CN105849261B

CN105849261B - 剑菌属菌株和使用其生产阿洛酮糖的方法

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Publication number: CN105849261B
Application number: CN201480071147.8A
Authority: CN
Inventors: 安信惠; 金慧贞; 韩恩珍; 田岁希; 朴钟辰; 李康杓
Original assignee: Samyang Corp
Current assignee: Samyang Corp
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2014-04-15
Publication date: 2019-04-19
Anticipated expiration: 2034-04-15
Also published as: US9951361B2; US20170211109A1; US20160304853A1; ES2750552T3; JP6282746B2; CN105849260B; EP3087180A1; EP3088515A1; EP3087180A4; CN105849261A; WO2015099246A1; JP2017501729A; US9701953B2; KR101539097B1; EP3088515A4; EP3088515B1; CN105849260A; JP6339680B2; WO2015099256A1; JP2017500873A

Abstract

提供了从土壤中分离出的新型粘着剑菌菌株以及使用其生产阿洛酮糖的方法。

Description

剑菌属菌株和使用其生产阿洛酮糖的方法

技术领域

本公开涉及从土壤中分离出的新型粘着剑菌(Ensifer adhaerens)菌株以及使用其生产阿洛酮糖的方法。

背景技术

阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，甜度为D-果糖的70％，因此发现用于在血糖控制、齿洞预防和肝脏的脂肪生成抑制中用作各种功能食品的糖成分。

广泛用作糖的替代物的糖醇在摄入一定量或更多量时具有引起腹泻的副作用，而已知阿洛酮糖没有副作用。因此，阿洛酮糖已经引起人们对将其用作甜味剂有广泛兴趣，但是由于阿洛酮糖在自然界中很少发现，因此其有效生产是应用于食品工业的前提条件。

通常，阿洛酮糖通过化学方法由D-果糖通过钼酸根离子的催化作用生产得到。同时，最近已知使用来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的阿洛酮糖差向异构酶的生物学方法是最有效的方法之一。化学方法具有在糖蜜处理或葡萄糖异构化过程中只产生极少量阿洛酮糖的缺点，该方法昂贵，且产生副产物。此外，生物学方法的缺点在于生产成本高，且产量低。

因此，需要可以在适于工业化的温度和pH条件下以高产量且无副产物产生的方式生产阿洛酮糖的方法。

发明内容

技术问题

一种实施方式提供了一种从土壤中分离出具有由果糖生产阿洛酮糖的活性的菌株的方法。

另一种实施方式提供了具有生产阿洛酮糖的活性的剑菌属(Ensifer sp.)菌株。

又一种实施方式提供了一种用于生产阿洛酮糖的组合物，包含选自由剑菌属菌株的细胞、细胞培养物和细胞裂解物组成的组中的至少一种。

还有一种实施方式提供了一种生产阿洛酮糖的方法，该方法利用选自由剑菌属菌株的细胞、细胞培养物和细胞裂解物组成的组中的至少一种组成的组中的至少一种。

技术方案

分离并鉴定具有将D-果糖转化为阿洛酮糖的高活性的新型粘着剑菌(Ensiferadhaerens)菌株，通过使用该菌株分析由果糖到阿洛酮糖的转化率，并考察pH、温度和对金属离子的依赖性的反应条件，以建立针对大量生产而优化的生产条件，于是，本发明人就完成了本发明。

另一种实施方式提供了具有生产阿洛酮糖活性的剑菌属菌株，该剑菌属菌株为粘着剑菌。

在另一种实施方式中，通过使用该菌株提供生产阿洛酮糖的方法。在该方法中，提供了针对阿洛酮糖的高转化率而优化的细胞反应条件和针对大量生产阿洛酮糖的条件。

将更详细地说明本发明。

提供新型剑菌属菌株。该剑菌属菌株具有将果糖转化为阿洛酮糖的高活性，并且为选自由粘着剑菌(Ensifer adhaerens)、瓜拉马剑菌(Ensifer garamanticus)、菽剑菌(Ensifer sojae)、墨西哥剑菌(Ensifer mexicanus)、努米底亚剑菌(Ensifer numidicus)等组成的组中的至少一种，例如为粘着剑菌。

所述剑菌属菌株为以登记号KCCM11405P保藏的粘着剑菌SYG29。粘着剑菌具有16srRNA(具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列)，具有硝酸盐还原、脲酶、β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶的活性，并且能够代谢D-果糖、L-***糖、D-甘露糖、D-甘露糖醇、N-乙酰葡糖胺、D-麦芽糖和苹果酸的底物。另外，剑菌属菌株没有L-色氨酸降解、D-葡萄糖发酵、精氨酸双水解酶、明胶水解、葡糖酸钾的利用、癸酸利用、己二酸利用、柠檬酸三钠利用和苯乙酸利用的活性。

剑菌属菌株具有将果糖转化为阿洛酮糖的高活性。阿洛酮糖的转化能力是因为菌株的将果糖转化为阿洛酮糖的酶。剑菌属菌株可以产生具有将果糖转化为阿洛酮糖的高活性的酶，或者具有大量该酶，由此提供优异的阿洛酮糖生产率。剑菌属菌株可以用于生产阿洛酮糖，并且可以提高产量。

因此，提供了用于生产阿洛酮糖的组合物，该组合物包含选自由剑菌属菌株的细胞、细胞培养物和细胞裂解物组成的组中的至少一种。所述细胞培养物包含由剑菌属菌株产生的酶，并且可以包含剑菌属菌株的细胞，或者为不含细胞的溶液。所述细胞裂解物是指剑菌属菌株的细胞裂解物，或通过离心细胞裂解物获得的上清液，因此包含由剑菌属菌株产生的酶。除非本文另作说明，否则所述剑菌属菌株或剑菌属细胞是指选自由该菌株的细胞群、该菌株的培养物和该菌株的裂解物组成的组中的至少一种。

在另一种实施方式中，提供了通过使用剑菌属菌株来生产阿洛酮糖的方法。该方法包括使剑菌属与果糖反应的步骤。在一种实施方式中，使剑菌属与果糖反应的步骤是通过在包含果糖的培养基上培养剑菌属来进行的。在另一种实施方式中，使剑菌属与果糖反应的步骤包括例如将果糖与剑菌属菌株(例如，选自由剑菌属的细胞、细胞培养物和细胞裂解物组成的组中的至少一种)混合的步骤，或者使果糖与固定有剑菌属菌株的支持物接触的步骤。剑菌属菌株与果糖的反应可以将果糖转化为阿洛酮糖，以由果糖获得阿洛酮糖。

为了在该方法中有效地生产阿洛酮糖，使用在反应混合物中浓度为40～70％(重量/体积)，例如浓度为50～70％(重量/体积)的作为底物的D-果糖。D-果糖的浓度低于下限可以以这种方式降低阿洛酮糖的经济可行性。另一方面，如果浓度高于上限，D-果糖不太容易溶解。因此，浓度优选落入上述范围内。D-果糖可以为在缓冲液或水(例如，蒸馏水)中的溶液的形式。

反应可以在6～9.5的pH下，例如，在7～9的pH下、在7～8的pH下或在8～9的pH下进行。另外，反应可以在30℃或更高的温度下，例如在40℃或更高的温度下进行。然而，底物D-果糖在80℃或更高的温度下可能有褐变的倾向。因此，反应可以在40～80℃，例如50～75℃、60～75℃或68～75℃的温度条件下进行。另外，较长的反应时间导致较高的阿洛酮糖转化率。推荐将反应进行1小时或更长，例如2小时或更长、3小时或更长、4小时或更长、5小时或更长或6小时或更长。然而，反应时间优选设定在48小时内，因为当反应时间延长超过48小时时，阿洛酮糖的转化率的增量变得微小，或者可能减小。因此，反应时间可以设定为1～48小时、2～48小时、3～48小时、4～48小时、5～48小时或6～48小时。考虑到工业和经济方面，反应时间可以落入1～48小时、2～36小时、3～24小时、3～12小时或3～6小时的范围内，但是不限于此。选择该条件以使由D-果糖到阿洛酮糖的转化率最大。

另外，在生产阿洛酮糖的方法中，可以将其浓度设定为在整个反应混合物中为5mg(dcw：干细胞重量)/ml或更高，例如5～100mg(dcw)/ml、10～90mg(dcw)/ml、20～80mg(dcw)/ml、30～70mg(dcw)/ml、40～60mg(dcw)/ml或45～55mg(dcw)/ml。如果细胞群的浓度低于下限，表现出弱的阿洛酮糖转化活性或几乎没有阿洛酮糖转化活性。另一方面，浓度超过上限意味着细胞拥挤，所述细胞有可能起到阿洛酮糖的整个转化率优化的阻碍物的作用。

酶(例如，差向异构酶)将果糖转化为阿洛酮糖的活性可能受到金属离子的控制。因此，金属离子的存在可能促进由酶蛋白催化的反应，从而提高阿洛酮糖的产量。通过使用剑菌属菌株生产阿洛酮糖的方法包括添加金属离子的步骤。在一种实施方式中，可以在细胞培养期间向培养基中添加金属离子，或者可以在添加有金属离子的培养基上进行培养。在另一种实施方式中，可以向包括果糖的底物或果糖与剑菌属菌株的混合物中添加金属离子。在另外的实施方式中，可以将金属离子添加到固定有剑菌属菌株的支持物、果糖与固定有剑菌属菌株的支持物的混合物或含有果糖的混合物中。

金属离子可以选自由铜离子、锰离子、钙离子、镁离子、锌离子、镍离子、钴离子、铁离子和铝离子及它们的任意组合组成的组。例如，金属离子可以是锰离子、镁离子、镍离子、钴离子或它们的混合物，或者可以是锰离子、钴离子或它们的混合物。当金属离子的量低于0.5mM，对阿洛酮糖的产量的提高只有略微作用。因此，使用量为0.5mM或更高的金属离子。另一方面，当金属离子的量超过5mM时，与该过剩的量相比，添加的作用不显著。将金属离子的量设定为5mM或更少。例如，使用量为0.5～5mM，例如0.5～2mM的金属离子。

只要为长时间保持菌株或由该菌株产生的酶蛋白的活性创建环境，可以使用任何用于将该菌株或该酶蛋白固定到其上的载体。例如，褐藻酸钠可以用作该支持物。褐藻酸钠，一种天然存在的在褐藻的细胞壁中大量发现的胶体多糖，由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸组成，二者之间为共价β1-4键。允许将菌株或酶稳定地固定于其上，线性聚合物可能对于阿洛酮糖的产量有利。在一种实施方式中，可以使用1.5～4.0％(重量/体积)的褐藻酸钠溶液(例如，褐藻酸钠水溶液)，例如约2.5％(重量/体积)的褐藻酸钠溶液来固定菌株。通过举例的方式，使菌株的细胞群、含有由该菌株产生的酶的培养肉汤或该菌株的裂解物与1～2体积的褐藻酸钠水溶液混合，使用注射泵和真空泵将该混合物滴入0.2M的钙离子溶液中，以形成该菌株的细胞群、含有由该菌株产生的酶的培养物或该菌株的裂解物固定于其上的小珠。可以使用通常的方法(例如，透析、沉淀、吸附、电泳、亲和色谱或离子交换色谱)将酶从菌株、菌株的培养物或菌株的裂解物中纯化出来。

在阿洛酮糖的生产中，可以额外使用非离子型表面活性剂来增加阿洛酮糖的生产率。该非离子型表面活性剂增强细胞膜的渗透性，使细胞内的酶释放出来，从而提高阿洛酮糖的生产率。非离子型表面活性剂可以是辛基酚聚氧乙烯醚(Triton X-100；C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)n；n＝9或10)(参见图8)。

用于生产阿洛酮糖的包含剑菌属菌株的组合物进一步包含非离子型表面活性剂，例如辛基酚聚氧乙烯醚。生产阿洛酮糖的方法进一步包括添加非离子型表面活性剂的步骤。在一种实施方式中，可以在细胞培养阶段向培养基中添加非离子型表面活性剂，或者可以在添加有非离子表面活性剂的培养基上进行细胞培养。在另一种实施方式中，可以将非离子型表面活性剂添加到包含果糖的反应底物中或者反应底物与剑菌属菌株的混合物中。在另外的实施方式中，可以将非离子型表面活性剂添加到固定有剑菌属菌株的支持物、果糖与固定有剑菌属菌株的支持物的混合物或含有果糖的混合物中。

添加的非离子型表面活性剂的量可以通过考虑阿洛酮糖的产量来确定，可以为0.01～0.5％(体积/体积)，例如，0.05～0.45％(体积/体积)、0.2～0.45％(体积/体积)或0.3～0.42％(体积/体积)。

根据本发明的生产阿洛酮糖的方法在不使用缓冲液的情况下用细胞将果糖转化为阿洛酮糖，从而使用简单工艺高产量生产阿洛酮糖。如图11中所示，在不使用缓冲液的情况下，在pH范围(例如，pH 7～9、pH 7～8或pH 8～9)下进行反应时，与在该pH范围之外进行的反应相比，阿洛酮糖的转化率被保持在高水平。

在使用本发明的方法由D-果糖生产阿洛酮糖后，可以通过本领域技术人员可容易地，例如，从由离心、过滤、结晶、离子交换色谱及组合组成的组中选择的通常方法纯化阿洛酮糖。

有益效果

本发明的新型的剑菌属菌株具有生产阿洛酮糖的活性，且在工业适用条件下的热稳定性优异，因此可以预期发现有用地广泛用在各种功能食品和药物中。

附图说明

图1是表示根据本发明的实施方式通过使用分离出的剑菌属菌株由果糖生产阿洛酮糖的TLC分析的照片(1：果糖或阿洛酮糖的标准；2～3：通过使用由分离出的剑菌属菌株的细胞裂解物获得的上清液生产的阿洛酮糖)。

图2是表示由高浓度果糖生产阿洛酮糖的HPLC图。

图3是根据本发明的实施方式的分离出的剑菌属菌株的***树分析的结果。

图4是表示阿洛酮糖生产量相对于细胞浓度的曲线图。

图5是表示阿洛酮糖生产量相对于反应温度的曲线图。

图6是表示阿洛酮糖生产量相对于反应pH的曲线图。

图7是表示阿洛酮糖生产量相对于金属离子的种类的曲线图。

图8是表示阿洛酮糖生产量相对于Triton X-100的浓度的曲线图。

图9是表示分离出的剑菌属菌株的热稳定性相对于温度的曲线图。

图10是表示进行6小时的阿洛酮糖生产量相对于不同反应温度的曲线图。

图11是表示在不使用缓冲液的情况下，阿洛酮糖生产量相对于反应底物的初始pH条件的曲线图，该初始pH条件通过使用HCl和NaOH控制。

具体实施方式

通过以下给出的用于举例说明本发明而不解释为本发明的限制的实施例可以获得对本发明更好的理解。

实施例1：具有将D-果糖转化为阿洛酮糖的活性的土壤细菌的分离

使用含有1％阿洛酮糖的基本培养基(KH₂PO₄ 2.4g/L、K₂HPO₄ 5.6g/L、(NH₄)₂·SO₄2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、酵母提取物1g/L)。

使1g根际土壤悬于10mL 0.85％(重量/体积)的NaCl中，将从该悬液中吸取的100μl(微升)在琼脂平板上铺开，并在30℃下孵育。在琼脂平板上形成的菌落中，选择形状和大小不同的那些菌落。将所选择的菌落接种到基本培养基中，并在30℃下在震荡培养24小时。离心分离细胞群。将该细胞群悬于100μL 50mM的PIPES(哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸))缓冲液(pH为8.0)中，并使用超声处理器(ColepParmer)使其裂解。在4℃下将裂解物以12000rmp离心裂解物10分钟后，分离由此形成的上清液，并用作粗酶。将10mM阿洛酮糖作为底物在30℃下用粗酶处理8小时。

通过薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)监测D-果糖向阿洛酮糖的转化。TLC分析使用20cm×5cm硅胶(硅胶60F254(Merck，德国))固相进行，用85:15的乙腈和水的混合物作为流动相展开3.5分钟，进行2次。对于HPLC，使用配备有Aminex HPX-87C柱(BIO-RAD)的折射率检测器(Agilent 1260RID)。将水用作流动溶剂，在80℃下流速为0.6ml/min。

TLC的结果在图1中示出。

根据TLC分析结果，选择具有将果糖转化为阿洛酮糖的活性的菌株，然后接种到含有1％(重量/体积)果糖和0.05％(重量/体积)阿洛酮糖的基本培养基中，并在30℃下培养24小时。通过离心分离细胞群。将该细胞群用0.85％(重量/体积)NaCl清洗，并以40mg-dcw/ml的浓度悬于含有400g/L果糖和1mM锰离子的50mM的PIPES缓冲液(pH为8.0)中，并使其与D-果糖在70℃下反应6小时，随后通过在100℃下将反应混合物加热5分钟使反应终止。HPLC分析证实了阿洛酮糖的产生。对于HPLC，在如上所述的条件下(溶剂：水；温度：80℃；流速：0.6ml/min)，使用配备有Aminex HPX-87C柱(BIO-RAD)的折射率检测器(Agilent1260RID)。结果在图2中给出。如图2中通过HPLC分析所分析的，最终选择一种发现产生最大量阿洛酮糖的菌株。

实施例2：对具有将D-果糖转化为阿洛酮糖的活性的细菌的鉴定

为了鉴定在实施例1中分离出的菌株，分析16s rRNA的核苷酸序列和生物化学性质。下面表示的SEQ ID NO:1示出了16s rRNA的核苷酸序列。

<16s rRNA的核苷酸序列>

5’->TGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGT

GGGAATCTACCCTTTTCTACGGAATAACGCAGGGAAACTTGTGCTAATAC

CGTATACGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGGAAAGGATGAGCCCGCGT

TGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAG

CTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAAC

TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGA

TCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTT

CACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTC

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTAC

TGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCG

GGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGGTGTCTAGAGTATGGAAG

AGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGG

AACACCAGTGGCGGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGC

GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTA

AACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTTTACTGTTCGGTGGCGCAGCTAA

CGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAA

GGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA

GCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGATCGCGGATTACGG

AGACGTTTTCCTTCAGTTCGGCTGGATCGGAGACAGGTGCTGCATGGCTG

TCGTCAGCTCGTGTCGTGGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA

CCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCC

GGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCT

TACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGA

GACCGCGAGGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCAC

TCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGC

ATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC

ATGGGAGTTGGTTCTACCCGAAGGTAGTGCGCTA->3’

如图3中所示，作为分离出的菌株的***树的结果，该分离出的菌株表现出与粘着剑菌100％的序列同一性，被指定为粘着剑菌SYG29。该菌株于2013年3月29日保藏在韩国微生物培养中心，然后以登记号KCCM11405P被受理。

分离出的菌株的生物化学性质总结在下表中。

表1

分类	反应
		硝酸盐还原	+
L-色氨酸降解	-
		D-葡萄糖发酵	-
精氨酸双水解酶	-
		脲酶	+
β-葡糖苷酶	+
		明胶水解	-
β-半乳糖苷酶	+
		D-葡萄糖利用	+
L-***糖利用	+
		D-甘露糖利用	+
D-甘露糖醇利用	+
		N-乙酰葡糖胺利用	+
D-麦芽糖利用	+
		葡糖酸钾利用	-
癸酸利用	-
		己二酸利用	-
苹果酸利用	+
		柠檬酸三钠利用	-
苯乙酸利用	-

实施例3：对通过使用细胞反应的阿洛酮糖的最佳生产条件的确定

为了分析pH和温度变化时阿洛酮糖的转化率，使分离出的菌株与底物在不同的pH和温度条件下反应，以比较阿洛酮糖的转化率。

3-1.针对细胞浓度的活性分析

为了考察用于生产阿洛酮糖的最小细胞浓度，将在实施例1中分离出的菌株以5～50g(dcw)/L的细胞浓度在添加有500g/L果糖和1mM的Mn离子的50mM的PIPES缓冲液(pH为7.0)中在60℃下孵育2小时。以13000rpm进行离心停止反应，并将上清液加热5分钟。然后，用HPLC分析来分析反应产物，以测量产生的阿洛酮糖。通过配备有Aminex HPX-87C柱(BIO-RAD)的折射率检测器(Agilent 1260RID)在上述条件下(溶剂：水；温度：80℃；流速：0.6ml/min)进行HPLC分析。

结果在图4中示出。如图4中所示，随着菌株的细胞浓度的增加，产生的阿洛酮糖的量增加。作为细胞反应的结果，当细胞浓度为50g(dcw)/L时，产生的阿洛酮糖的量为78.2g/L，为最大试验值。当细胞浓度为5g(dcw)/L时，检测到了菌株的转化活性。

3-2.针对反应温度的活性分析

为了考察关于阿洛酮糖生产的最佳温度，在与实施例3-1的相同条件下进行细胞反应，除了使实施例1中分离出的菌株以20mg(dcw)/ml的细胞浓度与底物在40～70℃的温度下反应以外。在反应2小时后，停止反应，然后根据实施例3-1的相同方法用HPLC分析进行分析，以测量产生的阿洛酮糖的量。

3-3.针对反应pH的活性分析

为了考察关于阿洛酮糖生产的最佳pH条件，在实施例3-1的相同条件下进行细胞反应，除了使在实施例1中分离出的菌株以25mg(dcw)/ml的细胞浓度与底物在添加有500g/L果糖和1mM的Mn离子的、pH为6.0～8.0的McIlvaine(具有各种量的0.1M柠檬酸和0.2M的磷酸氢二钠溶液来调节pH条件的缓冲液)和pH为8.5～9.5的100mM甘氨酸中在70℃下反应以外。在反应完成后，停止反应，然后根据实施例3-1的相同方法用HPLC分析进行分析以测量产生的阿洛酮糖的量。

测试结果在图6中示出。如图6中所示，pH为7.0～9.0时转化活性高。在pH为7.0～8.0的中性pH条件下，可有效地生产阿洛酮糖。

3-4.针对金属离子的活性分析

为了考察对金属离子的依赖性，在存在溶解于PIPES中的CuCl₂、MnCl₂、CaCl₂、ZnSO₄、MgSO₄、NiSO₄、CoCl₂或FeSO₄的1mM金属离子的情况下，使分离出的菌株与添加400g/L果糖的50mM PIPES(哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸))缓冲液(pH为7.0)在55℃下反应。在反应完成后，停止反应，然后根据实施例3-1的相同方法用HPLC分析进行分析以测量产生的阿洛酮糖的量。

测试结果在图7中示出。如图7中所示，与不存在金属离子的情况相比，当使用Mn离子和Co离子时，转化活性相对较高。

实施例4：用于大量生产阿洛酮糖的条件

4-1.针对Triton X-100浓度的阿洛酮糖的生产量

增加Triton X-100的浓度以增加细胞膜的渗透性可以使细胞膜内的酶释放出来，从而缩短阿洛酮糖的生产时间。

为了通过使用细胞反应有效地生产阿洛酮糖，通过改变Triton X-100的加入量来分析阿洛酮糖的生产量。将反应在60℃下进行2小时，并根据实施例3-1(果糖500g/L，1mM的Mn离子)的相同方法用HPLC进行分析，除了使用细胞浓度为20mg(dcw)/ml的分离出的菌株，添加0～0.5％(体积/体积)的Triton X-100以外。在反应完成后，通过HPLC分析测量产生的阿洛酮糖的量。

HPLC分析结果在图8中示出。如图8中所示，添加Triton X-100的反应表明，与不添加Triton X-100(Triton X-100的浓度：0％(体积/体积))的情况相比，阿洛酮糖生产量增加。当Triton X-100的浓度为0.4％(体积/体积)时，最高阿洛酮糖生产量为48.9g/L。

4-2.细胞的热稳定性

为了考察分离出的菌株的热稳定性，将在实施例1中获得的菌株悬于添加有1mM的Mn离子的50mM PIPES缓冲液中，并在55℃或60℃下用热击加热22小时进行处理。然后，根据实施例3-1的相同方法使反应在最终果糖浓度为400g/L、细胞浓度为20mg(dcw)/ml、55℃的情况下进行另外1小时。通过HPLC分析测量关于热击时间的阿洛酮糖生产量。

HPLC分析结果在图9中示出。如图9中所示，当在55℃下对细胞进行热击时，与没有热击相比，在热击22小时后，保持有大约52％的相对活性。当在60℃下对细胞进行热击时，相对活性降低至大约10％。结果，细胞活性的半寿期为456分钟(7.6小时)。

4-3.阿洛酮糖生产量

在为大量生产阿洛酮糖所建立的条件下，通过改变反应时间测试最大阿洛酮糖生产量。根据实施例3-1的方法，使在实施例1中分离出的菌株在细胞浓度为40mg-dcw/ml、果糖浓度为500g/L和pH为7.0的情况下，在40、50或70℃的温度下反应。反应时间为6小时，用HPLC以1小时为间隔分析阿洛酮糖生产量。通过在100℃下加热5分钟停止反应。

HPLC分析在图10中示出。如图10中所示，随着反应温度的增加和反应时间的过去，阿洛酮糖的生产量增加。特别地，当在70℃下进行反应时，6小时后，最大阿洛酮糖生产量达到生产的阿洛酮糖的量为130.3g/L，转化率为约26％。

4-4.针对初始pH条件的阿洛酮糖生产量

为了测试在初始pH条件下大量生产阿洛酮糖的可能性，使底物溶解于蒸馏水中，而不是缓冲液中，并用HCl和NaOH调节初始pH。通过参照实施例3-1的方法，在70℃、果糖为400g/L、Mn离子为1mM、细胞浓度为40mg(dcw)/ml，且添加0.4％(体积/体积)的Triton X-100的情况下，在初始pH条件为6.0、6.5或7.0时进行反应。在反应完成后，通过HPLC分析来测量产生的阿洛酮糖的量。

HPLC分析结果在图11中示出。如图11中所示，当通过使用底物溶液在初始pH为7.0的条件下进行反应时，在不存在缓冲液的情况下反应6小时后产生的阿洛酮糖的量为97.3g/L，转化率为24.3％。

登记号

保藏单位：韩国微生物培养中心

登记号：KCCM11405P

保藏日期：2013年3月29日

(翻译文)

对于原保藏的保藏证明

收件人：三养吉尼克斯

韩国首尔钟路区莲池洞263

(邮编)110-725

证明上述翻译文与原件没有差异

Claims

1.一种通过使用剑菌属(Ensifer sp.)菌株由果糖生产阿洛酮糖的方法，其中，所述剑菌属菌株为以登记号KCCM11405P保藏的粘着剑菌(Ensifer adhaerens)SYG29。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述剑菌属菌株为选自由剑菌属菌株的细胞、细胞培养物和细胞裂解物组成的组中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括使剑菌属菌株与果糖反应的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述使剑菌属菌株与果糖反应的步骤是通过在含有果糖的培养基上培养剑菌属菌株来进行的。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述使剑菌属菌株与果糖反应的步骤包括将所述果糖与选自由剑菌属菌株的细胞、细胞培养物和细胞裂解物组成的组中的至少一种混合的步骤。

6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述使剑菌属菌株与果糖反应的步骤包括使所述果糖与固定有选自由剑菌属菌株的细胞、细胞培养物和细胞裂解物组成的组中的至少一种的支持物接触的步骤。

7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法进一步包括添加至少一种选自由Cu、Mn、Ca、Mg、Zn、Ni、Co、Fe和Al离子组成的组的金属离子的步骤。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述方法在不使用缓冲液的情况下进行。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，使用浓度为以重量/重量计的40～75％的所述果糖。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述方法在pH为6～9且温度为40～80℃下进行。

11.一种用于由果糖生产阿洛酮糖的组合物，包含剑菌属菌株，其中，所述剑菌属菌株为以登记号KCCM11405P保藏的粘着剑菌SYG29。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述剑菌属菌株为选自由剑菌属菌株的细胞、细胞培养物和细胞裂解物组成的组中的至少一种。

13.一种粘着剑菌菌株，其具有将果糖转化为阿洛酮糖的活性，其中，所述粘着剑菌菌株为以登记号KCCM11405P保藏的粘着剑菌SYG29。