CN111139233B

CN111139233B - 广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体及应用

Info

Publication number: CN111139233B
Application number: CN202010060326.9A
Authority: CN
Inventors: 董少忠; 朱文兵; 蒋曦; 李卫宇; 郑雪麟; 刘卓航; 张雪梅; 徐婧雯; 吴忠香; 宋杰; 李慧; 孙明; 马绍辉
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2040-01-19
Also published as: CN111139233A

Abstract

本发明涉及一种广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人‑鼠嵌合IgM型单克隆抗体及应用，属于生物技术领域。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，其所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。本发明获得了一种可以同时抗EV71、CA16、CA 10和CA6的人‑鼠嵌合单克隆抗体，其由鼠源抗体IgM的可变区和人源抗体IgM的恒定区构成。本发明所述嵌合抗体对EV71、CA16、CA10和CA6均具有较高亲和力，对EV71、CA16、CA10和CA6展现广谱高效的中和活力，可用于治疗EV71、CA16、CA10和CA6等A型肠道病毒引起的手足口病。

Description

广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

肠道病毒71(Enterovirus 71，EV71)与柯萨奇病毒A型16(Coxsackievirus A 16，CA16)已被鉴定是诱发手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)的主要病原体。近年来，研究显示：柯萨奇病毒A型10(Coxsackievirus A 10，CA10)和柯萨奇病毒A型6(Coxsackievirus A 16，CA6)感染导致手足口病病例呈现上升趋势。目前，已经成功上市的灭活EV71疫苗针对EV71感染展现高效的保护效果，但其对CA16、CA10与CA6等其他型别肠道病毒没有交叉保护作用。同时，研究显示：在CA16疫苗免疫恒河猴后，其所产生的中和抗体不能有效保护宿主抵抗病毒感染。由此，开发针对肠道病毒具有广谱高效的中和抗体(broadly neutralizing antibodies,bNAbs)进行被动免疫的病毒防治已成为抗病毒的新策略之一。目前报道的单克隆抗体为IgG型，其仅对单一型别的肠道病毒具有中和治疗效应，且不具有交叉保护作用。因此如何克服现有技术的不足是目前生物技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体及其制备方法和应用，本发明采用杂交瘤法制备得到一株鼠源的单克隆抗体，但由于其可能引起人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)反应，影响其在人体内的治疗效果并产生副反应。因此，本发明利用人-鼠嵌合法将该株鼠源抗体进行修饰改造，降低其对人体的免疫原性。人-鼠嵌合抗体是利用基因工程技术将鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区相连接，构建成嵌合抗体，可以保持原有抗体的亲和力和特异性，减少人抗鼠抗体反应，延长半衰期和改善药代动力学。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6抗体杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)，免疫原的制备：以纯化的EV71和CA16病毒为免疫原；

步骤(2)，动物免疫：取6～8周龄Balb/c小鼠，以2周间隔进行四次免疫，程序为：首次免疫，弗氏完全佐剂与等量免疫原充分混合乳化后，背部皮下多点注射；第二次免疫和第三次免疫，佐剂换为弗氏不完全佐剂，方法和计量同首次免疫；第四次采用腹腔注射未加佐剂的免疫原，注射量同首次免疫；3天后，取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞；

步骤(3)，杂交瘤细胞株的制备和筛选：将处于对数生长期的SP2/0细胞与步骤(2)免疫小鼠脾脏细胞通过PEG4000的作用下进行细胞融合，利用1×HAT选择性培养基培养融合后的杂交瘤细胞，细胞融合后10-14天，通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清以筛选能特异性分泌广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6抗体的杂交瘤细胞株。

进一步，优选的是，步骤(2)中，首次免疫注射量为50ul 10⁷TCID50/ml EV71和50ul 10⁷TCID50/ml CA16。

进一步，优选的是，步骤(3)中，将处于对数生长期的SP2/0细胞与步骤(2)免疫小鼠脾脏细胞通过PEG4000的作用下进行细胞融合，利用1×HAT选择性培养基培养融合后的杂交瘤细胞，具体方法为：

选择6～8周龄Balb/c小鼠，取其腹腔巨噬细胞制备饲养层细胞；取处于对数生长期的SP2/0细胞与步骤(2)免疫小鼠脾脏细胞按照1∶10的细胞数量比例进行混和，采用40％聚乙二醇4000进行细胞融合，细胞融合后获得的杂交瘤细胞加入已含有饲养层细胞的培养板中，使用含有1×HAT选择性培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养。

进一步，优选的是，还包括杂交瘤细胞的克隆化，具体是：通过有限稀释法对杂交瘤细胞株进行亚克隆培养，连续培养多次，直至克隆孔内抗体检测100％阳性为止，扩大培养并冻存。

本发明第二方面提供一种广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体的制备方法，采用上述广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6抗体杂交瘤细胞株的制备方法制得的广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6抗体杂交瘤细胞株；包括如下步骤：

提取抗EV71、CA16、CA10和CA6广谱中和抗体杂交瘤细胞株的RNA，逆转录获取cDNA；然后巢式PCR扩增抗体重链可变区，同时巢式PCR扩增抗体轻链可变区；之后采用PVITRO1-hygro-mcs-IgM/κ连接载体对抗体可变区进行连接，获取IgM型抗体；同时，采用PVITRO1-hygro-mcsIgG/κ连接载体对抗体可变区进行连接，获取IgG型抗体；接着将连接得到的阳性单克隆抗体转染至CHO-S细胞，后纯化，即得广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体和IgG型单克隆抗体；所述的PVITRO1-hygro-mcs-IgM/κ连接载体的DNA序列如SEQ ID NO.7所示；所述的PVITRO1-hygro-mcsIgG/κ连接载体的DNA序列如SEQID NO.8所示。

本发明第三方面提供上述广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体的制备方法制备得到的广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体以及其IgG型单克隆抗体。

本发明第四方面提供一种广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，其所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

本发明第五方面提供一种如上述广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体的编码DNA，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明第六方面提供一种表达载体，包含重链恒定区DNA序列和轻链恒定区DNA序列，用于表达如权利要求5所述的广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体；

所述重链恒定区(C-Mu)的编码DNA序列如SEQ ID NO.5所示；

所述轻链恒定区(C-kapa)的编码DNA序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明第七方面提供一种宿主细胞，包含上述的表达载体。

本发明第八方面提供一种提供药物组合物，包括上述抗PD-1单克隆抗体和药学上可接受的载体。

本发明第八方面提供上述广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体在制备治疗或预防人病毒感染、肿瘤及炎性疾病药物中的应用。

本发明核苷酸分子的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地包括以下制备方法：通过基因克隆技术例如PCR方法等，获得编码所述单克隆抗体的核苷酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述单克隆抗体的核苷酸分子。

本领域技术人员知晓，编码上述单克隆抗体的氨基酸序列的核苷酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、***或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物或其保守型变异序列。本发明中多聚核苷酸的同系物或其保守型变异序列，可以通过对编码该单克隆抗体基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

本发明所述表达载体为本领域常规的表达载体，是指包含适当的调控序列，例如

启动子序列、终止子序列、多腺苷酰化序列、增强子序列、标记基因和/或序列以及其他适当

的序列的表达载体。所述表达载体可以是病毒或质粒，如适当的噬菌体或者噬菌粒，更多技术细节请参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989。许多用于核酸操作的已知技术和方案请参见Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等编著。本发明中的表达载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。

本发明所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核苷酸可被有效表达即可。本发明中的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。所述宿主细胞较佳地包括：COS、CHO、HeLa细胞系、骨髓细胞系如SP2/0细胞系、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或E.coliTG1、YB2/0细胞系等以及转化的B-细胞或杂交瘤细胞中的一种或多种的组合。更佳地为E.coli TG1、BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。

将上述表达载体转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。

本发明中所用的宿主细胞均为现有技术，可通过商业途径直接获取，培养中所用的培养基亦为各种常规培养基，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的单克隆抗体可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物以所述单克隆抗体为活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剂、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用抑制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的单克隆抗体可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式对抑制剂进行给药。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明采用杂交瘤法制备得到一株鼠源的单克隆抗体，但由于其可能引起人抗鼠抗体(humananti-mouse antibody,HAMA)反应，影响其在人体内的治疗效果并产生副反应。因此，本发明利用人-鼠嵌合法将该株鼠源抗体进行修饰改造，降低其对人体的免疫原性。人-鼠嵌合抗体是利用基因工程技术将鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区相连接，构建成嵌合抗体，可以保持原有抗体的亲和力和特异性，减少人抗鼠抗体反应，延长半衰期和改善药代动力学。

本发明所获人-鼠嵌合抗体：20-IgM，在体外(RD)和体内(一日龄乳鼠)对EV71、CA16、CA10和CA6感染均展现高效广谱中和作用。本发明的抗体可用于预防或治疗EV71、CA16、CA10和CA6感染，更进一步其有可能应用于其他型别的肠道病毒感染所引起的手足口病治疗。

附图说明

图1为抗体重链可变区PCR凝胶电泳图；

图2为抗体轻链可变区PCR凝胶电泳图；

图3为抗体氨基酸序列分析图；其中，A为20-IgM单克隆抗体重链序列及基因打靶结果图；B为20-IgM单克隆抗体轻链序列及基因打靶结果图；C为20-IgM单克隆抗体结构模拟图；

图4为抗体分子大小和纯度鉴定结果图；其中，Ladder：蛋白分子标准；20-IgG(non-reducing)：非还原状态20-IgG；20-IgM(non-reducing)：非还原状态20-IgM；20-IgG(reducing)：还原状态20-IgG；20-IgM(reducing)：还原状态20-IgM；

图5为抗体与不同型别肠道病毒交叉识别作用鉴定结果图；

图6为抗体亲和力鉴定结果图；其中，ligant Concentration为配体浓度，Fnorm[‰]为响应值；(a)：20-IgM分别于与EV71、CA16、CA10、CA6亲和力测定；(b)：20-IgG分别于与EV71、CA16、CA10、CA6亲和力测定。

图7为抗体中和表位鉴定结果图；A：20-IgM与20-IgG识别EV71衣壳蛋白鉴定；B：20-IgM与20-IgG识别CA16衣壳蛋白鉴定；C：20-IgM与20-IgG识别EV71衣壳蛋白鉴定；D：20-IgM与20-IgG识别CA6衣壳蛋白鉴定；E-G：ELISA法鉴定20-IgM与20-IgG识别抗原肽；H-I：抗原肽抑制试验鉴定20-IgM与20-IgG结合抗原肽；J：ELISA法鉴定20-IgM与20-IgG识别关键氨基酸位点；K：20-IgM与20-IgG识别EV71氨基酸位点；L：20-IgM与20-IgG识别CA16氨基酸位点；M：20-IgM与20-IgG识别CA6氨基酸位点；N：20-IgM与20-IgG识别CA10氨基酸位点；

图8为抗体中和效应细胞病变图；

图9为抗体中和效力测定结果图；左上：20-IgM与20-IgG对EV71的IC50与IC80测定；右上：20-IgM与20-IgG对CA16的IC50与IC80测定；左下：20-IgM与20-IgG对CA10的IC50与IC80测定；右下：20-IgM与20-IgG对CA6的IC50与IC80测定。IC50:(half maximalinhibitory concentration，半数有效抑制浓度；

图10为抗体对感染乳鼠保护量效图；其中，Days post-infection为感染后天数；Percent survival为生存百分比；Body weight change为体重变化。A：感染组与抗体组小鼠临床症状；B：EV71感染组与20-IgM治疗组小鼠生存率变化；C：EV71感染组与20-IgM治疗组小鼠体重变化；D：：CA16感染组与20-IgM治疗组小鼠生存率变化；E：：CA16感染组与20-IgM治疗组小鼠体重变化；

图11为pVITRO1-hygro-mcs-IgM/κ表达载体质粒图谱；

图12为pVITRO1-hygro-mcs-IgG/κ表达载体质粒图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明除非另有说明，否则百分号代表体积百分数，比例代表体积比。

1.抗EV71、CA16、CA10和CA6双效杂交瘤细胞株制备方法

1)免疫原制备：以纯化的EV71和CA16病毒为免疫原；

2)动物免疫：取6～8周龄Balb/c小鼠，以2周间隔进行四次免疫，程序为：首次免疫，弗氏完全佐剂与等量免疫原充分混合乳化后，背部皮下多点注射，100ul 10⁷TCID50/ml；第二次免疫和第三次免疫，佐剂换为弗氏不完全佐剂，方法和计量同首次免疫；第四次采用腹腔注射未加佐剂的免疫原，注射量同首次免疫；3天后，取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞；

3)杂交瘤细胞株的制备：具体是：细胞融合前2天，取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞。选择6～8周龄Balb/c小鼠，取其腹腔巨噬细胞制备饲养层细胞，使细胞浓度为10⁵个/mL，加入96孔板，每孔100μL，置于37℃、5％CO₂条件下培养备用。取处于对数生长期的SP2/0细胞(购自ATCC)与步骤2)免疫小鼠脾脏细胞按照1∶10的细胞数量比例进行混和，将45％聚乙二醇4000(PEG)(购买自sigma)细胞融合后获得的杂交瘤细胞加入已含有饲养层细胞的96孔板中，使用含有1×HAT选择性培养基[50×HAT(购买自sigma)、20％(V/V)胎牛血清、1640培养基(购买自Corning)]，在37℃、5％CO₂条件下培养。

4)杂交瘤细胞株的筛选，具体是：将步骤3)获得的杂交瘤细胞在含有1×HAT选择性培养基的条件下培养10-14天，每隔4天更换一半量的1×HAT的完全培养基。培养12天后取杂交瘤细胞上清进行间接ELISA以初次筛选能特异性分泌抗EV71、CA16、CA10和CA6的杂交瘤细胞。具体步骤如下：EV71或CA16包被酶标板，设置空白对照，取培养上清为一抗，SP2/0细胞培养上清为阴性对照，二抗为HRP标记山羊抗小鼠IgG(1:6000)(ThermoScientific)，TMB(Solarbio)显色终止后，酶标仪检测450nm吸光度值(A450值)，以高于阴性对照A450值2.1倍以上的孔为阳性细胞孔，并进行下一步的亚克隆。

5)杂交瘤细胞的克隆化，具体是：选取步骤4)中筛选得到的阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔的细胞进行克隆，将每孔200μL细胞吸取至加样槽，用1×HT完全培养基[(50×HT(购买自sigma)、20％(V/V)胎牛血清、1640培养基(购买自Corning)]稀释至20mL后，均匀加至一个新的96孔板，每孔200μL，37℃、5％CO₂条件下培养5天后再次进行间接ELISA检测，再次选取高于阴性对照A450值2.1倍以上且细胞生长状态良好的细胞孔，分克隆至另一个96孔板，并换1×HAT选择性培养基培养，如此重复三至四轮，直至克隆孔内抗体检测100％阳性为止。选取生长状态好的细胞，用普通完全培养基[20％(V/V)胎牛血清、1640培养基(购买自Corning)]逐步扩大培养，并液氮冻存。

在亚克隆培养筛选的过程中，用EV71、CA16、CA10和CA6分别包被酶标板，封闭后取杂交瘤细培养上清进行间接ELISA，设置空白对照，SP2/0细胞培养上清为阴性对照，HRP标记山羊抗小鼠IgG(1:6000)为二抗，根据两块酶标板A450值读数，筛选能够同时识别EV71和CA16的单克隆细胞，这些杂交瘤细胞株进行进一步的亚克隆和扩增培养。

6)杂交瘤抗体型别鉴定：采用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Roche)鉴定抗体的型别，方法见说明书。

2.人-鼠嵌合单克隆抗体制备

1)RNA提取：采用TRNzol-A⁺(TIANGEN)提取1中所筛选的同时识别EV71和CA16的杂交瘤细胞的RNA，细胞数为10⁵。

2)逆转录获取cDNA：采用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit将2.1获取的RNA逆转录为cDNA，方法参见试剂盒(Takara,Dalian)。

3)巢式PCR扩增抗体重链可变区：巢式PCR扩增体系为共54ul：

I-5^TM 2x High-Fidelity Master Mix(Tsingke,China)27ul；

步骤2)获取的cDNA 4ul；

VH Forward(每个引物浓度为2pM)：每个1ul，共4个，总共4ul；

VH Reverse(每个引物浓度为2pM)：每个1ul，共19个，总共19ul。

扩增程序为：98℃预变性1分钟；98℃变性，10秒，65℃复性10秒，72℃延伸10秒，循环35次；72℃延伸5分钟。结果见图1。

4)巢式PCR扩增抗体轻链可变区：巢式PCR扩增体系50ul：

I-5^TM 2x High-Fidelity Master Mix(Tsingke,China)25ul；

步骤2)获取的cDNA 4ul；

VL(κ)Forward(每个引物浓度为2pM)：每个1ul，共4个，总共4ul；

VL(κ)Reverse(每个引物浓度为2pM)：每个1ul，共17个，总共17ul。

扩增方法为：98℃预变性1分钟；98℃变性，10秒，60℃复性10秒，72℃延伸10秒，循环35次；72℃延伸5分钟。结果见图2。

5)琼脂糖凝胶电泳鉴定巢式PCR产物：上样样品：marker(DL2000/DL1000)，VH，VL；采用1％琼脂糖凝胶，100mA，20min。结果见图1和图2。

6)抗体可变区测序及序列分析：将步骤5)胶回收产物送Tsingke公司测序，测序结果经IgBLAST比对分析序列。结果显示：20-IgM抗体重链互补决定区3(complementaritydetermining region 3，CDR3)氨基酸序列为：Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr AlaMet Asp Tyr。其余序列结果见图3。

7)连接载体：步骤6)鉴定该株抗体亚型为IgM型，所用载体为PVITRO1-hygro-mcs-IgM/κ；载体由Tsingke公司合成，具体序列见SEQ ID NO.7及图谱见图11。同时，将抗体可变区连接至PVITRO1-hygro-mcsIgG/κ，构建其IgG型单克隆抗体；载体由Tsingke公司合成，具体序列见SEQ ID NO.8及图谱见图12。采用DNA Ligation Kit Ver 2.1(Takara,Dalian)连接。连接体系：SolutionⅠ10ul，PVITRO1-hygro-mcs-IgM/κ(图11)或PVITRO1-hygro-mcsIgG/κ(图12)和VH/VL按摩尔比3:1比例进行连接；即先用VH与PVITRO1-hygro-mcs-IgM/κ按摩尔比3:1比例连接后，再加入VL，VL与PVITRO1-hygro-mcs-IgM/κ的摩尔比也为3:1，这得到了第一个连接产物；同理，先用VH与PVITRO1-hygro-mcsIgG/κ按摩尔比3:1比例连接后，再加入VL，VL与PVITRO1-hygro-mcsIgG/κ的摩尔比也为3:1，这得到了第二个连接产物；

连接方法：16℃，30min。

连接产物加入大肠杆菌DH5α进行转化：冰浴1h，42℃90s，冰浴2min；加入100ul无抗LB[Tryptone(胰蛋白胨)：10g，Yeast Extract(酵母提取物)：5g,NaCl(氯化钠)：10g，加水配制1L]，摇床培养1h，180rpm；涂板。

8)阳性单克隆抗体鉴定：挑取单菌落扩大培养后，经Tsingke公司测序，测序结果经IgBLAST比对分析序列。

9)抗体表达：抗体质粒构建成功后，将其转染至FreeStyle^TMCHO-S细胞，转染试剂为FreeStyle^TMMAX Reagent(Thermo Scientific，USA)。转染方法见说明书。

10)抗体纯化：转染后细胞培养上清采用ProteinG亲和预装柱纯化。

表1 PCR引物

3.抗体特征鉴定

1)分子量及纯度鉴定：采用非还原和还原10％SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。还原状态：样品和5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液[250Mm Tris-HCl(pH6.8)，10％(W/V)SDS，0.5％(W/V)BPB，50％(V/V)甘油，5％(W/V)β-巯基乙醇]按体积比4:1比例混合，加入样品后缓冲液终浓度为1×，95℃加热10分钟，以充分变性蛋白。非还原状态：样品和5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液[250Mm Tris-HCl(pH6.8)0.5％(W/V)BPB，50％(V/V)甘油]按体积比4:1比例混合，加入样品后缓冲液终浓度为1×。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。80V 30分钟，150V 50分钟电泳。结果显示：未还原状态下：20-IgM分子量大小约为850KDa，20-IgG分子量大小为150KDa；还原状态下：20-IgG可见55KDa的重链和25KDa的轻链；20-IgM可见约80KDa大小的重链和25KDa的轻链。见图4。

2)结合特性鉴定：ELISA法。以EV71、CA16分别包被酶标板，以纯化后抗体为一抗，以HRP标记抗体为二抗(donkey anti-human IgG)，TMB显色终止后，酶标仪检测450nm吸光度值(A450值)。结果显示：20-IgM和20-IgG都可以同时识别EV71、CA16、CA10和CA6；见图5。

3)亲和力鉴定：微量热泳动法(microscale thermophoresis，MST)。采用MonolithNT Protein Labeling Kit RED分别标记EV71、CA16、CA10和CA6，标记方法见说明书。采用TBST[20mM Tris(pH 7.5),50mM NaCl,5mMβ-mercaptoethanol,0.05％Tween-20and1％DMSO]倍比稀释抗体(稀释倍比为2¹～2¹⁶，共16个浓度)，分别取10ul稀释的抗体和10ul标记的病毒液混合，加入MST所用标准毛细管(Monolith TM standard-treated capillaries)，通过亲和结合分析计算抗体的平衡解离常数Kd。结果显示：20-IgM与EV71、CA16、CA10和CA6均具有将强的结合能力，其亲和力常数(Kd)分别为：0.06nM、0.12nM、3.12nM、0.25nM。20-IgG与EV71、CA16、CA10和CA6的亲和力常数(Kd)分别为：0.6nM、1.2nM、3.12nM、2.5nM。20-IgM与相对应病毒的亲和力显著高于20-IgG(10倍)。见图6。

4)抗体中和表位鉴定：

a)抗体识别病毒表位鉴定：分别以EV71、CA16、CA10和CA6全病毒进行SDS-PAGE电泳后，转PVDF膜进行Western Blot分析。使用半干转膜装置(BIO-RAD)，设定转膜电流为100mA，转膜时间为45分钟，按照转膜仪的说明书，将电泳后的蛋白转印至PVDF膜(购买自Millipore)上。转膜完毕后，立即把转膜完成的PVDF膜放置到预先准备好的5％(W/V)脱脂奶粉的TBS[20mMTris-HCl，500mMNaCl(pH7.5)]中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。纯化的单克隆抗体作为一抗，用TBST洗膜液[20mMTris-HCl，500mMNaCl(pH7.5)0.01％Tween-20(V/V)]将其稀释成1∶1000，加入至封闭完成后的PVDF膜中孵育过夜。弃一抗稀释液。加入TBST洗膜液5ml。在侧摆摇床上摇动，重复5次。随后以HRP标记的山羊抗人IgG为二抗(用TBST稀释1:10000)进行室温孵育1h。弃二抗稀释液，TBST洗膜重复5次，加入ECL(购买自Millipore)试剂，在暗室压片，经显影液定影液进行洗片或者进行机器曝光，检测单克隆抗体的识别效果。结果显示：20-IgM特异性识别EV71、CA16、CA10和CA6的VP1衣壳蛋白(图7A-D)。

抗体识别氨基酸位点鉴定：鉴定结果显示抗体特异性识别EV71、CA16、CA10、CA6的VP1蛋白，为了进一步确定抗体识别的关键氨基酸序列，合成VP1的多肽序列：每个肽段由15个氨基酸组成，如表2，由吉尔生化(上海)有限公司合成。采用ELISA法鉴定：以不同的肽段包被酶标板进行鉴定，结果显示：20-IgM特异性识别VP1蛋白的肽段(Phe Gly Glu His LysGln Glu Lys Asp.Leu Glu Tyr Gly Ala Cys,FGEHKQEKDLEYGAC)。见图7E-7G。并采用抗原肽抑制实验近一步确认20-IgM与FGEHKQEKDLEYGAC肽段结合的特异性：将不同浓度梯度的抗原肽段(15-For,15,15-Back)与20-IgM于37度孵育1小时后，加入微量中和实验，结果显示：15号肽段特异性的影响20-IgM的中和效力，见图7H-7I。以上结果证实：20-IgM特异性的识别VP1衣壳蛋白FGEHKQEKDLEYGAC肽段。20-IgG显示同样结果。

表2抗原肽氨基酸序列

1	Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser Ile Gly Asp Ser
		2	Val Ser Arg Ala Leu Thr His Ala Leu Pro Ala Pro Thr Gly Gln
3	Asn Thr Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys Val Pro
		4	Ala Leu Gln Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp
5	Glu Ser Met Ile Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr
		6	Ala Glu Thr Thr Leu Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val
7	Gly Glu Ile Asp Leu Pro Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly
		8	Tyr Ala Asn Trp Asp Ile Asp Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg
9	Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu
		10	Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr Gly Glu Val Val Pro Gln Leu
11	Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Ser
		12	Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe
13	Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val Pro Phe Met
		14	Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr
15	Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp.Leu Glu Tyr Gly Ala Cys
		16	.Ser Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Thr
17	Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met
		18	Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn
19	Tyr Leu Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser Ile Lys
		20	Pro Thr Gly Ala Ser Arg Thr Ala Ile Thr Thr Leu
15For	Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp.Leu
		15Back	Gln Glu Lys Asp.Leu Glu Tyr Gly Ala Cys Ser Asn Asn Met Met

b)抗体识别关键氨基酸位点鉴定：鉴定结果显示抗体特异性地识别15号肽段，因此将15号肽段进行氨基酸位点突变，由吉尔生化(上海)有限公司合成(表3)。采用ELISA法鉴定，以点突变肽段包被酶标板。结果显示：20-IgM特异性识别氨基酸位点为：DLEYG(219-223)。结果见图7J。近一步本研究通过比对EV71、CA16、CA10和CA6的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列同源性，结果显示：20-IgM结合位点在EV71衣壳蛋白VP1为DLEYG(219-223)(图7K)；CA16为DLDYG(219-223)(图7L)；CA10为NTTYG(218-222)(图7N)；CA6为NLQYG(214-218)(图7M)。20-IgG显示同样结果。

表3抗原肽氨基酸序列

5)中和效力鉴定：微量中和实验。于96孔板中，每孔加入50ul 2000TCID50/ml病毒液(EV71/CA16/CA10/CA6，即4个实验，每组分别为EV71、CA16、CA10、CA6)与50ul梯度稀释(稀释倍比为2¹～2⁸，共8个浓度)的抗体37℃孵育1h后，加入RD细胞(15000个)，37℃，5％CO₂培养3天，采用MTT法测量细胞活力。同时，每天观察细胞病变效应。结果显示：1nM 20-IgM抗体可以抑制EV71/CA16/CA10/CA6感染细胞发生病变。相对应，1nM 20-IgG不能完全抑制细胞病变。见图8。

6)MTT法：RD细胞培养3天后，每孔加入20ul噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/ml)，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清。每孔加入150ul DMSO，振荡10分钟后于490nm波长下在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度值。并于Graphpad绘制生长曲线和计算抗体的半数有效抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。结果显示：EV71感染组，20-IgM的IC50为0.11nM，IC80为0.35nM；20-IgG的IC50为1.31nM，IC80为4.3nM。CA16感染组，20-IgM IC50为0.45nM，IC80为1.03nM；20-IgG的IC50为6.47nM，IC80为14.14nM。CA10感染组，20-IgM IC50为1.47nM，IC80为3.33nM；20-IgG的IC50为10.85nM，IC80为22.64nM；CA6感染组，20-IgM IC50为0.55nM，IC80为1.39nM；20-IgG的IC50为4.97nM，IC80为11.37nM。见图9。

7)抗体对临床分离病毒株中和效力鉴定：微量中和实验鉴定抗体的结合效力；ELISA鉴定抗体的结合效力。结果显示：20-IgM对分离的5株EV71和5株CA16临床病毒株均具有较高的中和效力和结合效力。相对应，20-IgG同样对分离的5株EV71和5株CA16临床病毒株均具有较高的中和效力和结合效力，但其结合效力和中和效力均低于20-IgM。见表4。

表4抗体对临床分离病毒株的中和效力8)动物保护效力鉴定：

i.以1日龄乳鼠为感染模型来评价抗体在动物体内的保护效应。1日龄乳鼠感染模型：颅腔注射30ul 10⁷TCID50/ml病毒(EV71或CA16)感染1日龄乳鼠(每组15只)，每天记录小鼠的生存率以及小鼠的体重变化情况和临床症状。结果显示：感染组小鼠出现体重减轻、四肢麻痹等临床症状直致死亡，感染后10天乳鼠基本全部死亡。见图10A箭头标出。

ii.抗体保护效果评价：乳鼠感染病毒1天后，腹腔注射抗体(5mg/kg)，每天记录小鼠的生存率以及小鼠的体重变化情况和临床症状。结果显示：20-IgM治疗组小鼠临床症状减轻，体重增长恢复趋近于对照组(PBS)(图10C和图10E)；生存率统计结果显示：5mg/kg20-IgM对EV71/CA16感染小鼠的保护率达到100％(图10B和图10D)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Ile Pro Gly Ser Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

Glu Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln

50 55 60

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120

<210> 2

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Glu Phe Asp His Cys Ser Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg

1 5 10 15

Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser

20 25 30

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro

35 40 45

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

50 55 60

Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

85 90 95

Gln Leu

<210> 3

<211> 359

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

caggttccaa gctgcagcag tctggacctg agctggtgaa gcctggggct tcagtgaaga 60

tatcctgcaa gacttctgga tacacattca ctgaatacac catgcactgg gtgaagcaga 120

gccatggaaa gagccttgag tggattggag gtattaatcc taacaatggt ggtactagct 180

acaaccagaa gttcaagggc aaggccacat tgactgtaga caagtcctcc agcacagcct 240

acatggagct ccgcagcctg acatctgagg attctgcagt ctattactgt gcaagaggtg 300

gtaactacta ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctcg 359

<210> 4

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gatcattgtt ctcaatccag tcagagtctg ctcaacagta gaacccgaaa gaactacttg 60

gcttggtacc agcagaaacc agggcagtct cctaaactgc tgatctactg ggcatccact 120

agggaatctg gggtccctga tcgcttcaca ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 180

accatcagca gtgtgcaggc tgaagacctg gcagtttatt actgcaagca atcttataat 240

cttcggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaataaaac gt 282

<210> 5

<211> 1362

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ggatctgcat ccgctccaac cctgttcccc cttgtgagct gcgaaaattc tccatccgac 60

acaagcagcg tcgcggtcgg ctgcctggct caagactttc tccccgacag catcactttc 120

agttggaagt acaagaacaa cagtgacatt tctagtacaa gaggatttcc gagtgttctg 180

agaggcggga agtacgctgc tacatcccag gtgctgctgc cgtcaaaaga cgttatgcag 240

ggtaccgatg agcacgtagt gtgtaaggtg caacacccaa acggcaacaa agagaagaat 300

gtccccctgc cagtgattgc tgaactgccc cctaaagtct ccgtctttgt accccccaga 360

gacggattct tcggcaaccc acgaaagtcc aagctcatct gccaggccac gggattctct 420

cctcgccaga tccaggtgtc ttggttgagg gaggggaaac aggttggctc tggcgttacc 480

accgatcagg ttcaggccga ggccaaagag tccgggccaa ctacctataa ggttacaagt 540

accctgacta taaaagaaag tgactggctg tctcaatcca tgtttacatg cagagtcgat 600

catcgaggcc tgacgttcca acagaatgcc agttccatgt gcgtgccaga tcaagatacc 660

gctataagag tgttcgcaat ccctccttca ttcgcttcca tattccttac taagagcacc 720

aagctgacat gtcttgtgac tgatttgacc acttacgaca gcgttacaat cagctggacc 780

cgccagaatg gcgaagctgt gaaaacccac acaaacatct ccgagtctca ccccaacgct 840

acatttagcg ccgtcggcga ggcatccatc tgcgaggacg attggaacag tggggagcgg 900

ttcacgtgca ctgttacgca tacagacctg ccgtctcctc tcaaacaaac tatcagccga 960

cctaaaggag tggcactgca ccggccagac gtttacctgc tgccccctgc ccgggaacag 1020

ctgaacctgc gggaatccgc cacaattaca tgcctggtga ctggatttag cccagccgac 1080

gtgttcgtgc agtggatgca gagggggcag cccctctccc cggaaaaata cgtaacatcc 1140

gctcccatgc ctgagcctca ggcccctgga cggtatttcg cccatagtat tctgactgtg 1200

tctgaagagg aatggaatac aggcgaaaca tatacttgcg tggttgctca tgaggccctg 1260

cctaaccgag tcacagagag aacagtggat aaatctacag gcaagccgac cctctataat 1320

gtgtctctcg tgatgtcaga tacggctggc acttgctact ga 1362

<210> 6

<211> 323

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gtacggtggc ggcgccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 60

gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 120

ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 180

gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 240

aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 300

gcttcaacag gggagagtgt tag 323

<210> 7

<211> 8285

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

cctgcagggc ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga 60

aagaaccagc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca 120

ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca 180

ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc 240

ccactagtgg agccgagagt aattcataca aaaggaggga tcgccttcgc aaggggagag 300

cccagggacc gtccctaaat tctcacagac ccaaatccct gtagccgccc cacgacagcg 360

cgaggagcat gcgctcaggg ctgagcgcgg ggagagcaga gcacacaagc tcatagaccc 420

tggtcgtggg ggggaggacc ggggagctgg cgcggggcaa actgggaaag cggtgtcgtg 480

tgctggctcc gccctcttcc cgagggtggg ggagaacggt atataagtgc ggcagtcgcc 540

ttggacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gtcagaacgc aggtgagggg cgggtgtggc 600

ttccgcgggc cgccgagctg gaggtcctgc tccgagcggg ccgggccccg ctgtcgtcgg 660

cggggattag ctgcgagcat tcccgcttcg agttgcgggc ggcgcgggag gcagagtgcg 720

aggcctagcg gcaaccccgt agcctcgcct cgtgtccggc ttgaggccta gcgtggtgtc 780

cgcgccgccg ccgcgtgcta ctccggccgc actctggtct tttttttttt tgttgttgtt 840

gccctgctgc cttcgattgc cgttcagcaa taggggctaa caaagggagg gtgcggggct 900

tgctcgcccg gagcccggag aggtcatggt tggggaggaa tggagggaca ggagtggcgg 960

ctggggcccg cccgccttcg gagcacatgt ccgacgccac ctggatgggg cgaggcctgg 1020

ggtttttccc gaagcaacca ggctggggtt agcgtgccga ggccatgtgg ccccagcacc 1080

cggcacgatc tggcttggcg gcgccgcgtt gccctgcctc cctaactagg gtgaggccat 1140

cccgtccggc accagttgcg tgcgtggaaa gatggccgct cccgggccct gttgcaagga 1200

gctcaaaatg gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg 1260

aagagggcct ggtccctcac cggctgctgc ttcctgtgac cccgtggtcc tatcggccgc 1320

aatagtcacc tcgggctttt gagcacggct agtcgcggcg gggggagggg atgtaatggc 1380

gttggagttt gttcacattt ggtgggtgga gactagtcag gccagcctgg cgctggaagt 1440

catttttgga atttgtcccc ttgagttttg agcggagcta attctcgggc ttcttagcgg 1500

ttcaaaggta tcttttaaac ccttttttag gtgttgtgaa aaccaccgct aattcaaagc 1560

aaccggtatg gactggacct ggaggatcct cttcttggtg gcagcagcca caggagccca 1620

ctccctcgag tgcgcacgct ccaaccctgt tcccccttgt gagctgcgaa aattctccat 1680

ccgacacaag cagcgtcgcg gtcggctgcc tggctcaaga ctttctcccc gacagcatca 1740

ctttcagttg gaagtacaag aacaacagtg acatttctag tacaagagga tttccgagtg 1800

ttctgagagg cgggaagtac gctgctacat cccaggtgct gctgccgtca aaagacgtta 1860

tgcagggtac cgatgagcac gtagtgtgta aggtgcaaca cccaaacggc aacaaagaga 1920

agaatgtccc cctgccagtg attgctgaac tgccccctaa agtctccgtc tttgtacccc 1980

ccagagacgg attcttcggc aacccacgaa agtccaagct catctgccag gccacgggat 2040

tctctcctcg ccagatccag gtgtcttggt tgagggaggg gaaacaggtt ggctctggcg 2100

ttaccaccga tcaggttcag gccgaggcca aagagtccgg gccaactacc tataaggtta 2160

caagtaccct gactataaaa gaaagtgact ggctgtctca atccatgttt acatgcagag 2220

tcgatcatcg aggcctgacg ttccaacaga atgccagttc catgtgcgtg ccagatcaag 2280

ataccgctat aagagtgttc gcaatccctc cttcattcgc ttccatattc cttactaaga 2340

gcaccaagct gacatgtctt gtgactgatt tgaccactta cgacagcgtt acaatcagct 2400

ggacccgcca gaatggcgaa gctgtgaaaa cccacacaaa catctccgag tctcacccca 2460

acgctacatt tagcgccgtc ggcgaggcat ccatctgcga ggacgattgg aacagtgggg 2520

agcggttcac gtgcactgtt acgcatacag acctgccgtc tcctctcaaa caaactatca 2580

gccgacctaa aggagtggca ctgcaccggc cagacgttta cctgctgccc cctgcccggg 2640

aacagctgaa cctgcgggaa tccgccacaa ttacatgcct ggtgactgga tttagcccag 2700

ccgacgtgtt cgtgcagtgg atgcagaggg ggcagcccct ctccccggaa aaatacgtaa 2760

catccgctcc catgcctgag cctcaggccc ctggacggta tttcgcccat agtattctga 2820

ctgtgtctga agaggaatgg aatacaggcg aaacatatac ttgcgtggtt gctcatgagg 2880

ccctgcctaa ccgagtcaca gagagaacag tggataaatc tacaggcaag ccgaccctct 2940

ataatgtgtc tctcgtgatg tcagatacgg ctggcacttg ctactgatgt acagctagct 3000

ggccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa 3060

aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct 3120

gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg 3180

tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtatggaa atgttaatta 3240

actagccatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 3300

agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 3360

aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 3420

ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta 3480

gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 3540

aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 3600

aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 3660

gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 3720

aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 3780

aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 3840

cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 3900

cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 3960

tgctcacatg ttcttaatta acctgcaggc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 4020

ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 4080

acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 4140

ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 4200

aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 4260

tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgatgatgc ggttttggca gtacatcaat 4320

gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 4380

gggagtttgt tttgactagt ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc 4440

gcaaggggag agcccaggga ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc 4500

cccacgacag cgcgaggagc atgcgcccag ggctgagcgc gggtagatca gagcacacaa 4560

gctcacagtc cccggcggtg gggggagggg cgcgctgagc gggggccagg gagctggcgc 4620

ggggcaaact gggaaagtgg tgtcgtgtgc tggctccgcc ctcttcccga gggtggggga 4680

gaacggtata taagtgcggt agtcgccttg gacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgtc 4740

agaacgcagg tgagtggcgg gtgtggcttc cgcgggcccc ggagctggag ccctgctctg 4800

agcgggccgg gctgatatgc gagtgtcgtc cgcagggttt agctgtgagc attcccactt 4860

cgagtggcgg gcggtgcggg ggtgagagtg cgaggcctag cggcaacccc gtagcctcgc 4920

ctcgtgtccg gcttgaggcc tagcgtggtg tccgccgccg cgtgccactc cggccgcact 4980

atgcgttttt tgtccttgct gccctcgatt gccttccagc agcatgggct aacaaaggga 5040

gggtgtgggg ctcactctta aggagcccat gaagcttacg ttggatagga atggaagggc 5100

aggaggggcg actggggccc gcccgccttc ggagcacatg tccgacgcca cctggatggg 5160

gcgaggcctg tggctttccg aagcaatcgg gcgtgagttt agcctacctg ggccatgtgg 5220

ccctagcact gggcacggtc tggcctggcg gtgccgcgtt cccttgcctc ccaacaaggg 5280

tgaggccgtc ccgcccggca ccagttgctt gcgcggaaag atggccgctc ccggggccct 5340

gttgcaagga gctcaaaatg gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc 5400

cacacaaagg aagagggcct tgcccctcgc cggccgctgc ttcctgtgac cccgtggtct 5460

atcggccgca tagtcacctc gggcttctct tgagcaccgc tcgtcgcggc ggggggaggg 5520

gatctaatgg cgttggagtt tgttcacatt tggtgggtgg agactagtca ggccagcctg 5580

gcgctggaag tcattcttgg aatttgcccc tttgagtttg gagcgaggct aattctcaag 5640

cctcttagcg gttcaaaggt attttctaaa cccgtttcca ggtgttgtga aagccaccgc 5700

taattcaaag caatccggaa tgttgccatc acaactcatt gggtttctgc tgctctgggt 5760

tccagctagc cgcggtgaat tcgtttaaac gtacggtggc ggcgccatct gtcttcatct 5820

tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata 5880

acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta 5940

actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca 6000

ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc 6060

atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tagggatccc 6120

gtacgcctag gagcaggttt ccccaatgac acaaaacgtg caacttgaaa ctccgcctgg 6180

tctttccagg tctagagggg taacactttg tactgcgttt ggctccacgc tcgatccact 6240

ggcgagtgtt agtaacagca ctgttgcttc gtagcggagc atgacggccg tgggaactcc 6300

tccttggtaa caaggaccca cggggccaaa agccacgccc acacgggccc gtcatgtgtg 6360

caaccccagc acggcgactt tactgcgaaa cccactttaa agtgacattg aaactggtac 6420

ccacacactg gtgacaggct aaggatgccc ttcaggtacc ccgaggtaac acgcgacact 6480

cgggatctga gaaggggact ggggcttcta taaaagcgct cggtttaaaa agcttctatg 6540

cctgaatagg tgaccggagg tcggcacctt tcctttgcaa ttactgaccc tatgaataca 6600

ctgactgttt gacaattaat catcggcata gtatatcggc atagtataat acgactcact 6660

ataggagggc caccatgaag aaacctgaac tgacagcaac ttctgttgag aagtttctca 6720

ttgaaaaatt tgattctgtt tctgatctca tgcagctgtc tgaaggtgaa gaaagcagag 6780

ccttttcttt tgatgttgga ggaagaggtt atgttctgag ggtcaattct tgtgctgatg 6840

gtttttacaa agacagatat gtttacagac actttgcctc tgctgctctg ccaattccag 6900

aagttctgga cattggagaa ttttctgaat ctctcaccta ctgcatcagc agaagagcac 6960

aaggagtcac tctccaggat ctccctgaaa ctgagctgcc agctgttctg caacctgttg 7020

ctgaagcaat ggatgccatt gcagcagctg atctgagcca aacctctgga tttggtcctt 7080

ttggtcccca aggcattggt cagtacacca cttggaggga tttcatttgt gccattgctg 7140

atcctcatgt ctatcactgg cagactgtga tggatgacac agtttctgct tctgttgctc 7200

aggcactgga tgaactcatg ctgtgggcag aagattgtcc tgaagtcaga cacctggtcc 7260

atgctgattt tggaagcaac aatgttctga cagacaatgg cagaatcact gcagtcattg 7320

actggtctga agccatgttt ggagattctc aatatgaggt tgccaacatt tttttttgga 7380

gaccttggct ggcttgcatg gaacaacaaa caagatattt tgaaagaaga cacccagaac 7440

tggctggttc ccccagactg agagcctaca tgctcagaat tggcctggac caactgtatc 7500

aatctctggt tgatggaaac tttgatgatg ctgcttgggc acaaggaaga tgtgatgcca 7560

ttgtgaggtc tggtgctgga actgttggaa gaactcaaat tgcaagaagg tctgctgctg 7620

tttggactga tggatgtgtt gaagttctgg ctgactctgg aaacaggaga ccctccacaa 7680

gacccagagc caaggaatga atattagcta gattatccct aatacctgcc accccactct 7740

taatcagtgg tggaagaacg gtctcagaac tgtttgtttc aattggccat ttaagtttag 7800

tagtaaaaga ctggttaatg ataacaatgc atcgtaaaac cttcagaagg aaaggagaat 7860

gttttgtgga ccactttggt tttctttttt gcgtgtggca gttttaagtt attagttttt 7920

aaaatcagta ctttttaatg gaaacaactt gaccaaaaat ttgtcacaga attttgagac 7980

ccattaaaaa agttaaatga gaaacctgtg tgttcctttg gtcaacaccg agacatttag 8040

gtgaaagaca tctaattctg gttttacgaa tctggaaact tcttgaaaat gtaattcttg 8100

agttaacact tctgggtgga gaatagggtt gttttccccc cacataattg gaaggggaag 8160

gaatatcatt taaagctatg ggagggttgc tttgattaca acactggaga gaaatgcagc 8220

atgttgctga ttgcctgtca ctaaaacagg ccaaaaactg agtccttggg ttgcatagaa 8280

agctg 8285

<210> 8

<211> 7930

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

cctgcagggc ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga 60

aagaaccagc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca 120

ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca 180

ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc 240

ccactagtgg agccgagagt aattcataca aaaggaggga tcgccttcgc aaggggagag 300

cccagggacc gtccctaaat tctcacagac ccaaatccct gtagccgccc cacgacagcg 360

cgaggagcat gcgctcaggg ctgagcgcgg ggagagcaga gcacacaagc tcatagaccc 420

tggtcgtggg ggggaggacc ggggagctgg cgcggggcaa actgggaaag cggtgtcgtg 480

tgctggctcc gccctcttcc cgagggtggg ggagaacggt atataagtgc ggcagtcgcc 540

ttggacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gtcagaacgc aggtgagggg cgggtgtggc 600

ttccgcgggc cgccgagctg gaggtcctgc tccgagcggg ccgggccccg ctgtcgtcgg 660

cggggattag ctgcgagcat tcccgcttcg agttgcgggc ggcgcgggag gcagagtgcg 720

aggcctagcg gcaaccccgt agcctcgcct cgtgtccggc ttgaggccta gcgtggtgtc 780

cgcgccgccg ccgcgtgcta ctccggccgc actctggtct tttttttttt tgttgttgtt 840

gccctgctgc cttcgattgc cgttcagcaa taggggctaa caaagggagg gtgcggggct 900

tgctcgcccg gagcccggag aggtcatggt tggggaggaa tggagggaca ggagtggcgg 960

ctggggcccg cccgccttcg gagcacatgt ccgacgccac ctggatgggg cgaggcctgg 1020

ggtttttccc gaagcaacca ggctggggtt agcgtgccga ggccatgtgg ccccagcacc 1080

cggcacgatc tggcttggcg gcgccgcgtt gccctgcctc cctaactagg gtgaggccat 1140

cccgtccggc accagttgcg tgcgtggaaa gatggccgct cccgggccct gttgcaagga 1200

gctcaaaatg gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg 1260

aagagggcct ggtccctcac cggctgctgc ttcctgtgac cccgtggtcc tatcggccgc 1320

aatagtcacc tcgggctttt gagcacggct agtcgcggcg gggggagggg atgtaatggc 1380

gttggagttt gttcacattt ggtgggtgga gactagtcag gccagcctgg cgctggaagt 1440

catttttgga atttgtcccc ttgagttttg agcggagcta attctcgggc ttcttagcgg 1500

ttcaaaggta tcttttaaac ccttttttag gtgttgtgaa aaccaccgct aattcaaagc 1560

aaccggtatg gactggacct ggaggatcct cttcttggtg gcagcagcca caggagccca 1620

ctccctcgag tgcgcacccg ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc 1680

ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc 1740

cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc 1800

ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag 1860

cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt 1920

ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc 1980

acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct 2040

catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc 2100

tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc 2160

gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca 2220

ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc 2280

catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct 2340

gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg 2400

cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta 2460

caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac 2520

cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc 2580

tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gatgtacagc 2640

tagctggcca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 2700

gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 2760

aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 2820

ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta tggaaatgtt 2880

aattaactag ccatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 2940

cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 3000

ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 3060

actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 3120

gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 3180

ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 3240

gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 3300

acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 3360

tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 3420

gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 3480

cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 3540

cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 3600

ccttttgctc acatgttctt aattaacctg caggcgttac ataacttacg gtaaatggcc 3660

cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca 3720

tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg 3780

cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg 3840

acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt 3900

ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatgat gatgcggttt tggcagtaca 3960

tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg 4020

tcaatgggag tttgttttga ctagtggagc cgagagtaat tcatacaaaa ggagggatcg 4080

ccttcgcaag gggagagccc agggaccgtc cctaaattct cacagaccca aatccctgta 4140

gccgccccac gacagcgcga ggagcatgcg cccagggctg agcgcgggta gatcagagca 4200

cacaagctca cagtccccgg cggtgggggg aggggcgcgc tgagcggggg ccagggagct 4260

ggcgcggggc aaactgggaa agtggtgtcg tgtgctggct ccgccctctt cccgagggtg 4320

ggggagaacg gtatataagt gcggtagtcg ccttggacgt tctttttcgc aacgggtttg 4380

ccgtcagaac gcaggtgagt ggcgggtgtg gcttccgcgg gccccggagc tggagccctg 4440

ctctgagcgg gccgggctga tatgcgagtg tcgtccgcag ggtttagctg tgagcattcc 4500

cacttcgagt ggcgggcggt gcgggggtga gagtgcgagg cctagcggca accccgtagc 4560

ctcgcctcgt gtccggcttg aggcctagcg tggtgtccgc cgccgcgtgc cactccggcc 4620

gcactatgcg ttttttgtcc ttgctgccct cgattgcctt ccagcagcat gggctaacaa 4680

agggagggtg tggggctcac tcttaaggag cccatgaagc ttacgttgga taggaatgga 4740

agggcaggag gggcgactgg ggcccgcccg ccttcggagc acatgtccga cgccacctgg 4800

atggggcgag gcctgtggct ttccgaagca atcgggcgtg agtttagcct acctgggcca 4860

tgtggcccta gcactgggca cggtctggcc tggcggtgcc gcgttccctt gcctcccaac 4920

aagggtgagg ccgtcccgcc cggcaccagt tgcttgcgcg gaaagatggc cgctcccggg 4980

gccctgttgc aaggagctca aaatggagga cgcggcagcc cggtggagcg ggcgggtgag 5040

tcacccacac aaaggaagag ggccttgccc ctcgccggcc gctgcttcct gtgaccccgt 5100

ggtctatcgg ccgcatagtc acctcgggct tctcttgagc accgctcgtc gcggcggggg 5160

gaggggatct aatggcgttg gagtttgttc acatttggtg ggtggagact agtcaggcca 5220

gcctggcgct ggaagtcatt cttggaattt gcccctttga gtttggagcg aggctaattc 5280

tcaagcctct tagcggttca aaggtatttt ctaaacccgt ttccaggtgt tgtgaaagcc 5340

accgctaatt caaagcaatc cggaatgttg ccatcacaac tcattgggtt tctgctgctc 5400

tgggttccag ctagccgcgg tgaattcgtt taaacgtacg gtggcggcgc catctgtctt 5460

catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct 5520

gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc 5580

gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag 5640

cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt 5700

cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttaggg 5760

atcccgtacg cctaggagca ggtttcccca atgacacaaa acgtgcaact tgaaactccg 5820

cctggtcttt ccaggtctag aggggtaaca ctttgtactg cgtttggctc cacgctcgat 5880

ccactggcga gtgttagtaa cagcactgtt gcttcgtagc ggagcatgac ggccgtggga 5940

actcctcctt ggtaacaagg acccacgggg ccaaaagcca cgcccacacg ggcccgtcat 6000

gtgtgcaacc ccagcacggc gactttactg cgaaacccac tttaaagtga cattgaaact 6060

ggtacccaca cactggtgac aggctaagga tgcccttcag gtaccccgag gtaacacgcg 6120

acactcggga tctgagaagg ggactggggc ttctataaaa gcgctcggtt taaaaagctt 6180

ctatgcctga ataggtgacc ggaggtcggc acctttcctt tgcaattact gaccctatga 6240

atacactgac tgtttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac 6300

tcactatagg agggccacca tgaagaaacc tgaactgaca gcaacttctg ttgagaagtt 6360

tctcattgaa aaatttgatt ctgtttctga tctcatgcag ctgtctgaag gtgaagaaag 6420

cagagccttt tcttttgatg ttggaggaag aggttatgtt ctgagggtca attcttgtgc 6480

tgatggtttt tacaaagaca gatatgttta cagacacttt gcctctgctg ctctgccaat 6540

tccagaagtt ctggacattg gagaattttc tgaatctctc acctactgca tcagcagaag 6600

agcacaagga gtcactctcc aggatctccc tgaaactgag ctgccagctg ttctgcaacc 6660

tgttgctgaa gcaatggatg ccattgcagc agctgatctg agccaaacct ctggatttgg 6720

tccttttggt ccccaaggca ttggtcagta caccacttgg agggatttca tttgtgccat 6780

tgctgatcct catgtctatc actggcagac tgtgatggat gacacagttt ctgcttctgt 6840

tgctcaggca ctggatgaac tcatgctgtg ggcagaagat tgtcctgaag tcagacacct 6900

ggtccatgct gattttggaa gcaacaatgt tctgacagac aatggcagaa tcactgcagt 6960

cattgactgg tctgaagcca tgtttggaga ttctcaatat gaggttgcca acattttttt 7020

ttggagacct tggctggctt gcatggaaca acaaacaaga tattttgaaa gaagacaccc 7080

agaactggct ggttccccca gactgagagc ctacatgctc agaattggcc tggaccaact 7140

gtatcaatct ctggttgatg gaaactttga tgatgctgct tgggcacaag gaagatgtga 7200

tgccattgtg aggtctggtg ctggaactgt tggaagaact caaattgcaa gaaggtctgc 7260

tgctgtttgg actgatggat gtgttgaagt tctggctgac tctggaaaca ggagaccctc 7320

cacaagaccc agagccaagg aatgaatatt agctagatta tccctaatac ctgccacccc 7380

actcttaatc agtggtggaa gaacggtctc agaactgttt gtttcaattg gccatttaag 7440

tttagtagta aaagactggt taatgataac aatgcatcgt aaaaccttca gaaggaaagg 7500

agaatgtttt gtggaccact ttggttttct tttttgcgtg tggcagtttt aagttattag 7560

tttttaaaat cagtactttt taatggaaac aacttgacca aaaatttgtc acagaatttt 7620

gagacccatt aaaaaagtta aatgagaaac ctgtgtgttc ctttggtcaa caccgagaca 7680

tttaggtgaa agacatctaa ttctggtttt acgaatctgg aaacttcttg aaaatgtaat 7740

tcttgagtta acacttctgg gtggagaata gggttgtttt ccccccacat aattggaagg 7800

ggaaggaata tcatttaaag ctatgggagg gttgctttga ttacaacact ggagagaaat 7860

gcagcatgtt gctgattgcc tgtcactaaa acaggccaaa aactgagtcc ttgggttgca 7920

tagaaagctg 7930

Claims

1.抗EV71、CA16、CA10和CA6广谱中和抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），免疫原的制备：以纯化的EV71和CA16病毒为免疫原；

步骤（2），动物免疫：取6～8周龄Balb/c小鼠，以2周间隔进行四次免疫，程序为：首次免疫，弗氏完全佐剂与等量免疫原充分混合乳化后，背部皮下多点注射；第二次免疫和第三次免疫，佐剂换为弗氏不完全佐剂，方法和计量同首次免疫；第四次采用腹腔注射未加佐剂的免疫原，注射量同首次免疫；3天后，取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞；

步骤（3），杂交瘤细胞株的制备和筛选：将处于对数生长期的SP2/0细胞与步骤（2）免疫小鼠脾脏细胞通过PEG4000的作用下进行细胞融合，利用1×HAT选择性培养基培养融合后的杂交瘤细胞，细胞融合后10-14天，通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清以筛选能特异性分泌抗EV71、CA16、CA10和CA6广谱中和抗体的杂交瘤细胞株。

2.根据权利要求1所述的抗EV71、CA16、CA10和CA6广谱中和抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，首次免疫注射量为50ul 10⁷TCID50/ml EV71和 50ul10⁷TCID50/ml CA16；

步骤（3）中，将处于对数生长期的SP2/0细胞与步骤（2）免疫小鼠脾脏细胞通过PEG4000的作用下进行细胞融合，利用1×HAT选择性培养基培养融合后的杂交瘤细胞，具体方法为：

选择6～8周龄Balb/c小鼠，取其腹腔巨噬细胞制备饲养层细胞；取处于对数生长期的SP2/0细胞与步骤（2）免疫小鼠脾脏细胞按照1∶10的细胞数量比例进行混和，采用聚乙二醇4000进行细胞融合，细胞融合后获得的杂交瘤细胞加入已含有饲养层细胞的培养板中，使用含有1×HAT选择性培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养；

还包括杂交瘤细胞的克隆化，具体是：通过有限稀释法对杂交瘤细胞株进行亚克隆培养，连续培养多次，直至克隆孔内抗体检测100％阳性为止，扩大培养并冻存。

3.广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体的制备方法，其特征在于，采用权利要求1~2任意一项所述的抗EV71、CA16、CA10和CA6广谱中和抗体杂交瘤细胞株的制备方法制得的抗EV71、CA16、CA10和CA6广谱中和抗体杂交瘤细胞株；包括如下步骤：

提取抗EV71、CA16、CA10和CA6广谱中和抗体杂交瘤细胞株的RNA，逆转录获取cDNA；然后巢式PCR扩增抗体重链可变区，同时巢式PCR扩增抗体轻链可变区；之后采用PVITRO1-hygro-mcs-IgM/κ连接载体对抗体20-IgM可变区进行连接，获取IgM型抗体；同时，采用PVITRO1-hygro-mcsIgG/κ连接载体对抗体20-IgM可变区进行连接，获取IgG型抗体；接着将连接得到的阳性单克隆抗体转染至CHO-S细胞，后纯化，即得广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体和IgG型单克隆抗体；所述的PVITRO1-hygro-mcs-IgM/κ连接载体的DNA序列如SEQ ID NO.7所示；所述的PVITRO1-hygro-mcsIgG/κ连接载体的DNA序列如SEQ ID NO.8所示。

4.采用权利要求3所述的广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体的制备方法制备得到的抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合广谱中和IgM型单克隆抗体以及其IgG型单克隆抗体。

5.一种广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，其所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

6.一种如权利要求5所述的广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体的编码DNA，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

7.一种表达载体，其特征在于，包含重链恒定区DNA序列和轻链恒定区DNA序列，用于表达如权利要求5所述的广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体；

所述重链恒定区的编码DNA序列如SEQ ID NO.5所示；

所述轻链恒定区的编码DNA序列如SEQ ID NO.6所示。

8.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求7所述的表达载体。

9.药物组合物，其特征在于，包括如权利要求4或5所述的广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体和药学上可接受的载体。

10.权利要求4或5所述的广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体在制备治疗或预防EV71、CA16、CA10和CA6感染引起的手足口病的药物中的应用。