JP2017500873A - プシコースエピメラーゼをコードするポリヌクレオチド、およびこれを用いるプシコース生産方法。 - Google Patents
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Abstract
Description
砂糖代替甘味料として多く使用されている糖アルコール類は、一定量以上摂取時、下痢を誘発するなどの副作用があるが、プシコースは知られた副作用がない。
したがってプシコースの甘味料としての関心が高まっているが、自然系に極めて珍しく存在する単糖類である希少糖に属するため、食品産業に適用するためには、プシコースを効率的に生産する技術の開発が必要である。
したがって、副産物を生成せず、産業化に適した温度およびpH条件を示し高い収率でプシコースを生産できる方法が要求されている。
他の例は、前記酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。
他の例は、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを提供する。
他の例は、前記組み換えベクターを含む組み換え菌株を提供する。
他の例は、前記酵素、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、および前記組み換えベクターを含む組み換え菌株からなる群より選択された1種以上を含むプシコース製造用組成物を提供する。
他の例は、前記酵素、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、および前記組み換えベクターを含む組み換え菌株からなる群より選択された1種以上を使用するプシコース製造方法を提供する。
即ち、本発明は、機能が明らかになっていない蛋白質のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子の塩基配列を確認し、前記蛋白質がD−プシコース3−エピメラーゼ活性を有し高収率でプシコースを製造することができるのを確認して完成されたものであって、前記遺伝子および蛋白質プシコース生産における用途および前記蛋白質のD−プシコース3−エピメラーゼとしての用途を提供する。
前記蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号2の塩基配列、または前記塩基配列に対して実質的同一性を有する配列を含むものであり得る。前記の実質的な同一性は、配列番号2の塩基配列と任意の他の配列を最大限に対応するように整列し、その配列を分析して、前記任意の他の配列が配列番号2の塩基配列と70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上、または99%以上の配列相同性を有し、これからコードされた蛋白質が果糖をプシコースに転換する活性を維持することを意味する。
前述のように、前記配列番号1のアミノ酸配列を有する蛋白質は、果糖をプシコースに転換させるプシコース転換能に優れた酵素蛋白質である。したがって、前記配列番号1のアミノ酸配列を有する蛋白質またはこれを発現する組み換え菌株は、プシコース製造に有用に適用できる。
好ましい他の実施形態において、前記プシコースの生産方法は、配列番号1のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する組み換え菌株を培養および回収する段階;および前記組み換え菌株または前記組み換え菌株から分離された酵素蛋白質を果糖と反応させる段階を含むものであり得る。
前記組み換え菌株の培養段階は、使用される菌株(宿主細胞)の特性により関連技術分野の当業者によって容易に選択される培地および培養条件下で遂行することができる。例えば、前記培養は連続、半連続、または回分式培養であり得るが、この方法に限定されたのではない。前記培地としては、大腸菌をはじめとする任意の宿主細胞、および細胞内容物を支持するかまたは含有することができる任意の培養培地、溶液、固体、半固体または剛性支持体を含み、例えば、2YT培地、LB培地、SOB培地、TB培地などからなる群より選択されたものであり得る。
また、組み換え菌株を使用する場合、好ましくは果糖と反応させる前に前記回収された菌体を、例えば、0.85%(w/v)NaClなどを用いて2回以上洗浄して使用することができる。
[発明の効果]
エンシファーアドヘレンス(Ensifer adhaerens)菌株(Ensifer adhaerens SYG29;寄託番号:KCCM11405P)を1%プシコースが添加された最小培地(KH2PO42.4g/L、K2HPO45.6g/L、(NH4)2・SO42.6g/L、MgSO4・7H2O0.1g/L、酵母エキス(yeast extract)1g/L)を用いて30℃で24時間振盪培養した。前記得られた培養物を4,000rpmで20分間遠心分離した後、菌体のみ回収した。
根圏土壌1gを0.85%(w/v)NaCl10mLに懸濁し、100μl(microliter)を取って寒天培地に塗抹した後、30℃で培養した。前記寒天培地で形成されたコロニーのうちの形状と大きさが異なるコロニーを選別した後、最小培地(KH2PO42.4g/L、K2HPO45.6g/L、(NH4)2・SO42.6g/L、MgSO4・7H2O0.1g/L、酵母エキス(yeast extract)1g/L)に接種して30℃で24時間振盪培養し、遠心分離した後、菌体のみ回収した。回収した菌体は50mMのPIPES(piperazine−N,N’−bis(2−ethanesulfonic acid))緩衝溶液(pH8.0)100μlに入れて浮遊させ、音波振動機(Ultrasonic processor.ColepParmer)を用いて破砕した。前記破砕液を12,000rpmで4℃で10分間遠心分離し、上澄み液を回収して酵素液(crude enzyme)として使用し、前記酵素液を10mMプシコースを基質にして30℃で8時間反応させた。
前記実施例1で回収された菌体を1mMのフッ化フェニルメチルスルホニル(phenylmethylsulfonyl fluoride)(PMSF)を含む50mMのPIPES緩衝溶液(pH7.0)に混濁させた後、音波振動機(Ultrasonic processor.ColepParmer)を用いて4℃で40分間破砕した。前記破砕液を13,000rpmで4℃で20分間遠心分離し、上澄み液を回収して粗酵素として使用した。
部分精製された酵素は60℃で10分間熱処理後、4℃で8,000rpmで20分間遠心分離した後に上澄み液を回収して50mMのTris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で平衡化させた後、Hi−trap Q ion exchange chromatography column(Amersham Biosciences、Uppsala、Sweden)を実施した。結合蛋白質はNaClを用いて1.0Mまで濃度勾配を与えて溶出させた後、各分画の活性を測定し、活性の高い分画を集めて濃縮した。
各精製段階別精製程度を確認するために、SDS−PAGEを使用した。SDS−PAGEは12%ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)を使用し、20mAを与えて実施した。前記得られた結果を図1に示した。図1で示されるように、精製された蛋白質が約30kDaの分子量を有することを確認した(図1)。前記精製された蛋白質を0.004mg/mlの濃度で果糖50mMと55℃条件下で10分間反応させた後、得られた結果物に対して実施例1に記載されたところと同様な方法でHPLC分析を行った。HPLC分析結果(HPLC条件は実施例1と同一)、前記精製された蛋白質は果糖からプシコースを生産する活性を有することを確認することができる。したがって、前記精製された蛋白質が果糖からプシコースを生産するD−プシコースエピメラーゼ(psicose epimerase)の活性を有することが分かる。
前記で精製された蛋白質のN−末端アミノ酸配列は、イマス(E−Mass。Co)に依頼して分析した。N−末端の最初44個のアミノ酸残基はMQGFGVHTSMWTMNWDRPGAERAVAAAVKYAVDFIEIPMLNPPAであった。酵素のアミノ酸配列をGenBankに対するBLAST調査(NCBI)を通じて分析した。その結果、前記精製された蛋白質はシノリゾビウム属(Sinorhizobium fredii NGR234)のD−タガトースエピメラーゼ(tagatose epimerase)(accession number;YP002823363.1)と約80%の高い相同性を示した。
4−1.蛋白質をコードするDNAを増幅させるための合成DNAプライマーの製造
プシコース転換酵素活性を有する蛋白質をコードするDNAを増幅させるための合成DNAプライマーを製造するために次のような実験を行った。前記実施例3でのエンシファーアドヘレンス(Ensifer adhaerens)由来プシコース転換酵素のN−末端アミノ酸配列のprotein blast(NCBI)分析結果を土台に80%以上の相同性がある酵素(Accession Nos.:YP002823363.1、YP006398480.1、YP005192599.1、NP437010.1)を選別して該当酵素が5’および3’末端に隣接した部位にそれぞれシュガーABCトランスポーター(sugar ABC transporter)および炭水化物キナーゼ(carbohydrate kinase)をコーディングするDNA配列を共通的に有する構造であることを確認した。
配列番号5:5’ TAT TTG ATG AAG TCG CGT GC 3’
配列番号6:5’ GCA CGC GAC TTC ATC AAA TA 3’
配列番号7:5’ GGC CGA GAT ACC AGC GCG C 3’
前記実施例1で準備された菌株の培養液5mlを遠心分離して集菌しGenomic DNA extraction kit(Bioneer社)を用いて、説明書方法に基づいて、菌体から染色体DNAを取得した。鋳型としてエンシファーアドヘレンス(Ensifer adhaerens)(Ensifer adhaerens SYG29;寄託番号:KCCM11405P)由来染色体DNA(chromosomal DNA)を使用し、それぞれ配列番号4と5、および6と7に記載された塩基配列を有する合成DNAプライマーを使用して、PCR技術で増幅を行った。増幅は、サーマルサイクラー(Thermal Cycler)(パーキンエルマー社(Perkin Elmer.Co.))を用いてそれぞれ94℃で1分、50℃で1分、72℃で1分からなる30回のサイクルで実施した。増幅生成物確認は、反応液2μlを1%アガロース電気泳動で行った。その結果、約1kbのDNA断片が増幅されていることが確認された。
PCR増幅技術で確保したポリヌクレオチド(配列番号2)を制限酵素NdeIとXhoI(NEB)を用いて、発現ベクターであるpET21a(Nobagen)の同一な制限酵素部位に挿入し、組み換えベクターpET21a/プシコース3−エピメラーゼ(pET−EDPE)を製作した。(図2参照)。前記製作された組み換えベクターをヒートショック(heat shock)方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning)によって大腸菌BL21(DE3)(invitrogen)を形質転換して組み換え菌株を製造した。
形質転換された組み換え菌株を5mlLB−アンピシリン(LB−ampicillin)培地(Difco)に104CFU/mlの量で接種した後、600nmでの吸光度が1.5に到達するまで37℃、200rpmで振とう培養し、これを再び200mlLB−アンピシリン(LB−ampicillin)培地に接種、37℃の振とう培養機で培養した。この培養液の600nmで吸光度が0.5である時、0.1mMのIPTG(Isopropyl−β−D−thio−galactoside)を添加して目的酵素の過発現を誘導した。この時、過発現誘導時点から培養条件は16℃、150rpmに転換して16時間維持した。
その後、遠心分離機4000rpmで20分間遠心分離して菌体のみを回収した。回収した菌体は、0.85%(w/v)NaClで2回洗浄後、酵素精製に使用した。
5−1.D−プシコース3−エピメラーゼの精製
前記実施例4−3で回収された菌体をlysis buffer(50mM Tris−HCl 300mM NaCl pH7.0、10mMイミダゾール)に混濁させた後、音波振動機(Ultrasonic processor.ColepParmer)を用いて4℃で20分間破砕した。破砕液を13000rpmで20分間遠心分離して上澄み液のみを集めた後、予めlysis bufferで平衡化させたNi−NTAカラム(Ni−NTA Superflow、Qiagen)に適用させた後、50mM Tris−HCl 300mm NaCl pH7.0に20mMイミダゾールと250mMイミダゾールが含まれている緩衝溶液を順次に流した。最後の過程である50mM Tris−HCl 300mM NaCl pH7.0、250mMイミダゾールを流すことによって目的蛋白質を精製した。溶出された蛋白質は酵素活性測定用緩衝溶液(50mM PIPES pH7.0)で転換した後、実験に使用した。
前記実施例5−1で得られたD−プシコースエピメラーゼの金属イオン要求性を確認するために金属イオンのMgSO4またはMnCl2をそれぞれ1mMずつ処理して酵素活性を測定した。
前記酵素活性測定は、前記金属イオン存在下で50mM果糖と酵素0.5unit/mlが50mM PIPES(piperazine−N,N’−bis(2−ethanesulfonic acid))緩衝溶液(pH7.0)で55℃で酵素と反応させて分当り1マイクロモルのプシコースを生産する量を1unitと定義した。対照群(Non)として金属イオンを処理していないものを使用した。
前記酵素活性は生産されたプシコース量(mM)を使用された酵素量と反応時間に分けて計算し、プシコース量はHPLCで分析した。前記HPLC分析は、87C(BIO−RAD)カラムを用いて80℃で、移動相としては水100%(v/v)を0.6ml/min流速で流しながら行い、屈折率検出器(Refractive Index Detector)(Agilent 1260 TID)でプシコースを検出してプシコース生産性を分析した。
前記測定された各金属イオンを処理した酵素活性を対照群の酵素活性と比較して図3に示した。図3に示されているように、実施例5−1の酵素はマンガン、マグネシウムイオンによって活性が増加することが明らかになって金属イオン要求性があることが分かる。
pHおよび温度変化によるプシコース3−エピメラーゼの活性を確認するために、多様なpHおよび温度で酵素と果糖基質を反応させて活性を確認した。
まず、pHを7.0にし、温度を40〜70℃範囲で変化させて、酵素活性を測定した。前記酵素活性測定は、実施例5−2の過程を参照した。前記得られた結果を図4に示した。図4に示されているように、前記酵素は50〜60℃範囲で高い転換率を示し、特に55℃で最大転換率を示すことが分かった。図4のY軸の相対的活性は、最もよく示された酵素活性を100にした時の相対値を意味する。
前記結果から分かるように、本発明によるプシコース3−エピメラーゼは比較的に広い温度およびpH範囲で活性の変化が大きくないことが確認され、これは産業的に使用するに適した利点であって、プシコース産業化に有利に使用されることが期待される。
温度変化によるプシコース3−エピメラーゼの安定性を確認するために、前記実施例5−1で精製された酵素を55℃および60℃で一定時間(8時間)熱処理した後、50mMの果糖を基質にして1mM MnCl2と酵素0.5unit/mlが含まれている50mM PIPES緩衝溶液でpH7.0および55℃条件下で10分間反応させて酵素活性を測定した。酵素活性は100℃で5分間加熱して中止させた。
前記熱処理時間によって得られた結果を図6に示した。図6のように、実施例5−1で精製された酵素の半減期は55℃と60℃それぞれ約22時間、7時間に計算された。これは従来に報告された大部分のプシコース3−エピメラーゼに比べて非常に高い値であって、本発明によるプシコース3−エピメラーゼが産業的に反応の容易な温度で熱安定性が優れていることを確認することができる。
実施例5−1で精製したエンシファーアドヘレンス(Ensifer adhaerens)由来のプシコースエピメラーゼの酵素反応速度を確認してみるために動態パラメーター(kinetic parameter)分析を実施した。
基質である果糖の濃度を10〜50mM範囲で変化させながら、実施例5−1の酵素0.5unit/mlおよび1mM MnCl2が添加された50mM PIPES緩衝溶液pH7.0および55℃条件下で反応させて酵素活性を測定した。100℃で5分間加熱して酵素活性を中止させた。
前記得られた結果を図7に示した。図7に示された結果で酵素反応速度を単量体で計算した場合、果糖のKm値は18.6mMであり、kcatは2511.2min−1であった。前記酵素反応速度はミカエリスメンテン式(michaelis−menten equation)に基づいて計算した。
本発明によるプシコース3−エピメラーゼの果糖に対する触媒効率(catalytic efficiency)は135であって、従来に発表されたアグロバクテリウムツメファシエンス由来のプシコース3−エピメラーゼの触媒効率である85より高いことが明らかになった。
高濃度のプシコースを生産するために、実施例5−1で精製したD−プシコース3−エピメラーゼ0.1〜0.5mg/mlの濃度で55℃、50mM PIPES緩衝溶液pH7.0および1mM MnCl2の条件下で高濃度(400g/L)の果糖と反応させた。
前記実施例5−2と同様な方法で前記反応結果生産されたプシコース生産量を測定して果糖からプシコースへの転換率を測定した。使用された果糖が高濃度であるため、各時間別にサンプリングした溶液を20倍に希釈してHPLC分析を行った。
前記得られた結果を図8に示した。図8に示されているように、0.5mg/mlの濃度でプシコース最終生産量が118.6g/Lであり、プシコース転換率が約30%程度である。
一方、前記のように高濃度果糖での生物転換によるプシコース生産性をHPLCで測定してその結果を図9に示した。
受託番号:KCCM11405P
受託日付:20130329
Claims (12)
- 配列番号1のアミノ酸配列からなるプシコースエピメラーゼ。
- 請求項1のプシコースエピメラーゼをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号2の塩基配列からなる、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項2のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
- 請求項4の組み換えベクターを含む組み換え菌株。
- 配列番号1のアミノ酸配列からなる蛋白質、前記蛋白質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、前記組み換えベクターを含む組み換え菌株、前記組み換え菌株の培養物、および前記組み換え菌株の破砕物からなる群より選択された1種以上を含む、プシコース製造用組成物。
- 銅イオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、アルミニウムイオン、およびカルシウムイオンからなる群より選択された1種以上の金属イオンを追加的に含む、請求項6に記載のプシコース製造用組成物。
- 配列番号1のアミノ酸配列からなる蛋白質、前記蛋白質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、前記組み換えベクターを含む組み換え菌株、前記組み換え菌株の培養物、および前記組み換え菌株の破砕物からなる群より選択された1種以上を果糖と反応させる段階を含む、プシコース生産方法。
- 前記反応に使用される果糖の濃度は55〜75%(w/w)である、請求項8に記載のプシコース生産方法。
- 前記反応はpH7〜10の条件下で行われる、請求項8に記載のプシコース生産方法。
- 前記反応は40〜70℃の条件下で行われる、請求項8に記載のプシコース生産方法。
- 銅イオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、アルミニウムイオン、およびカルシウムイオンからなる群より選択された1種以上の金属イオンを添加する段階を追加的に含む、請求項8〜11のうちのいずれか一項に記載のプシコース生産方法。
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