JP2017225432A - 組換え酵母、及びそれを用いたエタノールの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子(EC 1.2.1.10)を導入し、且つトレハロース蓄積に関与する酵素を制御した組換え酵母。
【選択図】なし
Description
アセトアルデヒド+NAD++コエンザイムA⇔アセチルコエンザイムA+NADH+H+
0.5グルコース+NADH+H++ATP→グリセリン+NAD++ADP+Pi
アセチルコエンザイムA+NADH+H+→アセトアルデヒド+NAD++コエンザイムA
酢酸+2NADH+2H++ATP→エタノール+NAD++AMP+Pi
(1)アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子(EC 1.2.1.10)を導入し、且つトレハロース蓄積に関与する酵素を制御した組換え酵母。
(2)アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、大腸菌由来のアセトアルデヒド脱水素酵素をコードするものである、(1)記載の組換え酵母。
(3)大腸菌由来のアセトアルデヒド脱水素酵素は、以下の(a)又は(b)のタンパク質である、(2)記載の組換え酵母。
(a)配列番号2、4又は6に示すアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)配列番号2、4又は6に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つアセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質
(4)トレハロース蓄積に関与する酵素の制御が、トレハラーゼ遺伝子の発現量の低下である、(1)〜(3)のいずれか1記載の組換え酵母。
(5)更にキシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されたものである、(1)〜(4)のいずれか1記載の組換え酵母。
(6)キシロースイソメラーゼは、以下の(a)又は(b)のタンパク質である、(5)記載の組換え酵母。
(a)配列番号12に示すアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)配列番号12に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、キシロースをキシルロースにする酵素活性を有するタンパク質
(7)更にキシルロキナーゼ遺伝子が導入されたものである、(1)〜(6)のいずれか1記載の組換え酵母。
(8)ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群より選択される酵素をコードする遺伝子が更に導入されたものである、(1)〜(7)のいずれか1記載の組換え酵母。
(9)ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群は、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、リブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼである、(8)記載の組換え酵母。
(10)アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子を高発現する、(1)〜(9)のいずれか1記載の組換え酵母。
(11)エタノールをアセトアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子の発現量が低下したものである、(1)〜(10)のいずれか1記載の組換え酵母。
(12)(1)〜(11)のいずれか1記載の組換え酵母を、グルコース及び/又はキシロースを含有する培地において培養してエタノール発酵を行う工程を含む、エタノールの製造方法。
(13)培地はセルロースを含有しており、エタノール発酵では、少なくともセルロースの糖化が同時に進行する、(12)記載の方法。
本発明に係る組換え酵母は、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子(EC 1.2.1.10)を導入し、且つ細胞内のトレハロース蓄積量を増加させるようにトレハロース蓄積に関与する酵素を制御した組換え酵母である。本発明に係る組換え酵母は、培地に含まれる酢酸を代謝することができ、エタノール発酵等の培養に伴って培地中の酢酸濃度が低減するといった特徴がある。
上述したアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を宿主となる酵母のゲノムに導入し、且つトレハロース蓄積に関与する酵素を当該酵母で制御することにより、本発明に係る組換え酵母を作製することができる。ここで、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、キシロース代謝能を有しない酵母に導入しても良いし、キシロース代謝能を本来的に有する酵母に導入しても良いし、キシロース代謝能を有しない酵母にキシロース代謝関連遺伝子と共に導入されても良い。また、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子及び上述した遺伝子を酵母に導入する際、全ての遺伝子を同時に導入しても良いし、異なる発現ベクターを利用して逐次導入しても良い。
本発明に係るエタノールの製造方法は、上記組換え酵母を使用し、培地に含まれる糖源からエタノールを合成する方法である。本発明に係るエタノールの製造方法では、上記組換え酵母により培地に含まれる酢酸を代謝することができ、エタノール発酵に伴って培地中の酢酸濃度が低減するといった特徴がある。
本実施例では、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入し、且つトレハロース蓄積に関与するNTH1遺伝子を破壊した組換え酵母を作製し、この組換え酵母の酢酸代謝能を評価した。
(1)XI・XKS1・TKL1・TAL1・RKI1・RPE1遺伝子導入及びGRE3遺伝子破壊用プラスミド
GRE3遺伝子座にGRE3遺伝子を破壊しながら、ヤマトシロアリ(Reticulitermes speratus)腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子(塩基配列:配列番号11及びアミノ酸配列:配列番号12)の337番目のアミノ酸をアスパラギンからシステインに置換され、キシロースの資化速度が向上した変異遺伝子(XI_N337C;国際公開第2014/156194号のSEQ ID NO:48)、酵母由来のキシルロキナーゼ(XKS1)遺伝子(塩基配列:配列番号17及びアミノ酸配列:配列番号18)、ペントースリン酸回路のトランスケトラーゼ1(TKL1)遺伝子(塩基配列:配列番号19及びアミノ酸配列:配列番号20)、トランスアルドラーゼ1(TAL1)遺伝子(塩基配列:配列番号21及びアミノ酸配列:配列番号22)、リブロースリン酸エピメラーゼ1(RPE1)遺伝子(塩基配列:配列番号23及びアミノ酸配列:配列番号24)、リボースリン酸ケトイソメラーゼ(RKI1)遺伝子(塩基配列:配列番号25及びアミノ酸配列:配列番号26)を酵母に導入するために必要な配列を含むプラスミド、pUC-5U_GRE3- P_HOR7- TKL1- TAL1-FBA1_P-P_ADH1-RPE1- RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1- P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3を作製した。
ADH2遺伝子座にADH2遺伝子(塩基配列:配列番号15及びアミノ酸配列:配列番号16)を破壊しながら、E. coli由来のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子(mhpF)(塩基配列:配列番号1及びアミノ酸配列:配列番号2)及び、酵母由来のアルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH1)遺伝子(塩基配列:配列番号13及びアミノ酸配列:配列番号14)を酵母に導入するために必要な配列を含むプラスミド、pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2を作製した。
ADH2遺伝子座にADH2遺伝子(塩基配列:配列番号15及びアミノ酸配列:配列番号16)を破壊しながら、E. coli由来のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子(adhE)(塩基配列:配列番号3及びアミノ酸配列:配列番号4)及び、酵母由来のアルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH1)遺伝子(塩基配列:配列番号13及びアミノ酸配列:配列番号14)を酵母に導入するために必要な配列を含むプラスミド、pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-adhE-HOR7_P-URA3-3U_ADH2を作製した。
ADH2遺伝子座にADH2遺伝子(塩基配列:配列番号15及びアミノ酸配列:配列番号16)を破壊しながら、E. coli由来のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子(eutE)(塩基配列:配列番号5及びアミノ酸配列:配列番号6)及び、酵母由来のアルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH1)遺伝子(塩基配列:配列番号13及びアミノ酸配列:配列番号14)を酵母に導入するために必要な配列を含むプラスミド、pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-eutE-HOR7_P-URA3-3U_ADH2を作製した。
NTH1遺伝子を破壊するために必要な配列を含むプラスミド、pCR-5U_NTH1U- LoxP-G418-LoxP -3U_NTH1を作製した。
NTH1遺伝子のターミネーターについて、発現量が弱いターミネーターであるGIC1(US20130244243)と置き換えるために必要な配列を含むプラスミド、pUC-5U_NTH1-NTH1-T_GIC1-LoxP-P_CYC1-G418-T_URA3-LoxP-3U_NTH1を作製した。
機能していないURA3遺伝子座のURA3遺伝子を相同組換えにより野生型に戻すための野生型URA3遺伝子断片をOC2株より増幅した。本DNA断片は表1のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。
Cre遺伝子をマルチコピーで発現するためのプラスミドpYES-Creを作製した。
2倍体酵母のSaccharomyces cerevisiae OC2株(NBRC2260)を5-フルオロオロチン酸添加培地で選抜し(Boeke, J.D., et al. 1987 Methods Enzymol.;154:164-75.)、ウラシル要求性となった株(OC2U)を宿主とした。
なお、それぞれの株はヘテロに(1コピー)組換えが起こっていることを確認した。
最終的に作製した株の遺伝子型をまとめると以下の表2になる。
作製した株からそれぞれ発酵能力が高い2株を選び、フラスコ発酵試験を以下のように実施した。
カラム:AminexHPX-87H
移動相:0.01N H2SO4
流量:0.6ml/min
温度:30℃
検出器:示差屈折率検出器 RID-10A
表3及び4に示すように、コントロール株及びNTH1の破壊した株は酢酸を資化しなかったが、ADH2を破壊、ADH1とアセトアルデヒド脱水素酵素を過剰発現した株と、それらの株に追加してNTH1を破壊した株(Uz1607dS、Uz1811dS、Uz1822dS)は酢酸の資化が改善した。
Claims (13)
- アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子(EC 1.2.1.10)を導入し、且つトレハロース蓄積に関与する酵素を制御した組換え酵母。
- アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、大腸菌由来のアセトアルデヒド脱水素酵素をコードするものである、請求項1記載の組換え酵母。
- 大腸菌由来のアセトアルデヒド脱水素酵素は、以下の(a)又は(b)のタンパク質である、請求項2記載の組換え酵母。
(a)配列番号2、4又は6に示すアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)配列番号2、4又は6に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つアセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質 - トレハロース蓄積に関与する酵素の制御が、トレハラーゼ遺伝子の発現量の低下である、請求項1〜3のいずれか1項記載の組換え酵母。
- 更にキシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されたものである、請求項1〜4のいずれか1項記載の組換え酵母。
- キシロースイソメラーゼは、以下の(a)又は(b)のタンパク質である、請求項5記載の組換え酵母。
(a)配列番号12に示すアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)配列番号12に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、キシロースをキシルロースにする酵素活性を有するタンパク質 - 更にキシルロキナーゼ遺伝子が導入されたものである、請求項1〜6のいずれか1項記載の組換え酵母。
- ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群より選択される酵素をコードする遺伝子が更に導入されたものである、請求項1〜7のいずれか1項記載の組換え酵母。
- ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群は、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、リブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼである、請求項8記載の組換え酵母。
- アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子を高発現する、請求項1〜9のいずれか1項記載の組換え酵母。
- エタノールをアセトアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子の発現量が低下したものである、請求項1〜10のいずれか1項記載の組換え酵母。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載の組換え酵母を、グルコース及び/又はキシロースを含有する培地において培養してエタノール発酵を行う工程を含む、エタノールの製造方法。
- 培地はセルロースを含有しており、エタノール発酵では、少なくともセルロースの糖化が同時に進行する、請求項12記載の方法。
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