JP2017143759A - 細胞観察装置および細胞観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ブラケット撮像の撮像回数の増加を抑制しつつ、精度良く合焦点位置を推測する技術を提供する。
【解決手段】細胞が収容された容器を、焦点位置を変更して撮像可能な撮像装置３０と、容器を照射する照明装置４０と、撮像装置３０を制御する制御部１０とを有する。制御部１０は、撮像装置３０に前記焦点位置を変えながら複数のブラケット画像Ｄ１を撮像させるブラケット撮像制御部７１と、各ブラケット画像Ｄ１の画素値の分散値Ｄ２を算出する分散値算出部７２と、各ブラケット画像Ｄ１のエッジの強さを表すエッジ指標値Ｄ３を算出するエッジ指標値算出部７３と、分散値Ｄ２およびエッジ指標値Ｄ３から合焦点位置において極小値を有するフォーカス評価値Ｄ４を算出するフォーカス評価値算出部７４と、フォーカス評価値Ｄ４が極小値を有する焦点位置を算出して合焦点位置を推測する合焦点位置推測部７５とを含む細胞観察装置１。
【選択図】図２

Description

本発明は、細胞観察装置および細胞観察方法に関する。

培養容器内で培養された細胞を観察する際には、細胞の観察に適した焦点位置を見つける必要がある。従来、培養容器内の細胞に対する合焦点位置を検出するために、焦点位置をずらしつつ複数枚の画像を取得する、所謂ブラケット撮像が行われることが知られている。ブラケット撮像については、例えば、特許文献１に記載されている（段落００１９）。

特開２０１５−８２０９６号公報

複数のブラケット画像について、例えば、その画素値の分散値を求めることにより、合焦点位置を推測できる。しかしながら、当該分散値は、合焦点位置付近で急峻に変化する。このため、精度良く合焦点位置を推測するためには、撮像間隔を短くする必要がある。すなわち、ブラケット撮像の枚数が多いほど、合焦点位置を正確に推測できる。しかしながら、撮像時には、細胞に対して照明光を照射するため、ブラケット撮像の撮像回数が多いほど、照明光による細胞へのダメージが大きくなる。したがって、細胞へのダメージを最小限に抑えつつ適切に細胞を観察するためには、少ない枚数のブラケット撮像画像から精度良く合焦点位置を正確に推測する必要がある。

本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、ブラケット撮像の撮像回数を抑制しつつ、精度良く合焦点位置を推測する技術を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本願の第１発明は、二次元培養された細胞を観察する細胞観察装置であって、前記細胞が収容された容器を、焦点位置を変更して撮像可能な撮像装置と、前記容器を照射する照明装置と、前記撮像装置を制御する制御部と、を有し、前記制御部は、前記撮像装置に前記焦点位置を変えながら複数のブラケット画像を撮像させるブラケット撮像制御部と、前記ブラケット画像のそれぞれについて、画素値の分散値を算出する分散値算出部と、前記ブラケット画像のそれぞれに対して、エッジの強さを表すエッジ指標値を算出するエッジ指標値算出部と、前記分散値および前記エッジ指標値に基づいて、前記ブラケット画像のそれぞれに対して、前記合焦点位置において極小値を有するフォーカス評価値を算出するフォーカス評価値算出部と、前記ブラケット画像のそれぞれに対する前記フォーカス評価値に基づいて、前記フォーカス評価値が極小値を有する前記焦点位置を算出し、前記合焦点位置を推測する合焦点位置推測部と、を含む。

本願の第２発明は、第１発明の細胞観察装置であって、前記フォーカス評価値算出部は、フォーカス評価値＝分散値／（エッジ指標値）＾２として前記フォーカス評価値を算出する。

本願の第３発明は、第１発明または第２発明の細胞観察装置であって、前記エッジ指標値算出部は、前記ブラケット画像のそれぞれに対して、ハイパスフィルタ画像を生成し、前記ハイパスフィルタ画像に基づいて、エッジ成分が強いほど大きい値を有する前記エッジ指標値を算出する。

本願の第４発明は、第３発明の細胞観察装置であって、前記エッジ指標値算出部は、前記ハイパスフィルタ画像の分散値を前記エッジ指標値とする。

本願の第５発明は、第１発明ないし第４発明のいずれかの細胞観察方法であって、前記制御部は、前記合焦点位置推測部が推測した前記合焦点位置から所定の距離ずれた位置を焦点位置として、前記撮像装置に前記細胞の観察用画像を撮像させる観察用画像撮像制御部をさらに有する。

本願の第６発明は、二次元培養された細胞を観察する細胞観察方法であって、ａ）焦点位置を変えながら複数のブラケット画像を撮像するブラケット撮像工程と、ｂ）前記ブラケット画像のそれぞれについて、画素値の分散値を算出する工程と、ｃ）前記ブラケット画像のそれぞれに対して、エッジの強さを表すエッジ指標値を算出する工程と、ｄ）前記ブラケット画像のそれぞれに対して、前記分散値および前記エッジ指標値に基づいて、前記合焦点位置において極小値を有するフォーカス評価値を算出する工程と、ｅ）前記ブラケット画像における前記焦点位置と前記フォーカス評価値の関係に基づいて、前記フォーカス評価値が極小値を有する前記焦点位置を算出し、前記合焦点位置を推測する工程と、を有する。

本願の第７発明は、第６発明の細胞観察方法であって、前記工程ｄ）において、前記複数の画像のそれぞれの前記フォーカス評価値は、フォーカス評価値＝分散値／（エッジ指標値）＾２として算出される。

本願の第８発明は、第６発明または第７発明の細胞観察方法であって、前記工程ｃ）は、ｃ１）前記ブラケット画像のそれぞれに対して、ハイパスフィルタ画像を生成する工程と、ｃ２）前記ハイパスフィルタ画像に基づいて、エッジ成分が大きいほど大きい値を有する前記エッジ指標値を算出する工程と、を含む。

本願の第９発明は、第８発明の細胞観察方法であって、前記エッジ指標値は、前記ハイパスフィルタ画像の画素値の分散値である。

本願の第１０発明は、第８発明または第９発明の細胞観察方法であって、前記工程ｃ１）は、ｃ１１）前記複数の画像のそれぞれに対して、ガウスフィルタ処理を施して、ローパスフィルタ画像を取得する工程と、ｃ１２）前記複数の画像のそれぞれに対して、元画像と前記ローパスフィルタ画像との各画素値との比較により、前記ハイパスフィルタ画像を生成する工程と、を含む。

本願の第１１発明は、第８発明または第９発明の細胞観察方法であって、前記工程ｃ１）は、ｃ１３）前記複数の画像のそれぞれに対して、フーリエ変換を行う工程と、ｃ１４）フーリエ変換後の前記複数の画像の低周波成分を除去する工程と、ｃ１５）前記低周波成分を除去したフーリエ変換後の前記複数の画像のそれぞれに対して、逆フーリエ変換を行う工程と、を含む。

本願の第１２発明は、第６発明ないし第１１発明のいずれかの細胞観察方法であって、前記工程ｅ）において、複数の前記フォーカス評価値のうち、前記極小値付近の３つの前記フォーカス評価値に対してパラボラフィッティングを行うことにより、前記フォーカス評価値が極小値を有する前記焦点位置を算出する。

本願の第１３発明は、第６発明ないし第１２発明のいずれかの細胞観察方法であって、ｆ）前記工程ｅ）において推測した前記合焦点位置から所定の距離ずれた位置を焦点位置として、前記細胞の撮像を行う。

本願の第１発明から第１３発明によれば、ブラケット画像の撮像枚数を抑制しつつ、精度良く合焦点位置を推測できる。

細胞観察装置の概略図である。 細胞観察装置の制御系統を示したブロック図である。 細胞観察装置における観察画像取得処理の流れを示したフローチャートである。 ブラケット撮像を行う撮像範囲を示した図である。 焦点位置と分散値Ｄ２との関係の例を１μｍ間隔で示した図である。 焦点距離と細胞の見え方との関係を模式的に示した図である。 焦点位置と分散値Ｄ２との関係の例を３μｍ間隔で示した図である。 焦点位置と分散値Ｄ２との関係の例を４μｍ間隔で示した図である。 焦点位置とブラケット画像のハイパスフィルタ画像の画素値の分散値との関係の例を示した図である。 焦点位置とフォーカス評価値との関係の例を１μｍ間隔で示した図である。 焦点位置とフォーカス評価値との関係の例を３μｍ間隔で示した図である。 焦点位置とフォーカス評価値との関係の例を４μｍ間隔で示した図である。 観察用画像の撮像範囲を示した図である。 変形例に係る細胞観察装置においてブラケット撮像を行う撮像範囲を示した図である。 変形例に係る細胞観察装置における、焦点位置とフォーカス評価値との関係の例を示した図である。 変形例に係る細胞観察装置における、焦点位置とハイパスフィルタ画像の画素値の平均値との関係の例を示した図である。 変形例に係る細胞観察装置における、焦点位置とフォーカス評価値との関係の例を示した図である。 変形例に係る細胞観察装置における、焦点位置とフォーカス評価値との関係の例を示した図である。 変形例に係る細胞培養容器の斜視図である。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明する。

＜１．細胞観察装置の構成＞
図１は、本発明の一実施形態に係る細胞観察装置１の概略図である。本実施形態の細胞観察装置１は、容器支持部２１上に載置された培養容器９内に保持された細胞の画像を取得する装置である。図１に示すように、本実施形態の培養容器９は、ガラスや樹脂等で形成されたシャーレである。培養容器９は、内部に培養液９１を収容するとともに、観察対象である細胞９２を培養液９１中に保持する。

培養容器９の内部において細胞９２を培養することにより、培養容器９の底部に沿って２次元的に細胞９２が培養される。

図１に示すように、細胞観察装置１は、装置本体２０と、撮像装置３０と、照明装置４０と、移動機構５０と、操作部６０と、制御部１０とを有する。

装置本体２０は、撮像装置３０および照明装置４０を支持する筐体である。撮像装置３０および照明装置４０は、装置本体２０に対して、水平方向に移動可能に支持される。また、装置本体２０は、培養容器９を支持する容器支持部２１を有する。培養容器９は、その底部が下側となる水平姿勢で、容器支持部２１にセットされる。

撮像装置３０は、容器支持部２１の下方に配置される。撮像装置３０は、細胞９２が収容された培養容器９を、焦点位置を変更して撮像可能である。すなわち、撮像装置３０は、培養容器９を下方から撮像することにより、細胞９２を含む培養容器９の画像データを取得する。撮像装置３０は、例えば、レンズ等の光学系と、ＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子とを有するカメラにより実現される。

照明装置４０は、容器支持部２１の上方に配置される。照明装置４０は、撮像装置３０の動作時に、撮影対象となる培養容器９に対して上側から白色の照明光を照射する。これにより、培養容器９に収容された細胞９２に照明光が照射される。

なお、照明装置４０は、培養容器９内の細胞９２に対して照明光を照射するものであればよい。したがって、照明装置４０の光源の位置は、培養容器９の上方に限られない。照明装置４０の光源は、培養容器９の上方から外れた位置に配置され、ミラー等の光学系を介して、培養容器９に照明光が照射される構成であってもよい。

また、本実施形態では、撮像装置３０が培養容器９の下方に配置され、照明装置４０が培養容器９の上方に配置されたが、本発明の細胞観察装置は、このような構造に限られない。撮像装置３０が培養容器９の上方に配置され、照明装置４０が培養容器９の下方に配置されてもよい。また、撮像装置３０と照明装置４０との双方が、培養容器９の上方に配置されてもよいし、培養容器９の下方に配置されてもよい。

移動機構５０は、撮像装置３０および照明装置４０を、装置本体２０に対して水平方向に移動するための機構である。移動機構５０は、撮像装置３０と照明装置４０との相対位置を変えることなく、撮像装置３０および照明装置４０を移動する。

本実施形態の細胞観察装置１では、撮像装置３０による撮像範囲と、照明装置４０による光の照射範囲とが、いずれも、培養容器９の大きさよりも小さい。このため、培養容器９の全体に対して撮像を行うためには、撮像装置３０と照明装置４０とを水平方向に移動させつつ、複数回の撮像を行う必要がある。

培養容器９の所定箇所において画像データを取得する時には、まず、移動機構５０が撮像装置３０および照明装置４０を所定の位置に配置する。これにより、撮像装置３０の撮像範囲と、照明装置４０の照射範囲とを、画像データを取得する対象箇所に重なるように配置する。そして、照明装置４０から培養容器９に向けて照明光が照射されるとともに、撮像装置３０が培養容器９を撮影する。ここで撮影される画像には、培養容器９の底部に沿って保持された細胞９２が含まれる。

また、培養容器９の底部の全体に対して画像データを取得する時には、まず、移動機構５０が撮像装置３０および照明装置４０を所定の初期位置に配置する。そして、照明装置４０による照明光の照射および撮像装置３０による撮影と、移動機構５０による撮像装置３０および照明装置４０の移動とを繰り返すことにより、培養容器９の底部の全体を走査しつつ撮影する。

操作部６０は、表示部６１および入力部６２を有する。表示部６１には、制御部１０から入力される培養容器９の画像データが表示される。表示部６１には、例えば、液晶ディスプレイが用いられる。オペレータは、入力部６２から制御部１０への指令を入力できる。入力部６２には、例えば、キーボードやマウスが用いられる。

制御部１０は、細胞観察装置１内の各部を動作制御するための部位である。図１中に概念的に示したように、本実施形態の制御部１０は、ＣＰＵ等の演算処理部１１、ＲＡＭ等のメモリ１２、およびハードディスクドライブ等の記憶部１３を有するコンピュータにより構成されている。

図２は、細胞観察装置の制御系統を示したブロック図である。制御部１０は、図２に示したように、撮像装置３０、照明装置４０、移動機構５０、表示部６１および入力部６２と、それぞれ電気的に接続されている。

制御部１０は、記憶部１３に記憶されたコンピュータプログラム１３１やデータ１３２を、メモリ１２に一時的に読み出し、当該コンピュータプログラム１３１およびデータ１３２に基づいて、演算処理部１１が演算処理を行うことにより、細胞観察装置１内の各部を動作制御する。これにより、細胞観察装置１における細胞観察処理が進行する。なお、制御部１０は、電子回路により構成されていてもよい。

また、図２に示すように、制御部１０は、ソフトウェア上で実現される処理部として、ブラケット撮像制御部７１と、分散値算出部７２と、エッジ指標値算出部７３と、フォーカス評価値算出部７４と、合焦点位置推測部７５と、観察用焦点位置決定部７６と、観察用画像撮像制御部７７とを有する。

ブラケット撮像制御部７１は、撮像装置３０に、焦点位置を変えながら複数の画像を撮像させる。すなわち、ブラケット撮像制御部７１は、撮像装置３０にブラケット撮像を行わせる。なお、ブラケット撮像により取得した複数の画像を、ブラケット画像Ｄ１と称する。

分散値算出部７２は、ブラケット画像Ｄ１のそれぞれについて、画素値の分散値Ｄ２を算出する。エッジ指標値算出部７３は、ブラケット画像Ｄ１のそれぞれに対して、エッジの強さを表すエッジ指標値Ｄ３を算出する。エッジ指標値Ｄ３の詳細については、後述する。

フォーカス評価値算出部７４は、分散値算出部７２が算出した分散値Ｄ２と、エッジ指標値算出部７３が算出したエッジ指標値Ｄ３とに基づいて、ブラケット画像Ｄ１のそれぞれに対してフォーカス評価値Ｄ４を算出する。フォーカス評価値Ｄ４の詳細については、後述する。

合焦点位置推測部７５は、ブラケット画像Ｄ１のそれぞれに対するフォーカス評価値Ｄ４に基づいて、合焦点位置を推測し、推測合焦点位置Ｄ５を算出する。推測合焦点位置Ｄ５は、フォーカス評価値Ｄ４が極小値を有する焦点位置とされる。

観察用焦点位置決定部７６は、推測合焦点位置Ｄ５に基づいて、観察用画像を撮像する際の焦点位置である観察用焦点位置Ｄ６を決定する。観察用画像撮像制御部７７は、観察用焦点位置Ｄ６を焦点位置として、撮像装置３０に培養容器９中の細胞９２の画像を撮像させる。

＜２．細胞観察処理について＞
次に、細胞観察装置１における細胞観察処理について、図３を参照しつつ説明する。図３は、本実施形態の細胞観察処理の流れを示すフローチャートである。

細胞観察処理においては、まず、培養容器９を容器支持部２１に配置する（ステップＳ１０１）。このとき、オペレータが、培養容器９を容器支持部２１に手動で載置してもよい。あるいは、細胞観察装置１が、自動で培養容器９を容器支持部２１へ載置する移動機構を有していてもよい。

次に、ブラケット撮像制御部７１がブラケット撮像を行う（ステップＳ１０２）。図４は、ブラケット撮像を行う撮像範囲Ａ１を示した図である。図４では、容器支持部２１に保持された培養容器９を下方から見た様子が示されている。なお、図４中、培養容器９内の細胞９２については、図示を省略している。本実施形態では、ブラケット撮像を行う撮像範囲Ａ１は、培養容器９の略中央に配置されている。なお、ブラケット撮像を行う撮像範囲Ａ１は、培養容器９の略中央に限られない。撮像範囲Ａ１は、細胞９２の多い領域に設定されることが好ましい。

ブラケット撮像において、ブラケット撮像制御部７１は、まず、移動機構５０を駆動させて、撮像装置３０および照明装置４０を撮像範囲Ａ１の撮像位置へ配置する。続いて、ブラケット撮像制御部７１は、照明装置４０と撮像装置３０とを駆動させて、焦点位置を変えながら複数のブラケット画像Ｄ１を取得する。

続いて、撮像範囲Ａ１について、推測合焦点位置Ｄ５を推測する（ステップＳ１０２〜ステップＳ１０７）。まず、分散値算出部７２が、複数のブラケット画像Ｄ１のそれぞれについて、画素値の分散値Ｄ２を算出する。図５は、焦点位置を１μｍ間隔で変更しつつブラケット画像Ｄ１を取得した場合の、焦点位置（横軸）と分散値Ｄ２（縦軸）との関係の例を示した図である。図６は、焦点距離と細胞の見え方との関係を模式的に示した図である。

図５に示すように、分散値Ｄ２は、２つの極大値と、１つの極小値とを有する。分散値Ｄ２は、合焦点位置において極小値を有し、合焦点位置から近距離方向および遠距離方向のそれぞれに一定距離ずれた焦点位置において極大値を有する。

図６中に模式的に示したように、細胞が透明であるため、合焦点位置において、細胞内部と細胞外部との輝度は近似している。このため、ブラケット画像Ｄ１の分散値Ｄ２は低く、極小値をとる。また、合焦点位置に近づくにつれ、エッジの強さが強くなるが、合焦点位置のごく近傍では、エッジが弱くなる。そして、合焦点位置においては、細胞がほぼ視認できない状態となる。

合焦点位置から近距離方向へ焦点位置をずらすと、細胞内部が細胞外部よりも白く見える。細胞内部と細胞外部との輝度が大きく異なるため、合焦点位置から一定距離近距離方向へずらした位置において、ブラケット画像Ｄ１の分散値Ｄ２は極大値をとる。さらに近距離方向へ焦点位置がずれると、画像がぼけて、分散値Ｄ２は次第に小さくなる。

一方、合焦点位置から遠距離方向へ焦点位置をずらすと、細胞内部が細胞外部よりも黒く見える。細胞内部と細胞外部との輝度が大きく異なるため、合焦点位置から一定距離近距離方向へずらした位置に置いて、ブラケット画像Ｄ１の分散値Ｄ２は極大値をとる。さらに遠距離方向へ焦点位置がずれると、画像がぼけて、分散値Ｄ２は次第に小さくなる。

このため、細かい間隔で複数のブラケット画像Ｄ１を取得し、各ブラケット画像Ｄ１の分散値Ｄ２を求めることにより、合焦点位置を推測できる。図５の例では、分散値Ｄ２が、焦点位置１１μｍにおいて極小値をとり、その前後の焦点位置のうち、焦点位置１２μｍにおける分散値Ｄ２が焦点位置１０μｍにおける分散値Ｄ２よりも当該極小値に近い値であるため、焦点位置１１μｍ以上１２μｍ未満の範囲に合焦点位置があると推測できる。

このように、分散値Ｄ２のうちの極小値付近の値に対してフィッティングを行うことにより、合焦点位置を推測できる。しかしながら、極小値付近において分散値Ｄ２の勾配が急であることから、精度良く合焦点位置を推測するためには、十分に細かい間隔で複数のブラケット画像Ｄ１を取得する必要がある。細かい間隔でブラケット画像Ｄ１を取得するためには、ブラケット画像Ｄ１の撮像回数が多くなる。すなわち、撮像対象である細胞９２へのダメージが大きくなるとともに、ブラケット撮像時間も長くなる。しかしながら、ブラケット画像Ｄ１取得する際の焦点位置の間隔を大きくすると、分散値Ｄ２の極小値の焦点位置を正確に推測することが困難になる。

図７は、図５の例のブラケット画像Ｄ１の分散値Ｄ２を、焦点位置を３μｍ間隔として示した図である。図８は、図５の例のブラケット画像Ｄ１の分散値Ｄ２を、焦点位置を４μｍ間隔として示した図である。図７および図８に示すように、ブラケット画像Ｄ１取得時の焦点距離の間隔が大きくなると、極小値の位置がわかりにくくなる。したがって、合焦点位置の推測精度が低下する。そこで、この細胞観察装置１では、以下のステップＳ１０４〜ステップＳ１０６により求められるフォーカス評価値Ｄ４を用いて、合焦点位置を推測し、推測合焦点位置Ｄ５を算出する。

分散値算出部７２による各ブラケット画像Ｄ１の分散値Ｄ２の算出後、または分散値Ｄ２の算出と並行して、エッジ指標値算出部７３は、各ブラケット画像Ｄ１に対するエッジ指標値Ｄ３を算出する（ステップＳ１０４〜ステップＳ１０５）。エッジ指標値Ｄ３として、各ブラケット画像Ｄ１のエッジ強さを表す値を用いる。すなわち、エッジ指標値Ｄ３として、各ブラケット画像Ｄ１のエッジ成分が大きいほど大きい値を有する値を用いる。本実施形態のエッジ指標値Ｄ３は、各ブラケット画像Ｄ１に対してハイパスフィルタ処理を行ったハイパスフィルタ画像の分散値である。

エッジ指標値Ｄ３を算出するためには、エッジ指標値算出部７３は、まず、各ブラケット画像Ｄ１に対してハイパスフィルタ処理を行ったハイパスフィルタ画像を生成する。本実施形態のエッジ指標値算出部７３は、各ブラケット画像Ｄ１に対してガウスフィルタ処置を実施し、処理前のブラケット画像Ｄ１とガウスフィルタ処理後の画像との画素値の差分を二乗することにより、ハイパスフィルタ処理を行う。なお、ハイパスフィルタ処理は当該方法に限られない。エッジ指標値算出部７３は、例えば、各ブラケット画像Ｄ１に対して高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を行い、低周波成分を除去した後にＦＦＴの逆変換（Ｉｎｖｅｒｓｅ ＦＦＴ、ＩＦＦＴ）を行うことにより、ハイパスフィルタ処理を行ってもよい。

続いて、エッジ指標値算出部７３は、各ハイパスフィルタ画像における画素値の分散値であるエッジ指標値Ｄ３を算出する（ステップＳ１０５）。図９は、図５の例のブラケット画像Ｄ１について、焦点位置（横軸）とエッジ指標値Ｄ３（縦軸）との関係を示した図である。上記の通り、合焦点位置に向かうにつれてエッジが強くなるとともに、合焦点位置のごく近傍ではエッジが弱くなる。したがって、エッジ指標値Ｄ３は合焦点位置に向かうにつれて大きくなるとともに、合焦点位置のごく近傍では小さくなる。

分散値算出部７２による分散値Ｄ２の算出（ステップＳ１０３）と、エッジ指標値算出部７３によるエッジ指標値Ｄ３の算出（ステップＳ１０４〜Ｓ１０５）とが完了すると、引き続き、フォーカス評価値算出部７４がフォーカス評価値Ｄ４を算出する（ステップＳ１０６）。

本実施形態におけるフォーカス評価値Ｄ４は、各ブラケット画像Ｄ１について、分散値Ｄ２をエッジ指標値Ｄ３の２乗で除した値である。すなわち、フォーカス評価値Ｄ４は、
（フォーカス評価値Ｄ４）＝（分散値Ｄ２）／（エッジ指標値Ｄ３）＾２
で示される。

図１０は、図５の例のブラケット画像Ｄ１について、焦点位置とフォーカス評価値Ｄ４との関係を示した図である。分散値Ｄ２が合焦点位置において極小値をとり、エッジ指標値Ｄ３が合焦点位置付近で比較的大きい値をとることから、フォーカス評価値Ｄ４は、合焦点位置において極小値をとる。したがって、フォーカス評価値Ｄ４の極小値をとる焦点位置を推測することにより、推測合焦点位置Ｄ５を算出できる。

図１１は、図１０に示すフォーカス評価値Ｄ４を、焦点位置を３μｍ間隔として示した図である。図１２は、図１０に示すフォーカス評価値Ｄ４を、焦点位置を４μｍ間隔として示した図である。

図５、図７および図８に示すように、極小値付近における勾配が大きい分散値Ｄ２では、焦点位置の間隔を広げると、グラフ形状が大きく異なった。しかしながら、図１０に示すように、フォーカス評価値Ｄ４は、図５に示す分散値Ｄ２と比べて、極小値付近における勾配が小さい。このため、図１０ないし図１２に示すように、フォーカス評価値Ｄ４では、焦点位置の間隔を広げても、分散値Ｄ２と比べてグラフ形状の変形が小さい。このため、フォーカス評価値Ｄ４の極小値をとる焦点位置を合焦点位置として推測すれば、分散値Ｄ２の極小値をとる焦点位置を合焦点位置として推測する場合と比べて、精度良く推測合焦点位置Ｄ５を算出できる。

ステップＳ１０６におけるフォーカス評価値Ｄ４の算出後、合焦点位置推測部７５は、フォーカス評価値Ｄ４が極小値を有する推測合焦点位置Ｄ５を算出し、合焦点位置を推測する（ステップＳ１０７）。具体的には、合焦点位置推測部７５は、複数のブラケット画像Ｄ１に対応する複数のフォーカス評価値Ｄ４のうち、極小値となるフォーカス評価値Ｄ４と、焦点位置が隣接する２つのフォーカス評価値Ｄ４との３つのフォーカス評価値Ｄ４に対してパラボラフィッティングを行う。すなわち、合焦点位置推測部７５は、焦点位置と当該３つのフォーカス評価値Ｄ４との関係に対して２次関数近似を行う。そして、近似２次関数が極小値をとる焦点位置を推測合焦点位置Ｄ５として算出する。

なお、本実施形態ではパラボラフィッティングを用いて推測合焦点位置Ｄ５を算出したが、本発明はこの限りではない。合焦点位置推測部７５は、等角直線フィッティングを用いて推測合焦点位置Ｄ５を算出してもよいし、その他の関数近似法を用いて推測合焦点位置Ｄ５を算出してもよい。また、ブラケット画像Ｄ１の焦点間隔が十分小さい場合は、複数のフォーカス評価値Ｄ４のうち、極小値となるフォーカス評価値Ｄ４の焦点位置をそのまま推測合焦点位置Ｄ５としてもよい。

推測合焦点位置Ｄ５が算出されると、次に、観察用焦点位置決定部７６が観察用画像撮像時における焦点位置である観察用焦点位置Ｄ６を設定する（ステップＳ１０８）。制御部１０には、予め、観察対象である細胞９２の種類や、ユーザの希望観察状態等の情報が入力部６２から入力される。また、制御部１０の記憶部１３には、予め、細胞の種類ごとに、近距離側観察時における合焦点位置からの適切ずれ量、および、遠距離側観察時における合焦点位置からの適切ずれ量が記載されたデータテーブルが記憶される。

ユーザの希望観察状態が合焦点位置である場合、観察用焦点位置決定部７６は、推測合焦点位置Ｄ５を観察用焦点位置Ｄ６として設定する。ユーザの希望観察状態が近距離側である場合、観察用焦点位置決定部７６は、データテーブルの該当する近距離側の適切ずれ量を参照し、推測合焦点位置Ｄ５から近距離側へ当該適切ずれ量分ずれた位置を観察用焦点位置Ｄ６として設定する。また、ユーザの希望観察状態が遠距離側である場合、観察用焦点位置決定部７６は、データテーブルを参照して該当する遠距離側の適切ずれ量を参照し、推測合焦点位置Ｄ５から遠距離側へ当該適切ずれ量分ずれた位置を観察用焦点位置Ｄ６として設定する。すなわち、次のステップＳ１０９において、ユーザの希望状態が近距離側あるいは遠距離側である場合、推測合焦点位置Ｄ５から所定の距離ずれた位置を焦点位置として細胞９２の撮像を行う。

観察用焦点位置Ｄ６の決定後、観察対象である細胞９２の観察用画像を撮像する（ステップＳ１０９）。図１３は、観察用画像の撮像を行う撮像範囲Ｂ１〜Ｂｎを示した図である。図１３では、容器支持部２１に保持された培養容器９を下方から見た様子が示されている。なお、図１３中、培養容器９内の細胞９２については、図示を省略している。

図１３に示すように、本実施形態では、培養容器９に対して複数の撮像範囲Ｂ１〜Ｂｎを設けている。観察用画像の撮像時には、図１３中に矢印で示すように、ｎ個の撮像範囲Ｂ１〜Ｂｎを、撮像範囲Ｂ１からＢ２，Ｂ３，…，Ｂｎの順に移動しながら撮像する。すなわち、移動機構５０による撮像装置３０および照明装置４０の移動と、撮像装置３０および照明装置４０による撮像とを繰り返す。これにより、複数の観察画像を撮像する。本実施形態では、１回で撮像できる撮像範囲が、培養容器９の大きさと比べて小さい。このため、培養容器９を複数の撮像範囲Ｂ１〜Ｂｎに分けて撮像する。

このように、複数のブラケット画像Ｄ１からフォーカス評価値Ｄ４を算出し、フォーカス評価値Ｄ４から合焦点位置を推測することにより、ブラケット画像Ｄ１の撮像枚数の増加を抑制しつつ、精度良く合焦点位置を推測できる。

＜３．変形例＞
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。

図１４は、一変形例に係る細胞観察装置において、ブラケット撮像を行う撮像範囲Ｃ１〜Ｃ４を示した図である。図１４では、容器支持部２１に保持された培養容器９を下方から見た様子が示されている。なお、図１４中、培養容器９内の細胞９２については、図示を省略している。

図１４の例では、ブラケット撮像を行う撮像範囲Ｃ１〜Ｃ４は、培養容器９の中央からの距離が略同一であり、かつ、周方向に略均等に配置されている。このように、３箇所以上の箇所においてブラケット撮像を行い、それぞれの箇所における推測合焦点位置Ｄ５を算出することにより、培養容器９の各箇所における合焦点位置を、さらに精度良く推測することが可能となる。すなわち、４つの撮像範囲Ｃ１〜Ｃ４の推測合焦点位置Ｄ５から、観察用画像の撮像範囲Ｂ１〜Ｂｎのそれぞれの箇所における合焦点位置をさらに精度良く推測できる。

このように、ブラケット撮像を行う撮像範囲は、１箇所に限られない。また、ブラケット撮像を複数箇所で行う場合は、３箇所以上であることが好ましい。なお、観察用画像の撮像範囲Ａ１〜Ａｎのそれぞれについて、ブラケット撮像を行ってもよい。

図１５は、図５の例のブラケット画像Ｄ１について、焦点位置と、変形例に係る計算方法により求めたフォーカス評価値Ｄ４との関係を示した図である。図１５の例のフォーカス評価値Ｄ４は、エッジ指標値Ｄ３として、各ブラケット画像Ｄ１のハイパスフィルタ画像の画素値の平均値を用いている。また、図１５の例では、上記の実施形態と同様、各ブラケット画像Ｄ１について、分散値Ｄ２をエッジ指標値Ｄ３の２乗で除した値をフォーカス評価値Ｄ４としている。

図１６は、焦点位置とハイパスフィルタ画像の画素値の平均値との関係を示した図である。ハイパスフィルタ画像の画素値の平均値は、ハイパスフィルタ画像の画素値の分散値と同様に、エッジ強さを表す値である。すなわち、ハイパスフィルタ画像の画素値の平均値は、各ブラケット画像Ｄ１のエッジ成分が大きいほど大きい値を有する。上記の通り、合焦点位置に向かうにつれてエッジが強くなるとともに、合焦点位置のごく近傍ではエッジが弱くなる。ハイパスフィルタ画像の画素値の平均値は、合焦点位置に向かうにつれて大きくなるとともに、合焦点位置のごく近傍では小さくなる。このため、ハイパスフィルタ画像の画素値の平均値をエッジ指標値Ｄ３として用いることができる。

図１５および図１６の例でも、フォーカス評価値Ｄ４は、図５に示す分散値Ｄ２と比べて、極小値付近における勾配が小さい。このため、フォーカス評価値Ｄ４の極小値をとる焦点位置を合焦点位置として推測すれば、分散値Ｄ２の極小値をとる焦点位置を合焦点位置として推測する場合と比べて、精度良く推測合焦点位置Ｄ５を算出できる。

図１５および図１６の例のように、エッジ指標値Ｄ３として、各ブラケット画像Ｄ１のハイパスフィルタ画像の画素値の平均値を用いてもよい。

図１７および図１８は、図５の例のブラケット画像Ｄ１について、焦点位置と、他の変形例に係る計算方法により求めたフォーカス評価値Ｄ４との関係を示した図である。図１７の例のフォーカス評価値Ｄ４と、図１８の例のフォーカス評価値Ｄ４とは、いずれも、各ブラケット画像Ｄ１について、分散値Ｄ２をエッジ指標値Ｄ３の１乗で除した値をフォーカス評価値Ｄ４としている。すなわち、フォーカス評価値Ｄ４は、
（フォーカス評価値Ｄ４）＝（分散値Ｄ２）／（エッジ指標値Ｄ３）
で示される。

また、図１７の例では、ハイパスフィルタ画像の画素値の分散値をエッジ指標値Ｄ３としている。図１８の例では、ハイパスフィルタ画像の画素値の平均値をエッジ指標値Ｄ３としている。図１７の例および図１８の例のいずれの場合も、フォーカス評価値Ｄ４は、図５に示す分散値Ｄ２と比べて、極小値付近における勾配が小さい。このため、フォーカス評価値Ｄ４の極小値をとる焦点位置を合焦点位置として推測すれば、分散値Ｄ２の極小値をとる焦点位置を合焦点位置として推測する場合と比べて、精度良く推測合焦点位置Ｄ５を算出できる。

図１７の例および図１８の例のように、フォーカス評価値Ｄ４として、分散値Ｄ２をエッジ指標値Ｄ３の１乗で除した値を用いてもよい。しかしながら、図１０および図１５に示すように、フォーカス評価値Ｄ４として、分散値Ｄ２をエッジ指標値Ｄ３の２乗で除した値を用いる方が、極小値付近における勾配がより小さくなるため、より好ましい。また、フォーカス評価値Ｄ４として、分散値Ｄ２をエッジ指標値Ｄ３の３乗または４乗で除した値を用いてもよい。

図１９は、変形例に係る培養容器９Ａを示した斜視図である。図１９の例では、培養容器９Ａは、複数の窪部９３Ａを有するウェルプレートである。複数の窪部９３Ａは、二次元的に規則的に配列されている。また、各窪部９３Ａは、光透過性の底部を有する。各窪部９３Ａ内には、培養液９１Ａとともに、観察対象となる細胞９２Ａが収容される。

本発明の培養容器には、図１９に示すように、培養液や細胞を収容する部位が複数の領域に分かれたものが用いられてもよい。

また、上記の実施形態や変形例に登場した各要素を、矛盾が生じない範囲で、適宜に組み合わせてもよい。

１ 細胞観察装置
９，９Ａ 培養容器
１０ 制御部
３０ 撮像装置
４０ 照明装置
５０ 移動機構
７１ ブラケット撮像制御部
７２ 分散値算出部
７３ エッジ指標値算出部
７４ フォーカス評価値算出部
７５ 合焦点位置推測部
７６ 観察用焦点位置決定部
７７ 観察用画像撮像制御部
９２，９２Ａ 細胞
Ｄ１ ブラケット画像
Ｄ２ 分散値
Ｄ３ エッジ指標値
Ｄ４ フォーカス評価値
Ｄ５ 推測合焦点位置
Ｄ６ 観察用焦点位置

Claims (13)

1. 二次元培養された細胞を観察する細胞観察装置であって、
   前記細胞が収容された容器を、焦点位置を変更して撮像可能な撮像装置と、
   前記容器に照射光を照射する照明装置と、
   前記撮像装置を制御する制御部と、
   を有し、
   前記制御部は、
   前記撮像装置に前記焦点位置を変えながら複数のブラケット画像を撮像させるブラケット撮像制御部と、
   前記ブラケット画像のそれぞれについて、画素値の分散値を算出する分散値算出部と、
   前記ブラケット画像のそれぞれに対して、エッジの強さを表すエッジ指標値を算出するエッジ指標値算出部と、
   前記分散値および前記エッジ指標値に基づいて、前記ブラケット画像のそれぞれに対して、前記合焦点位置において極小値を有するフォーカス評価値を算出するフォーカス評価値算出部と、
   前記ブラケット画像のそれぞれに対する前記フォーカス評価値に基づいて、前記フォーカス評価値が極小値を有する前記焦点位置を算出し、前記合焦点位置を推測する合焦点位置推測部と、
   を含む、細胞観察装置。
2. 請求項１に記載の細胞観察装置であって、
   前記フォーカス評価値算出部は、
   フォーカス評価値＝分散値／（エッジ指標値）＾２
   として前記フォーカス評価値を算出する、細胞観察装置。
3. 請求項１または請求項２に記載の細胞観察装置であって、
   前記エッジ指標値算出部は、前記ブラケット画像のそれぞれに対して、ハイパスフィルタ画像を生成し、前記ハイパスフィルタ画像に基づいて、エッジ成分が強いほど大きい値を有する前記エッジ指標値を算出する、細胞観察装置。
4. 請求項３に記載の細胞観察装置であって、
   前記エッジ指標値算出部は、前記ハイパスフィルタ画像の分散値を前記エッジ指標値とする、細胞観察装置。
5. 請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の細胞観察方法であって、
   前記制御部は、
   前記合焦点位置推測部が推測した前記合焦点位置から所定の距離ずれた位置を焦点位置として、前記撮像装置に前記細胞の観察用画像を撮像させる観察用画像撮像制御部
   をさらに有する、細胞観察装置。
6. 二次元培養された細胞を観察する細胞観察方法であって、
   ａ）焦点位置を変えながら複数のブラケット画像を撮像するブラケット撮像工程と、
   ｂ）前記ブラケット画像のそれぞれについて、画素値の分散値を算出する工程と、
   ｃ）前記ブラケット画像のそれぞれに対して、エッジの強さを表すエッジ指標値を算出する工程と、
   ｄ）前記ブラケット画像のそれぞれに対して、前記分散値および前記エッジ指標値に基づいて、前記合焦点位置において極小値を有するフォーカス評価値を算出する工程と、
   ｅ）前記ブラケット画像における前記焦点位置と前記フォーカス評価値の関係に基づいて、前記フォーカス評価値が極小値を有する前記焦点位置を算出し、前記合焦点位置を推測する工程と、
   を有する、細胞観察方法。
7. 請求項６に記載の細胞観察方法であって、
   前記工程ｄ）において、前記複数の画像のそれぞれの前記フォーカス評価値は、
   フォーカス評価値＝分散値／（エッジ指標値）＾２
   として算出される、細胞観察方法。
8. 請求項６または請求項７に記載の細胞観察方法であって、
   前記工程ｃ）は、
   ｃ１）前記ブラケット画像のそれぞれに対して、ハイパスフィルタ画像を生成する工程と、
   ｃ２）前記ハイパスフィルタ画像に基づいて、エッジ成分が大きいほど大きい値を有する前記エッジ指標値を算出する工程と、
   を含む、細胞観察方法。
9. 請求項８に記載の細胞観察方法であって、
   前記エッジ指標値は、前記ハイパスフィルタ画像の画素値の分散値である、細胞観察方法。
10. 請求項８または請求項９に記載の細胞観察方法であって、
    前記工程ｃ１）は、
    ｃ１１）前記複数の画像のそれぞれに対して、ガウスフィルタ処理を施して、ローパスフィルタ画像を取得する工程と、
    ｃ１２）前記複数の画像のそれぞれに対して、元画像と前記ローパスフィルタ画像との各画素値との比較により、前記ハイパスフィルタ画像を生成する工程と、
    を含む、細胞観察方法。
11. 請求項８または請求項９に記載の細胞観察方法であって、
    前記工程ｃ１）は、
    ｃ１３）前記複数の画像のそれぞれに対して、フーリエ変換を行う工程と、
    ｃ１４）フーリエ変換後の前記複数の画像の低周波成分を除去する工程と、
    ｃ１５）前記低周波成分を除去したフーリエ変換後の前記複数の画像のそれぞれに対して、逆フーリエ変換を行う工程と、
    を含む、細胞観察方法。
12. 請求項６ないし請求項１１のいずれかに記載の細胞観察方法であって、
    前記工程ｅ）において、
    複数の前記フォーカス評価値のうち、前記極小値付近の３つの前記フォーカス評価値に対してパラボラフィッティングを行うことにより、前記フォーカス評価値が極小値を有する前記焦点位置を算出する、細胞観察方法。
13. 請求項６ないし請求項１２のいずれかに記載の細胞観察方法であって、
    ｆ）前記工程ｅ）において推測した前記合焦点位置から所定の距離ずれた位置を焦点位置として、前記細胞の撮像を行う、細胞観察方法。