JP2017505311A - エキセメスタン及びエベロリムスと組み合わせてインスリン様成長因子（ｉｇｆ）受容体アンタゴニストを用いる癌治療 - Google Patents

エキセメスタン及びエベロリムスと組み合わせてインスリン様成長因子（ｉｇｆ）受容体アンタゴニストを用いる癌治療 Download PDF

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Abstract

本開示は、乳癌患者の治療でエキセメスタン及びエベロリムスと組み合わせて使用される、インスリン様成長因子（IGF）受容体アンタゴニストに関係する。

Description

本発明は癌の治療に関し、特に、本発明は、乳癌患者におけるヒト抗IGF抗体とエキセメスタン及びエベロリムスとの有利な併用に関する。
乳癌は全世界でもっとも一般的な女性の悪性疾患である。2010年には全世界の女性で1,600,000件を超える新規乳癌症例が発生したと概算される（Forouzanfar M, Foreman K, Delossantos AM, Lozano R, Lopez AD, Murray CJL, et al. Lancet 378, 1461-1484, 2011）。早期発見及び早期治療の改善を反映して1990年以来着実に死亡率が減少しているとはいえ、これまでのところ乳癌は女性の癌関連死の第二の主要原因である。この高死亡率は、特に疾患が進行した患者では従来の治療選択肢の有効性が限定的であることを反映している。
原発性乳癌の約75%がホルモン受容体について陽性である（HR+）。これらの癌はエストロゲン受容体（ER）及び/又はプロゲストン受容体（PgR）を発現する。内分泌受容体指向療法は重要な治療選択肢である。閉経後HR+乳癌については、アロマターゼ阻害剤（AI）、例えばレトロゾール及びアナストロゾールが管理のために推奨される第一選択治療である。残念ながら、全ての患者が第一選択肢の内分泌療法に応答するわけではなく（根原的耐性又は新規（de novo）耐性）、さらに応答を示す患者でさえも最終的には再発するであろう（後天耐性）。疾患が進行したとき、第二治療選択肢は、他のクラスのアロマターゼ阻害剤（ステロイド系又は非ステロイド系）及びエストロゲン受容体（ER）アンタゴニストのフルベストラント及びタモキシフェンを含む（Villarreal-Garza C, Cortes J, Andre F, Verma S. Ann Oncol 23 (10), 2526-2535, 2012）。
内分泌療法に対する新規及び後天耐性は、HR+乳癌の管理における主要な難問である。哺乳動物照準ラパマイシン（mTOR）経路は、内分泌療法に対する耐性で重要な役割を演じることが示された。最近発表された2つの報告が、内分泌療法と併用された新規なmTOR阻害剤エベロリムスは有益であることを示した。ホルモン不応性、ホルモン受容体陽性、HER2陰性転移性乳癌患者で、タモキシフェン＋エベロリムスは、タモキシフェン単独と比較して臨床的利益を増加させ、進行時間の改善（PFSは8.6カ月対4.5カ月）及び全生存の改善をもたらした（併用療法が関与する死亡リスクで55%減少、HR、0.45；95% CI、0.24から0.81；実地調査P＝007）（Bachelot T, Bourgier C, Cropet C, Ray-Coquard I, Ferrero JM, Freyer G, et al. J Clin Oncol 30 (22), 2718 - 2724, 2012）。同様な患者集団で、経口エベロリムス2のフェースIII乳癌臨床試験（BOLERO-2）（Baselga J, Campone M, Piccart M, Burris HA, Rugo HS, Sahmoud T et al. N Engl J Med 2012; 366(6): 520-529）は、エベロリムス＋エキセメスタンによる治療は、現場の研究者の判定によればエキセメスタン単独で治療した患者の3.2カ月と比較して無進行生存の中央値が2倍より大きい7.8カ月であることを示した（ハザード比、0.45；95%信頼区間、0.38−0.54：片側ログランクP＜0.001）。全応答率もまたエキセメスタン単独と比較して改善された（12.6%対1.7%）。この試験の結果に基づいて、mTORクラスの第一の薬剤として、エベロリムスは、レトロゾール又はアナストロゾールによる治療の失敗後にエキセメスタンを併用する、進行性のホルモン受容体陽性でHER2陰性の乳癌（進行性HR+BC）を有する閉経後女性の治療のために規制庁によって承認された。
インスリン様成長因子-1（IGF-1；70アミノ酸ポリペプチド）及びインスリン様成長因子-2（IGF-2；67アミノ酸ポリペプチド）は、多くの哺乳動物細胞の増殖を強力に刺激することができる、血清に存在する7.5kDの可溶性因子である（以下で概括されている：Pollack et al., Nature Rev. Can. 4: 505-518, 2004）。血流に分泌されるとき、IGFはIGFBPと複合体を形成する（IGFBPはそれらが標的組織に向かう途上、タンパク分解からIGFを保護し、さらにIGFがIGF受容体と結合するのを防ぐ）。IGFはまた自己分泌態様又は傍分泌態様で標的組織それ自体で分泌されることが知られている。これは、正常な胎児発生時に生じることが知られており、当該発生時にIGFは組織、骨及び器官の成長に決定的な役割を果たす。さらにまたIGFは多くの腫瘍細胞で見られ、そこでは腫瘍細胞と間質細胞との間で傍分泌シグナル伝達が存在するか又は腫瘍細胞それ自体による自己分泌IGF産生が存在すると考えられている（以下で概括されている：LeRoith D, Experimental Diab. Res. 4: 205-212, 2003）。
IGF-1及びIGF-2は、類似する親和性で、多くの正常組織で発現されるIGF-1受容体（IGF-1R）（二量体化したアルファサブユニット及びベータサブユニットから成る460kDのヘテロ四量体である）と結合することできる（Rubin et al., Lab. Invest. 73: 311-31, 1995）。IGF-2はまたIGF-2受容体と結合できる（IGF-2受容体はIGF-2とIGF-1Rとの結合及び前記を介するシグナル伝達を防止すると考えられている）。これに関して、IGF-2Rは腫瘍抑制タンパク質であることが示されている。IGF-1Rは構造的にインスリン受容体と類似する。インスリン受容体は2つの形態、IR-A及びIR-Bで存在し、それらはIR-Aの細胞外ドメインのまた別の12アミノ酸スプライスによるエクソン欠失によって相違する。IR-Bはほとんどの正常な成人組織で発現される優勢なIRアイソフォームであり、それら組織においてIR-Bは代謝におけるインスリンの作用を媒介するために働く。他方、IR-Aは発育中の胎児組織で高度に発現されるが成人の正常組織ではそうではないことが知られている。最近の研究はまた、IR-BではなくIR-Aはいくつかの癌で発現されることを示している。IR-Aのエクソン欠失はインスリン結合に影響しないが、IR-Bに対するよりもはるかに高い親和性でIGF-2を結合させる小さな立体構造変化を確かにもたらす（Frasca et al., Mol. Cell. Biol. 19: 3278-88, 1999；Pandini et al., J. Biol. Chem. 277: 39684-95, 2002）。このように、癌組織でIR-Aが発現しておりIGF-2結合傾向が増加しているので、IR-AはIGF-2の癌における有糸***作用の媒介でIGF-1Rと同じように重要でありうる。
IGFとIGF-1Rとの結合は複雑な細胞内シグナル伝達カスケードを始動させ、前記カスケードは増殖及び生存を刺激するタンパク質の活性化をもたらす（以下で概括されている：Pollack et al., Nature Rev. Can. 4: 505-518, 2004）。
異なる多くの癌タイプの発生、進行、及び転移におけるIGFの役割を示唆する大量の学術的、疫学的及び医療文献が存在する（以下で概括されている：Jerome et al., End. Rel. Cancer 10: 561-578, 2003；及びPollack et al., Nature Rev. Can. 4: 505-518, 2004）。
前臨床データ及び臨床データは、IGF系の異常調節は乳癌発症に起因し、さらにまた多様な乳癌病期に影響を与えることを示している。IGF-1Rの過剰発現は乳癌細胞株及び新しい腫瘍生検に共通し（Cullen KJ, Yee D, Sly WS, Perdue J, Hampton B, Lippman ME, Rosen N Cancer Res 50 (1), 48-53, 1990；Yang Y, Yee D. J Mammary Gland Biol Neoplasia 17 (3/4), 251-261, 2012；Peyrat JP, Bonneterre J, Beuscart R, Dijane J, Demaille A. Cancer Res 48 (22), 6429-6433, 1988）、さらにマイクロアレイシグナチャーで捕捉されるIGF活性は臨床所産の乏しさと密接に関係している（Zardavas, D, Basalga J and Piccart M. Nat Rev Clin Oncol. 2013 Apr;10(4):191-210）。エストロゲン及びIGFシグナル伝達経路の双方向性混信は、内分泌耐性を媒介するIGFシグナル伝達の活性化（Wiseman LR, Johnson MD, Wakeling AE, Lykkesfeldt AE, May FEB, Westley BR. Eur J Cancer (A) 29 (16), 2256-2264, 1993）とともに良く記述されている（Clarke RB, Howell A, Anderson E. Br J Cancer 75 (2), 251-257, 1997；Hamelers IHL, Schaik RFMA van, Teeffelen HAAM van, Sussenbach JS, Steenbergh PH. Exp Cell Res 273, 107-117）。ホルモン療法に耐性を示すER+乳癌では、InsR-Aアイソフォームが優勢なインスリン受容体であり、IGF-2シグナル伝達に対する重要な役割を示唆している（Bachelot T, Bourgier C, Cropet C, Ray-Coquard I, Ferrero JM, Freyer G, et al. J Clin Oncol 30 (22), 2718-2724, 2012）。したがって、IGFシグナル伝達ネットワークは進行性乳癌の有望な標的である。
これまでのところ、IGF経路を阻害する以下を含む3つの異なる戦略がある：抗受容体モノクローナル抗体（ガニツマブ、シクスツムマブ及びダロツズマブ）、チロシンキナーゼ阻害剤（TKI、二重IGF-1R及びInsRチロシンキナーゼ阻害剤BMS-754807、KW2450及びリンスチニブが含まれる）、及び抗IGFリガンド抗体（ヅシギツマブ（MEDI-573（Astra Zeneca/MedImmune）））。これらの薬剤は、単剤療法として又は細胞毒性薬剤及び/又は他の分子標的薬剤と併用して診療所で現在試験中である。
IGF-1及びIGF-2の双方に対する中和抗体の主要な利点は、リガンド隔離がIGF-1又はIGF-2による受容体活性化を発生させないことを担保し、さらにIGF-2によるInsR-Aの活性化の可能性を排除するという点である。したがって、前記は、多様な癌で治療潜在力を示す均衡のとれたアプローチを提供し、モノクローナル抗体（mAb）を用いてIGF-1Rへ標的誘導する場合の陥穽が少ない。
mTOR阻害剤療法に対する耐性をもたらす潜在的メカニズムはAKTリン酸化の誘発であり、前記は前臨床試験及び臨床試験の両方でしばしば観察される（Sun SY, Rosenberg LM, Wang X, Zhou Z, Yue P, Fu H, et al. Cancer Res. 2005 Aug 15;65(16):7052-8；Tabernero J, Rojo F, Calvo E, Burris H, Judson I, Hazell K, et al. J Clin Oncol 2008; 26(10):1603-1610；Wan X, Harkavy B, Shen N, Grohar P, Helman LJ. Oncogene 26, 1932-1940, 2007；O'Reilly KE, Rojo F, She QB, Solit D, Mills GB, Smith D, et al. Cancer Res 66 (3), 1500-1508, 2006）。さらにまた、AKT活性のアップレギュレーションは、インスリン様成長因子(IGF)/インスリン様成長因子1型受容体(IGF-1R)シグナル伝達に依存する。これまでに腫瘍で示されたことであるが、ラパローグによるmTORの阻害は、成長因子受容体（インスリン様成長因子-1受容体/インスリン受容体基質(IRS)-1複合体を含む）で負のフィードバックを解除し、IGF-1Rシグナル伝達の活性化及び最終的にAKTのリン酸化をもたらし、前記はmTOR阻害剤の抗腫瘍作用に順次潜在的に対抗することができよう。該活性化は、IGFシグナル伝達が同時に遮断される場合に予防できる（Higgins MJ, Baselga J. J Clin Invest 121 (10), 3797-3803, 2011）。
この背景状況に対して、本発明者らはヒト抗IGF抗体とエキセメスタン及びエベロリムスとを併用することを決定した。驚くべきことに、当該発明者らは、ヒト抗IGF抗体とエキセメスタン及びエベロリムスとの三重併用は、エキセメスタンとエベロリムスとの二重併用よりも乳癌細胞株の増殖への影響で明瞭な利点があることを見出した。本発明まで、乳癌患者の治療でヒト抗IGF抗体とエキセメスタン及びエベロリムスとを併用することは開示されたことも意図されたこともない。
本出願は、乳癌患者におけるヒト抗IGF抗体とエキセメスタン及びエベロリムスとの有利な併用に関する。
ある特徴では、本発明は、乳癌患者の治療でエキセメスタン及びエベロリムスと組み合わせて使用されるインスリン様成長因子(IGF)受容体アンタゴニストに関係する。
別の特徴では、本発明は乳癌を治療する方法に関し、前記方法は、治療的に有効な量のIGF受容体アンタゴニストをその必要がある患者に投与する工程、並びに治療的に有効な量のエキセメスタン及びエベロリムスを同一患者に追加投与する工程を含む。
好ましくは、乳癌は局所進行性の又は転移性の乳癌である。
エベロリムス及びエキセメスタンの二重併用に対する、IGF Ab 60833、エベロリムス及びエキセメスタンの三重併用の効果。図は、IGF Ab 60833、エベロリムス及びエキセメスタンの三重併用（下パネル）に対するエベロリムス及びエキセメスタンの二重併用（上パネル）の比較を示す。図１A：二重併用-エベロリムス＋エキセメスタン“キャンペーン：mAb濃度によって区分けされる三重併用”、AlamarBlue細胞株のN=3平均（Bliss CCIm）（144h、細胞{29164/5000/}）、図1B：三重併用-エベロリムス＋エキセメスタン、＋60833（10nM）“キャンペーン：mAb濃度によって区分けされる三重併用”、AlamarBlue細胞株のN=3平均（Bliss CCIm）（144h、細胞{29164/5000/}）。 MCF7aro細胞のin vitro増殖に対する単独又は併用エベロリムス及びエキセメスタンの効果。3つの別個の実験（A、B、C）で、MCF7aro細胞を種々の濃度のエベロリムス及びエキセメスタンで単剤として及び併用により処理した。6日間のインキュベーション後に、MCF7aro細胞増殖に対する阻害効果を、AlamarBlue(商標)細胞生存性アッセイを用いて定量した。（D）に示すデータは3つの別個の実験の平均値を表す。 10nMのIGF Ab 60833と併用したエベロリムス及びエキセメスタン（単独又は併用）のMCF7aro細胞のin vitro増殖に対する効果。3つの別個の実験（A、B、C）で、10nMのIGF Ab 60833と併用して種々の濃度のエベロリムス及びエキセメスタン（単独又は併用）でMCF7aro細胞を処理した。6日間のインキュベーション後に、MCF7aro細胞増殖に対する阻害効果を、AlamarBlue(商標)細胞生存性アッセイを用いて定量した。（D）に示すデータは3つの別個の実験の平均値を表す。 in vitroのMCF7aro細胞のAKT及びS6リン酸化状態に対するIGF Ab 60833及びエベロリムス（単独又は併用）の効果。100nMのIGF Ab 60833及び0.32nMのエベロリムスで単剤として又は併用によりMCF7aro細胞を24時間処理した。ビヒクル（DMSO）処理及び阻害剤処理細胞から調製した細胞溶解物をウェスタンブロットで分析した。 in vitroのMCF7aro細胞のアポトーシス誘発に対するIGF Ab 60833、エキセメスタン及びエベロリムス（単独又は併用）の効果。1μMのIGF Ab 60833、1μMのエキセメスタン及び1μMのエベロリムスで単剤として又は併用によりMCF7aro細胞を72時間処理した。ビヒクル（DMSO）処理及び阻害剤処理細胞から調製した細胞溶解物をウェスタンブロット及びPARP切断誘発のMSDアポトーシスパネルによって分析した。
本発明は、乳癌、特に進行性エストロゲン受容体陽性乳癌における、インスリン様成長因子（IGF）受容体アンタゴニストとエキセメスタン（アロマシン(商標)（Aromasin(商標)））及びラパローグ（第一世代mTOR阻害剤）エベロリムス（アフィニター(商標)（Afinitor(商標)））との併用に関する。哺乳動物照準ラパマイシン(mTOR)阻害剤は、1型インスリン様成長因子受容体（IGF-1R）依存メカニズムを介してAKT活性化を媒介する。インスリン様成長因子（IGF）受容体アンタゴニストとの併用は、フィードバックループに照準をあてることによりmTOR阻害に対する耐性を調節して、mTORを標的とする抗癌活性を強化すると考えられる。
ある特徴では、本発明は、乳癌患者の治療でエキセメスタン及びエベロリムスと組み合わせて使用するためのインスリン様成長因子（IGF）受容体アンタゴニストに関係する。
好ましくは、乳癌は局所進行性である。
好ましくは、乳癌は転移性乳癌である。
患者が局所進行性又は転移性乳癌を有するか否かを識別する方法は当業界で周知であり、熟練者は容易にこれを用いることができる。別の実施態様では、局所進行性又は転移性乳癌はホルモン受容体（例えばエストロゲン受容体）を過剰発現する。
別の実施態様では、局所進行性又は転移性乳癌は、エストロゲン受容体（ER）及び/又はプロゲステロン受容体（PgR）について陽性である。好ましくは、局所進行性又は転移性乳癌はまたHER2について陰性である。さらにまた好ましくは、局所進行性又は転移性乳癌はまた、非ステロイド系アロマターゼ阻害剤（例えばレトロゾール及び/又はアナストロゾール）に不応性である。
患者がエストロゲン受容体（ER）及び/又はプロゲステロン受容体（PgR）陽性の乳癌を有するか否か、及び前記がホルモン受容体（例えばエストロゲン受容体）を過剰発現するか否かを識別する方法は当業界で周知である。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、根治的外科手術又は根治的放射線療法に馴染みにくい局所進行性又は転移性乳癌を有する。
別の実施態様では、治療されるべき患者は閉経後女性である。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、試験登録前に乳癌の全身療法の最後の選択肢の最中又はその後で、再発又は進行性症状の客観的証拠を示す。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、RECISTバージョン1.1にしたがい測定可能な病巣を有するか、又は上記に定義する測定可能な病巣が存在しないとき骨病巣のみ（溶解型又は混合型（溶解型＋硬化型））を有する。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、米国東海岸癌臨床試験グループのパフォーマンススコアが2以下である。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、調査委員の意見で6カ月以上の余命を有する。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、空腹時血中グルコースが8.9mmol/L未満（＜160mg/dL）及びHbA1cが8.0%未満である。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、IGF経路、ホスホイノチシド3-キナーゼ（PI3K）シグナル伝達経路、タンパク質キナーゼB（AKT）又は哺乳動物照準ラパマイシン（mTOR）経路を標的とする薬剤で治療されたことがない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、エキセメスタンで治療されたことがない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、モノクローナル抗体、mTOR阻害剤（例えばシロリムス）又はいずれかの試験薬の賦形剤に対して既知の過敏症がない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、卵巣放射線照射又は黄体形成ホルモン放出ホルモン（LH-RH）アゴニストを用いる治療による卵巣抑制がない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、弱毒生ワクチンによる免疫から治療まで1週間以上である。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、治療に入る前の4週間以内に放射線療法を受けていない（ただし鎮痛目的のため、又は骨折のリスクがある溶解性病巣のための局所放射線療法の事例で、試験治療前2週間以内に完了できるものを除く）
別の実施態様では、治療されるべき患者は、化学療法、生物学療法（ベバシズマブ以外）、免疫療法を受けたことがないか、研究薬剤（当該薬剤の5半減期以内又は治療開始前2週間以内のどちらか長い方）；ベバシズマブ治療（試験治療の開始前4週間以内）を受けていない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、治療開始前2週間以内に乳癌のホルモン治療を受けていない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、治療の開始前4週間以内に大きな外科手術を受けていないか、又は企画治療の行程中に手術の予定がない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、付随する免疫抑制剤、又は長期的コルチコステロイドの使用（局所適用、吸入スプレー、点眼若しくは局所注射、又は試験治療前の少なくとも2週間の安定な低用量の使用を除く）を受けていない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、B型肝炎慢性感染、C型肝炎慢性感染がないか、及び/又は既知のHIVキャリアではない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、470msを超えるQTcF延長化又は臨床的に関係があると思われるQT延長化を示さない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、急速に進行するか又は生命の危険がある疾患、例えば広範囲の症候性内臓疾患（肝臓の関与及び腫瘍の肺リンパ管性拡散を含む）を示さない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、脳又は他のCNS転移歴がない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、両側性びまん性リンパ管性癌腫症ではない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、グレード1を超える低カリウム血症ではない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、5年以内の別の原発性悪性疾患歴がない（ただし子宮頸癌、子宮体癌、基底細胞若しくは扁平上皮癌、又は非メラノーマ性皮膚癌であって発生場所で適切に処置されたものを除く）。
別の実施態様では、治療されるべき患者はQT延長症候群の家族歴がない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、患者の安全を脅かすか、又は当該医薬の安全性及び抗腫瘍活性を妨げるような随伴する重篤な疾患又は器官系の機能不全をもたない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、治療前2週間以内に、強い若しくは中等度のCYP3A4及び/又はPgP阻害剤及び/又は強力なCYP3A4誘発剤であると認識されている薬剤による処置中ではない。
別の実施態様では、治療されるべき患者は、局所進行性又は転移性乳癌のための3つ以上の化学療法選択肢を受けていない。
本発明の関係のIGFアンタゴニストは、直接又は間接的にIGF受容体シグナル伝達を妨害及び低下又は遮断させる化合物である。好ましくは、IGF受容体アンタゴニストは、IGFリガンドとその受容体との結合を低下若しくは遮断させるか、又はIGF受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物である。
さらに別の実施態様では、本発明のIGF受容体アンタゴニストは、IGFリガンドと結合し、したがってリガンドと受容体との結合を低下させるか又は妨げる抗体である。別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、IGF-1受容体と結合し、したがってリガンドと受容体との結合を低下させるか又は妨げる抗体である。受容体-リガンド結合を遮断することによって、該受容体のチロシンキナーゼ活性を介するリガンド誘発受容体シグナル伝達は低下するか又は妨げられる。そのような抗体は、一般的には中和抗体と称される。別の特徴では、本発明は、インスリン様成長因子、IGF-1及びIGF-2の増殖促進特性を中和するIGF受容体アンタゴニストに関係する。
“抗体”という用語は、抗体、抗体フラグメント、抗体様分子及び上記のいずれかとの複合物を包含する。抗体にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒトの抗体、単一特異性、二特異性若しくはマルチ特異性抗体が含まれるが、ただしこれらに限定さない。“抗体”という用語は、リンパ球によって生成され、例えば血清に存在する完全な免疫グロブリン、ハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体、宿主細胞での組換え発現によって産生されるポリペプチド（免疫グロブリン又はモノクローナル抗体の結合特異性を有する）、及びそのような免疫グロブリン、モノクローナル抗体若しくはポリペプチドから更なるプロセッシングによって誘導されるがそれらの結合特異性を保持する分子を包含するであろう。特に、“抗体”という用語は、2つの重鎖及び2つの軽鎖を含む完全な免疫グロブリンを含む。別の実施態様では、該用語は、免疫グロブリンのフラグメント、例えばFabフラグメントを包含する。別の実施態様では、“抗体”という用語は免疫グロブリンから誘導される1つ以上の可変ドメインを有するポリペプチド、例えば一本鎖抗体（scFv）、単一ドメイン抗体などを包含する。
さらに別の実施態様では、本発明のIGF受容体アンタゴニストは、IGF-1に対する抗体、IGF-2に対する抗体、IGF-1及びIGF-2の両方に結合する抗体、IGF-1受容体（IGF-1R）に対する抗体、又はIGF-1Rチロシンキナーゼ活性の阻害剤である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:1（HCDR1）、配列番号:2（HCDR2）及び配列番号:3（HCDR3）の重鎖相補性決定領域並びに配列番号:4（LCDR1）、配列番号:5（LCDR2）及び配列番号:6（LCDR3）の軽鎖決定領域を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:11（HCDR1）、配列番号:12（HCDR2）及び配列番号:13（HCDR3）の重鎖相補性決定領域並びに配列番号:14（LCDR1）、配列番号:15（LCDR2）及び配列番号:16（LCDR3）の軽鎖決定領域を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:21（HCDR1）、配列番号:22（HCDR2）及び配列番号:23（HCDR3）の重鎖相補性決定領域並びに配列番号:24（LCDR1）、配列番号:25（LCDR2）及び配列番号:26（LCDR3）の軽鎖決定領域を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:31（HCDR1）、配列番号:32（HCDR2）及び配列番号:33（HCDR3）の重鎖相補性決定領域並びに配列番号:34（LCDR1）、配列番号:35（LCDR2）及び配列番号:36（LCDR3）の軽鎖決定領域を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:7の重鎖可変領域及び配列番号:8の軽鎖可変領域を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:17の重鎖可変領域及び配列番号:18の軽鎖可変領域を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:27の重鎖可変領域及び配列番号:28の軽鎖可変領域を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:37の重鎖可変領域及び配列番号:38の軽鎖可変領域を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:41の重鎖可変領域及び配列番号:42の軽鎖可変領域を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:43の重鎖可変領域及び配列番号:44の軽鎖可変領域を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:9の重鎖及び配列番号:10の軽鎖を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:19の重鎖及び配列番号:20の軽鎖を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:29の重鎖及び配列番号:30の軽鎖を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:39の重鎖及び配列番号:配列番号:40の軽鎖を有するIGFリガンド抗体である。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、配列番号:45の重鎖及び配列番号:46の軽鎖を有するIGF受容体抗体である。
好ましくは、IGF受容体アンタゴニストは60833であり、前記は、配列番号:39の重鎖及び配列番号:40の軽鎖を有するIGFリガンドに対する抗体である。前記の製造はWO 2010/066868に開示されている。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストは、ヅシギツマブ、フィギツムマブ、ダロツズマブ、シキスツムマブ、ロバツムマブ又はガニツマブである。
別の実施態様では、IGF受容体アンタゴニストはリンシチニブである。
上述の抗体の製造及び治療的使用は当業界で開示され当業者には周知であり、個別の開示は以下で確認できる：WO2002/53596、WO2007/070432、WO2008/152422、WO2008/155387及びWO2010/066868。
ある実施態様では、抗体は哺乳動物宿主細胞での組換え発現によって生成され、一連のクロマトグラフィー工程及び非クロマトグラフィー工程によって精製され、さらに10mg/mLの抗体濃度での非経口（静脈内）輸液又は注射のために水性緩衝液組成物中で処方される。前記緩衝液は、例えば25mMクエン酸ナトリウム（pH6）、115mM NaCl及び0.02%ポリソルベート20を含む。静脈内輸液のために、医薬組成物は、生理学的溶液（例えば0.9%塩化ナトリウム又はG5溶液）で希釈することができる。
抗体は、1mg/kgから20mg/kgの用量で、1回以上の別々の投与によって、又は連続輸液（例えば1時間にわたる輸液）によって患者に投与できる。典型的な治療スケジュールは通常、1週間に1回から3週間に1回の抗体投与を含む。例えば、1週間の用量は5、10又は15mg/kgであり得る。
抗体はまた500から1000mg/週、場合によって750又は1000mg/週の用量で患者に投与できる。
IGF受容体アンタゴニストは、エキセメスタン及びエベロリムスの投与と組み合わせて患者に投与される。“組み合わせて（併用して）”とは、一定の時間枠内で同一患者に薬剤を投与して、作用態様の併用効果によって引き起こされる治療効果を達成することを意味する。ある特徴では、エキセメスタン及びエベロリムスはIGF受容体アンタゴニストと同じ日に投与される。本発明の別の特徴では、エキセメスタン及びエベロリムスは、IGF受容体アンタゴニストの投与前又は投与後1、2、3、4、5、6又は7日に投与される。
別の特徴では、3つの活性化合物の全てが同一医薬組成物中に存在する。したがって、別の実施態様では、本発明は、IGF受容体アンタゴニスト並びにエキセメスタン及びエベロリムスを医薬的に許容できる担体と一緒に含む医薬組成物に関係する。
エキセメスタンは、アロマターゼ阻害剤として知られる薬剤クラスのメンバーである。いくつかの乳癌は増殖にエストロゲンを必要とする。そのような癌はエストロゲン受容体（ER）を有し、ER陽性と称される。それらはまた、エストロゲン応答性、ホルモン応答性、又はホルモン受容体陽性と称することができる。アロマターゼはエストロゲンを合成する酵素である。アロマターゼ阻害剤はエストロゲンの合成を阻害する。これはエストロゲンレベルを低下させ、癌の増殖を遅らせる。
エキセメスタンの構造は下記に提供される：
体系的名称は6-メチリデンアンドロスタ-1,4-ジエン-3,17-ジオンである。
エキセメスタンは、商品名アロマシンとして市場で入手できる。エキセメスタンの製造、処方及び使用は最新技術で見出すことができる。
好ましくは、エキセメスタンは、経口的に25mg/日の投薬量で患者に供給されるであろう。
エベロリムスは哺乳動物照準ラパマイシン（mTOR）の阻害剤である。
エベロリムスの構造は下記に提供される：
体系的名称は、ジヒドロキシ-12-[(2R)-1-[(1S,3R,4R)-4-(2-ヒドロキシエトキシ)-3-メトキシシクロヘキシル]プロパン-2-イル]-19,30-ジメトキシ-15,17,21,23,29,35-ヘキサメチル-11,36-ジオキサ-4-アザトリシクロ[30.3.1.0ヘキサトリアコンタ-16,24,26,28-テトラエン-2,3,10,14,20-ペントンである。
エベロリムスは商品名アフィニターとして市場で入手できる。エキセメスタンの製造、処方及び使用は最新技術で見出すことができる。
好ましくは、エベロリムスは、経口的に5mg/日から10mg/日、場合によって7.5mg/日の投薬量で患者に供給されるであろう。
別の実施態様では、本発明は乳癌を治療する方法に関係し、前記方法は、治療的に有効な量のIGF受容体アンタゴニストをその必要がある患者に投与する工程、並びに治療的に有効な量のエキセメスタン及びエベロリムスを同一患者に追加投与する工程を含む。
好ましくは、乳癌は局所進行性又は転移性乳癌である。
投与されるべきIGF受容体アンタゴニスト又はエキセメスタン及びエベロリムスの“治療的に有効な量”は、局所進行性又は転移性乳癌を予防、軽減又は治療するために必要な最小量である。
局所進行性又は転移性乳癌の女性でエキセメスタン及びエベロリムスと併用したIGF Ab 60833とエキセメスタン及びエベロリムス単独との対比試験
序
ここで提唱される試験は、エストロゲン受容体陽性転移性乳癌におけるエキセメスタン及びエベロリムス併用IGF Ab 60833の効果を精査する。
より詳細には、フェーズI部分は、HR+/HER2-の進行性乳癌の女性における、IGF Ab 6083及びエキセメスタン併用エベロリムスの最大耐性用量（MTD）並びに推奨フェーズII用量（RP2D）を決定する。：
フェーズII部分は、HR+/HER2-の進行性乳癌の女性で、エキセメスタン及びエベロリムス単独と比較した、エキセメスタン及びエベロリムス併用IGF Ab 60833の抗腫瘍活性を評価する。
バックグラウンド
IGF Ab 60833は、IgG1アイソタイプの完全にヒトのモノクローナル抗体である。当該Abは高親和性でIGF-1及びIGF-2と結合し、両タンパク質によって始動される増殖性及び生存促進性細胞シグナル伝達を強力に中和する。
エベロリムスは選択性mTOR（哺乳動物照準ラパマイシン）阻害剤である。
エキセメスタンは経口用ステロイド系アロマターゼ阻害剤であり、閉経後女性の外科手術及び/又は照射に加えてER陽性乳癌で用いられる。
投与
IGF Ab 60833は、注射/輸液用溶液のための濃縮物として試験現場に供給される。合計100mg（ミリグラム）が患者の静脈内に供給される。患者は、疾患の進行、受容不能AE、中止の同意、又は試験の非遵守が生じるまで治療の続行を受ける。
エベロリムスは10mg(ミリグラム)/日の投薬量で経口的に患者に投与される。患者は、疾患の進行、受容不能AE、中止の同意、又は試験の非遵守が生じるまで治療の続行を受ける。
エキセメスタンもまた患者に経口的に投与される。
試験中の医学的状態又は症状
ここで提唱される試験は、非ステロイド系アロマターゼ阻害剤（レトロゾール及び/又はアナストロゾール）に不応性である、エストロゲン受容体（ER）及び/又はプロゲステロン受容体（PgR）に陽性、及び/又はHER2に陰性の局所進行性又は転移性乳癌について精査することである。
基本的組み入れ基準
以下の基準を用いて当該試験への患者の組み入れを判定する。
−組織学的に確認した局所進行性乳癌（aBC）又は転移性乳癌（mBC）が根治的外科手術又は根治的放射線療法に馴染みやすいとは思われない
−腫瘍はエストロゲン受容体（ER）及び/又はプロゲステロン受容体（PgR）について陽性である
−腫瘍は現場の検査室試験でHER2について陰性である必要がある
−腫瘍は外科手術又は生検に由来する適切な保存腫瘍組織を有する必要がある
−閉経後女性である
−試験の登録の前に乳癌の最後の選択肢の全身療法中又はその後に再発又は進行性症状の客観的証拠が存在する
−患者の症状は非ステロイド系アロマターゼ阻害剤（レトロゾール及び/又はアナストロゾール）に不応性である
−患者は、RECISTバージョン1.1にしたがって測定可能な病巣を有するか、又は上記に定義された測定可能な病巣が存在しないとき骨病巣のみ（溶解型又は混合型（溶解型＋硬化型））を有する必要がある
−米国東海岸癌臨床試験グループのパフォーマンススコアが2以下である
−当該試験者の意見で余命は6カ月以上である
−空腹時血中グルコースが8.9mmol/L未満（＜160mg/dL）及びHbA1cが8.0%未満である
−器官の機能は適切である
−試験登録時に以前の治療に関連した毒性からグレード1以下に回復している（グレード2以下の安定した知覚神経障害及び円形脱毛を除く）
−ICH-GCPガイドラインに一致する書面によるインフォームドコンセント及び生検サブスタディのための現場の組み入れ基準規制は、以下の2つの組み入れ基準を除いてフェースII部分の主試験と同一である：
−新鮮な腫瘍生検は試験者が安全で実施可能と考えたときに及び患者のインフォームドコンセントに基づいて採取されるべきであり、骨病巣の生検は推奨されない
−腫瘍生検を受ける資格のある患者は正常な凝固パラメーターを有するべきである（INR及びPTTは正常範囲内）。
基本的排除規準
以下の基準を用いて当該試験における患者の排除を判定する。
−IGF経路、ホスホイノチシド3-キナーゼ（PI3K）シグナル伝達経路、タンパク質キナーゼB（AKT）又は哺乳動物照準ラパマイシン（mTOR）経路を標的とする薬剤による以前の治療
−エキセメスタンによる以前の治療
−モノクローナル抗体、mTOR阻害剤（例えばシロリムス）又はいずれかの試験薬の賦形剤に対して既知の過敏症
−卵巣放射線照射又は黄体形成ホルモン放出ホルモン（LH-RH）アゴニストを用いる治療による卵巣抑制
−弱毒生ワクチンによる免疫から試験治療まで1週間未満
−治療に入る前の4週間以内に放射線療法（ただし鎮痛目的のため、又は骨折のリスクがある溶解性病巣のための局所放射線療法の事例で、試験治療前2週間以内に完了できるものを除く）
−化学療法、生物学療法（ベバシズマブ以外）、免疫療法又は研究薬剤（当該薬剤の5半減期以内又は治療開始前2週間以内のどちらか長い方）；試験治療の開始前4週間以内にベバシズマブ治療
−試験治療開始前2週間以内に乳癌ホルモン治療
−試験者の判断で試験治療の開始前4週間以内に大きな外科手術又は企画試験の行程中に手術の予定
−付随する免疫抑制剤、又は長期的コルチコステロイドの使用（局所適用、吸入スプレー、点眼若しくは局所注射、又は試験治療前の少なくとも2週間の安定な低用量の使用を除く）を受けている患者
−B型肝炎慢性感染、C型肝炎慢性感染及び/又は既知のHIVキャリア
−470msを超えるQTcF延長化又は試験者が臨床的に関係有りと考えるQT延長化
−急速に進行するか又は生命の危険があると考えられる疾患、例えば広範囲の症候性内臓疾患（肝臓の関与及び腫瘍の肺リンパ管性拡散を含む）
−脳又は他のCNS転移歴
−両側性びまん性リンパ管性癌腫症
−グレード1を超える低カリウム血症
−5年以内の別の原発性悪性疾患歴（ただし子宮頸癌、子宮体癌、基底細胞若しくは扁平上皮癌、又は非メラノーマ性皮膚癌であって発生場所で適切に処置されたものを除く）
−QT延長症候群の家族歴
−試験者の意見として、患者の安全を脅かすか、又は当該試験医薬の安全性及び抗腫瘍活性の判定を妨げるようないずれかの随伴する重篤な疾患又は器官系の機能不全
−試験登録前2週間以内に、強い若しくは中等度のCYP3A4及び/又はPgP阻害剤及び/又は強力なCYP3A4誘発剤であると認識されている薬剤で治療中の患者
−局所進行性又は転移性乳癌のために第三選択肢以降の化学療法を受けている患者（フェースIIについては第二選択肢以降）。
目標
根原的目標は以下のとおりである：
1：無進行性生存（PFS）（判定時点は10,8カ月まで）。
2：用量制限毒性の出現−フェースI部分（判定時点は28日まで）。
二次的目標は以下のとおりである：
1：無増悪期間（TTP）（C1V1の日付から最初の客観的腫瘍進行の日付までの期間と定義される、判定の時点は10,8カ月まで）。
2：客観的応答（OR）（完全応答（CR）又は部分的応答（PR）（CR＋PR）と定義される、判定の時点は10,8カ月まで）。
3：客観的応答までの時間（判定の時点は10,8カ月まで）。
4：客観的応答の期間（判定の時点は10,8カ月まで）。
5：臨床的利益（CB）（完全応答（CR）又は部分的応答（PR）の最高の合計応答、又は6カ月以上の症状の安定（SD）、又は6カ月以上の非CR/非PD（CR＋PR＋SD6m＋非CR/非PD6m）と定義される、判定の時点は10,8カ月まで）。
6：臨床的利益の期間（判定の時点は10,8カ月まで）。
局所進行性又は転移性乳癌女性における、エキセメスタン及びエベロリムス併用IGF Ab 60833対エキセメスタン及びエベロリムス単独に関する予備試験
エベロリムス及びエキセメスタンの二重併用に対するIGF Ab 60833、エベロリムス及びエキセメスタンの三重併用の効果を予備的に調べた。試験は、ヒトアロマターゼ遺伝子を発現するように操作したER陽性乳癌細胞株で実施した。
図1は、IGF Ab 60833、エベロリムス及びエキセメスタンの三重併用（下パネル）に対するエベロリムス及びエキセメスタンの二重併用（上パネル）の比較を示す。
IGF Ab 60833は、エベロリムス及びエキセメスタン併用に対して驚くほど大きな細胞増殖阻害の増加を引き起こすことが、2つのパネルの比較から明瞭に見ることができる。
乳癌細胞株MCF7aroの増殖及びバイオマーカーのリン酸化状態におけるmTOR阻害剤エベロリムス及びアロマターゼ阻害剤エキセメスタン併用IGF Ab 60833の効果
要旨
本試験の目的は、MCF7aro細胞の増殖における、IGF Ab 60833（IGF-1及びIGF-2と結合する完全にヒトの抗体）とmTOR阻害剤エベロリムス及びアロマターゼ阻害剤エキセメスタンとの併用のin vitro効果を探求することであった（MCF7aro細胞はエストロゲン受容体陽性乳癌細胞株MCF7から誘導され、ヒトアロマターゼタンパク質を安定的に発現するように操作された）。
MCF7aro乳癌細胞をエストラジオール前駆体アンドロステンジオン補充ステロイド枯渇培養液中で培養し、さらにIGF Ab 60833、エベロリムス及びエキセメスタンを単剤として、又は組み合わせてインキュベートし、PI3K/mTOR経路シグナル伝達、細胞増殖及び生存における効果を決定した。
MCF7aro細胞のエベロリムス単独処置はAKTリン酸化の強化をもたらしたが、IGF Ab 60833との共同処理はホスホAKTの増加を妨げて下流シグナル伝達のより深甚な阻害をもたらした。IGF Ab 60833とエベロリムス及びエキセメスタンとの三重併用は、エベロリムス及びエキセメスタンの二重併用による処理と比較して、細胞増殖阻害の強化及びアポトーシス誘発をもたらした。
この試験は、エベロリムス及びエキセメスタンの併用（ホルモン受容体陽性乳癌の現在の標準治療である）へのIGF Ab 60833の追加は、in vitroで抗新形成活性の改善をもたらすことを示している。
序
インスリン様成長因子（IGF）シグナル伝達系及びPI3キナーゼ/mTORシグナル伝達系はともに、哺乳動物細胞の生存及び増殖の調節に重要な役割を果たす。
インスリン様成長因子（IGF）シグナル伝達系は、リガンド（インスリン様成長因子1及び2（IGF-1、IGF-2））、IGF結合タンパク質（IGFBP）、及び受容体（インスリン様成長因子1受容体（IGF-1R）、IGF-2R及びインスリン受容体（IR））から成る。IGFを標的とすることは癌治療で有用でありうるという証拠が数十年前に初めて認識された。IGFシグナル伝達の研究は、前記シグナル伝達が重要な細胞活性（増殖、成長及び生存を含む）を制御すること及び新形成でしばし脱調節されることを示した。
IGF-1Rの発現は、多様な癌（肺癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、肝癌、及び肉腫を含む）で増加することが示されている。したがって、IGF系が抗癌剤開発の標的となった。薬理学的標的誘導戦術には、IGF-1R抗体又は小分子受容体チロシンキナーゼ阻害剤による受容体機能の阻害が含まれる。IGF Ab 60833は、IGFリガンド中和抗体として機能することによってまた別のアプローチを提供する。IGF-1Rの発現に加えて、多数の癌でIGFリガンドの自己分泌及び/又は傍分泌（特にIGF-2自己分泌）の証拠が存在する。IGF-2はまたインスリン受容体アイソフォームA（IR-A）と結合し、前記を介してシグナルを送ることが示された（IR-Aは胎児性細胞及び癌性細胞で発現される）。したがって、IGF-1及びIGF-2を標的とする戦術は治療の進歩に潜在能力を有する。
IGF Ab 60833は完全にヒトのモノクローナル抗体であり、前記はIGF-1及びIGF-2と結合し、それらの同族受容体との相互作用を阻害することによって、それらの生物学的作用を中和する、抗新形成活性の潜在能力を有する。
極めて多数の前臨床試験が、セリン/スレオニンキナーゼmTOR及びPI3キナーゼ/mTOR経路の他の成分の癌における機能的役割を評価している。経路成分の変異又は増幅によるPI3キナーゼ/mTORシグナル伝達経路の活性化が、種々の起源を有する癌の大部分で見いだされ、当該疾患の原因論における経路過剰活性化の重要な役割を示唆している。
mTORキナーゼは、別個の基質及び活性化のメカニズムを有する2つの細胞性マルチタンパク質複合体、mTORC1及びmTORC2で機能し、さらに細胞の生存、増殖及び細胞周期の進行を調節する。
PI3K/mTOR経路の過剰活性化は標準療法（例えばホルモン受容体陽性乳癌の内分泌療法）に対する耐性をもたらすと主張されている。
他の薬剤と併用されるmTORの阻害は、したがって癌療法の有望なアプローチと考えられる。
ラパマイシン誘導体（ラパローグ）はいくつかの癌タイプの治療について承認されている。それらはmTORC1タンパク質複合体のアロステリック阻害剤として機能する。内分泌療法（すなわちアロマターゼ阻害剤エキセメスタン（Aromasin(商標)、Pfizer Inc.））と併用されるラパローグのエベロリムス（Afinitor(商標)、Novartis Pharma）は、エストロゲン受容体（ER）陽性乳癌の治療のために承認されている。
ラパマイシンアナローグ（例えばエベロリムス）はいくつかの癌で臨床活性を示しているという事実にも関わらず、前臨床及び臨床データは、mTORC1が阻害されるとき、負のフィードバックループの解除によって耐性が獲得され、AKTリン酸化の誘発、すなわちPI3キナーゼ/mTOR経路のシグナル伝達の再活性化が生じうることを示唆している。
ユーイング肉腫の前臨床モデルでは、ラパマイシンがIGF Ab 60833と併用されたときに抗腫瘍有効性の改善が観察された。IGF Ab 60833はpAKTのラパマイシン誘発増加を阻害することが示され、pAKTレベルの上昇はIGFリガンド駆動シグナル伝達の強化によることを示した。
総合すれば、前臨床データは臨床的証拠とともに、2つ以上の経路成分を標的とする薬剤の併用（垂直経路阻害として知られる）は、より深甚な阻害及び抗癌有効性の改善をもたらすことを示している。
目的
本試験の目的は、MCF7aro細胞の増殖における、IGF Ab 60833とmTORC1阻害剤エベロリムス及びアロマターゼ阻害剤エキセメスタンとの併用のin vitro効果を探求することであった（MCF7aro細胞はエストロゲン受容体陽性乳癌細胞株MCF7から誘導され、ヒトアロマターゼタンパク質を安定的に発現するように操作された）。
試験設計
3つの別個の実験を実施して、エベロリムス及びエキセメスタンと併用されたIGF Ab 60833のMCF7aro乳癌細胞における抗増殖効果を決定した。試験化合物との6日間のインキュベーション後の細胞増殖及び生存性を、各アッセイウェルの生細胞の還元環境をモニターするアッセイを用いて決定した。
PI3キナーゼ/mTOR経路シグナル伝達における効果はウェスタンブロット分析によって評価し、アポトーシスの誘発は、メゾスケールディスカバリーアポトーシス全細胞溶解キットを用いて追跡監視した。
IGF Ab 60833は配列番号:39の重鎖及び配列番号:40の軽鎖を含む。その製造はWO2010/066868に開示されている。
この試験で用いられたエベロリムス（EX00100386）は本明細書に提供した化学構造を有する。
この試験で用いられたエキセメスタン（EX0003557）は本明細書に提供した化学構造を有する。
MCF7aro細胞はヒトアロマターゼタンパク質を安定的に発現する。前記細胞は、アロマターゼcDNAのトランスフェクション、ジェネティシン選別（ネオマイシン）及びクローン精製によってMCF7ヒトER陽性***腺癌細胞（ATCC, HTB-22）から誘導された。
方法
細胞培養
MCF7aro細胞は、MEM増殖培地（10% FBS、2mM GlutaMAX、1mMピルビン酸ナトリウム及び0.1mg/mLジェネティシンを補充）で単層培養物として培養された。細胞は湿潤雰囲気中の5% CO2下、37℃で175cm2の組織培養フラスコにて維持された。
細胞増殖アッセイ及びウェスタンブロット分析のために、飢餓培地（フェノールレッドを含まないMEMアルファに10%活性炭除去FBS、2mM GlutaMAX及び1mM プルビン酸ナトリウムを補充）での72時間培養によって細胞をステロイド枯渇させた。
接着増殖MCF7aro乳癌細胞の細胞増殖アッセイ
このアッセイを用いて、MCF7aro細胞の生存性及び増殖におけるIGF Ab 60833、エベロリムス及びエキセメスタンの阻害効果を決定した。
アッセイ条件:接着細胞をトリプシン/EDTA溶液ではがして飢餓培地に再懸濁し、さらに飢餓培地で25,000細胞/mLに希釈した。ウェルにつき200μLの細胞懸濁物（5,000細胞）を4枚の無菌的NuncTM Edge96ウェルプレートに播種した（ウェルB1/B2を除く：培地コントロール（200μLの飢餓培地のみを添加））。プレートを37℃及び5% CO2の湿潤インキュベーターで48時間インキュベートした。2日後に上清を吸引し、150μLのアッセイ培地（フェノールレッドを含まないMEMアルファに10%活性炭除去FBS、2mM GlutaMAX、1mM プルビン酸ナトリウム及び1nMアンドロステンジオンを補充）を各プレートの各ウェルに添加した。
試験化合物の添加：エベロリムスとエキセメスタンの併用のために、50μL/ウェルのアッセイ培地を全ウェルに添加した。5倍連続希釈のエベロリムス（最高試験濃度は50nM）、エキセメスタン（最高試験濃度は200nM）又はDMSO（ビヒクル処理細胞コントロール及び培地コントロール）をHP D300デジタルディスペンサーで細胞に添加した。
エベロリムス、エキセメスタン及びIGF Ab 60833の三重併用のために、40nMのIGF Ab 60833溶液をアッセイ培地で調製した。50μL/ウェルのIGF Ab 60833溶液を細胞に添加し、10nMの最終試験濃度を得た。50μL/ウェルアッセイ培地を細胞コントロール及び培地コントロールウェルに添加した。5倍連続希釈のエベロリムス（最高試験濃度は50nM）、エキセメスタン（最高試験濃度は200nM）又はDMSOをHP D300デジタルディスペンサーで細胞に添加した。ウェル当たりの最終体積は200μLであった。
試験ウェルの溶媒DMSOの最終濃度は0.1%であった。エベロリムス及びエキセメスタンは5濃度で試験し、各々2組のウェルで単剤又は併用として測定した。
37℃及び5%CO2の湿潤インキュベーターでの試験化合物との2日間のインキュベーション後に培地を新しいアッセイ培地に交換し、化合物を再度添加した。合計6日間の試験化合物とのインキュベーション期間の後で、細胞を20μLのAlamarBlue(商標)細胞生存性試薬で染色して細胞生存性を評価した。プレートを37℃及び5%CO2で6時間インキュベートして、細胞にレサズリンをレソルフィンに変換させた。続いて各ウェルの全蛍光強度をワラックVICTORマルチラベルカウンター（Wallac VICTOR Multilabel Counter）で544nmの励起波長及び590nmの測定発光を用いて測定した。
試験化合物の添加時に、“タイムゼロ”(t＝0)未処理細胞プレートをAlamarBlue(商標)細胞生存性試薬で染色した。150μLのアッセイ培地中に細胞を含む各ウェルに、50μLのアッセイ媒体及び20μLのAlamarBlue(商標)細胞生存性試薬を添加した。37℃及び5%CO2で6時間のインキュベーション後に、全蛍光強度を測定した。
AlamarBlue(商標)アッセイは、蛍光/比色定量増殖インジケーターを取り込むことによって代謝活性の検出に基づいて細胞の生存性を定量的に測定するように設計されている。蛍光シグナルは生存細胞の総数に比例する。
細胞が生きているとき、それらは細胞ゾル内で還元環境を維持する。レサズリン（AlamarBlue(商標)細胞生存性試薬の活性成分）は非毒性の細胞透過性化合物であり、青色で実質的に非蛍光性である。細胞侵入時に、レサズリンはレソルフィンに還元される（レソルフィンは赤色で高度に蛍光性である）。生存細胞は持続的にレサズリンをレソルフィンに変換して総蛍光及び細胞周囲の培地の色を増強する。
データ分析：６日間のインキュベーション後のビヒクル処理コントロール細胞についてのAlamarBlue(商標)アッセイの出力（100%細胞生存性に対応する）をその後の全ての計算のための参照シグナルとして採取した。化合物処理培養物の相対的細胞生存性（コントロールに対するシグナルパーセント“POC”）を以下の式にしたがって計算した：
POC（t＝144h）＝100*蛍光（化合物ウェル）／蛍光（コントロールウェル）。
加えて、各化合物処理培養物について、144時間のインキュベーション後の蛍光シグナル（POC（t＝144h））を処理開始時のシグナル（POC（t＝0h））と比較した：
POC（t＝0h）＝100*t=0の蛍光（コントロールウェル）／t=144hの蛍光（コントロールウェル）。
濃度応答曲線の計算のために、全く上下限のない4パラメーターログ-ロジスティック関数を用いてPOCデータを解析した。化合物処理培養物における相対的細胞増殖阻害（CGI%）は以下の式にしたがって計算される:
式中、
St 144＝POC(t=144h)
Sc 0＝POC(t=0h)
0%より大きく100%より小さいCGIはビヒクル処理コントロールと対比して部分的増殖阻害を反映し、100%のCGIは増殖の完全阻害と等価であり、100%を超えるCGIは正味の細胞死を示す。
結果は、試験化合物2の種々の濃度に対して試験化合物1の多数の化合物濃度をプロットしCGIマトリックスによって判定した。
細胞溶解物の調製及びウェスタンブロット（AKT及びS6のリン酸化状態の評価）
1.8ｘ106のMCF7aro細胞を10cmディッシュの飢餓培地にプレートした（飢餓培地：フェノールレッドを含まないMEMアルファに10%活性炭除去FBS、2mM GlutaMAX及び1mM プルビン酸ナトリウムを補充）。一晩インキュベートした後、培地をアッセイ培地に交換し、細胞を100nMのIGF Ab 60833又は0.32nMのエベロリムス又は抗体及びmTORC1阻害剤の組み合わせで処理した（アッセイ培地：フェノールレッドを含まないMEMアルファに10%活性炭除去FBS、2mM GlutaMAX、1mM プルビン酸ナトリウム及び1nMアンドロステンジオンを補充）。コントロールとして、細胞をビヒクル（DMSO）のみで処理した。処理後24時間で、細胞をMSDトリス溶解緩衝液（以下を含む：20mMトリス（pH7.5）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1%トリトンX-100）を用いて氷上で溶解し、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテルで完了させた。使用前に、新しく調製した2mMのPMSFを前記緩衝液に添加した。
総タンパク質を単離し、Bradfordタンパク質アッセイを製造業者の指示にしたがって用いタンパク質濃度を定量した。
総タンパク質の30μgを4−12% Bis-Trisプレカーストゲルで分離させ、BIO-RADトランスブロット(商標)ターボTM装置（BIO-RAD Trans-Blot(商標)TurboTM）を用いてPVDF膜にブロットした。
膜は、1ｘTBS/0.1%トウィーン20中の5%の脱脂粉乳で室温にて1時間ブロッキングし、続いて以下のタンパク質に対する抗体で一晩プローブした：pAKT（S473）、pAKT（T308）、AKT、pS6（S235/236）、S6、及びアクチン（ローディングコントロールとして供された）。抗体希釈物は5%脱脂粉乳で調製した。洗浄及び二次抗体によるインキュベーションの後で、ECLウェスタンブロット検出試薬を製造業者の指示にしたがって用いてイムノブロットタンパク質を可視化した。
一次抗体：
ウサギ抗ホスホAKT（S473）（Cell Signaling #9271、1:1000）
ウサギ抗ホスホAKT（T308）（Cell Signaling #2965、1:1000）
ウサギ抗ホスホS6リボソームタンパク質（S235/236）（Cell Signaling #2211、1:2000）
ウサギ抗AKT（Cell Signaling #9272、1:2000）
ウサギ抗S6リボソームタンパク質（Cell Signaling #2217、1:2000）
ウサギ抗ベータアクチン（Dako #P0448、1:1000）
二次抗体：
ヤギ抗ウサギIgG（HRP結合）（Dako #P0448、1:1000）
細胞溶解物の調製及びウェスタンブロット（切断PARPの評価）
1.5ｘ106のMCF7aro細胞を10cmディッシュの飢餓培地にプレートした（飢餓培地：フェノールレッドを含まないMEMアルファに10%活性炭除去FBS、2mM GlutaMAX及び1mM プルビン酸ナトリウムを補充）。一晩インキュベートした後、培地をアッセイ培地に交換し、細胞を以下で処理した：ビヒクル（DMSO）、又は1μMのIGF Ab 60833、又は1μMのエキセメスタン、又は1μMのエベロリムス、又はエキセメスタン及びエベロリムスの組み合わせ、又は3つ全ての阻害剤の組み合わせ（アッセイ培地：フェノールレッドを含まないMEMアルファに10%活性炭除去FBS、2mM GlutaMAX、1mM プルビン酸ナトリウム及び1nMアンドロステンジオンを補充）。処理後72時間で、細胞をMSDトリス溶解緩衝液（以下を含む：20mMトリス（pH7.5）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1%トリトンX-100）を用いて氷上で溶解し、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテルで完了させた。使用前に、新しく調製した2mMのPMSFを前記緩衝液に添加した。
総タンパク質を単離し、Bradfordタンパク質アッセイを製造業者の指示にしたがって用いタンパク質濃度を定量した。
総タンパク質の20μgを4−12% Bis-Trisプレカーストゲルで分離させ、BIO-RADトランスブロット(商標)ターボTM装置を用いてPVDF膜にブロットした。
膜は、1ｘTBS/0.1%トウィーン20中の5%の脱脂粉乳で室温にて1時間ブロッキングし、続いてPARP及びアクチン（ローディングコントロールとして供された）に対する抗体で一晩4℃にてプローブした。抗体希釈物は5%脱脂粉乳で調製した。洗浄及び二次抗体によるインキュベーションの後で、ECLウェスタンブロット検出試薬を製造業者の指示にしたがって用いイムノブロットタンパク質を可視化した。
一次抗体：
ウサギ抗PARP（Cell Signaling #9542、1:1000）
ウサギ抗ベータアクチン（Cell Signaling #4967、1:3000）
ヤギ抗ウサギIgG（HRP結合）
二次抗体：
ヤギ抗ウサギIgG（HRP結合）（Dako #P0448、1:1000）
細胞溶解物中の切断PARPのMSDアポトーシスパネルによる決定
メゾスケールディスカバリー細胞溶解プロトコールにしたがって細胞溶解物を調製した。MSDアポトーシスパネル全細胞溶解物キットを用いて20μgの清澄な溶解物を2組ずつ解析し、切断PARPシグナルを製造業者の指示にしたがって測定した。プレートはSECTORイメージ6000プレートリーダーで読み取った。
結果
MCF7aro乳癌細胞の増殖における効果
MCF7aro細胞の増殖における、単剤として又は併用でのエベロリムス、エキセメスタン及びIGF Ab 60833の阻害活性を単層培養で決定した。エベロリムス及びエキセメスタンの併用については、各薬剤の5濃度を単剤及びマトリックス形式での組合せの両方で試験した。三重併用については、同じレイアウトをエベロリムス及びエキセメスタンのために適用し、IGF Ab 60833を10nMの固定濃度で各サンプルに添加した。二重併用及び三重併用について、2組ずつの測定を含む3つの別個の実験を実施した。
6日間のインキュベーション後に、単剤としてのエベロリムス及びエキセメスタンは、細胞増殖の用量依存性の部分的低下を示し、最大平均CGIはそれぞれ47%及び60%であった。エベロリムス及びエキセメスタンの併用はより有効であった。すなわちほぼ完全な細胞増殖阻害（90%を超える平均CGI）が6つの異なる濃度比で達成され、各阻害剤で用いた最高濃度で最大平均CGIは103%であった。
個々の実験のデータ及び平均CGI値は図2に示されている。
固定濃度（10nM）のIGF Ab 60833のエベロリムス/エキセメスタンの組合せへの添加は抗増殖効果の更なる強化をもたらした。化合物と6日間インキュベートした後で、13の異なる濃度比において正味の細胞死の深甚な誘発（120%を超える平均CGI）が観察され、最大平均CGIは149%であった。
個々の実験のデータ及び平均CGI値は図3に示されている。
MCF7aro細胞のAKT及びS6リン酸化における効果
セリン473（pAKT S473）及びスレオニン308（pAKT T308）におけるAKTのリン酸化、並びにセリン235/236におけるS6のリン酸化（pS6）に対する単剤及び併用IGF Ab 60833及びエベロリムスの効果を、処理後24時間で調製したMCF7aro細胞溶解物のウェスタンブロット分析によって追跡監視した。
100nMのIGF Ab 60833単独による処理はAKT又はS6リン酸化の阻害を生じなかった。0.32nMのエベロリムスによる処理時に、pS6シグナルの低下が観察されたが、pAKT S473及びT308レベルは、ビヒクル（DMSO）処理コントロールと比較して増加した。100nMのIGF Ab 60833と0.32nMのエベロリムスとの併用処理はpS6レベルをさらに低下させ（すなわち、弱いシグナルが検出できただけであり）、さらにDMSO処理と類似するpAKT S473及びT308レベルをもたらした（図4）。
MCF7aro細胞でのアポトーシスの誘発
エベロリムス、エキセメスタン及びIGF Ab60833を単剤として又は組み合わせて72時間用いて処理した後で調製したMCF7aro細胞溶解物で、ウェスタンブロット及びMSDアポトーシスパネルによってアポトーシスのマーカーとしての切断PARPを分析した。エベロリムス及びエキセメスタンの単剤又は併用による処理の後で切断PARPのレベルは、ビヒクル処理コントロールのレベルと類似するか又はわずかに高かっただけであった。エベロリムス、エキセメスタン及びIGF Ab 60833の三重併用による処理は切断PARPの強力な誘発をもたらした（図5）。
考察
ラパマイシンアナローグ（例えばエベロリムス）はいくつかの癌で臨床的活性を示しているという事実にもかかわらず、前臨床及び臨床データは、mTORC1が遮断されるとき負のフィードバックループの解除によって後天耐性が存在しうることを示唆している。mTORC1活性化に続いて、フィードバックメカニズムはIRS-1のリン酸化（前記は順に分解される）を生じ、それによってシグナル伝達経路を阻害する。逆に、MTORC1がラパマイシン又はアナローグによって阻害されるとき、負のフィードバックメカニズムが解除され、mTORC1の上流経路は再活性化され、AKTリン酸化の増強をもたらす。
マウスでは、ラパマイシンは血清IGFの生物活性を増加させることが見出され、血中IGFレベルの上昇は少なくとも部分的にはラパマイシンによって誘発されるpAKTレベルの上昇の理由を説明できることを示唆している。ユーイングン肉腫モデルでは、IGF Ab 60833は、pAKTのラパマイシン誘発増加を阻害することが示された。総合すれば、これらの発見は、ラパマイシン処理時のpAKT上昇はIGFリガンド駆動シグナル伝達の強化のためであったことを示唆している。in vivoでは、IGF Ab 60833及びラパマイシンの組み合わせは、どちらかの単剤だけよりも強力な抗腫瘍活性を示した。
これらの前臨床試験は、ラパローグとIGF Ab 60833との併用はIGF-1R経路のより持続的な阻害をもたらし、有効性を改善できることを示した。これらのデータは、エストロゲン陽性乳癌でIGF Ab 60833とエベロリムスとの併用の評価のために適切な論理的根拠を提供する。エベロリムスは、この適応症でアロマターゼ阻害剤のエキセメスタンとの併用が最近承認された。
これまでの試験では、三重併用（エベロリムス、エキセメスタン及びIGF Ab 60833）の細胞性活性が、ヒトアロマターゼタンパク質（MCF7aro）を発現するように操作されたヒトホルモン受容体陽性乳癌細胞株で試験された。血清枯渇条件下では、これらの細胞の増殖はエストロゲンによって支援される（エストロゲンは増殖培地に補充されたアンドロゲンからアロマターゼによって細胞内で合成される）。このモデルを用いて、アロマターゼ阻害剤の抗増殖活性をin vitroで評価することができる。
MCF7aro細胞の三重併用による処理は、二重併用（エベロリムス及びエキセメスタン）と比較して細胞増殖阻害の増強をもたらした。IGF Ab 60833はエベロリムス誘発AKTリン酸化を逆転させ、当該併用はIGF-1Rシグナル伝達経路の著しい阻害をもたらした。エベロリムス及びエキセメスタンによる共同処理後に細胞死は観察されなかったが、当該二重併用へのIGF Ab 60833の添加はアポトーシスの誘発をもたらした。
結論
この試験は、エベロリムス及びエキセメスタンの併用（前記はホルモン受容体陽性乳癌の現在の標準治療である）へのIGF Ab 60833の添加は、in vitroにおける抗新形成活性の改善をもたらす。

Claims (13)

  1. 乳癌患者の治療でエキセメスタン及びエベロリムスと組み合わせて使用するための、インスリン様成長因子（IGF）受容体アンタゴニスト。
  2. 乳癌が局所進行性又は転移性乳癌である、請求項1に記載のIGF受容体アンタゴニスト。
  3. IGF-1に対する抗体、及びIGF-2に対する抗体、IGF-1及びIGF-2の双方に対する抗体、IGF-1受容体（IGF-1R)に対する抗体、又はIGF-1Rチロシンキナーゼ活性の阻害剤である、請求項1又は2に記載のIGF受容体アンタゴニスト。
  4. 配列番号:1（HCDR1）、配列番号:2（HCDR2）及び配列番号:3（HCDR3）の重鎖相補性決定領域並びに配列番号:4（LCDR1)、配列番号:5（LCDR2）及び配列番号:6（LCDR3）の軽鎖決定領域を有する抗体、又は配列番号:11（HCDR1)、配列番号:12（HCDR2）及び配列番号:13（HCDR3)並びに配列番号:14（LCDR1）、配列番号:15（LCDR2）及び配列番号:16（LCDR3）の軽鎖決定領域を有する抗体、又は配列番号:21（HCDR1）、配列番号:22（HCDR2）及び配列番号:23（HCDR3）の重鎖相補性決定領域並びに配列番号:24（LCDR1）、配列番号:25（LCDR2）及び配列番号:26（LCDR3）の軽鎖決定領域を有する抗体、又は配列番号:31（HCDR1）、配列番号:32（HCDR2）及び配列番号:33（HCDR3）の重鎖相補性決定領域並びに配列番号:34（LCDR1）、配列番号:35（LCDR2）及び配列番号:36（LCDR3）の軽鎖決定領域を有する抗体、又は配列番号:7の重鎖可変領域及び配列番号:8の軽鎖可変領域を有する抗体、又は配列番号:17の重鎖可変領域及び配列番号:18の軽鎖可変領域を有する抗体、又は配列番号:27の重鎖可変領域及び配列番号:28の軽鎖可変領域を有する抗体、又は配列番号:37の重鎖可変領域及び配列番号:38の軽鎖可変領域を有する抗体、又は配列番号:41の重鎖可変領域及び配列番号:42の軽鎖可変領域を有する抗体、又は配列番号:43の重鎖可変領域及び配列番号:44の軽鎖可変領域を有する抗体、又は配列番号:9の重鎖及び配列番号:10の軽鎖を有する抗体、又は配列番号:19の重鎖及び配列番号:20の軽鎖を有する抗体、又は配列番号:29の重鎖及び配列番号:30の軽鎖を有する抗体、又は配列番号:39の重鎖及び配列番号:配列番号:40の軽鎖を有する抗体、又は配列番号:45の重鎖及び配列番号:46の軽鎖を有する抗体である、請求項1から3のいずれか1項に記載のIGF受容体アンタゴニスト。
  5. 抗体が配列番号:39の重鎖及び配列番号:40の軽鎖を有する、請求項4に記載のIGF受容体アンタゴニスト。
  6. インスリン様成長因子（IGF）受容体アンタゴニストと組み合わせて乳癌の患者の治療に使用するためのエキセメスタン及びエベロリムス。
  7. 乳癌の治療方法であって、治療的に有効な量のIGF受容体アンタゴニストをその必要がある患者に投与する工程、並びに治療的に有効な量のエキセメスタン及びエベロリムスを追加投与する工程を含む、前記乳癌の治療方法。
  8. 乳癌治療用医薬の製造のためのIGF受容体アンタゴニストの使用であって、該IGF受容体アンタゴニストはエキセメスタン及びエベロリムスと組み合わせて使用される、前記使用。
  9. 乳癌治療用医薬の製造のためのエキセメスタン及びエベロリムスの使用であって、該エキセメスタン及びエベロリムスはIGF受容体アンタゴニストと組み合わせて使用される、前記使用。
  10. 乳癌が局所進行性乳癌又は転移性乳癌である、請求項1から9項のいずれかに記載のエキセメスタン及びエベロリムス、方法又は使用。
  11. IGF受容体アンタゴニスト並びにエキセメスタン及びエベロリムスを医薬的に許容できる担体と一緒に含む、医薬組成物。
  12. 治療されるべき患者が、局所進行性の若しくは転移性の乳癌がエストロゲン受容体（ER）及び/又はプロゲステロン受容体（PgR）陽性、局所進行性の若しくは転移性の乳癌がHER2陰性、局所進行性の若しくは転移性の乳癌が非ステロイド系アロマターゼ阻害剤（例えばレトロゾール及び/又はアナストロゾール）に不応性から選択される1つ以上の特徴を有する、請求項1から11のいずれかに記載のIGF受容体アンタゴニスト、エキセメスタン及びエベロリムス、方法又は使用。
  13. 治療されるべき患者が、局所進行性の若しくは転移性の乳癌がエストロゲン受容体（ER）及び/又はプロゲステロン受容体（PgR）陽性、及び局所進行性の若しくは転移性の乳癌がまたHER2陰性、及び局所進行性の若しくは転移性の乳癌がまた非ステロイド系アロマターゼ阻害剤（例えばレトロゾール及び/又はアナストロゾール）に不応性という特徴を有する、請求項12に記載のIGF受容体アンタゴニスト、エキセメスタン及びエベロリムス、方法又は使用。
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