞的存在和分布和/或使其定量的方法，该方法包括：
a.将至少一种根据本发明的任何方面的抗体或其片段与从至少一个受试者获得的至少一个样品相接触；以及
b.检测和定量抗体与EV71感染的细胞的结合。
检测步骤可以包括将样品与含有或结合有可检测元素的结合蛋白相接触。特别地，根据本发明的任何方面的抗体可以固定在固体表面上。更特别地，结合蛋白可以包含放射性原子，可以结合荧光分子，或者可以结合酶。
本发明还包括用于EV71的定性和/或定量测定的分析和检测试剂盒。根据所选择的方法，例如“竞争性”、“夹心”、“DASP”等，这种试剂盒可以至少包含根据本发明的任何方面的mAb或相关结合蛋白，用于检测mAb或相关结合蛋白与生物样品中的EV71的免疫特异性结合的工具，以及使用说明。该试剂盒还可以包含阳性和阴性对照。它们可以设置为与自动化分析仪或自动免疫组织化学玻片染色设备使用。
特别地，本发明的测试盒可以进一步包括可以被标记或可以提供与固体载体的连接（或附着于固体载体）的第二抗体或结合蛋白。该抗体或结合蛋白可以是例如与EV71结合的抗体或结合蛋白。这种第二抗体或结合蛋白可以是多克隆或单克隆抗体。
MAb1C6、7C7和4B12在检测EV71中是非常有效的。它们可以分别和/或共同用于EV71的有效和有用的早期检测。根据本发明的任何方面的抗体提供用于检测EV71的方便、高度特异和灵敏的方法。一种这样的方法是ELISA形式。MAb1C6、7C7和4B12中的每一个可以单独或组合用作捕获抗体。如果单独使用，所选择的抗体可作为捕获抗体，并且相同的与辣根过氧化物酶（HRP）结合的抗体可以用作检测抗体。
其他的检测EV71病毒的免疫学方法包括例如斑点印迹和原位杂交。
根据另一个方面，本发明提供至少一种治疗和/或预防EV71和/或至少一种与EV71有关的疾病的方法，该方法包括给需要其的受试者施用至少一种根据本发明的任何方面的抗体或其片段。本发明的抗体可以与靶向不同的EV71表位的其他类似抗体结合施用。因而该病毒可能没有机会去适应这种形式的治疗。
根据另一个方面，本发明提供至少一种根据本发明的任何方面的抗体或其片段在药物中的应用。
根据另一个方面，本发明提供根据本发明的任何方面的抗体或其片段在制备用于治疗EV71和/或至少一种与EV71相关的疾病的药物中的至少一种用途。与EV71相关的疾病包括但不限于无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林-巴利综合征、脊髓灰质炎样综合征、手足口病等。
根据另一个方面，本发明提供至少一种含有根据本发明任何方面的抗体和药学上可接受载体的药物组合物。
根据本发明的任何方面的EV71mAb具有超过作为诊断工具的其它现行方法的优点。例如，该mAb是对于EV71高度特异性的，这在在病毒学领域仍是未完全认识的。这种高度特异性的mAb代表在EV71诊断领域的一个突破。根据本发明的任何方面的mAb可以识别所有的或者基本上所有的EV71基因型。这些单克隆抗体也提供了检测的EV71的安全、便捷的诊断方法。该抗体对于诊断和制备用于治疗的重组抗体是有用的，并因此将在抑制潜在的EV71爆发上是是非常有用的工具。
此外，尽管存在分型方法，但仍需要能够在快速和准确区分EV71和CA16的诊断测定法中使用并且可以用于特异性地鉴定EV71毒株的试剂。根据本发明的任何方面的mAb可以用于快速、准确地识别EV71的毒株和/或区分EV71和CA16。该试剂和方法将允许临床医生提高处理大量临床样品的速度和准确性。该试剂和方法也将有助于临床医生对病人的管理，杜绝不必要的检查，提高诊断和预后的速度和准确性，有利于控制EV71感染，并减少不必要的抗生素的使用。根据本发明的任何方面的mAb可以用于疱或口腔拭样中的EV71病毒颗粒的直接检测。
现在是一般性地描述了本发明，通过参考通过举例说明的方式提供的下述实施例，可以更容易地理解其相同点，且并不是试图限制本发明。
本领域技术人员将会理解的是，根据本文所给出的方法，本发明可以无需过度的实验而实施。所述的方法、技术和化学物质在给出的参考文献中描述或来自标准生物技术和分子生物学教科书中的实验方案。
实施例
本技术领域中已知的和没有具体描述的标准分子生物学技术通常根据在Sambrook和Russel，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，纽约（2001）中的描述。
实施例1
从完整EV71病毒制备和纯化单克隆抗体1C6和7C7。
分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤由BALB/c小鼠得到，该BALB/c小鼠已用在0.1ml PBS中的纯化的EV71-B5毒株（用等体积的佐剂（SEPPIC，法国）乳化）肌内注射两次免疫。在脾细胞与购自ATCC的SP/2.0脊髓瘤细胞的融合前三天，给予其相同剂量的病毒的腹膜内加强剂。通过有限稀释克隆经鉴定产生特异性抗体的杂交瘤，并在75cm2烧瓶中扩大。一周后，采集杂交瘤悬浮液，并且在400g下离心10分钟使细胞碎片沉淀，然后收集上清液，并于-20℃温度条件下贮存。用分光光度计确定单克隆抗体的浓度（Nanodrop，DE，USA）。
抗原捕获ELISA。
用100μl碳酸盐缓冲液（73mM的碳酸氢钠和30mM碳酸钠，pH值9.7）中的500ng-1ug/孔的捕获抗体包被96孔圆底微量滴定板（Nunc，Roskilde，丹麦），在4℃下过夜，或者在37℃下2小时。用PBST将板洗涤两次，接着在每次用抗体或抗原孵育之后用PBS洗涤两次。用100μl封闭缓冲液（含5％乳状物的PBS）在室温下将经抗体包被的板封闭1小时，然后用100μl稀释在PBST中的含病毒样品在37℃下孵育1小时。用100μl的结合了辣根过氧化物酶的检测单克隆抗体（Pierce公司的内部标签）在37℃下孵育1小时来检测病毒结合。通过加入的100μl的新近配制的底物溶液（邻苯二胺二盐酸盐，Sigma）来介导色原体显影。通过加入0.1N的硫酸使反应终止，并记录490nm处的光密度。检测界限被确定为是给予信噪比为3的光密度值。
单克隆抗体1C6的特征描述。
如使用同种型分型试剂盒(GE)所鉴定的，单克隆抗体1C6属于同种型IgG2a。如图1A所示，正如通过免疫荧光试验（IFA）所示，1C6可以检测感染的Vero细胞中EV71病毒蛋白的表达。如图1B所示，在非感染的Vero细胞中没有检测到信号，确认其是EV71-特异性mAb。mAb1C6在针对EV71完整病毒裂解物的蛋白质印迹中被检测出呈阴性，表明其实识别构象表位而不是线性表位。使用在昆虫细胞中表达VP0、VP1、VP2、VP3或VP4的重组杆状病毒把表位归因于特异性EV71衣壳蛋白的尝试失败了。然而，1C6可以检测VP0、VP1和VP3共感染的昆虫细胞中生成的病毒样颗粒EV71，如图1C所示，证明1C6对EV71衣壳是特异性的。在使用1C6的EV71病毒中和试验中，没有观察到病毒中和活性。
单克隆抗体7C7的特征描述。
单克隆抗体7C7已经用Isostrip（Santa Cruz）同种型分型为具有kappa轻链的IgG1。如IFA所示，该抗体能够检测在受感染的Vero细胞中的EV71。如图2A所示，在未被感染的细胞中没有观察到标记。如图2B所示，蔗糖梯度纯化的来自C4毒株的EV71病毒颗粒的蛋白质印迹显示，单克隆抗体7C7对于VP2是特异性的并且还识别前体蛋白VP0。为了测试单克隆抗体7C7的灵敏度，进行了斑点印迹测定。EV71B5病毒以每点106.6至103.6TCID50单位的稀释点加且用7C7标记。该斑点印迹的结果示于图2C中。检出界限为约105TCID50单位。在病毒中和测定中，没有观察到病毒中和活性。
实施例2
从EV71C4亚型制备和纯化重组体3CD
来自EV71C4亚型基因组的非结构蛋白3CD得以表达来用作抗原以产生单克隆抗体。该3CD DNA由根据EV71C4亚型基因组（Fuyang-08）的公布序列设计的合成基因扩增。该序列由NCBI指定为登记号EU703813.1并克隆到pGex-4T-1载体中，并转化到大肠杆菌中。诱导和未诱导细胞的总裂解物通过SDS-PAGE分析，其中可以在98.5kDa检测到表达的3CD-GST融合蛋白。该融合蛋白可以通过用8M尿素进行提取来富集，通过蛋白质印迹法显示为GST阳性。然后将富集的蛋白通过凝胶切割来纯化，通过BCA测定来确定重组蛋白的浓度。
抗EV713CD的单克隆抗体的生产
注射的蛋白 小鼠的编号 第一次注射 第一次加强免疫 第二次加强免疫 第三次加强免疫
EV71:3CD 3 28/09/09 12/10/09 26/10/09 09/11/09
开发抗纯化的EV713CD蛋白的多克隆和单克隆抗体。用根据标准实验方案纯化的抗原使小鼠免疫。简言之，将100μg的凝胶洗脱的3CD-GST融合蛋白以1:1的乳剂与Seppic非特异性免疫增生剂（Seppic adjuvans）皮下注射。三次加强免疫给药，每次间隔14天，收集血液来监测多克隆抗体的生产，如图3A所示。然后得到脾细胞和与杂交瘤细胞融合。单克隆抗体的筛选和随后的亚克隆导致3CD特异性单克隆抗体4B12的分离。
单克隆抗体4B12的特征描述
正如通过Isostrip（Santa Cruz）所确定的，单克隆抗体4B12属于IgG1同种型。采用蛋白质印迹法和IFA测定该4B12单克隆抗体的特异性。如图3A所示，在IFA中，4B12mAb特异性地标记EV71感染的Vero细胞。此外，正如图3B中的蛋白质印迹所显示的，4B12识别3CD上的线性表位。如图3C所示，在来自EV71感染的细胞的全部RD细胞裂解物中，抗体检测在73kDa的3CD、3C蛋白酶和3D聚合酶的前体，以及在52kDa的RNA依赖性RNA聚合酶3D。在来自未被感染的RD细胞的全部细胞裂解物中，没有观察到非特异性条带。如在图1B中的泳道3中证实的那样，3CD和3D蛋白质均还可以在蔗糖梯度纯化的EV71病毒颗粒的制品中检测出。
实施例3
表位作图7C7
为了表征7C7表位的特性，VP2蛋白分段成GST-标记的连续重叠肽，并克隆到pGex-4T-1载体中，并在大肠杆菌BL21细胞中表达并使用单克隆抗体7C7在Western印迹蛋白质印迹中检测。片段长度的逐渐减少导致被定位到VP2蛋白的氨基酸位置142-147或者EV71开放阅读框的氨基酸位置211-216的7C7线性表位的识别。如图4所示，最小表位由6个氨基酸EDSHPP（B5）（SEQ ID NO:1）或ENSHPP（A，CA16）（SEQ ID NO:2）组成。
单克隆抗体4B12的表位作图
为了表征4B12表位的特性，3CD蛋白分段成GST-标记的连续重叠肽，并克隆到pGex-4T-1载体，并在大肠杆菌BL21细胞中表达。如图5C所示，片段长度的逐渐减少导致在肽“H”上对应于EV71多聚蛋白的氨基酸位置1784-1791的8个氨基酸长的表位（DFEQALFS）（SEQ ID NO:3）的识别。如图6B所示，其进一步证实4B12表位确实包括这8个氨基酸，并且该抗体不识别短肽EQALFS（SEQ ID NO:4）。该表位位于3CD聚合酶的N-末端区域，靠近聚合酶活性位点，并且3C蛋白酶不能由4B12单克隆抗体识别。将该表位DFEQALFS针对EV71序列进行blast程序，且两个单氨基酸突变被识别：在3CD的第53位天门冬氨酸到谷氨酸和在第56位谷氨酰胺到组氨酸。通过定点突变将这些突变引入到我们确定的4B12表位并评价4B12是否仍然识别该表位。使用4B12的突变表位的蛋白质印迹显示在图6C中，这两个常见的氨基酸替换都能被识别出，开发了一种通用的EV71检测试剂盒。
为了进一步证实4B12单克隆抗体的特异性，将EV713D表位针对甲型肝炎病毒和肠病毒家族的脊髓灰质炎病毒1进行blast程序，且其相应的表位作为GST融合蛋白在大肠杆菌中表达。通过用抗GST抗体的蛋白质印迹，证实融合蛋白的表达。如图6所示，甲型肝炎和脊髓灰质炎1表位没有被4B12mAb识别。
实施例4
通过IFA法的7C7和1C6对于EV71亚型基因组的特异性
为了证实表位的突变分析的结果，我们将受感染的非洲绿猴肾细胞（VERO）感染野生型EV71亚型基因组A（BrCr）、B2（7423-MS-87）、B4（NUH-HFM41）、B5（＃363，马来西亚，未发表的序列）、B5（NUH0083-SIN-08）、C1（Y90-3761）、C2（NUH0075-SIN-08）、C4（75-Yamagata-03）和C5（3437-SIN-06）。如图7所示，两个单克隆抗体7C7和1C6在IFA中对所有测试EV71亚型基因组起反应。
通过IFA法的4B12对于EV71亚型基因组的特异性
为了证实表位的突变分析的结果，用来自不同亚型基因组的野生型EV71感染非洲绿猴肾细胞（vero），并进行IFA。所选择的毒株为预先生长在横纹肌肉瘤（rhabdomysarcoma（RD））细胞中的A（BrCr）、B2（7423-MS-87）、B4（NUH-HFM41）、B5（＃363，马来西亚，未发表的序列）、B5（NUH0083-SIN-08）、C1（Y90-3761）、C2（NUH0075-SIN-08）、C4（75-Yamagata-03）和C5（3437-SIN-06）。如图8所示，通过单克隆抗体4B12，确定所有供试毒株呈阳性。因此，4B12可以用作一个通用的用于检测EV71的抗体。
通过蛋白质印迹法的4B12对于EV71亚型基因组的特异性
为了确认在病毒颗粒中3D蛋白的存在，纯化来自不同EV71亚型基因组的病毒颗粒。用病毒感染RD细胞，当超过90％的细胞表现出细胞病变作用时48小时后收集上清液。通过澄清旋转和通过0.2μm的截止过滤器微滤去除细胞碎片，然后在100′000g超旋3小时来浓缩。通过27′000g下在20％到60％的蔗糖梯度下离心3小时，将病毒颗粒进行纯化。检测几个条带，收集在40～60％的蔗糖弯月面的病毒带。如图9A所示，进行使用4B12作为第一抗体的蛋白质印迹，并且在病毒部分中检测到3CD和3D蛋白条带。
通过斑点印迹法的4B12对于EV71亚型基因组的特异性
下一步是开发一种用于EV71的检测的斑点印迹法。纯化的病毒毒株在含有2％SDS的缓冲液中进行稀释和点加在硝酸纤维素膜上。然后，该印迹用作为第一抗体的4B12和HRP-偶联的第二抗体孵育。用传统的ECL化疗发光试剂（Amersham公司）使信号显影。再次，如图9B所示，由我们的Mab识别出所有测试的毒株为阳性，使得斑点印迹成为检测EV71抗原的可行策略。
实施例5
4B12针对重组3D蛋白的灵敏度。
使用ECL和红外（IR）检测方法评价斑点印迹***的灵敏度，所述方法已被证明分别在≥20pg和≥0.6pg蛋白下检测低浓度抗原（斑点，自然方法，IR检测，LI-COR）。重组3D蛋白在大肠杆菌BL21细胞中表达，通过His-珠纯化，用Bradford法测定蛋白浓度。稀释3D蛋白从1ng到10pg，点样并用4B12标记。如图10A所示，使用结合HRP的第二抗体和ECL检测或者红外（IR）标记第二抗体，然后通过在LI-COR Odyssey读出机上扫描，可以检测少至10pg的蛋白。
4B12针对完整EV71病毒的灵敏度。
对EV71野生型毒株A、B2、B5＃557、C1、C2、C5和B5＃363进行连续稀释，每个斑点从107到101TCID50，用单克隆抗体4B12标记，接着通过结合IR的第二抗体，并且用Odyssey读出机检测。如图10B所示，对所有受测毒株的检测界限为104TCID50单位的EV71病毒。
实施例6
用特异性单克隆抗体来检测EV71的抗原捕获ELISA法的开发。
筛选两个多克隆抗血清作为用于EV71AC-ELISA法的捕获抗体。豚鼠和兔抗EV71血清呈现高读数，但豚鼠血清的背景较高。因此，兔抗EV71多克隆血清用作捕获抗体来评价作为检测抗体的单克隆抗体。筛选4B12、7C7和1C6作为用于EV71AC-ELISA法的检测抗体。单克隆抗体4B12，靶向3D聚合酶，具有低活性。然而，单克隆抗体7C7和1C6，靶向病毒衣壳蛋白，能够检测捕获的EV71病毒。根据这一结果，用HRP标记的单克隆抗体1C6作为检测抗体进一步检测作为捕捉抗体的单克隆抗体7C7和1C6。检测的这两种单克隆抗体能够捕捉EV71病毒。为了测试AC-ELISA的特异性，单克隆抗体1C6同时用作捕获抗体和检测抗体。不同的EV71毒株加入到该测试中。基于1C6的AC–ELISA法可以成功地检测到所有的病毒毒株，而没有发生与培养基或其他非相关的病毒（例如猪病毒PCV）的任何交叉反应。
实施例7
用于对人EV71的血清抗体通用检测的表位封闭ELISA法的开发。
研发基于单克隆抗体1C6的表位封闭ELISA来检测针对人或动物的血清中的人EV71病毒的特异性抗体。评价对于EV71的表位封闭（EB-）ELISA的灵敏度和特异性，并与微量中和进行比较。另外，在封闭ELISA和微量中和中测试来自受到EV71病毒潜在感染的人类个体的血清样品。用缺少针对EV71的抗体的正常小鼠和豚鼠血清来确定对于EB-ELISA的截断值。≥30％封闭实现了具有95％的置信区间的特异性封闭活性。在用不同EV71和柯萨奇病毒毒株免疫的豚鼠的血清中检测EB-ELISA的特异性。结果表明，在EV71免疫动物中容易检测EV71的抗体（≥80％封闭），而具有其他肠道病毒的抗体的样本均呈阴性结果（≤12％封闭）。与微量中和相比，EB-ELISA的敏感度明显较高（p<0.005）。最后，在EB-ELISA法中测试病毒中和阳性（中和滴定度>8）或阴性（<8）的人血清样品。人脐血作为阴性对照。在1C6EB-ELISA中，100个具有阳性中和滴定度的样品呈现显著的封闭百分数（>70％，20倍稀释）。此外，以30％封闭的截断值，通过1C6封闭ELISA，发现300个VN-阴性样品中的249个呈现阳性，而所有的脐血样本均为阴性（9-18％封闭）。这些发现进一步证实，用1C6的封闭ELISA比病毒中和具有更好的灵敏度。对于人血清中的人EV71病毒，基于独特的单克隆抗体1C6的表位封闭ELISA提供了高度灵敏的和100％特异的检测的抗体（图11和12）。
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Figure IDA0000470199280000011

Claims (33)

1.一种分离的单克隆抗体或其片段，所述抗体或其片段能够特异性地结合肠道病毒71型（EV71）的至少一个构象表位。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述的构象表位包含至少一种衣壳蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中，所述的构象表位是完整病毒衣壳。
4.根据权利要求2或3所述的抗体，其中，所述衣壳蛋白是VP1、VP2VP3、VP4和/或VP0前体。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其实质上具有单克隆抗体1C6的免疫结合特性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中，所述抗体选自：
(a)由杂交瘤细胞系CBA20110001产生的抗体；
(b)具有由杂交瘤细胞系CBA20110001产生的抗体的结合特性的抗体；以及
(c)与能够结合由杂交瘤细胞系CBA20110001产生的抗体的抗原相结合的抗体。
7.一种分离的单克隆抗体或其片段，其中，所述抗体能够特异地结合肠道病毒71型的至少一个表位衣壳蛋白VP2。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中，所述抗体实质上具有单克隆抗体7C7的免疫结合特性。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述抗体选自：
(a)由杂交瘤细胞系CBA20110003产生的抗体；
(b)具有由杂交瘤细胞系CBA20110003产生的抗体的结合特性的抗体；以及
(c)与能够结合由杂交瘤细胞系CBA20110003产生的抗体的抗原相结合的抗体。
10.一种分离的单克隆抗体或其片段，所述抗体或其片段能够特异性地结合肠道病毒71型（EV71）的至少一个表位非结构蛋白。
11.根据权利要求10所述的抗体，其中，所述非结构蛋白是3CD。
12.根据权利要求10或11所述的抗体，其中，所述抗体实质上具有单克隆抗体4B12的免疫结合特性。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的抗体，其中，所述抗体选自：
(a)由杂交瘤细胞系CBA20110002产生的抗体；
(b)具有由杂交瘤细胞系CBA20110002产生的抗体的结合特性的抗体；以及
(c)与能够结合由杂交瘤细胞系CBA20110002产生的抗体的抗原相结合的抗体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中，所述抗体是至少一种人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中，EV71的基因型选自A、B2、B4、B5、C1、C2、C4和C5。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中，所述抗体用至少一种放射性核素和/或荧光染料标记。
17.根据前述权利中任一项所述的抗体，其中，所述抗体与至少一种药物、抗病毒药物和/或毒素连接。
18.一种分离的杂交瘤细胞系，其以保藏编号CBA20110001、CBA20110003和/或CBA20110002保藏于美国典型培养物保藏中心（ATCC）。
19.一种检测受试者中至少一种EV71感染的细胞的存在和分布和/或使其定量的方法，该方法包括：
a.将至少一种根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或其片段与从至少一个受试者获得的至少一个样品相接触；以及
b.检测和定量所述抗体与EV71感染的细胞的结合。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，检测步骤包括将样品与含有或结合可检测元素的结合蛋白相接触。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中，所述的抗体被固定在固体表面上。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中，所述结合蛋白包含放射性原子，结合荧光分子，或者结合酶。
23.一种用于诊断EV71和/或至少一种与EV71有关的疾病的试剂盒，该试剂盒包含至少一种根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或其片段。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中，所述与EV71有关的疾病是选自无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林-巴利综合征、脊髓灰质炎样综合征和手足口病中的至少一种疾病。
25.治疗EV71和/或至少一种与EV71有关的疾病的方法，该方法包括给予需要的受试者服用根据权利要求1至17中的任一项所述的至少一种抗体或其片段。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，与EV71有关的疾病选自无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林-巴利综合征、脊髓灰质炎样综合征和手足口病中的至少一种疾病。
27.根据权利要求1-17中任一项所述的分离的抗体，用于在药物中应用。
28.根据权利要求1-17中任一项所述的分离的抗体，用于治疗EV71和/或至少一种与EV71有关的疾病。
29.根据权利要求28所述的抗体，其中，所述与EV71有关的疾病是选自无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林-巴利综合征、脊髓灰质炎样综合征和手足口病中的至少一种疾病。
30.根据权利要求1-17中任一项所述的分离的抗体在制备用于治疗EV71和/或至少一种与EV71有关的疾病的药物中的用途。
31.根据权利要求30所述的用途，其中，所述与EV71有关的疾病是选自无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林-巴利综合征、脊髓灰质炎样综合征和手足口病中的至少一种疾病。
32.一种保护受试者不受EV71感染的方法，其包括向所述受试者施用至少一种对于保护受试者不受EV71感染的有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段。
33.一种药物组合物，其包含前述权利要求1-17中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
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