JP2017003827A - 顕微鏡装置、制御方法および制御プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】複数の合焦位置が存在する場合であっても所望の合焦位置を正確に検出することができる顕微鏡装置、制御方法および制御プログラムを提供すること。
【解決手段】本発明にかかる顕微鏡装置は、二つの界面を有する試料を保持し、光路に沿って移動可能なステージと、対物レンズの特性情報、ならびに第１および第２移動限界位置を記憶する記憶部と、試料から反射された光をもとに、試料の合焦位置を検出する合焦位置検出部と、第１移動限界位置側からステージを移動させた場合に、第１の合焦位置に基づき、該第１の合焦位置と対物レンズの特性情報とに応じて少なくとも第２移動限界位置を変更する移動限界位置変更部と、変更後の移動限界位置のうち、一方の移動限界位置からステージを光路に沿って移動させつつ、合焦位置検出部に他方の界面に相当する第２の合焦位置を検出させる制御を行う移動制御部とを備えた。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡装置、制御方法および制御プログラムに関するものである。

従来、医学や生物学等の分野では、細胞等の観察に、標本を照明して観察する顕微鏡が用いられている。また、工業分野においても、金属組織等の品質管理や、新素材の研究開発、電子デバイスや磁気ヘッドの検査等、種々の用途で顕微鏡が利用されている。

近年、顕微鏡のオートフォーカス（ＡＦ）処理として、赤外光を標本を含む試料に照射し、屈折率差を有する界面から反射される反射光を検出して、検出した反射光の強度をもとに合焦しているか否かを判断する技術が知られている。ＡＦ処理では、電気制御によって上下方向（Ｚ方向）に移動するステージなどの焦準部の位置（以下、Ｚ位置という）を変えながら赤外光の照射を行う。

水浸対物レンズやシリコーン浸対物レンズのような対物レンズとディッシュとの間に液体を介在させて、ディッシュやボトムに収容された培養液中の標本を観察する際、例えば液体とディッシュとの界面、およびディッシュと培養液との界面のような屈折率差がほぼ同じ界面が存在する場合、所望の界面とは異なる界面において合焦していると判断されてしまうことがある。

この問題に対して、合焦位置が複数存在する場合に、ディッシュ等の厚さ情報に基づいて対物レンズをＺ方向に移動させて、所望の合焦位置を検出する技術が開示されている（例えば、特許文献１を参照）。

特開２００６−３５４３号公報

しかしながら、ディッシュやボトムなどの厚さは、同種の容器であっても個体差により異なる場合がある。特許文献１が開示する技術では、使用する容器の実際の厚さと、厚さ情報とが異なる場合、例えばディッシュの底部における外表面および内表面などの二つの合焦位置の検出精度が低下してしまうという問題があった。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、二つの合焦位置が存在する場合であっても所望の合焦位置を正確に検出することができる顕微鏡装置、制御方法および制御プログラムを提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる顕微鏡装置は、倒立型の顕微鏡装置であって、対物レンズを光路上に配置可能なレボルバ本体と、二つの界面を有する観察対象物を保持するとともに、前記光路に沿って移動可能なステージと、前記対物レンズの特性情報、ならびに前記光路に対する前記ステージの移動限界位置であって、前記対物レンズに近づく側の移動限界位置である第１移動限界位置、および前記対物レンズから遠ざかる側の移動限界位置である第２移動限界位置を記憶する記憶部と、前記観察対象物から反射された赤外光をもとに、前記観察対象物の合焦位置を検出する合焦位置検出部と、前記第１移動限界位置側から前記ステージを移動させた場合に、前記合焦位置検出部により検出された一方の界面に相当する第１の合焦位置に基づき、該第１の合焦位置と前記対物レンズの特性情報とに応じて少なくとも前記第２移動限界位置を変更する移動限界位置変更部と、前記移動限界位置変更部による変更後の前記第１および第２移動限界位置のうち、一方の移動限界位置から前記ステージを前記光路に沿って移動させつつ、前記合焦位置検出部に他方の界面に相当する第２の合焦位置を検出させる制御を行う移動制御部と、を備えたことを特徴とする。

また、本発明にかかる顕微鏡装置は、上記の発明において、観察対象物は、標本および該標本を保持する保持部材を含み、前記記憶部は、前記対物レンズの特性情報として、対物レンズの作動距離を記憶するとともに、使用し得る複数の前記容器の各底面の厚さをさらに記憶し、前記移動限界位置変更部は、前記第１の合焦位置、および使用中の前記容器の底面の厚さに基づいて前記第１移動限界位置を変更するとともに、前記第１の合焦位置および前記作動距離に基づいて前記第２移動限界位置を変更し、前記移動制御部は、前記移動限界位置変更部による変更後の前記第１および第２移動限界位置のうち、前記第１移動限界位置から前記ステージを前記光路に沿って移動させることを特徴とする。

また、本発明にかかる顕微鏡装置は、上記の発明において、観察対象物は、標本および該標本を保持する保持部材を含み、前記記憶部は、前記対物レンズの特性情報として、対物レンズの作動距離を記憶し、前記移動限界位置変更部は、前記第１の合焦位置および前記作動距離に基づいて前記第２移動限界位置を変更し、前記移動制御部は、前記移動限界位置変更部による変更後の前記第１および第２移動限界位置のうち、前記第２移動限界位置から前記ステージを前記光路に沿って移動させることを特徴とする。

また、本発明にかかる顕微鏡装置は、上記の発明において、前記保持部材は、少なくとも底部が光を透過可能である収容容器であり、前記合焦位置検出部は、前記収容容器の前記底部の外表面を前記第１の合焦位置として検出し、前記底部の内表面を前記第２の合焦位置として検出することを特徴とする。

また、本発明にかかる顕微鏡装置は、上記の発明において、前記移動制御部は、前記合焦位置検出部により前記第２の合焦位置が検出された後、前記第２の合焦位置を合焦位置として追従させる追従モードに移行することを特徴とする。

また、本発明にかかる顕微鏡装置の制御方法は、対物レンズを光路上に配置可能なレボルバ本体と、二つの界面を有する観察対象物を保持するとともに、前記光路に沿って移動可能なステージと、を備えた倒立型の顕微鏡装置の制御方法であって、前記対物レンズに近づく側の移動限界位置である第１移動限界位置側から前記ステージを移動させながら、前記観察対象物から反射された光をもとに一方の界面に相当する第１の合焦位置を検出する検出ステップと、前記検出ステップの検出結果に基づき、前記第１の合焦位置と対物レンズの特性情報とに応じて少なくとも前記対物レンズから遠ざかる側の移動限界位置である第２移動限界位置を変更する移動限界位置変更ステップと、前記移動限界位置変更ステップによる変更後の前記第１および第２移動限界位置のうち、一方の移動限界位置から前記ステージを前記光路に沿って移動させながら、前記観察対象物から反射された光をもとに他方の界面に相当する第２の合焦位置を検出させる制御を行う移動制御ステップと、を含むことを特徴とする。

また、本発明にかかる制御プログラムは、対物レンズを光路上に配置可能なレボルバ本体と、二つの界面を有する観察対象物を保持するとともに、前記光路に沿って移動可能なステージと、を備えた倒立型の顕微鏡装置の制御プログラムであって、前記対物レンズに近づく側の移動限界位置である第１移動限界位置側から前記ステージを移動させながら、前記観察対象物から反射された光をもとに一方の界面に相当する第１の合焦位置を検出する検出手順と、前記検出手順の検出結果に基づき、前記第１の合焦位置と対物レンズの特性情報とに応じて少なくとも前記対物レンズから遠ざかる側の移動限界位置である第２移動限界位置を変更する移動限界位置変更手順と、前記移動限界位置変更手順による変更後の前記第１および第２移動限界位置のうち、一方の移動限界位置から前記ステージを前記光路に沿って移動させながら、前記観察対象物から反射された光をもとに他方の界面に相当する第２の合焦位置を検出させる制御を行う移動制御手順と、を前記顕微鏡装置に実行させることを特徴とする。

本発明によれば、二つの合焦位置が存在する場合であっても所望の合焦位置を正確に検出することができるという効果を奏する。

図１は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡装置の全体の概略構成を示す模式図である。 図２は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡装置の要部の構成を示す模式図である。 図３は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡装置の要部の構成を示すブロック図である。 図４は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡装置のコントロール部が記憶する情報を説明する図である。 図５Ａは、本発明の実施の形態１にかかる２分割ＰＤへの結像の様子を説明するための図である。 図５Ｂは、本発明の実施の形態１にかかる２分割ＰＤへの結像の様子を説明するための図である。 図５Ｃは、本発明の実施の形態１にかかる２分割ＰＤへの結像の様子を説明するための図である。 図６Ａは、本発明の実施の形態１にかかる２分割ＰＤへの結像の様子を説明するための図である。 図６Ｂは、本発明の実施の形態１にかかる２分割ＰＤへの結像の様子を説明するための図である。 図６Ｃは、本発明の実施の形態１にかかる２分割ＰＤへの結像の様子を説明するための図である。 図７Ａは、本発明の実施の形態１にかかる２分割ＰＤへの結像の様子を説明するための図である。 図７Ｂは、本発明の実施の形態１にかかる２分割ＰＤへの結像の様子を説明するための図である。 図７Ｃは、本発明の実施の形態１にかかる２分割ＰＤへの結像の様子を説明するための図である。 図８は、本発明の実施の形態１にかかる２分割ＰＤの検出信号の強度を示すグラフである。 図９は、本発明の実施の形態１にかかる２分割ＰＤの検出信号から算出したＥＦ値を示すグラフである。 図１０は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡装置が行うＡＦ処理を説明するフローチャートである。 図１１は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡装置が行うＡＦ処理を説明する模式図である。 図１２は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡装置が行うＡＦ処理を説明する模式図である。 図１３は、本発明の実施の形態２にかかる顕微鏡装置が行うＡＦ処理を説明するフローチャートである。 図１４は、本発明の実施の形態２にかかる顕微鏡装置が行うＡＦ処理を説明する模式図である。

以下、本発明を実施するための形態を図面とともに詳細に説明する。なお、以下の実施の形態により本発明が限定されるものではない。また、以下の説明において参照する各図は、本発明の内容を理解し得る程度に形状、大きさ、および位置関係を概略的に示してあるに過ぎない。すなわち、本発明は各図で例示された形状、大きさ、および位置関係のみに限定されるものではない。

（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１にかかる顕微鏡装置の全体の概略構成を示す模式図である。図１に示す顕微鏡装置１００は、倒立型であって、ステージ１およびレボルバ本体２を有する顕微鏡本体部１０１と、結像レンズおよびミラー等を介して入射された観察像を拡大する接眼レンズ１０２と、を備える。接眼レンズ１０２は、一または複数のレンズを用いて構成される。本実施の形態１では、観察対象である標本Ｓが、培養液とともにディッシュ１０３に収容されているものとして説明する。

ステージ１は、ディッシュ１０３を保持し、光路上に配置されている対物レンズの光軸方向に移動可能である。レボルバ本体２は、対物レンズ３ａ〜３ｃを保持するとともに、自身の回転動作によりいずれかの対物レンズを光路上に配置する。なお、本実施の形態１では、対物レンズ３ａが中ＮＡの対物レンズ、対物レンズ３ｂが高ＮＡの対物レンズ、対物レンズ３ｃが低ＮＡの対物レンズであるものとして説明する。

続いて、顕微鏡装置１００の内部に設けられ、焦点を標本Ｓに自動で合焦させるオートフォーカス（ＡＦ）機構について、図２を参照して説明する。図２は、本実施の形態１にかかる顕微鏡装置の要部の構成を示す模式図である。本実施の形態１にかかるオートフォーカス機構は、顕微鏡装置１００は、基準光源４、コリメートレンズ５、投光側ストッパー６、偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ：Polarization Beam Splitter）７、集光レンズ群８、オフセットレンズ群９、λ／４板１０、ダイクロックミラー１１、受光側ストッパー１２、集光レンズ群１３、２分割フォトダイオード（ＰＤ）１４、レボルバ用モーター１５、焦準用モーター１６、オフセットレンズ用モーター１７、レボルバ用モーター駆動制御部１８、焦準用モーター駆動制御部１９、オフセットレンズ用モーター駆動制御部２０、レボ穴位置検出部２１、レーザー駆動制御部２２、Ａ／Ｄ変換器２３、コントロール部２４、パルスカウンタ２５、ＪＯＧエンコーダ２６、リミット検出部２７を備える。

基準光源４は、ＡＦに用いられる光源であって、赤外線等の可視外光波長領域の光源が使用される。基準光源４は、レーザー駆動制御部２２による制御のもと、ＡＦを行うためのＡＦ光として赤外レーザー光を出射する。基準光源４は、光源のパルス点灯等を行ない、光源の強弱をコントロールするレーザー駆動制御部２２により制御される。

コリメートレンズ５は、平行光を保つために設けられる。投光側ストッパー６は、コリメートレンズ５を通過した平行光の光束の半分をカットする。ＰＢＳ７は、ＡＦ光を透過するとともに、ＡＦ光の偏光成分を反射する。集光レンズ群８は、ＰＢＳ７を透過した光の光束を一旦集光するとともに、オフセットレンズ群９を透過した光を透過する。

オフセットレンズ群９は、オフセットレンズ用モーター１７により焦点距離を変更するズーム機構と、光軸方向への移動を行なう機構の両方を兼ね備えた構成になっており、オフセットレンズ用モーター駆動制御部２０によって駆動される。また、オフセットレンズ群９の光軸方向における所定の範囲の両端には、リミット検出部２７が設けられており、オフセットレンズ群９の光軸方向の移動範囲を制限している。

λ／４板１０は、直線偏光を楕円偏光や円偏光に、また逆に楕円偏光や円偏光を直線偏光に変える。ダイクロックミラー１１は、赤外域の光を反射し、可視域の光を通過する。これにより、ダイクロックミラー１１は、ＡＦ光を反射し、標本Ｓを視察するための可視光、すなわち観察光および照明光は、光路中に挿入された対物レンズを介して、接眼レンズ１０２に至り、観察試料Ｓを観察することが可能になる。受光側ストッパー１２は、ＰＢＳ７により反射されたＡＦ光の偏光成分の光の光束の半分をカットする。集光レンズ群１３は、ＰＢＳ７により反射されたＡＦ光の偏光成分の光を２分割ＰＤ１４に集光する。

２分割ＰＤ１４は、光軸を中心に二つの受光領域（第１領域Ｒ_A、第２領域Ｒ_B）を有するフォトダイオードにより実現される光検出器である。２分割ＰＤ１４で結像されたスポットの光強度に応じた電流信号は、電流／電圧変換された後に所定の増幅率をもって増幅され、その後Ａ／Ｄ変換器２３にてデジタル値に変換されてからコントロール部２４で演算処理される。

焦準用モーター１６は、焦準用モーター駆動制御部１９の制御のもと、観察対象となる標本Ｓ（ディッシュ１０３）を載置する焦準部としてのステージ１を光軸方向に移動する。

レボルバ用モーター１５は、レボルバ用モーター駆動制御部１８による制御のもと、レボルバ本体２を回転させて任意の対物レンズ（対物レンズ３ａ〜３ｃのいずれか）を光路中に挿入させるために電気的な駆動を行なう。

レボ穴位置検出部２１は、レボルバ本体２のどの対物レンズ取付け位置が現在光路中に挿入されているかを検出する。レボ穴位置検出部２１は、例えば、磁気センサや光学センサ、ボタン等を用いて構成される。

このような電動レボルバにおいて、コントロール部２４からの信号を受けるレボルバ用モーター駆動制御部１８の駆動制御によりレボルバ用モーター１５が回転駆動され、レボルバ本体２のどの穴位置に対物レンズが装着されているかを検出するレボ穴位置検出部２１で検出された情報がコントロール部２４へ送られる。

また、観察者が直接操作する操作部として、レボルバ本体２を回転させて、光路上に配置する対物レンズを変更するための対物レンズ変換スイッチ（不図示）、ＡＦ動作の設定／解除を行なうＡＦスイッチ、並びにステージ１の上下動およびオフセットレンズ群９の移動を指示するためのＪＯＧエンコーダ２６が設けられている。ＪＯＧエンコーダ２６からのエンコーダ信号は、パルスカウンタ２５にてパルス数に変換されてコントロール部２４に送られる。コントロール部２４は、このパルスカウンタ２５からのパルス数を読込むことでＪＯＧエンコーダ２６がどちらの方向にどれだけ回転されたかを判断し、ＪＯＧエンコーダ２６の回転量に応じて各々の駆動部を動かすようになっている。

コントロール部２４は、周知のＣＰＵ（Central Processing Unit）回路であり、ＣＰＵ本体、制御プログラムを格納したＲＯＭ、制御に必要なデータを随時格納する揮発性メモリであるＲＡＭ、制御信号の入出力を行なうＩ／Ｏポート、およびこれらの各部を接続するデータバス、発振器、アドレスデコーダ等の周知の周辺回路から構成され、データバスおよびＩ／Ｏポートを介して周辺装置の制御を行なう。

図３は、本実施の形態１にかかる顕微鏡装置の要部の構成を示すブロック図であって、コントロール部２４の内部構成を示すブロック図である。図４は、本実施の形態１にかかる顕微鏡装置のコントロール部が記憶する情報を説明する図である。コントロール部２４は、入出力部２４０、検出信号記憶部２４１、ＥＦ値演算部２４２、ＡＦ処理部２４３、サーチレンジ記憶部２４４、オフセットレンズ駆動指示部２４５、焦準部駆動指示部２４６、レボルバ駆動指示部２４７、レーザー駆動指示部２４８、ワークディスタンス（ＷＤ）記憶部２４９、サーチリミット変更部２５０（移動限界位置変更部）およびボトム厚記憶部２５１を備える。各記憶部は、例えば、フラッシュメモリやＤＲＡＭ（Dynamic Random Access Memory）等の半導体メモリを用いて実現され、各々が個別のメモリにより構成されるものであってもよいし、一つのメモリにより構成されるものであってもよい。

入出力部２４０は、Ａ／Ｄ変換器２３にてデジタル値に変換された２分割ＰＤ１４の検出値、パルスカウンタ２５にてパルス数に変換されたＪＯＧエンコーダ２６からのエンコーダ信号、または現在光路中に挿入されているレボルバ本体２の対物レンズ取付け位置を入力したり、レボルバ用モーター駆動制御部１８、焦準用モーター駆動制御部１９、オフセットレンズ用モーター駆動制御部２０、およびレーザー駆動制御部２２を駆動するための駆動信号を各駆動部に対して出力したりする。

検出信号記憶部２４１は、Ａ／Ｄ変換器２３にてデジタル値に変換された２分割ＰＤ１４の検出値を格納し、ＥＦ値演算部２４２は、検出信号記憶部４１に格納された２分割ＰＤ１４の検出値に基づいて、ＥＦ値を算出する。

ＡＦ処理部２４３は、ＥＦ値演算部２４２で算出したＥＦ値を用いて、後述するＡＦ処理を実行する。サーチレンジ記憶部２４４は、ステージ１のＺ方向への検出範囲（サーチレンジ）の上限値（上側サーチリミット）および下限値（下側サーチリミット）を記憶する。図４に示すように、ステージ１は、上側サーチリミットＳＲ_upおよび下側サーチリミットＳＲ_downの間のサーチレンジＲ₂₀を移動可能である。

ここで、本実施の形態１では、対物レンズとディッシュ１０３との間には、浸液Ｌ_gが設けられている。浸液Ｌ_gとしては、水やシリコーンオイル、一般的なイマージョンオイル、グリセリンなどが挙げられる。標本Ｓの深部（例えば培養液３００中の核などの対象物Ｃ）を観察する場合は、標本の屈折率に近い水などが好ましく用いられ、細胞の屈折率が約１．３８であるため、細胞を観察する場合には、屈折率が約１．４のシリコーンオイルが好ましく用いられる。

オフセットレンズ駆動指示部２４５は、オフセットレンズ群９の駆動を指示し、焦準部駆動指示部２４６は、焦準用モーター駆動制御部１９に焦準用モーター１６の駆動を指示し、レボルバ駆動指示部２４７は、電動レボルバの駆動を指示し、レーザー駆動指示部２４８は、レーザー駆動制御部２２に基準光源４の駆動を指示する。

ＷＤ記憶部２４９は、対物レンズ３ａ〜３ｃについて、焦点を合わせたときの、対物レンズ先端から標本面までの距離である作動距離を記憶する。なお、本実施の形態１では、作動距離がディッシュ１０３のボトム厚よりも大きいものとして説明する。

サーチリミット変更部２５０は、ＡＦ処理部２４３による検出結果に基づいて、ステージ１のＺ方向へのサーチレンジの上限値（上側サーチリミット）および下限値（下側サーチリミット）の少なくとも一方を変更し、サーチレンジの再設定を行う。設定変更については、後述する。

ボトム厚記憶部２５１は、使用し得るディッシュ１０３のボトム厚を記憶する。ディッシュ１０３は、同種のディッシュであっても個体差があり、ボトム厚が若干異なる。このため、ボトム厚記憶部２５１は、使用し得る複数のディッシュ１０３の各ボトム厚を記憶する。

図２に戻り、オートフォーカス機構において、基準光源４から発せられたＡＦ光としての赤外レーザー光は、コリメートレンズ５を通り、投光側ストッパー６を介して標本Ｓ側に導かれる。すなわち、集光レンズ群８により一旦集光された光束は、オフセットレンズ群９を通り、λ／４板１０を通過し、ダイクロックミラー１１により反射される。

ダイクロックミラー１１により反射されたＡＦ光は、対物レンズにより標本Ｓ（またはディッシュ１０３）にスポット状の像を形成する。そして、標本Ｓにより反射されたＡＦ光は、対物レンズ、ダイクロックミラー１１を介し、λ／４板１０を通過する。その後、オフセットレンズ群９、集光レンズ群８を通過し、ＰＢＳ７へ入射する。ＰＢＳ７で反射されたＡＦ光の偏光成分は、受光側ストッパー１２、集光レンズ群１３を通過した後に２分割ＰＤ１４に結像される。

フォトダイオードの領域は、反射光の光軸を中心にして２つの領域（第１領域Ｒ_A、第２領域Ｒ_B）に分けられ、２分割ＰＤ１４が、分割された二つの領域に対応するセンサがそれぞれの領域の光強度を検出信号Ｑ_A，Ｑ_Bとして検出する。そして、ＥＦ値演算部２４２が、これらの差（Ｑ_A−Ｑ_B）をこれらの和（Ｑ_A＋Ｑ_B）で除算した値（（Ｑ_A−Ｑ_B）／（Ｑ_A＋Ｑ_B））をＥＦ値として算出し、ＡＦ処理部２４３が、そのＥＦ値を用いて合焦判定を行なう。すなわち、対物レンズと標本Ｓとの距離を相対的に変化させ、ＥＦ値が０となる箇所を合焦位置と判定している。

次に、顕微鏡装置１００によって実行されるＡＦ処理について説明する。ＡＦ動作の設定／解除を行なうＡＦスイッチが押下されると、コントロール部２４は、ＡＦ用の赤外光のスポットを標本Ｓに照射させるためにレーザー駆動制御部２２に信号を与え、基準光源４の発振を開始する。

基準光源４からの光束により観察試料Ｓにスポットが照射され、その反射光が２分割ＰＤ１４に投影される。そして、この投影されたスポットの位置によりＡＦ制御が行なわれる。

図５Ａ〜５Ｃ、図６Ａ〜６Ｃ、図７Ａ〜７Ｃは、２分割ＰＤ１４への結像の様子を説明するための図であり、図５Ａ〜５Ｃが中ＮＡの対物レンズ３ａを用いた場合、図６Ａ〜６Ｃが高ＮＡの対物レンズ３ｂを用いた場合、図７Ａ〜７Ｃが低ＮＡの対物レンズ３ｃを用いた場合である。

まず、焦点深度が中間のＮＡ（中ＮＡ）の対物レンズ３ａの場合であって、ディッシュ１０３の底面の位置が合焦位置より下の場合、すなわちディッシュ１０３の底面が対物レンズ３ａから遠い位置の場合を考える。この場合、ＡＦ光は、ディッシュ１０３の底面から早く反射されるので、図５Ａに示すように、２分割ＰＤ１４に結像されるスポット像２０１ａは、中心位置から第１領域Ｒ_A側に結像される。他方、ディッシュ１０３の底面が合焦位置より上にある場合、すなわちディッシュ１０３の底面が対物レンズ３ａから近い位置の場合には、図５Ｂに示すように、２分割ＰＤ１４に結像されるスポット像２０２ａは、第２領域Ｒ_B側に結像される。

これに対し、ディッシュ１０３の底面が正確に合焦位置にある場合のスポット像２０３ａは、図５Ｃに示すように、第１領域Ｒ_Aおよび第２領域Ｒ_Bが共に均等な範囲でほぼ光軸の中心に結像する。さらに、この場合は焦点位置にあるために中心の光強度は最も高くなっている。

焦点深度が小さい高ＮＡの対物レンズ３ｂの場合は、図６Ａ，６Ｂに示すように、合焦位置より下、上のスポットの形状２０１ｂ，２０２ｂは、中ＮＡの対物レンズのスポット像２０１ａ，２０２ａに比べて大きくなる。焦点深度が大きい低ＮＡの対物レンズ３ｃの場合は、図７Ａ，７Ｂに示したように、合焦位置より下、上のスポットの形状２０１ｃ，２０２ｃは、中ＮＡの対物レンズのスポット像２０１ａ，２０２ａに比べて小さくなる。また、図６Ｃ，７Ｃに示すように、ディッシュ１０３の底面が正確に合焦位置にある場合のスポット像２０３ｂ，２０３ｃは、第１領域Ｒ_Aおよび第２領域Ｒ_Bが共に均等な範囲でほぼ光軸の中心に結像する。

このように、２分割ＰＤ１４のフォトダイオードに形成されるスポットは、中ＮＡ、高ＮＡ、低ＮＡの対物レンズによって異なる。上述したように２分割ＰＤ１４は、フォトダイオードの領域を反射光の光軸を中心にして２つの領域（第１領域Ｒ_A、第２領域Ｒ_B）に分け、２個のセンサとしてそれぞれの領域の光強度を検出信号として検出する。コントロール部２４は、ＥＦ値を算出して合焦判定を行なう。

具体的には、対物レンズと標本Ｓとの距離を相対的に変化させ、ＥＦ値が０となるようにステージ１を移動することによりＡＦ動作を行なう。すなわち、第１領域Ｒ_Aからの出力（検出信号Ｑ_A）が大きい場合はステージ１を上に駆動し、第２領域Ｒ_Bからの出力（検出信号Ｑ_B）が大きい場合は下に移動する。これにより、標本Ｓに正確に合焦できることになる。

このような移動量は、対物レンズの特性、基準光源４の使用波長により異なることから、予め対物レンズ３ａ〜３ｃごとの移動値をＲＯＭあるいはその他の記憶媒体、例えば不揮発性メモリであるＥＥＰＲＯＭ等に格納しておく。

コントロール部２４が上述のようにして合焦したと判断しても、ＡＦ光により検出できるのは、屈折率差のあるディッシュと水との界面、またはディッシュと空気との界面であり、観察対象となる細胞等は、この界面よりも上方に位置する。これを補正するのがオフセットレンズ群９である。

コントロール部２４は、オフセットレンズ用モーター駆動制御部２０に駆動指示を与え、オフセットレンズ用モーター１７を駆動してオフセットレンズ群９の光軸方向に対する移動量を調整し、２分割ＰＤ１４の結像位置の補正を行なう。

図８は、２分割ＰＤ１４の検出信号の強度を示すグラフであり、Ｑ_Amが中ＮＡの対物レンズを用いて検出した場合の検出信号Ｑ_Aの出力値（信号強度）にかかる曲線、Ｑ_Bmが中ＮＡの対物レンズを用いて検出した場合の検出信号Ｑ_Bの出力値（信号強度）にかかる曲線、Ｑ_Ahが高ＮＡの対物レンズを用いて検出した場合の検出信号Ｑ_Aの出力値（信号強度）にかかる曲線、Ｑ_Bhが高ＮＡの対物レンズを用いて検出した場合の検出信号Ｑ_Bの出力値（信号強度）にかかる曲線、Ｑ_Alが低ＮＡの対物レンズを用いて検出した場合の検出信号Ｑ_Aの出力値（信号強度）にかかる曲線、Ｑ_Blが低ＮＡの対物レンズを用いて検出した場合の検出信号Ｑ_Bの出力値（信号強度）にかかる曲線を示す。図８に示すグラフでは、縦軸が出力値であり、横軸が光軸に対するステージ１（焦準部）位置である。図９は、２分割ＰＤ１４の検出信号Ｑ_A，Ｑ_Bから算出したＥＦ値（（Ｑ_A−Ｑ_B）／（Ｑ_A＋Ｑ_B））を示すグラフであって、ＥＦ_Mが中ＮＡの対物レンズのＥＦ値にかかる曲線、ＥＦ_Hが高ＮＡの対物レンズのＥＦ値にかかる曲線、ＥＦ_Lが低ＮＡの対物レンズのＥＦ値にかかる曲線を示す図である。

ＡＦ処理部２４３は、検出信号Ｑ_A，Ｑ_Bの和（Ｑ_A＋Ｑ_B）、およびＥＦ値（（Ｑ_A−Ｑ_B）／（Ｑ_A＋Ｑ_B））を用いて以下のように合焦位置の判定を行う。まず、対物レンズ３ａ〜３ｃごとに設定されているノイズ判定閾値（Ｎ_TH）を不揮発性メモリ（不図示）から読み出し、（Ｑ_A＋Ｑ_B）の値と比較する。その結果、（Ｑ_A＋Ｑ_B）の値が所定のノイズ判定閾値Ｎ_THより小さければ、すなわち、（Ｑ_A＋Ｑ_B）＜Ｎ_THであれば、コントロール部２４は、ディッシュ１０３の底面を補足していないと判定し、（Ｑ_A＋Ｑ_B）の値がノイズ判定閾値Ｎ_TH以上になるように、すなわち（Ｑ_A＋Ｑ_B）≧Ｎ_THが成立するように、ステージ１を駆動する。

ディッシュ１０３の底面を補足する範囲は、図８に示す通り、低ＮＡの対物レンズの場合が範囲Ｒ₁₁であり、同様に中ＮＡの対物レンズが範囲Ｒ₁₂、高ＮＡの対物レンズが範囲Ｒ₁₃であり、高ＮＡの対物レンズが最も狭く、対物レンズの倍率が小さくなるほどこの範囲は広くなる。

そして、（Ｑ_A＋Ｑ_B）≧Ｎ_THが成立すると、コントロール部２４は、ＥＦ値が所定の合焦範囲内に入るように、ステージ１を駆動する。すなわち、下式（１）が成立するように、コントロール部２４はステージ１を移動させ、成立したところでステージ１の動作を止める。
−Ｆ_TH＜（Ｑ_A−Ｑ_B）／（Ｑ_A＋Ｑ_B）＜＋Ｆ_TH ・・・（１）
ここで、Ｆ_THは合焦判定閾値であり、ステージ１の位置が各対物レンズの焦点深度の範囲内に必ず移動されるように決められており、対物レンズごとに設定されている値である。

続いて、顕微鏡装置１００によって実行されるＡＦ処理の流れを、図１０を参照して説明する。図１０は、本実施の形態１にかかる顕微鏡装置が行うＡＦ処理を説明するフローチャートである。図１１，１２は、本実施の形態１にかかる顕微鏡装置が行うＡＦ処理を説明する模式図である。以下のフローチャートでは、コントロール部２４の制御のもとで各部が動作するものとして説明する。ＡＦ動作の設定／解除を行なうＡＦスイッチが押下されると、コントロール部２４は、ＡＦ光を標本（ディッシュ１０３）に照射させるためにレーザー駆動制御部２２に信号を与え、基準光源４の発振を開始する。

コントロール部２４は、合焦サーチレンジを最大に設定する（ステップＳ１０１）。具体的には、コントロール部２４は、検出範囲記憶部２４４を参照して、合焦サーチレンジを、図４に示すような、上側サーチリミットＳＲ_upおよび下側サーチリミットＳＲ_downの間であるサーチレンジＲ₂₀に設定する。

合焦サーチレンジを設定後、コントロール部２４は、焦準部駆動指示部２４６にステージ１（焦準部）を下側サーチリミットＳＲ_downまで移動させるよう指示する（ステップＳ１０２）。焦準部駆動指示部２４６は、焦準用モーター駆動制御部１９の制御のもと、ステージ１を下側サーチリミットＳＲ_downまで移動させる。

その後、焦準部駆動指示部２４６の制御によりステージ１をディッシュ１０３に近づく方向（図１２の矢印Ｙ１）に移動させて合焦サーチを行いながら（ステップＳ１０３）、ＡＦ処理部２４３が移動した位置においてＡＦ光Ｌ_AFにより取得した検出信号をもとに合焦判定を行う（ステップＳ１０４：検出ステップ）。ここで、ＡＦ処理部２４３が合焦していないと判定した場合は（ステップＳ１０４：Ｎｏ）、コントロール部２４は、ステップＳ１０３に移行して、ステージ１を移動させて合焦判定を繰り返す。一方、ＡＦ処理部２４３が合焦していると判定し、該判定した位置を合焦位置として検出した場合（ステップＳ１０４：Ｙｅｓ）、コントロール部２４は、ステップＳ１０５に移行する。この際の合焦位置は、ディッシュ１０３の下側界面Ｂ_down（ディッシュ１０３の外表面）である（図１１（ａ）参照）。

ステップＳ１０５では、サーチリミット変更部２５０は、上側界面に合焦するような上側界面用の合焦サーチレンジの設定を行う（移動限界位置変更ステップ）。具体的には、下側から上側に向かう方向を正としたときに、下側界面Ｂ_downに光路上に配置している対物レンズのＷＤを加算した位置（Ｂ_down＋ＷＤ）を上側サーチリミットＳＲ_up’として再設定するとともに、下側界面Ｂ_downに、ボトム厚記憶部２５１を参照して使用中のディッシュ１０３のボトム厚を読み出すことにより、個体差を加味したディッシュ１０３のボトム厚（Ｎｏ１Ｓガラス：０．１５〜０．１９ｍｍ）をボトムの屈折率で除した値の１／２（例えば５０μｍ）を加算した位置（Ｂ_down＋５０）を下側サーチリミットＳＲ_down’として再設定する（図１２参照）。サーチリミット変更部２５０は、合焦サーチレンジを、図１２に示すような、上側サーチリミットＳＲ_up’および下側サーチリミットＳＲ_down’の間であるサーチレンジＲ₂₁に設定する。

合焦サーチレンジを再設定後、コントロール部２４は、焦準部駆動指示部２４６に焦準部（ステージ１）を下側サーチリミットＳＲ_down’まで移動させるよう指示する（ステップＳ１０６）。焦準部駆動指示部２４６は、焦準用モーター駆動制御部１９の制御のもと、ステージ１を下側サーチリミットＳＲ_down’まで移動させる（図１２の矢印Ｙ２）。

その後、焦準部駆動指示部２４６の制御によって、ステージ１を下側サーチリミットＳＲ_down’からディッシュ１０３に近づく方向（図１２の矢印Ｙ３）に移動させて合焦サーチを行いながら（ステップＳ１０７）、ＡＦ処理部２４３が移動した位置において取得した検出信号をもとに合焦判定を行う（ステップＳ１０８）。ここで、ＡＦ処理部２４３が合焦していないと判定した場合（ステップＳ１０８：Ｎｏ）、コントロール部２４は、ステップＳ１０７に移行して、ステージ１を移動させて合焦判定を繰り返す。一方、ＡＦ処理部２４３が合焦していると判定し、該判定した位置を合焦位置として検出した場合（ステップＳ１０８：Ｙｅｓ）、コントロール部２４は、ステップＳ１０９に移行する。この際の合焦位置は、ディッシュ１０３の上側界面Ｂ_up（ディッシュ１０３の内表面）である（図１１（ｂ）参照）。

ステップＳ１０９では、観察用の照明光Ｌ_SによりＡＦ処理を行ない、ステージ１が移動した際に上側界面Ｂ_upを合焦位置として追従する合焦追従モードに移行する（図１１（ｃ）参照）。その後は、本ＡＦ処理の終了指示の入力があるか否かを判断する（ステップＳ１１０）。ここで、ＡＦ処理の終了指示の入力がなければ（ステップＳ１１０：Ｎｏ）、ステップＳ１０９に移行して合焦追従モードを継続する。これに対して、本ＡＦ処理の終了指示の入力があれば（ステップＳ１１０：Ｙｅｓ）、本ＡＦ処理を終了する。上述した処理により、標本（例えば対象物Ｃ）に焦点の合った観察を行なうことが可能となる。

上述した本実施の形態１によれば、ディッシュ１０３の下側界面Ｂ_downを検出後、該下側界面Ｂ_downに基づいて上側サーチリミットＳＲ_up’および下側サーチリミットＳＲ_down’を再設定し、下側界面Ｂ_downを含まないサーチレンジＲ₂₁でディッシュ１０３の上側界面Ｂ_upを検出するようにしたので、複数の合焦位置（界面）が存在する場合であって、ディッシュ１０３の実際の厚さなどが不明な場合であっても所望の合焦位置を正確に検出することができる。さらに、ディッシュ１０３の上側界面Ｂ_upを検出後に、該上側界面Ｂ_upに合焦した状態を維持する追従モードに移行するようにしたので、オフセットレンズ群９による細胞の深部観察を迅速に行うことができる。

また、本実施の形態１にかかるＡＦ処理をボタン入力により実行するようにすることで、術者による一回のボタンの入力操作のみで、ディッシュ１０３の上側界面Ｂ_upを簡易に検出することができる。このため、術者の操作にかかる負担を軽減することができる。

なお、上述した実施の形態１では、浸液Ｌgに関わらずにＡＦ処理を行なうものとして説明したが、浸液Ｌgの種別に応じてＡＦ処理を行なうか否かを判断するようにしてもよい。この場合、例えば、浸液Ｌgが水またはシリコーンオイルであれば一連のＡＦ処理を行ない、浸液Ｌgが低自家蛍光オイルであればＳ１０５からＳ１０８のＡＦ処理を行なわないようにしてもよい。

（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２について説明する。上述した実施の形態１では、下側界面Ｂ_downを検出後、該下側界面Ｂ_downに基づいて上側サーチリミットＳＲ_up’および下側サーチリミットＳＲ_down’を再設定するものとして説明したが、本実施の形態２では、下側界面Ｂ_downを検出後、該下側界面Ｂ_downに基づいて上側サーチリミットＳＲ_up’のみを再設定する。

図１３は、本実施の形態２にかかる顕微鏡装置が行うＡＦ処理を説明するフローチャートである。図１４は、本実施の形態２にかかる顕微鏡装置が行うＡＦ処理を説明する模式図である。以下のフローチャートでは、コントロール部２４の制御のもとで各部が動作するものとして説明する。上述した実施の形態１と同様、ＡＦ動作の設定／解除を行なうＡＦスイッチが押下されると、コントロール部２４は、ＡＦ光を標本（ディッシュ１０３）に照射させるためにレーザー駆動制御部２２に信号を与え、基準光源４の発振を開始する。

コントロール部２４は、合焦サーチレンジを最大に設定する（ステップＳ２０１）。具体的には、サーチリミット変更部２５０は、サーチレンジ記憶部２４４を参照して、合焦サーチレンジを、図１４に示すような、上側サーチリミットＳＲ_upおよび下側サーチリミットＳＲ_downの間であるサーチレンジＲ₂₀に設定する。

合焦サーチレンジを設定後、コントロール部２４は、焦準部駆動指示部２４６に焦準部（ステージ１）を下側サーチリミットＳＲ_downまで移動させるよう指示する（ステップＳ２０２）。焦準部駆動指示部２４６は、焦準用モーター駆動制御部１９の制御のもと、ステージ１を下側サーチリミットＳＲ_downまで移動させる。

その後、焦準部駆動指示部２４６の制御によりステージ１をディッシュ１０３に近づく方向（図１４の矢印Ｙ１）に移動させながら（ステップＳ２０３）、ＡＦ処理部２４３が移動した位置において取得した検出信号をもとに合焦判定を行う（ステップＳ２０４）。ここで、ＡＦ処理部２４３により合焦していないと判定された場合は（ステップ２０４：Ｎｏ）、ステップＳ２０３に移行して、ステージ１を移動させて合焦判定を繰り返す。一方、ＡＦ処理部２４３により合焦していると判定された場合は（ステップＳ２０４：Ｙｅｓ）、ステップＳ２０５に移行する。この際の合焦位置は、ディッシュ１０３の下側界面Ｂ_downである。

ステップＳ２０５では、サーチリミット変更部２５０は、上側界面に合焦するような上側界面用の合焦サーチレンジの設定を行う。具体的には、下側から上側に向かう方向を正としたときに、下側界面Ｂ_downに光路上に配置している対物レンズのＷＤを加算した位置（Ｂ_down＋ＷＤ）を上限である上側サーチリミットＳＲ_up’’として再設定する（図１４参照）。本実施の形態２では、下限である下側サーチリミットＳＲ_downの再設定は行わない。サーチリミット変更部２５０は、合焦サーチ範囲を、図１４に示すような、上側サーチリミットＳＲ_up’ ’および下側サーチリミットＳＲ_downの間であるサーチレンジＲ₂₂に設定する。

合焦サーチレンジを再設定後、コントロール部２４は、焦準部駆動指示部２４６に焦準部（ステージ１）を上側サーチリミットＳＲ_up’’まで移動させるよう指示する（ステップＳ２０６）。焦準部駆動指示部２４６は、焦準用モーター駆動制御部１９の制御のもと、ステージ１を上側サーチリミットＳＲ_up’’まで移動させる（図１４の矢印Ｙ２’）。

その後、焦準部駆動指示部２４６の制御によって、ステージ１を上側サーチリミットＳＲ_up’’から下方（図１４の矢印Ｙ３’）に移動させながら（ステップＳ２０７）、ＡＦ処理部２４３が移動した位置において取得した検出信号をもとに合焦判定を行う（ステップＳ２０８）。ここで、ＡＦ処理部２４３により合焦していないと判定された場合は（ステップＳ２０８：Ｎｏ）、ステップＳ２０７に移行して、ステージ１を移動させて合焦判定を繰り返す。一方、ＡＦ処理部２４３により合焦していると判定された場合は（ステップＳ２０８：Ｙｅｓ）、ステップＳ２０９に移行する。この際の合焦位置は、ディッシュ１０３の上側界面Ｂ_upである。

ステップＳ２０９では、観察用の照明光Ｌ_SによりＡＦ処理を行ない、標本、例えば、対象物Ｃに追従する合焦追従モードに移行する（例えば図１１（ｃ）を参照）。その後は、本ＡＦ処理の終了指示の入力があるか否かを判断する（ステップＳ２１０）。ここで、ＡＦ処理の終了指示の入力がなければ（ステップＳ２１０：Ｎｏ）、ステップＳ２０９に移行して合焦追従モードを継続する。これに対して、本ＡＦ処理の終了指示の入力があれば（ステップＳ２１０：Ｙｅｓ）、本ＡＦ処理を終了する。上述した処理により、標本（対象物Ｃ）に焦点の合った観察を行なうことが可能となる。

上述した本実施の形態２によれば、ディッシュ１０３の下側界面Ｂ_downを検出後、該下側界面Ｂ_downに基づいて上側サーチリミットＳＲ_up’’を再設定し、下側界面Ｂ_downを含まない検出範囲Ｒ₂₂で上側サーチリミットＳＲ_up’’側から上側界面Ｂ_upを検出するようにしたので、複数の合焦位置（界面）が存在する場合であって、ディッシュ１０３の実際の厚さなどが不明な場合であっても所望の合焦位置を正確に検出することができる。さらに、ディッシュ１０３の上側界面Ｂ_upを検出後に、該上側界面Ｂ_upに合焦した状態を維持する追従モードに移行するようにしたので、オフセットレンズ群９による細胞の深部観察を迅速に行うことができる。

なお、上述した実施の形態１，２では、ステージを焦準部として説明したが、対物レンズを光軸に沿って移動可能な焦準部としてもよい。また、対象物Ｃを保持する保持部材は、上述したディッシュ１０３に限らず、対象物Ｃを載置して保持するスライドガラスなど、光を透過可能な底部が厚みを有する保持部材であれば適用可能である。

上述した実施の形態１，２は、本発明を実施するための例にすぎず、本発明はこれらに限定されるものではない。また、本発明は、各実施の形態に開示されている複数の構成要素を適宜組み合わせることによって、種々の発明を形成できる。本発明は、仕様等に応じて種々変形することが可能であり、更に本発明の範囲内において、他の様々な実施の形態が可能であることは、上記記載から自明である。

１ ステージ
２ レボルバ本体
３ａ〜３ｃ 対物レンズ
４ 基準光源
５ コリメートレンズ
６ 投光側ストッパー
７ 偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ）
８，１３ 集光レンズ群
９ オフセットレンズ群
１０ λ／４板
１１ ダイクロックミラー
１２ 受光側ストッパー
１４ ２分割フォトダイオード（ＰＤ）
１５ レボルバ用モーター
１６ 焦準用モーター
１７ オフセットレンズ用モーター
１８ レボルバ用モーター駆動制御部
１９ 焦準用モーター駆動制御部
２０ オフセットレンズ用モーター駆動制御部
２１ レボ穴位置検出部
２２ レーザー駆動制御部
２３ Ａ／Ｄ変換器
２４ コントロール部
２５ パルスカウンタ
２６ ＪＯＧエンコーダ
２７ リミット検出部
１００ 顕微鏡装置
１０１ 顕微鏡本体部
１０２ 接眼レンズ
１０３ ディッシュ
２４０ 入出力部
２４１ 検出信号記憶部
２４２ ＥＦ値演算部
２４３ ＡＦ処理部
２４４ サーチレンジ記憶部
２４５ オフセットレンズ駆動指示部
２４６ 焦準部駆動指示部
２４７ レボルバ駆動指示部
２４８ レーザー駆動指示部
２４９ ワークディスタンス（ＷＤ）記憶部
２５０ サーチリミット変更部
２５１ ボトム厚記憶部

Claims (7)

1. 倒立型の顕微鏡装置であって、
   対物レンズを光路上に配置可能なレボルバ本体と、
   二つの界面を有する観察対象物を保持するとともに、前記光路に沿って移動可能なステージと、
   前記対物レンズの特性情報、ならびに前記光路に対する前記ステージの移動限界位置であって、前記対物レンズに近づく側の移動限界位置である第１移動限界位置、および前記対物レンズから遠ざかる側の移動限界位置である第２移動限界位置を記憶する記憶部と、
   前記観察対象物から反射された赤外光をもとに、前記観察対象物の合焦位置を検出する合焦位置検出部と、
   前記第１移動限界位置側から前記ステージを移動させた場合に、前記合焦位置検出部により検出された一方の界面に相当する第１の合焦位置に基づき、該第１の合焦位置と前記対物レンズの特性情報とに応じて少なくとも前記第２移動限界位置を変更する移動限界位置変更部と、
   前記移動限界位置変更部による変更後の前記第１および第２移動限界位置のうち、一方の移動限界位置から前記ステージを前記光路に沿って移動させつつ、前記合焦位置検出部に他方の界面に相当する第２の合焦位置を検出させる制御を行う移動制御部と、
   を備えたことを特徴とする顕微鏡装置。
2. 観察対象物は、標本および該標本を保持する保持部材を含み、
   前記記憶部は、前記対物レンズの特性情報として、対物レンズの作動距離を記憶するとともに、使用し得る複数の前記容器の各底面の厚さをさらに記憶し、
   前記移動限界位置変更部は、前記第１の合焦位置、および使用中の前記容器の底面の厚さに基づいて前記第１移動限界位置を変更するとともに、前記第１の合焦位置および前記作動距離に基づいて前記第２移動限界位置を変更し、
   前記移動制御部は、前記移動限界位置変更部による変更後の前記第１および第２移動限界位置のうち、前記第１移動限界位置から前記ステージを前記光路に沿って移動させる
   ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 観察対象物は、標本および該標本を保持する保持部材を含み、
   前記記憶部は、前記対物レンズの特性情報として、対物レンズの作動距離を記憶し、
   前記移動限界位置変更部は、前記第１の合焦位置および前記作動距離に基づいて前記第２移動限界位置を変更し、
   前記移動制御部は、前記移動限界位置変更部による変更後の前記第１および第２移動限界位置のうち、前記第２移動限界位置から前記ステージを前記光路に沿って移動させる
   ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
4. 前記保持部材は、少なくとも底部が光を透過可能である収容容器であり、
   前記合焦位置検出部は、前記収容容器の前記底部の外表面を前記第１の合焦位置として検出し、前記底部の内表面を前記第２の合焦位置として検出することを特徴とする請求項２または３に記載の顕微鏡装置。
5. 前記移動制御部は、前記合焦位置検出部により前記第２の合焦位置が検出された後、前記第２の合焦位置を合焦位置として追従させる追従モードに移行することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の顕微鏡装置。
6. 対物レンズを光路上に配置可能なレボルバ本体と、二つの界面を有する観察対象物を保持するとともに、前記光路に沿って移動可能なステージと、を備えた倒立型の顕微鏡装置の制御方法であって、
   前記対物レンズに近づく側の移動限界位置である第１移動限界位置側から前記ステージを移動させながら、前記観察対象物から反射された光をもとに一方の界面に相当する第１の合焦位置を検出する検出ステップと、
   前記検出ステップの検出結果に基づき、前記第１の合焦位置と対物レンズの特性情報とに応じて少なくとも前記対物レンズから遠ざかる側の移動限界位置である第２移動限界位置を変更する移動限界位置変更ステップと、
   前記移動限界位置変更ステップによる変更後の前記第１および第２移動限界位置のうち、一方の移動限界位置から前記ステージを前記光路に沿って移動させながら、前記観察対象物から反射された光をもとに他方の界面に相当する第２の合焦位置を検出させる制御を行う移動制御ステップと、
   を含むことを特徴とする制御方法。
7. 対物レンズを光路上に配置可能なレボルバ本体と、二つの界面を有する観察対象物を保持するとともに、前記光路に沿って移動可能なステージと、を備えた倒立型の顕微鏡装置の制御プログラムであって、
   前記対物レンズに近づく側の移動限界位置である第１移動限界位置側から前記ステージを移動させながら、前記観察対象物から反射された光をもとに一方の界面に相当する第１の合焦位置を検出する検出手順と、
   前記検出手順の検出結果に基づき、前記第１の合焦位置と対物レンズの特性情報とに応じて少なくとも前記対物レンズから遠ざかる側の移動限界位置である第２移動限界位置を変更する移動限界位置変更手順と、
   前記移動限界位置変更手順による変更後の前記第１および第２移動限界位置のうち、一方の移動限界位置から前記ステージを前記光路に沿って移動させながら、前記観察対象物から反射された光をもとに他方の界面に相当する第２の合焦位置を検出させる制御を行う移動制御手順と、
   を前記顕微鏡装置に実行させることを特徴とする制御プログラム。

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