JP2016510721A - 癌の治療のためのクローディン１８．２に対する抗体を含む併用療法 - Google Patents

癌の治療のためのクローディン１８．２に対する抗体を含む併用療法 Download PDF

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Abstract

本発明は、膵癌およびその転移などの癌疾患を含む、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞に関連する疾患を有効に治療および／または予防するための併用療法を提供する。

Description

膵癌は最も致死的な癌の１つである。早期に転移拡大する傾向があること、ならびにこの疾患が放射線および化学療法に対して高度に抵抗性であることから、死亡率は１００％に迫る。毎年北米では２７，０００例およびヨーロッパでは６８，０００例の新たな症例が診断されることを考慮すると、膵癌患者の死亡率を低下させる新規治療戦略を開発する緊急の必要性が存在する。
密着結合分子クローディン１８のスプライス変異体２（クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）は、密着結合タンパク質のクローディンファミリーの成員である。ＣＬＤＮ１８．２は、膜を貫通する４つのドメインと２つの小さな細胞外ループを含む２７．８ｋＤａの膜貫通タンパク質である。正常組織では、胃を除いて、ＲＴ−ＰＣＲによるＣＬＤＮ１８．２の検出可能な発現は存在しない。ＣＬＤＮ１８．２特異的抗体を用いた免疫組織化学は、胃が唯一の陽性組織であることを明らかにする。ＣＬＤＮ１８．２は、短命の分化した胃上皮細胞上で排他的に発現される高度に選択的な胃系統抗原である。ＣＬＤＮ１８．２は悪性形質転換の過程で維持され、したがってしばしばヒト胃癌細胞の表面で提示される。さらに、この汎腫瘍抗原は、食道腺癌、膵腺癌および肺腺癌において有意のレベルで異所性に活性化される。
ＣＬＤＮ１８．２に対するキメラＩｇＧ１抗体、ＩＭＡＢ３６２はＧａｎｙｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＧ．によって開発された。ＩＭＡＢ３６２は高い親和性および特異性でＣＬＤＮ１８．２の１番目の細胞外ドメイン（ＥＣＤ１）を認識する。ＩＭＡＢ３６２は、クローディン１８の密接に関連するスプライス変異体１（ＣＬＤＮ１８．１）を含むいかなる他のクローディンファミリー成員にも結合しない。ＩＭＡＢ３６２は正確な腫瘍細胞特異性を示し、４つの独立した極めて強力な作用機構を束ねる。標的結合後、ＩＭＡＢ３６２は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび腫瘍細胞表面での標的の架橋結合によって誘導されるアポトーシスの誘導による細胞死滅ならびに増殖の直接阻害を媒介する。したがって、ＩＭＡＢ３６２は、インビトロおよびインビボでヒト胃癌細胞株を含むＣＬＤＮ１８．２陽性細胞を効率的に溶解する。
ＩＭＡＢ３６２の毒性およびＰＫ／ＴＫプロフィールはマウスおよびカニクイザルにおいて十分に検討されており、これには用量設定試験、カニクイザルにおける２８日間反復投与毒性試験およびマウスにおける３ヶ月間反復投与毒性試験が含まれる。マウス（最長処置期間は週１回投与で３ヶ月間、最高用量レベルは４００ｍｇ／ｋｇ）およびカニクイザル（週１回適用で最大５週間、最大１００ｍｇ／ｋｇまで）の両方で、ＩＭＡＢ３６２ ｉ．ｖ．の反復投与は良好に耐容される。全身または局所毒性の徴候は誘導されない。特に、胃毒性はいずれの毒性試験においても認められていない。ＩＭＡＢ３６２は免疫の活性化およびサイトカイン放出を誘導しない。雄性または雌性生殖器官への有害作用は記録されなかった。ＩＭＡＢ３６２は、標的を欠く組織には結合しない。マウスにおける生体内分布は、胃毒性が存在しない理由が、ＩＭＡＢ３６２エピトープのアクセス可能性を大きく低下させると考えられる、健常胃上皮の管腔部位における密着結合のコンパートメント化である可能性が高いことを指示する。
ＩＭＡＢ３６２は初期臨床試験段階である。第Ｉ相臨床試験がヒトにおいて実施された。各々３名の患者の５つの用量コホート（３３ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２）にＩＭＡＢ３６２の単回静脈内投与を実施し、２８日間観察した。ＩＭＡＢ３６２は非常に良好に耐容され、患者において関連する安全性所見はなかった。１名の患者では測定したすべての腫瘍マーカーが処置後４週間以内に有意に低下した。現在進行中の第ＩＩａ相臨床試験ではＩＭＡＢ３６２が反復投与される。
本明細書で本発明者らは、化学療法剤が膵癌細胞の表面でのＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させることができ、ＩＭＡＢ３６２などの抗ＣＬＤＮ１８．２抗体によるＣＬＤＮ１８．２のドラッガビリティの増強をもたらすことを明らかにするデータを提示する。特定の化学療法レジメン、特に膵癌治療のために使用される化学療法レジメンと、ＩＭＡＢ３６２などの抗ＣＬＤＮ１８．２抗体との相乗作用が認められた。化学療法で前処置したヒト癌細胞は、抗体が誘導する標的特異的死滅に対して感受性がより高い。マウス腫瘍モデルでは、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体プラス化学療法による腫瘍制御は、単剤としての抗ＣＬＤＮ１８．２抗体によるものを上回る。
本発明は一般に、癌疾患、例えば胃癌、食道癌、膵癌、肺癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、結腸癌、肝癌、頭頸部癌および胆嚢の癌ならびにこれらの転移、特に胃癌転移、例えばクルーケンベルク腫瘍、腹膜転移およびリンパ節転移を含む、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞に関連する疾患を有効に治療および／または予防するための併用療法を提供する。
１つの態様では、本発明は、患者において膵癌を治療または予防する方法であって、（ｉ）ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体および（ｉｉ）ＣＬＤＮ１８．２の発現、すなわちレベルを安定化するまたは増大させる作用物質、を患者に投与することを含む方法を提供する。ＣＬＤＮ１８．２の発現は、好ましくは癌細胞の細胞表面においてである。ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体の投与の前、抗体の投与と同時にもしくは抗体の投与後、またはこれらの組合せで投与し得る。
ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質は、細胞傷害性および／または細胞増殖抑制性薬剤であり得る。１つの実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質には、細胞周期の停止または細胞周期の１もしくはそれ以上の期、好ましくはＧ１期以外の細胞周期の１もしくはそれ以上の期、例えばＳ期、Ｇ２期、これらの組合せまたはＳ期もしくはＧ２期とＧ１期の組合せにおける細胞の蓄積を誘導する作用物質が含まれる。ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質には、ヌクレオシド類似体、白金化合物、カンプトテシン類似体およびタキサン類、そのプロドラッグ、その塩およびそれらの組合せから成る群より選択される作用物質が含まれ得る。ヌクレオシド類似体は、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、そのプロドラッグおよびその塩から成る群より選択され得る。白金化合物は、オキサリプラチン、シスプラチン、そのプロドラッグおよびその塩から成る群より選択され得る。カンプトテシン類似体は、イリノテカン、トポテカン、そのプロドラッグおよびその塩から成る群より選択され得る。タキサン類は、パクリタキセル、ドセタキセル、そのプロドラッグおよびその塩から成る群より選択され得る。ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質には、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、パクリタキセル、そのプロドラッグ、その塩およびそれらの組合せから成る群より選択される作用物質が含まれ得る。ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質には、オキサリプラチンと５−フルオロウラシルもしくはそのプロドラッグの組合せ、シスプラチンと５−フルオロウラシルもしくはそのプロドラッグの組合せ、少なくとも１つのタキサンとオキサリプラチンの組合せ、少なくとも１つのタキサンとシスプラチンの組合せ、少なくとも１つのタキサンと５−フルオロウラシルもしくはそのプロドラッグの組合せ、または少なくとも１つのカンプトテシン類似体と５−フルオロウラシルもしくはそのプロドラッグの組合せが含まれ得る。ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質には、ゲムシタビンとオキサリプラチンの組合せ、ゲムシタビンとシスプラチンの組合せ、ゲムシタビンとカルボプラチンの組合せ、またはオキサリプラチン、５−フルオロウラシルもしくはそのプロドラッグとイリノテカンの組合せが含まれ得る。したがって、本発明の方法は、ゲムシタビンとオキサリプラチンの組合せ、ゲムシタビンとシスプラチンの組合せ、ゲムシタビンとカルボプラチンの組合せ、またはオキサリプラチン、５−フルオロウラシルもしくはそのプロドラッグとイリノテカンの組合せを投与することを含み得る。１つの実施形態では、本発明の方法は、フォリン酸、５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグ、イリノテカンおよびオキサリプラチンを投与することを含む。ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質には、免疫原性細胞死を誘導する作用物質が含まれ得る。免疫原性細胞死を誘導する作用物質にはオキサリプラチンが含まれ得る。
さらなる態様では、本発明は、患者において膵癌を治療または予防する方法であって、（ｉ）ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体および（ｉｉ）ゲムシタビンを患者に投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、癌は、胃癌、食道癌、膵癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝癌、頭頸部癌、胆嚢の癌およびこれらの転移から成る群より選択される。癌疾患は、クルーケンベルク腫瘍、腹膜転移および／またはリンパ節転移であり得る。１つの実施形態では、癌は腺癌、特に進行した腺癌である。１つの実施形態では、癌は膵癌である。
１つの実施形態では、本発明の方法は、γδＴ細胞を刺激する作用物質を投与することをさらに含む。１つの実施形態では、γδＴ細胞はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞である、１つの実施形態では、γδＴ細胞を刺激する作用物質は、窒素含有ビスホスホネート（アミノビスホスホネート）などのビスホスホネートである。１つの実施形態では、γδＴ細胞を刺激する作用物質は、ゾレドロン酸、クロドロン酸、イバンドロン酸、パミドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、オルパドロン酸、アレンドロン酸、インカドロン酸およびそれらの塩から成る群より選択される。１つの実施形態では、γδＴ細胞を刺激する作用物質をインターロイキン２と組み合わせて投与する。
本発明の方法は、細胞傷害性薬剤であり得る、少なくとも１つのさらなる化学療法剤を投与することをさらに含み得る。
ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、生細胞の表面上に存在するＣＬＤＮ１８．２の天然エピトープに結合し得る。１つの実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、ＣＬＤＮ１８．２の第一細胞外ループに結合する。１つの実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）媒介性溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介性溶解、アポトーシスの誘導および増殖の阻害の１つまたはそれ以上による細胞死滅を媒介する。１つの実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、モノクローナル、キメラもしくはヒト化抗体、または抗体のフラグメントである。１つの実施形態では、前記抗体は、ＣＬＤＮ１８．２、特に細胞によってその細胞表面上に発現されるＣＬＤＮ１８．２に結合した場合、細胞死滅を媒介し、ここで細胞は、好ましくは癌細胞、例えば本明細書で述べる癌の細胞である。１つの実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、（ｉ）アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７３７、ＤＳＭ ＡＣＣ２７３８、ＤＳＭ ＡＣＣ２７３９、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４０、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４１、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４２、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４３、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４５、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４６、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４７、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４８、ＤＳＭ ＡＣＣ２８０８、ＤＳＭ ＡＣＣ２８０９またはＤＳＭ ＡＣＣ２８１０の下で寄託されたクローンによって産生されるおよび／または前記クローンから入手可能な抗体、（ｉｉ）（ｉ）に含まれる抗体のキメラ化またはヒト化形態である抗体、（ｉｉｉ）（ｉ）に含まれる抗体の特異性を有する抗体、ならびに（ｉｖ）（ｉ）に含まれる抗体の抗原結合部分または抗原結合部位、特に可変領域を含有し、および好ましくは（ｉ）に含まれる抗体の特異性を有する抗体、から成る群より選択される抗体である。１つの実施形態では、抗体は、治療薬、例えば毒素、放射性同位体、薬物または細胞傷害性薬剤に連結される。
１つの実施形態では、本発明の方法は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体を１０００ｍｇ／ｍ２までの用量で投与することを含む。１つの実施形態では、本発明の方法は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体を３００〜６００ｍｇ／ｍ２の用量で反復投与することを含む。
本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２は、好ましくは配列番号：１に従うアミノ酸配列を有する。
１つの実施形態では、本明細書で述べる癌はＣＬＤＮ１８．２陽性である。１つの実施形態では、本明細書で述べる癌の癌細胞はＣＬＤＮ１８．２陽性である。１つの実施形態では、本明細書で述べる癌の癌細胞は、ＣＬＤＮ１８．２をその細胞表面に発現する。
１つの実施形態では、本明細書で述べる膵癌は、原発癌、進行癌もしくは転移癌、またはこれらの組合せ、例えば膵原発癌と転移癌の組合せを含む。１つの実施形態では、本発明の方法は、原発癌と転移癌、例えば膵原発癌と膵転移癌の同時治療を目的とする。１つの実施形態では、転移癌は、リンパ節、卵巣、肝臓もしくは肺、またはこれらの組合せへの転移を含む。１つの実施形態では、膵癌は膵管の癌を含む。１つの実施形態では、膵癌は、腺癌もしくは癌腫、またはこれらの組合せを含む。１つの実施形態では、膵癌は、膵管腺癌、粘液性腺癌、神経内分泌癌もしくは腺房細胞癌、またはこれらの組合せを含む。１つの実施形態では、膵癌は、ゲムシタビン単独療法などのゲムシタビン治療に対して部分的または完全に抗療性である。１つの実施形態では、膵癌を予防することは、膵癌の再発を予防することを含む。
１つの実施形態では、本発明に従って治療されるべき患者は、膵癌のための手術を受けたことがある。１つの実施形態では、患者は、前癌膵病変、特に膵管における初期の悪性組織学的変化を含む前癌膵病変を有する。これらの実施形態では、本発明の方法は、好ましくは悪性膵癌の発症を防止することを目指す。
さらなる態様では、本発明は、膵癌を治療または予防するための医療製剤であって、（ｉ）ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体および（ｉｉ）ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質、を含有する医療製剤を提供する。本発明の医療製剤は、γδＴ細胞を刺激する作用物質をさらに含有し得る。ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体およびＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質、ならびに場合によりγδＴ細胞を刺激する作用物質は、混合物としてまたは互いに別々に医療製剤中に存在し得る。医療製剤は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体を含有する第一容器およびＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質を含有する第二容器、ならびに場合によりγδＴ細胞を刺激する作用物質を含有する容器を含むキットの形態で存在し得る。医療製剤は、膵癌の治療または予防のための製剤の使用、特に本発明の方法における製剤の使用に関する印刷された指示書をさらに含み得る。医療製剤ならびに、特にＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体、ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質およびγδＴ細胞を刺激する作用物質の種々の実施形態は、本発明の方法に関して上記で述べたとおりである。
特定の態様では、本発明は、（ｉ）ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体および（ｉｉ）ゲムシタビンを含有する医療製剤を提供する。本発明の医療製剤は、γδＴ細胞を刺激する作用物質をさらに含有し得る。ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体およびゲムシタビン、ならびに場合によりγδＴ細胞を刺激する作用物質は、混合物としてまたは互いに別々に医療製剤中に存在し得る。医療製剤は、膵癌などの癌を治療または予防することを目的とし得る。医療製剤は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体を含有する第一容器およびゲムシタビンを含有する第二容器、ならびに場合によりγδＴ細胞を刺激する作用物質を含有する容器を含むキットの形態で存在し得る。医療製剤は、膵癌などの癌の治療または予防のための製剤の使用、特に本発明の方法における製剤の使用に関する印刷された指示書をさらに含み得る。医療製剤ならびに、特にＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体、ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質およびγδＴ細胞を刺激する作用物質の種々の実施形態は、本発明の方法に関して上記で述べたとおりである。
本発明はまた、本明細書で述べる方法における使用のための、本明細書で述べる作用物質、例えばＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体および／またはＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質も提供する。例えば、本発明は、ゲムシタビンなどのＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質および場合によりγδＴ細胞を刺激する作用物質と併用して投与するための、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体も提供する。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
膵癌細胞株の形質導入のために使用したレンチウイルスベクター。ヒトＣＬＤＮ１８．２をＥＦ１αプロモーターの下流にクローニングした。発現カセットを、ウイルスｍＲＮＡのパッケージングおよび逆転写を可能にする長い末端反復配列（５'および３'−ＬＴＲ）の間に組み込む。ＲＳＶ：ラウス肉腫ウイルスは、ウイルスｍＲＮＡのＴａｔ非依存性産生を可能にする。Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子。ＰＧＫｐ：ブラスチシジンのプロモーター。ＷＰＲＥ：ウッドチャック転写後調節エレメントは、導入遺伝子発現を増強する。ＬＴＲ：長い末端反復配列は、ウイルスパッケージングを可能にする。ＳＶ４０Ａは、転写終結およびｍＲＮＡのポリアデニル化を可能にする。ｐＵＣ：細菌ベクター骨格。Ｂｌａ：アンピシリンのプロモーター。 マウス肺における膵細胞の転移分析。膵癌細胞を用いたマウスのｉ．ｖ．注射後のマウス肺の解剖図。 正常膵組織および癌性膵組織におけるＣＬＤＮ１８．２発現。モノクローナルマウス３５−２２Ａ抗体（０．２μｇ／ｍｌ）を用いた正常膵臓のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織（Ａ）および膵腺癌組織（Ｂ）の染色。ヘマトキシリン対比染色（２：００分）。倍率２００×。 正常膵組織および前癌性膵組織におけるＣＬＤＮ１８．２発現。様々な前癌構造の４３−１４Ａ染色：（Ａ）正常およびＰａｎＩＮ１；（Ｂ）ＰａｎＩＮ２；（Ｃ）ＰａｎＩＮ３。倍率２００×。 パイロット試験−分析した膵原発腫瘍に関するＣＬＤＮ１８．２シグナル強度と陽性腫瘍細胞の量との間の相関。各々の点は、モノクローナルマウス３５−２２Ａ抗体（０．２μｇ／ｍｌ）を用いてＦＦＰＥ切片を染色することによって分析した膵原発癌の場合を表す。点線は１０％値を示す。 パイロット試験−原発性および転移性膵腫瘍組織におけるＣＬＤＮ１８．２の発現。（Ａ）腺癌原発腫瘍および（Ｂ）リンパ節転移の、マウスモノクローナル３５−２２Ａ抗体を用いたＦＦＰＥ組織切片（３μｍ）の染色。ヘマトキシリン（Ｍａｙｅｒｓ）で対比染色した。 主試験：分析した膵原発腫瘍に関するＣＬＤＮ１８．２シグナル強度と陽性腫瘍細胞の量との間の相関。各々の点は、モノクローナルマウス４３−１４Ａ抗体（０．２μｇ／ｍｌ）を用いてＦＦＰＥ切片を染色することによって分析した膵管腺癌原発腫瘍（黒い円）または神経内分泌原発腫瘍（白い円）の場合を表す。 分析した膵転移に関するＣＬＤＮ１８．２シグナル強度と陽性腫瘍細胞の量との間の相関。各々の点は、モノクローナルマウス４３−１４Ａ抗体（０．２μｇ／ｍｌ）を用いてＦＦＰＥ切片を染色することによって分析した膵リンパ節転移（黒い円）または肝転移（白い円）の場合を表す。点線は１０％値を示す。 原発性および転移性膵腫瘍組織におけるＣＬＤＮ１８．２の発現。（Ａ、Ｃ、Ｅ）腺癌原発腫瘍および（Ｂ、Ｄ、Ｆ）リンパ節転移に関するマウスモノクローナル４３−１４Ａ抗体を用いたＦＦＰＥ組織切片（３μｍ）の染色。Ｍａｙｅｒｓヘマトキシリンを用いて切片を対比染色した。 グラフ分析−マッチする膵原発腫瘍組織とリンパ節転移組織におけるＣＬＤＮ１８．２の発現。 マッチする膵原発腫瘍組織と転移組織におけるＣＬＤＮ１８．２の発現。マウスモノクローナル４３−１４Ａ抗体を用いた、（Ａ）原発性腺癌、（Ｂ）肝転移および（Ｃ）リンパ節転移のＦＦＰＥ組織切片（３μｍ）の染色。Ｍａｙｅｒｓヘマトキシリンを用いて切片を対比染色した。２００×倍率。 膵癌細胞株におけるＣＬＤＮ１８．２ ｍＲＮＡレベル。 膵癌細胞株におけるＣＬＤＮ１８．２ ｍＲＮＡレベル。 （Ａ）種々の膵ＣＡ細胞株、レンチウイルス形質導入（ＬＶＴ）細胞株（灰色のバー）、胃癌細胞株ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（陽性対照）および乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３（陰性対照）のＱ−ＰＣＲ発現分析。ＣＬＤＮ１８．２転写産物を、遺伝子特異的プライマーを使用して増幅した。１×１０５を上回る相対的発現レベルを示す内因性細胞株をＣＬＤＮ１８．２陽性（斜線のバー）と採点した。ＮＴＣ：Ｈ２Ｏ対照試料。誤差バー：平均＋ＳＤ。（Ｂ〜Ｄ）Ｐａｔｕ８９８８Ｓ（Ｂ）、Ｐａｎｃ０５．０４（Ｃ）および示されているＬＶＴ細胞株（Ｄ）における継代依存性ＣＬＤＮ１８．２発現分析。継代数を各々のバーの下に示す。 膵癌細胞株の細胞溶解物中のＣＬＤＮ１８．２タンパク質レベル。タンパク質を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ウェスタンブロット分析を、ＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２のＣ末端を検出するＣＬＤＮ１８抗体（Ｚｙｍｅｄ−ＭＩＤ）を使用し、およびβ−アクチンを検出するローディングコントロール抗体を使用して実施した。１４０秒（Ｐｉｅｒｃｅ ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ）および２０秒（Ｐｉｅｒｃｅ ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ）の暴露時間をそれぞれ使用した。 （Ａ）膵細胞株溶解物、陽性対照細胞溶解物（ＨＥＫ２９３−ｐ７４０）および陰性対照細胞溶解物（ＳＫＢＲ−３）におけるＣＬＤＮ１８の検出。（Ｂ）非形質導入親細胞溶解物とレンチウイルス形質導入（ＬＶＴ）細胞株溶解物との間で比較したＣＬＤＮ１８．２発現。Ｐａｔｕ８９８８ＳおよびＳＫＢＲ−３をそれぞれ陽性対照および陰性対照として加えた。 膵癌細胞株におけるＣＬＤＮ１８発現の検出および細胞局在。カバーガラス上で増殖させた膵癌細胞株の染色。抗体：３５−２２Ａ（２０×倍率、暴露時間を各々の画像の下に示す）。ＤＡＰＩを使用して核（青色）を染色した。（Ａ：ＡｓＰＣ１；Ｂ：ＢｘＰＣ３；Ｃ：ＣＦＰＡＣ；Ｄ：ＤＡＮＧ；Ｅ：ＨＰＡＦ−ＩＩ；Ｆ：ＨＵＰ−Ｔ３；Ｇ：ＨＵＰ−Ｔ４；Ｈ：ＫＣＩ−ＭＯＨ；Ｉ：Ｐａｎｃ１；Ｊ：Ｐａｎｃ０５．０４；Ｋ：Ｐａｎｃ０２．０４；Ｌ：Ｐａｎｃ０４．０３；Ｍ：Ｐａｔｕ８９０２；Ｎ：Ｐａｔｕ８９８８Ｓ；Ｏ：Ｓｕ８６．８６：Ｐ：Ｓｕｉｔ−２；Ｑ：ＳＷ−１９９０；Ｒ：ＹＡＰＣ；Ｓ：胃癌対照細胞株ＫＡＴＯ−ＩＩＩ）。 ＣＬＤＮ１８．２形質導入膵癌細胞株におけるＣＬＤＮ１８発現の検出および細胞局在。固定および透過処理後の３５−２２Ａ抗体を用いたレンチウイルス形質導入（ＬＶＴ）膵癌細胞株におけるＣＬＤＮ１８検出。Ａｌｅｘａ４８８またはＡｌｅｘａ５５５標識二次抗体を検出のために使用した。Ａ：ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ；Ｂ：ＣＡＰＡＮ１−ＬＶＴ；Ｃ：ＤＡＮＧ−ＬＶＴ；Ｄ：ＨＰＡＣ−ＬＶＴ；Ｅ：ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴ；Ｆ：Ｐａｔｕ８９０２−ＬＶＴ；Ｇ：Ｓｕｉｔ−２−ＬＶＴ；Ｈ：ＹＡＰＣ−ＬＶＴ。 ＣＬＤＮ１８．２陽性膵ＣＡ細胞株の細胞表面へのＩＭＡＢ３６２の結合（薬力学）。 ＣＬＤＮ１８．２陽性膵ＣＡ細胞株の細胞表面へのＩＭＡＢ３６２の結合（薬力学）。ＣＬＤＮ１８．２を発現する膵癌細胞株（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）、レンチウイルス形質導入膵細胞株（Ｇ〜Ｌ）およびＫＡＴＯ−ＩＩＩ胃癌対照細胞（Ｃ、Ｆ）のＩＦ分析。細胞を天然条件下で（Ｄ〜Ｅ）ならびに細胞の固定および透過処理後の３５−２２Ａとの比較のために（Ａ〜Ｃ）ＩＭＡＢ３６２で染色した。ＤＡＰＩを使用して核を染色した。暴露時間を各々のパネル中に示す。Ｇ：ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ；Ｈ：ＣＡＰＡＮ１−ＬＶＴ；Ｉ：ＤＡＮＧ−ＬＶＴ；Ｊ：ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴ；Ｋ：Ｐａｔｕ８９０２−ＬＶＴ；Ｌ：Ｓｕｉｔ２−ＬＶＴ。 種々の細胞株の異種移植腫瘍におけるＣＬＤＮ１８．２発現。ＣＡＰＡＮ１−ＬＶＴ（Ａ、Ｂ）、ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ（Ｃ、Ｄ）、ＰＡＴＵ８９８８Ｓ−ＬＶＴ（Ｅ、Ｆ）、ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴ（Ｇ、Ｈ）、ＹＡＰＣ−ＬＶＴ（Ｊ、Ｋ）およびＤＡＮＧ−ＬＶＴ（Ｌ、Ｍ）異種移植腫瘍におけるＣＬＤＮ１８．２の発現。Ｚｙｍｅｄ−ＭＩＤ抗体を用いて組織染色を実施した。レンズ倍率：１０×（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｊ、Ｌ）および２０×（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ）。 Ｓｕｉｔ−２およびＭｉａＰａＣａ２膵癌細胞株の生着検査。細胞をヌードマウスの尾静脈に注射した。Ｓｕｉｔ−２（Ａ〜Ｃ）の適用後４５（Ａ）、５２（Ｂ）、５９（Ｃ）日目、またはＭｉａＰａＣａ２（Ｄ〜Ｆ）の注射後５９（Ｄ）、６６（Ｅ）、７３（Ｆ）日目に動物を犠死させた。マウス組織中のヒト細胞を検出するために肺を調製し、ＭＨＣクラスＩ抗体（抗ヒトＭＨＣ Ｉ、クローンＥＰＲ１３９４Ｙ）で染色した。 Ｐａｔｕ８９８８Ｓの転移生着分析。Ｐａｔｕ８９８８Ｓ細胞をＮｕ／Ｎｕマウスにおいて１×１０６または２×１０６細胞でｉ．ｖ．注射し、ｘ軸の下に示されている種々の時点でマウスの肺（Ａ）および肝臓（Ｂ）を単離した。各組織調製物中に存在するヒトＤＮＡの％を計算するため、ヒトＤＮＡとマウスＤＮＡを混合し、７つの５倍希釈物を調製して１００％（１）〜０．００６４％（７）ヒトＤＮＡを生じさせることにより、標準曲線を作成した。 マウス肺組織におけるＰａｔｕ８９８８Ｓ転移のＩＨＣ分析。Ｐａｔｕ８９８８Ｓ細胞を尾静脈に注射したマウスを種々の時点で（Ａ〜Ｄ＝７０日目、Ｅ〜Ｈ＝８６日目）犠死させ、肺組織を単離して、１：１０００希釈したＭＨＣ−Ｉ（ＥＰＲ１３９４Ｙ）抗体（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）または０．２μｇ／ｍｌの抗クローディン１８（Ｚｙｍｅｄ−Ｍｉｄ）（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）で染色した。倍率：Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ＝１０×およびＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ＝２０×。 ゲムシタビン処理した膵腫瘍細胞のＩＭＡＢ３６２媒介性アポトーシス。４８時間後にＢｘＰＣ３〜ＣＬＤＮ１８上でＣＬＤＮ１８．２の架橋結合によって誘導されたアポトーシス。ＢｘＰＣ３〜ＣＬＤＮ１８を培地中または培地＋１００ｎｇ／ｍｌゲムシタビン中で培養した。単核細胞のアポトーシス細胞の割合がシフトした。同様のシフトがカンプトテシンと腫瘍細胞のインキュベーションによって得られた。 膵癌細胞へのＩＭＡＢ３６２誘導性ＡＤＣＣ活性の効力。 膵癌細胞へのＩＭＡＢ３６２誘導性ＡＤＣＣ活性の効力。 （Ａ）種々のドナーのＰＢＭＣを使用してＣＬＤＮ１８．２陽性膵癌細胞株に関して実施されたＡＤＣＣ。（Ｂ〜Ｆ）ＣＬＤＮ１８．２を異所性に発現するＬＶＴ膵細胞株および対応する親細胞に関して実施されたＡＤＣＣ。（Ｇ）ドットプロット。 膵癌細胞へのＩＭＡＢ３６２誘導性ＣＤＣ活性の効力。 膵癌細胞へのＩＭＡＢ３６２誘導性ＣＤＣ活性の効力。 （Ａ）４つの独立した実験において補体源としての健常ヒト血清プール、ＩＭＡＢ３６２およびＣＬＤＮ１８．２陽性膵ＣＤＯＫ１−ｐ７４０対照細胞に関して実施されたＣＤＣ。（Ｂ）ＣＬＤＮ１８．２陽性（Ｐａｔｕ８９８８Ｓ、ＤＡＮＧ、Ｐａｎｃ０５．０４）およびＣＬＤＮ１８．２陰性（ＣＡＰＡＮ１、Ｓｕｉｔ２、ＢｘＰＣ３、ＹＡＰＣ）膵細胞株に関して実施されたＣＤＣ。（Ｃ）異所性発現ＬＶＴ細胞株に関するＣＤＣ。（Ｄ）膵癌細胞株に対して半最大溶解率（ＥＣ５０）を生じさせるＩＭＡＢ３６２濃度を示すドットプロット。（Ｅ）膵癌細胞株に対してＩＭＡＢ３６２で得られた最大死滅率。 皮下ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴ異種移植片へのＩＭＡＢ３６２処置の作用。ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴ異種移植腫瘍を、各処置群につき１５匹の雌性Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスの側腹部への１ｅ７ ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴ細胞の皮下注射によって接種した。腫瘍細胞注射後３日目に、それぞれＩＭＡＢ３６２ ２００μｇまたは対照で処置を開始した。動物を犠死させるまで週２回、ｉ．ｐ．注射とｉ．ｖ．注射を交互に行って処置を続けた。（Ａ）腫瘍増殖へのＩＭＡＢ３６２処置の作用。ｓ．ｃ．腫瘍の大きさを週２回測定した（平均＋ＳＥＭ）。（Ｂ）カプラン−マイヤー生存率プロット。腫瘍が１４００ｍｍ３の体積に達するかまたは腫瘍が潰瘍性になったときにマウスを犠死させた。 皮下ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ異種移植片のＩＭＡＢ３６２処置。ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ異種移植腫瘍を、各処置群につき１５匹の雌性Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスの側腹部への１ｅ７ ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ細胞の皮下注射によって接種した。腫瘍細胞注射後３日目に、それぞれＩＭＡＢ３６２ ２００μｇまたは対照で処置を開始した。動物を犠死させるまで週２回、ｉ．ｐ．注射とｉ．ｖ．注射を交互に行って処置を続けた。（Ａ）腫瘍増殖へのＩＭＡＢ３６２処置の作用。ｓ．ｃ．腫瘍の大きさを週２回測定した（平均＋ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５）。（Ｂ）カプラン−マイヤー生存率プロット。腫瘍が１４００ｍｍ３の体積に達するかまたは腫瘍が潰瘍性になったときにマウスを犠死させた。 Ｓｕｉｔ２−ＬＶＴ膵転移の増殖へのＩＭＡＢ３６２処置の作用。２×１０６ Ｓｕｉｔ２−ＬＶＴ腫瘍細胞を、処置群当たり１２匹の雌性Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスの尾静脈に静脈内注射した。腫瘍細胞注射後３日目に、ＩＭＡＢ３６２ ２００μｇ、アイソタイプ対照２００μｇまたは等容量のＰＢＳで処置を開始した。移植後４２日目に動物を犠死させた。（Ａ）マウス肺試料中に存在するヒトＤＮＡのパーセンテージを決定するｑＰＣＲ分析（試料につき２〜４回の反応の平均）。（Ｂ）マウス肺表面を覆うヒト細胞のパーセンテージを平面面積測定法によって決定した。ヒト細胞を、抗ヒトＭＨＣクラスＩ抗体を用いて組織切片において免疫組織化学的に染色した。＊ｐ＜０．０５（クラスカル−ウォリス検定）。エラーバー：平均±ＳＤ。 Ｐａｔｕ８９８８Ｓ肺転移のＱ−ＰＣＲおよびＩＨＣ分析。各マウスにつき２×１０６ Ｐａｔｕ８９８８Ｓ細胞を注射した。６５日後に動物を犠死させた。白い円：６３日後に犠死させたマウス。 Ｐａｔｕ８９８８Ｓ肺転移のＱ−ＰＣＲおよびＩＨＣ分析。各マウスにつき２×１０６ Ｐａｔｕ８９８８Ｓ細胞を注射した。６５日後に動物を犠死させた。白い円：６３日後に犠死させたマウス。 （Ａ）マウスを週２回ＩＭＡＢ３６２ ２００μｇまたは生理食塩水対照で処置した。Ｃｔ値から計算した、Ｑ−ＰＣＲで検出されたヒトＤＮＡの量（ｎｇ）。（Ｂ）（Ａ）で述べたＱ−ＰＣＲ実験の反復。ここではマウスＤＮＡ中に存在するヒトＤＮＡのパーセンテージをＣｔ値から計算した。（Ｃ）マウスをＩＭＡＢ３６２およびアイソタイプ対照抗体（リツキシマブ）で処置した。マウス肺中に存在するヒトＤＮＡのパーセンテージをＣｔ値から計算した。ＩＭＡＢ３６２群に関して、１例の異常値を検出した（白い三角）。異常値を含めてまたは除外して、有意性を示している。（Ｄ／Ｅ）（Ｃ）と同じ実験。ここではＩｍａｇｅ Ｊプログラムを使用して転移の表面を決定した。ドットプロットは、異常値を含む（Ｄ）かまたは除外した（Ｅ）ＩＭＡＢ３６２阻害の有意性を示す。Ｐ値：対応のないｔ検定。エラーバー±ＳＤ。 ゲムシタビンについての用量反応曲線。膵癌細胞株はゲムシタビンに対して非常に異なる感受性を示す。細胞株を種々の濃度のゲムシタビンに４日間暴露し、増殖の阻害を生存能アッセイによって分析した。 オキサリプラチンについての用量反応曲線。膵癌細胞株はオキサリプラチンに対して非常に異なる感受性を示す。細胞株を種々の濃度のオキサリプラチンに４日間暴露し、増殖の阻害を生存能アッセイによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２発現（ＲＮＡ）への化学療法剤による処置の作用。未処置、Ｇｅｍ（１ｎｇ／ｍｌ）もしくはＧｅｍＯｘ（Ｇｅｍ １ｎｇ／ｍｌ＋Ｏｘ １０ｎｇ／ｍｌ）で前処置したＤＡＮＧ細胞（２日間）（Ａ）またはＧｅｍ（１０ｎｇ／ｍｌ）もしくはＧｅｍＯｘ（Ｇｅｍ １０ｎｇ／ｍｌ＋Ｏｘ １００ｎｇ／ｍｌ）で３日間前処置したＰａｔｕ８９８８Ｓ細胞（Ｂ）のＲＮＡ。ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、ＣＬＤＮ１８．２転写産物レベルを定量的リアルタイムＰＣＲで分析した。結果を、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴの転写産物レベルと比較した相対単位として示す。 膵癌細胞におけるＣＬＤＮ１８．２タンパク質レベルへの化学療法の作用。未処置（培地）、Ｇｅｍ（１ｎｇ／ｍｌ）またはＧｅｍＯｘ（Ｇｅｍ １ｎｇ／ｍｌ＋Ｏｘ １０ｎｇ／ｍｌ）で前処置したＤＡＮＧ細胞（Ａ）またはＰａｔｕ８９８８Ｓ細胞（Ｂ）の全細胞溶解物からのタンパク質を、Ｚｙｍｅｄ Ｃ末端ポリクローナル抗血清を用いて検出されたＣＬＤＮ１８．２発現に関して分析した。タンパク質の等しい負荷を示すためにアクチンを使用した。 ＣＬＤＮ１８．２細胞表面発現のＦＡＣＳ分析。培地で培養した（左側）およびＧｅｍ処置した（右側）Ｐａｔｕ８９８８ＳのＣＬＤＮ１８発現（黒いヒストグラム）をアイソタイプ対照と比較して重ね合わせて示す。Ｐａｔｕ８９８８Ｓはゲムシタビン（１０ｎｇ／ｍｌ））で３日間処置する。 ゲムシタビン（Ｇｅｍ；２ｎｇ／ｍｌ）またはゲムシタビン＋オキサリプラチン（ＧｅｍＯｘ；１ｎｇ／ｍｌ＋１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで２日間処置するかまたは処置していないＤＡＮＧ細胞の細胞周期分析。（Ａ）ゲムシタビン処置はＳ期での細胞周期停止をもたらす。各々のバーの面積を除して、Ｇ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２期の細胞のパーセンテージを示す。（Ｂ）ウェスタンブロット分析は、Ｇｅｍによる処置後のＣＬＤＮ１８の上方調節を示した。 Ｐａｔｕ８９８８Ｓ細胞における細胞周期（Ａ）およびＣＬＤＮ１８．２発現（Ｂ、Ｃ）へのゲムシタビンの影響。Ｐａｔｕ８９８８Ｓ細胞は、未処置であるかまたはゲムシタビン（１０ｎｇ／ｍｌ）で２日間処置した。（Ａ）各々のバーの面積を除して、Ｇ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２期の細胞のパーセンテージを示す。ＣＬＤＮ１８．２（ｘ軸）の密度を細胞数（ｙ軸）に対してプロットした。（Ｂ）未処置（点線）対Ｇｅｍ処置（実線）のＣＬＤＮ１８．２発現を示す。（Ｃ）Ｇ０／Ｇ１期のＧｅｍ処置したＰａｔｕ８９８８Ｓ細胞（点線）対Ｓ期の細胞（実線）のＣＬＤＮ１８．２発現を示す。 胃癌細胞への化学療法の作用。 胃癌細胞への化学療法の作用。 胃癌細胞への化学療法の作用。９６時間のＫａｔｏ ＩＩＩ細胞の培養は、Ｇ０／Ｇ１期での細胞周期停止（ａ）およびＣＬＤＮ１８．２の下方調節（ｃ）をもたらす。細胞周期の種々の期で細胞周期停止を生じさせる細胞増殖抑制性化合物は、ＣＬＤＮ１８．２発現を安定化する（ｃ）。 胃癌細胞への化学療法の作用。細胞周期の種々の期（Ｓ／Ｇ２期（イリノテカン）またはＧ２期（ドセタキセル））で細胞周期停止を生じさせる細胞増殖抑制性化合物。各々のバーの面積を除して、Ｇ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２期の細胞のパーセンテージを示す。 ＤＡＮＧの化学療法処置後のＩＭＡＢ３６２媒介性ＡＤＣＣに関する用量反応曲線。（Ａ）ＧｅｍまたはＧｅｍＯｘによる４０時間のＤＡＮＧ膵癌細胞の前処置後の１例の代表的ドナーの用量反応曲線。（Ｂ）ＩＭＡＢ３６２媒介性ＡＤＣＣについてのＥＣ５０値（平均）。Ｐ値：対応のないｔ検定。 胃癌細胞への化学療法の作用。 胃癌細胞への化学療法の作用。 胃癌細胞への化学療法の作用。 （ａ）イリノテカン、ドセタキセルまたはシスプラチンで処置した細胞は、培地で培養した標的細胞と比較してより低いレベルの生細胞を示す。（ｂ）イリノテカン、ドセタキセルまたはシスプラチンで処置した細胞におけるＣＬＤＮ１８．２発現は、培地で培養した細胞と比較して増大している。（ｃ／ｄ）イリノテカン、ドセタキセルまたはシスプラチンでの細胞の処置は、ＡＤＣＣを誘導するＩＭＡＢ３６２の効力を増大させる。 ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴ細胞のＩＭＡＢ３６２媒介性ＣＤＣへの化学療法剤の影響。２つの独立したアッセイの用量反応曲線。ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴを培地、Ｇｅｍ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＧｅｍＯｘ（１０ｎｇ／ｍｌ Ｇｅｍ＋１００ｎｇ／ｍｌ Ｏｘ）中で７０時間培養した。 ＩＭＡＢ３６２誘導性ＣＤＣへの化学療法の作用。 ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ異種移植片へのＧｅｍまたはＧｅｍＯｘと併用したＩＭＡＢ３６２処置の作用。ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ異種移植腫瘍を、各処置群につき１０匹の雌性Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスの側腹部への８．５ｅ６ ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ細胞の皮下注射によって接種した。腫瘍細胞注射後３日目に、化学療法（５０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンｉ．ｐ．、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇゲムシタビン＋５ｍｇ／ｋｇオキサリプラチンｉ．ｐ．）での処置を開始し、週１回６週間継続した。化学療法剤の注射の２４時間後に、ＩＭＡＢ３６２ ８００μｇまたは対照を尾静脈に静脈内適用した。マウスを犠死させるまでＩＭＡＢ３６２処置を続けた。（Ａ）皮下ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ異種移植腫瘍の増殖曲線。ｓ．ｃ．腫瘍の大きさを週２回測定した（平均＋ＳＥＭ）。（Ｂ）カプラン−マイヤー生存率曲線。腫瘍が１４００ｍｍ３の体積に達するかまたは腫瘍が潰瘍性になったときにマウスを犠死させた。 ＩＭＡＢ３６２とゲムシタビンレジメンの併用による抗腫瘍効果の増強。ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ異種移植腫瘍を、各処置群につき１０匹の雌性Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスの側腹部への８．５ｅ６ ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ細胞の皮下注射によって接種した。腫瘍細胞注射後３日目に、化学療法（１００ｍｇ／ｋｇゲムシタビンｉ．ｐ．または１００ｍｇ／ｋｇゲムシタビン＋５ｍｇ／ｋｇオキサリプラチンｉ．ｐ．）での処置を開始し、週１回６週間継続した。化学療法剤の注射の２４時間後に、ＩＭＡＢ３６２ ２００μｇ（１／２用量）または４００μｇ（総用量）を尾静脈に静脈内適用した。マウスを犠死させるまで、週２回、ｉ．ｐ．注射とｉ．ｖ．注射を交互に行ってＩＭＡＢ３６２処置を続けた。（Ａ）皮下ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ異種移植腫瘍の増殖曲線。ｓ．ｃ．腫瘍の大きさを週２回測定した（平均＋ＳＥＭ）。（Ｂ）カプラン−マイヤー生存率曲線。腫瘍が１４００ｍｍ３の体積に達するかまたは腫瘍が潰瘍性になったときにマウスを犠死させた。 ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴ異種移植片へのゲムシタビンと併用したＩＭＡＢ３６２処置の作用。ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴ異種移植腫瘍を、各処置群につき１０匹の雌性Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスの側腹部への５ｅ６ ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴ細胞の皮下注射によって接種した。腫瘍細胞注射の４日後に、化学療法（５０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンｉ．ｐ．）での処置を開始し、週１回６週間継続した。化学療法剤の注射の２４時間後に、ＩＭＡＢ３６２ ２００μｇまたは対照を尾静脈に静脈内適用した。マウスを犠死させるまで、週２回、ｉ．ｐ．注射とｉ．ｖ．注射を交互に行ってＩＭＡＢ３６２処置を続けた。（Ａ）皮下異種移植腫瘍の増殖。腫瘍の大きさを週２回測定した（平均＋ＳＥＭ）。（Ｂ）カプラン−マイヤー生存率曲線。腫瘍が１４００ｍｍ３の体積に達するかまたは腫瘍が潰瘍性になったときにマウスを犠死させた。 確立されたＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴ異種移植腫瘍へのゲムシタビンと併用したＩＭＡＢ３６２処置の作用。ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴ異種移植腫瘍を、雌性Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスの側腹部への１ｅ７ ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴ細胞の皮下注射によって接種した。皮下腫瘍接種の９日後に、腫瘍担持マウスを各群につき８匹の動物で均一な処置群に再編成し、処置を開始した。マウスを１５０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンで週２回４週間、ｉ．ｐ．で処置した。ゲムシタビン注射の２４時間後に、ＩＭＡＢ３６２ ２００μｇまたは対照を尾静脈に静脈内適用した。マウスを犠死させるまで、ＩＭＡＢ３６２ ２００μｇでの処置を週２回、ｉ．ｐ．注射とｉ．ｖ．注射を交互に行って継続した。（Ａ）皮下腫瘍の大きさを週２回測定した（平均＋ＳＥＭ；＊＊＝ｐ＜０．０１）。（Ｂ）カプラン−マイヤー生存率曲線。腫瘍が１４００ｍｍ３の体積に達するかまたは腫瘍が潰瘍性になったときにマウスを犠死させた（ログランク（マンテル−コックス）検定；＊＊＝ｐ＜０．０１）。 Ｐａｔｕ８９８８Ｓ異種移植モデルにおける肺転移へのゲムシタビンと併用したＩＭＡＢ３６２の作用。 Ｐａｔｕ８９８８Ｓ異種移植モデルにおける肺転移へのゲムシタビンと併用したＩＭＡＢ３６２の作用。 ２×１０６Ｐａｔｕ８９８８Ｓ腫瘍細胞を、各処置群につき１２匹の雌性Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスの尾静脈に静脈内注射した。静脈内腫瘍細胞注射の２週間後に、処置を、１００ｍｇ／ｋｇゲムシタビンｉ．ｐ．の週２回４週間の投与と併用したＩＭＡＢ３６２ ２００μｇの週２回（ｉ．ｖ．／ｉ．ｐ．）の維持処置で開始した。対照群は、週２回の１００ｍｇ／ｋｇゲムシタビンと併用したアイソタイプ対照抗体２００μｇで処置した。動物を移植後７０日目に犠死させた。（Ａ）ＩＭＡＢ３６２およびアイソタイプ抗体で処置したマウスの肺試料中のヒトＤＮＡの定量的ＰＣＲ分析（各試料につき３回の反応の平均）。アイソタイプ対照に対して有意の差（Ｐ＝０．００３５、マン−ホイットニー検定）。（Ｂ）マウス肺表面を覆う染色したヒト細胞のパーセンテージをコンピュータによる解析によって決定した。抗ヒトＭＨＣ−Ｉ抗体（クローンＥＰＲ１３９４Ｙ）を用いてパラフィン包埋肺組織に関する免疫組織学的染色を実施した（平均±ＳＥＭ；Ｐ＝０．０００３、マン−ホイットニー検定）。（ＣおよびＤ）ＩＭＡＢ３６２＋ゲムシタビン処置マウス（Ｃ）またはアイソタイプ抗体＋ゲムシタビン処置マウス（Ｄ）におけるＰａｔｕ８９８８ｓ肺転移への抗ＭＨＣ−Ｉ抗体での免疫組織学的染色の例。
本発明を以下で詳細に説明するが、本発明は本明細書で述べる特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
以下において、本発明の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、これらは、付加的な実施形態を創製するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および好ましい実施形態は、本発明を明白に記述される実施形態だけに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明白に記述される実施形態と多くの開示される要素および／または好ましい要素とを組み合わせた実施形態を支持し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願において記述されるすべての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、本出願の説明によって開示されるとみなされるべきである。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ： （ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）"，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
本発明の実施は、特に指示されない限り、当分野の文献（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９参照）中で説明される化学、生化学、細胞生物学、免疫学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
本明細書および以下の特許請求の範囲全体を通して、文脈上特に要求されない限り、「含む」という語および「含むこと」などの変形は、記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、いかなる他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の排除も意味しないと理解され、しかし一部の実施形態においては、そのような他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群が排除され得る、すなわち主題が記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含に存する。本発明の説明に関連して（特に特許請求の範囲に関連して）使用される「１つの」および「その」という用語および同様の言及は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個別に言及することの簡略化した方法であることが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個別の値は本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書で述べるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図し、本発明あるいは特許請求されるものの範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、特許請求されない要素が本発明の実施に必須であることを指示すると解釈されるべきではない。
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される資料（すべての特許、特許出願、学術出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）の各々は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明のためにそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
「ＣＬＤＮ１８」という用語はクローディン１８に関し、クローディン１８スプライス変異体１（クローディン１８．１（ＣＬＤＮ１８．１））およびクローディン１８スプライス変異体２（クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２））を含む任意の変異体を包含する。
「ＣＬＤＮ１８．２」という用語は、好ましくはヒトＣＬＤＮ１８．２に関し、特に配列表の配列番号：１に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む、好ましくはそれから成るタンパク質に関する。
「ＣＬＤＮ１８．１」という用語は、好ましくはヒトＣＬＤＮ１８．１に関し、特に配列表の配列番号：２に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む、好ましくはそれから成るタンパク質に関する。
本発明による「変異体」という用語は、特に、突然変異体、スプライス変異体、立体配座変異体、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものを指す。対立遺伝子変異体は、遺伝子の正常な配列中の変化に関するが、その重要性はしばしば不明である。完全な遺伝子配列決定は、しばしば所与の遺伝子について数多くの対立遺伝子変異体を同定する。種ホモログは、所与の核酸配列またはアミノ酸配列のものとは異なる種を起源とする核酸配列またはアミノ酸配列である。「変異体」という用語は、任意の翻訳後修飾変異体および立体配座変異体を包含する。
本発明によれば、「ＣＬＤＮ１８．２陽性癌」という用語は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞、好ましくは前記癌細胞の表面にＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞を含む癌を意味する。
「細胞表面」は、当分野におけるその通常の意味に従って使用され、したがってタンパク質および他の分子による結合にアクセス可能である細胞の外側を含む。例えば、１またはそれ以上の細胞外部分を有する膜貫通タンパク質は、細胞表面に発現されているとみなされる。
ＣＬＤＮ１８．２は、これが細胞の表面に位置し、前記細胞に添加されたＣＬＤＮ１８．２特異的抗体による結合にアクセス可能である場合、前記細胞の表面に発現されている。
本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２は、発現のレベルが胃細胞または胃組織における発現と比較してより低い場合、細胞において実質的に発現されていない。好ましくは、発現のレベルは、胃細胞または胃組織における発現の１０％未満、好ましくは５％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％もしくは０．０５％未満であるかまたはさらに一層低い。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２は、発現のレベルが胃以外の非癌組織における発現のレベルを２倍しか、好ましくは１．５倍しか上回らない場合、および好ましくは前記非癌組織における発現のレベルを上回らない場合、細胞において実質的に発現されていない。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２は、発現のレベルが検出限界より低い場合および／または発現のレベルが細胞に添加されたＣＬＤＮ１８．２特異的抗体による結合を許容しないほど低い場合、細胞において実質的に発現されていない。
本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２は、発現のレベルが胃以外の非癌組織における発現のレベルを２倍以上、好ましくは１０倍、１００倍、１０００倍または１００００倍上回る場合、細胞において発現されている。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２は、発現のレベルが検出限界より高い場合および／または発現のレベルが細胞に添加されたＣＬＤＮ１８．２特異的抗体による結合を許容するのに十分なほど高い場合、細胞において発現されている。好ましくは、細胞において発現されるＣＬＤＮ１８．２は、前記細胞の表面に発現されるまたは露出される。
本発明によれば、「疾患」という用語は、癌、特に本明細書で述べる癌の形態を含む、任意の病的状態を指す。癌または癌の特定の形態への本明細書での言及は、その癌転移も包含する。好ましい実施形態では、本出願に従って治療されるべき疾患は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を含む。
「ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞に関連する疾患」または同様の表現は、本発明によればＣＬＤＮ１８．２が疾患組織または器官の細胞において発現されることを意味する。１つの実施形態では、疾患組織または器官の細胞におけるＣＬＤＮ１８．２の発現は、健常組織または器官における状態と比較して増大している。増大とは、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％またはさらにそれ以上の増大を指す。１つの実施形態では、発現は疾患組織においてのみ認められ、対応する健常組織における発現は抑制されている。例えば、ＣＬＤＮ１８．２は膵癌組織において発現されるが、非癌性膵組織では発現は検出不能である。本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞に関連する疾患には癌疾患が含まれる。さらに、本発明によれば、癌疾患は、好ましくは癌細胞がＣＬＤＮ１８．２を発現するものである。
本明細書で使用される場合、「癌疾患」または「癌」は、異常調節された細胞成長、増殖、分化、接着および／または移動を特徴とする疾患を包含する。「癌細胞」とは、急速で制御不能の細胞増殖によって成長し、新たな成長を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける異常細胞を意味する。好ましくは、「癌疾患」はＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を特徴とし、癌細胞はＣＬＤＮ１８．２を発現する。ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞は、好ましくは癌細胞、好ましくは本明細書で述べる癌の癌細胞である。
本発明によれば、「癌腫」は、上皮細胞に由来する悪性腫瘍である。
「腺癌」は、腺組織から発生する癌である。この組織は、上皮組織として知られるより大きな組織カテゴリーの一部でもある。上皮組織には、皮膚、腺ならびに身体の腔および器官を裏打ちする様々な他の組織が含まれる。上皮は発生学的に外胚葉、内胚葉および中胚葉に由来する。腺癌として分類されるために、細胞は、分泌特性を有する限り、必ずしも腺の一部である必要はない。この形態の癌腫は、ヒトを含む一部の高等哺乳動物において発生し得る。高分化型腺癌は、それらが由来する腺組織に類似する傾向があるが、低分化型はその傾向がない場合もある。生検からの細胞を染色することにより、病理学者は腫瘍が腺癌であるかまたは何らかの他の種類の癌であるかを決定する。腺癌は、体内での腺の遍在性のために身体の多くの組織で発生し得る。各々の腺が同じ物質を分泌しているとは限らないが、細胞への外分泌機能が存在する限り、腺とみなされ、それゆえその悪性形態は腺癌と命名される。悪性腺癌は他の組織に浸潤し、転移するのに十分な時間があればしばしば転移する。
内胚葉起源の器官である膵臓は、タンパク質および炭水化物消化ならびにグルコースホメオスタシスの極めて重要な調節因子である。膵外分泌部（器官の組織量の８０％）は、消化酵素を産生して胃腸管に送達する腺房細胞および膵管細胞の分岐ネットワークから成る。膵管ネットワークに沿って機能単位に構造化されている腺房細胞は、胃および十二指腸からの合図に応答して酵素を合成し、膵管内腔に分泌する。膵管近傍の腺房単位内には房心細胞が存在する。血流中へのホルモンの分泌を介して代謝およびグルコースホメオスタシスを調節する、膵内分泌部は、ランゲルハンス島と呼ばれるクラスターへと集合する４つの特殊な内分泌細胞型から成る。
膵癌は、膵臓を形成する組織中に生じる形質転換細胞に由来する悪性新生物である。膵癌は、米国では癌関連死亡原因の第４位であり、世界中では第８位である。初期膵癌はしばしば症状を引き起こさず、後期症状は通常非特異的で多様である。そのため、膵癌はしばしば進行するまで診断されない。膵癌は予後不良である：すべての病期を合わせると、１年および５年の相対生存率はそれぞれ２５％および６％である。局所疾患に関しては、５年生存率は約２０％であるが、合計で個体の８０％以上に相当する、局所進行疾患および転移性疾患に関する平均生存期間はそれぞれ約１０ヶ月および６ヶ月である。
膵癌には、膵臓の外分泌成分内に生じる腺癌（腺構造を示す腫瘍）および島細胞から生じる神経内分泌癌が含まれる。
最も一般的な形態の膵癌である膵管腺癌は、典型的には顕微鏡検査での中分化型から低分化型腺構造を特徴とする。膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は一般に膵臓の頭部に発生し、リンパ管、脾臓および腹腔を含む周辺組織への浸潤ならびに肝臓および肺への転移を伴う。ＰＤＡＣは、主として、管様構造を有する腺パターンならびに様々な度合いの細胞異型性および分化を示す。ＰＤＡＣのより一般的でないサブタイプには、膠様、腺扁平上皮または肉腫様組織構造が含まれる。しばしば個々の腫瘍内に、組織構造、腫瘍悪性度および分化の程度に局所的な差異が存在する。最も小さな原発病変でさえも、一般に神経周囲およびリンパ血管浸潤を示し、早期遠隔転移の傾向を示唆する。
２番目に多いタイプの外分泌膵癌は粘液性である。粘液性腺癌は、画像検査で嚢胞性外観を生じさせる多量のムチンを産生する。
膵神経内分泌腫瘍は、膵臓のホルモン産生細胞（島細胞）中で形成する。腺房細胞新生物は、膵臓の腺房細胞から生じる。
本発明によれば、「癌」という用語は、原発膵癌などの原発性腫瘍の癌転移も包含する。したがって、例えば膵癌に言及する場合、これは膵癌の転移、例えば肺、肝臓および／またはリンパ節への転移も包含する。
「転移」とは、そのもとの部位から身体の別の部分への癌細胞の拡大を意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔および脈管に侵入するための内皮基底膜の貫入、ならびに次に、血液によって運ばれた後、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位での新たな腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍転移はしばしば原発性腫瘍の除去後でも起こり、これは、腫瘍細胞または成分が残存し、転移能を発現し得るからである。１つの実施形態では、本発明による「転移」という用語は、原発性腫瘍および所属リンパ節系から遠く離れた転移に関連する「遠隔転移」に関する。１つの実施形態では、本発明による「転移」という用語はリンパ節転移に関する。本発明の治療法を用いて治療可能な転移の１つの特定の形態は、原発部位として膵癌から生じる転移である。好ましい実施形態では、そのような膵癌転移はリンパ節への転移、肺への転移および／または肝臓への転移である。
クルーケンベルク腫瘍は、すべての卵巣腫瘍の１％〜２％を占める卵巣のまれな転移性腫瘍である。クルーケンベルク腫瘍は卵巣の転移性印環細胞腺癌である。胃は大部分のクルーケンベルク腫瘍症例（７０％）における原発部位である。結腸、虫垂および***（主として浸潤性小葉癌）の癌がその次に最も多い原発部位である。胆嚢、胆管、膵臓、小腸、ファーター膨大部、子宮頸および膀胱／尿膜管の癌に由来するクルーケンベルク腫瘍のまれな症例が報告されている。
難治性癌は、最初から治療に不応性であるかまたは経時的に不応性となる、特定の治療が無効である悪性疾患である。
「治療する」とは、被験体において腫瘍の大きさもしくは腫瘍の数を低減することを含む、疾患を予防するもしくは排除する；被験体において疾患を停止させるもしくは疾患の進行を遅らせる；被験体において新たな疾患の発症を阻止するもしくは遅らせる；現在疾患を有しているもしくは以前に疾患を有していたことがある被験体において症状および／もしくは再発の頻度もしくは重症度を低下させる；ならびに／または被験体の生存期間を延長する、すなわち増大させるために、化合物または組成物または化合物もしくは組成物の組合せを被験体に投与することを意味する。
特に、「疾患の治療」という用語は、疾患またはその症状を治癒する、期間を短縮する、改善する、予防する、進行もしくは悪化を減速させるもしくは阻止する、または発症を予防するもしくは遅延させることを包含する。
「患者」という用語は、本発明によれば、ヒト、非ヒト霊長動物または別の動物、特に哺乳動物、例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯動物、例えばマウスおよびラットを含む、治療のための被験体、特に疾患被験体を意味する。特に好ましい実施形態では、患者はヒトである。
「ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質」という用語は、作用物質または作用物質の組合せを細胞に提供することが、細胞に前記作用物質または作用物質の組合せが提供されない状況と比較して、前記細胞におけるＣＬＤＮ１８．２のＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルの増大、好ましくは細胞表面上のＣＬＤＮ１８．２タンパク質レベルの増大を生じさせる作用物質または作用物質の組合せを指す。好ましくは、細胞は癌細胞、特にＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞であり、したがってＣＬＤＮ１８．２結合抗体の標的、例えば本明細書で述べる癌型の細胞、特に膵癌の細胞である。「ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質」という用語は、特に、作用物質または作用物質の組合せを細胞に提供することが、細胞に前記作用物質または作用物質の組合せが提供されない状況と比較して、前記細胞の表面により高い密度のＣＬＤＮ１８．２を生じさせる作用物質または作用物質の組合せを指す。「ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化すること」は、特に、作用物質または作用物質の組合せがＣＬＤＮ１８．２の発現の低下を防ぐかまたは低下を低減する、例えば作用物質または作用物質の組合せが提供されない場合はＣＬＤＮ１８．２の発現が低下すると考えられ、前記作用物質または作用物質の組合せの提供がＣＬＤＮ１８．２発現の前記低下を防ぐかまたは前記低下を低減する状況を含む。「ＣＬＤＮ１８．２の発現を増大させること」は、特に、作用物質または作用物質の組合せがＣＬＤＮ１８．２の発現を増大させる、例えば作用物質または作用物質の組合せが提供されない場合はＣＬＤＮ１８．２の発現が低下するか、基本的に一定なままであるかまたは増大すると考えられ、前記作用物質または作用物質の組合せの提供が、作用物質または作用物質の組合せが提供されない状況と比較してＣＬＤＮ１８．２発現を増大させ、そのため生じる発現が、作用物質または作用物質の組合せが提供されない場合にＣＬＤＮ１８．２の発現が低下するか、基本的に一定なままであるかまたは増大させるであろう状況と比較してより高い状況を含む。
本発明によれば、「ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質」という用語は、化学療法剤または化学療法剤の組合せ、例えば細胞増殖抑制剤を含む。化学療法剤は、以下の方法：（１）細胞のＤＮＡを損傷し、そのため細胞はもはや複製することができない、（２）細胞複製が不可能であるように新たなＤＮＡ鎖の合成を阻害する、（３）細胞が２個の細胞に***することができないように細胞の有糸***過程を停止させる、の１つで細胞に影響を及ぼし得る。
本発明によれば、「ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質」という用語は、好ましくは、作用物質または作用物質の組合せ、例えば細胞増殖抑制性化合物または細胞増殖抑制性化合物の組合せを細胞、特に癌細胞に提供することが、細胞が細胞周期の１またはそれ以上の期で、好ましくはＧ１期およびＧ０期以外、好ましくはＧ１期以外の細胞周期の１またはそれ以上の期で、好ましくは細胞周期のＧ２期またはＳ期、例えば細胞周期のＧ１／Ｇ２期、Ｓ／Ｇ２期、Ｇ２期またはＳ期の１またはそれ以上で停止するまたは蓄積することを生じさせる、作用物質または作用物質の組合せに関する。「細胞が細胞周期の１またはそれ以上の期で停止するまたは蓄積すること」という用語は、細胞周期の前記１またはそれ以上の期にある細胞のパーセンテージが増大することを意味する。各々の細胞は、自らを複製するために４つの期を含む周期を通過する。Ｇ１と呼ばれる最初の期は、細胞がその染色体を複製する準備をする段階である。２番目の段階はＳと呼ばれ、この期にＤＮＡ合成が起こり、ＤＮＡが複製される。次の期はＧ２期であり、ここでＲＮＡおよびタンパク質が複製する。最終段階はＭ期であり、これが実際の細胞***の段階である。この最終段階では、複製したＤＮＡおよびＲＮＡが分離し、細胞の別々の末端へと移動して、細胞が実際に２個の同一の機能性細胞に***する。ＤＮＡ損傷剤である化学療法剤は、通常Ｇ１および／またはＧ２期の細胞の蓄積を生じさせる。代謝拮抗物質などのＤＮＡ合成を妨げることによって細胞増殖をブロックする化学療法剤は、通常Ｓ期の細胞の蓄積を生じさせる。これらの薬剤の例は、ゲムシタビン、６−メルカプトプリンおよび５−フルオロウラシルである。
本発明によれば、「ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質」という用語は、ヌクレオシド類似体、例えばゲムシタビン、５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグ、白金化合物、例えばオキサリプラチンおよびシスプラチン、タキサン類、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル、ならびにカンプトテシン類似体、例えばイリノテカンおよびトポテカン、ならびに薬剤の組合せ、例えばゲムシタビン、オキサリプラチンおよび５−フルオロウラシルの１またはそれ以上を含む薬剤の組合せ、例えばゲムシタビンとオキサリプラチン、ゲムシタビンと５−フルオロウラシル、オキサリプラチンと５−フルオロウラシルを含む薬剤の組合せ、または本明細書で述べる他の薬剤の組合せを包含する。本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質への言及、例えばヌクレオシド類似体、白金化合物、カンプトテシン類似体またはタキサンへの言及、例えばゲムシタビン、５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカンまたはパクリタキセルへの言及は、前記作用物質のエステル、塩などの任意のプロドラッグまたは前記作用物質のコンジュゲートなどの誘導体を包含するものとする。例は、前記作用物質と担体物質のコンジュゲート、例えばアルブミン結合パクリタキセルなどのタンパク質結合パクリタキセルである。好ましくは、前記作用物質の塩は医薬的に許容される。
１つの好ましい実施形態では、「ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質」は、「免疫原性細胞死を誘導する作用物質」であるかまたはこれを含有する。
特定の状況では、癌細胞は、腫瘍特異的免疫応答を活性化するために免疫系によって解読される時空的に規定されたシグナルの組合せの放出に結び付く致死的ストレス経路に入り得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ １４０：７９８−８０４）。そのような状況では、癌細胞は、樹状細胞などの先天性免疫エフェクターによって感知されて、腫瘍細胞死が有効な抗癌免疫応答を誘発し得るようにＣＤ８＋Ｔ細胞およびＩＦＮ−γシグナル伝達を含むコグネイト免疫応答を引き起こすシグナルの放出を始動させる。これらのシグナルには、細胞表面における小胞体（ＥＲ）シャペロンであるカルレティキュリン（ＣＲＴ）のアポトーシス前露出、ＡＴＰのアポトーシス前分泌、および核タンパク質ＨＭＧＢ１のアポトーシス後放出が含まれる。合わせて考慮すると、これらの工程は免疫原性細胞死（ＩＣＤ）の分子決定基を構成する。アントラサイクリン、オキサリプラチンおよびγ線照射はＩＣＤを規定するすべてのシグナルを誘導することができるが、例えばシスプラチンは、ＥＲストレスを必要とする工程である、ＥＲから死細胞の表面へのＣＲＴ転位を誘導する能力を欠き、ＥＲストレス誘導物質であるタプシガルギンによる補完を必要とする。
本発明によれば、「免疫原性細胞死を誘導する作用物質」という用語は、細胞、特に癌細胞に提供された場合、細胞が、最終的に腫瘍特異的免疫応答を生じさせる致死的ストレス経路に入るのを誘導することができる作用物質または作用物質の組合せを指す。特に、細胞に提供された場合免疫原性細胞死を誘導する作用物質は、細胞が、特に細胞表面における小胞体（ＥＲ）シャペロンであるカルレティキュリン（ＣＲＴ）のアポトーシス前暴露、ＡＴＰのアポトーシス前分泌、および核タンパク質ＨＭＧＢ１のアポトーシス後放出を含む、時空的に規定されたシグナルの組合せを放出することを誘導する。
本発明によれば、「免疫原性細胞死を誘導する作用物質」という用語は、アントラサイクリンおよびオキサリプラチンを包含する。
「ヌクレオシド類似体」という用語は、プリン類似体およびピリミジン類似体の両方を包含するカテゴリーである、ヌクレオシドの構造類似体を指す。
「ゲムシタビン」という用語は、以下の式：
のヌクレオシド類似体である化合物である。
特に、この用語は、化合物４−アミノ−１−（２−デオキシ−２，２−ジフルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オンまたは４−アミノ−１−［（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−１，２−ジヒドロピリミジン−２−オンを指す。
本発明によれば、ゲムシタビンは、好ましくは静脈内経路によって投与される。好ましくは、ゲムシタビンは、０．５〜２ｇ／ｍ２、好ましくは０．８〜１．５ｇ／ｍ２、より好ましくは１〜１．２ｇ／ｍ２体表面積の用量範囲で投与される。例えば、ゲムシタビンは、８週間のうち７週間、週１回１０００ｍｇ／ｍ２の用量で投与され、次に４週間のうち３週間、週１回投与され得る。
「ヌクレオシド類似体」という用語は、フルオロウラシルおよびそのプロドラッグなどのフルオロピリミジン誘導体を包含する。「フルオロウラシル」または「５−フルオロウラシル」（５−ＦＵまたはｆ５Ｕ）（Ａｄｒｕｃｉｌ、Ｃａｒａｃ、Ｅｆｕｄｉｘ、ＥｆｕｄｅｘおよびＦｌｕｏｒｏｐｌｅｘの商標名で市販されている）という用語は、以下の式：
のピリミジン類似体である化合物である。
特に、この用語は、化合物５−フルオロ−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンを指す。
「カペシタビン」（Ｘｅｌｏｄａ、Ｒｏｃｈｅ）という用語は、組織中で５−ＦＵに変換されるプロドラッグである化学療法剤を指す。経口的に投与し得るカペシタビンは、以下の式：
を有する。
特に、この用語は、化合物ペンチル［１−（３，４−ジヒドロキシ−５−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）−５−フルオロ−２−オキソ−１Ｈ−ピリミジン−４−イル］カルバメートを指す。
本発明によれば、「白金化合物」という用語は、白金錯体などのその構造中に白金を含有する化合物を指し、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンなどの化合物を包含する。
「シスプラチン」または「シスプラチナム」という用語は、以下の式：
の化合物シス−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）を指す。
「カルボプラチン」という用語は、以下の式：
の化合物シス−ジアンミン（１，１−シクロブタンジカルボキシラト）白金（ＩＩ）を指す。
「オキサリプラチン」という用語は、以下の式：
のジアミノシクロヘキサン担体配位子に錯化した白金化合物である化合物を指す。
特に、「オキサリプラチン」という用語は、化合物［（１Ｒ，２Ｒ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン］（エタンジオアト−Ｏ，Ｏ'）白金（ＩＩ）を指す。注射用のオキサリプラチンも、Ｅｌｏｘａｔｉｎｅの商品名で市販されている。
タキサン類は、最初にイチイ属の植物などの天然源から誘導されたジテルペン化合物のクラスであるが、一部は人工的に合成されている。タキサンクラスの薬剤の主たる作用機構は微小管機能の破壊であり、それにより細胞***の過程を阻害する。タキサン類にはドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）およびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）が含まれる。
本発明によれば、「ドセタキセル」という用語は、以下の式：
を有する化合物を指す。
特に、「ドセタキセル」という用語は、化合物１，７β，１０β−トリヒドロキシ−９−オキソ−５β，２０−エポキシタキス−１１−エン−２α，４，１３α−トリチル４−アセテート２−ベンゾエート１３−｛（２Ｒ，３Ｓ）−３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−アミノ］−２−ヒドロキシ−３−フェニルプロパノエート｝を指す。
本発明によれば、「パクリタキセル」という用語は、以下の式：
を有する化合物を指す。
特に、「パクリタキセル」という用語は、化合物（２α，４α，５β，７β，１０β，１３α）−４，１０−ビス−（アセチルオキシ）−１３−｛［（２Ｒ，３Ｓ）−３−（ベンゾイルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−フェニルプロパノイル］オキシ｝−１，７−ジヒドロキシ−９−オキソ−５，２０−エポキシタキス−１１−エン−２−イルベンゾエートを指す。
本発明によれば、「カンプトテシン類似体」という用語は、化合物カンプトテシン（ＣＰＴ；（Ｓ）−４−エチル−４−ヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３'，４'：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４−（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン）の誘導体を指す。好ましくは、「カンプトテシン類似体」という用語は、以下の構造：
を含む化合物を指す。
本発明によれば、好ましいカンプトテシン類似体は、ＤＮＡ酵素トポイソメラーゼＩ（トポＩ）の阻害剤である。本発明による好ましいカンプトテシン類似体は、イリノテカンおよびトポテカンである。
イリノテカンは、トポイソメラーゼＩの阻害によってＤＮＡの巻戻しを防ぐ薬剤である。化学用語では、これは、以下の式：
を有する天然アルカロイドカンプトテシンの半合成類似体である。
特に、「イリノテカン」という用語は、化合物（Ｓ）−４，１１−ジエチル−３，４，１２，１４−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−３，１４−ジオキソ１Ｈ−ピラノ［３'，４'：６，７］−インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−９−イル−［１，４'−ビピペリジン］−１'−カルボキシレートを指す。
トポテカンは、式：
のトポイソメラーゼ阻害剤である。
特に、「トポテカン」という用語は、化合物（Ｓ）−１０−［（ジメチルアミノ）メチル］−４−エチル−４，９−ジヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３'，４'：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン一塩酸塩を指す。
アントラサイクリンは、抗生物質でもある、癌化学療法において一般的に使用される薬剤のクラスである。構造的に、すべてのアントラサイクリンは共通の４環性７，８，９，１０−テトラヒドロテトラセン−５，１２−キノン構造を共有し、通常は特定部位でのグリコシル化を必要とする。
アントラサイクリンは、好ましくは以下の作用機構の１またはそれ以上を生じさせる：１．ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の塩基対の間にインターカレートすることによってＤＮＡおよびＲＮＡ合成を阻害し、したがって急速に増殖する癌細胞の複製を妨げる。２．トポイソメラーゼＩＩ酵素を阻害し、超コイルＤＮＡの弛緩を妨げ、したがってＤＮＡの転写および複製をブロックする。３．ＤＮＡおよび細胞膜を損傷する鉄媒介性遊離酸素ラジカルを生成する。
本発明によれば、「アントラサイクリン」という用語は、好ましくはトポイソメラーゼＩＩのＤＮＡの再結合を阻害することによって、好ましくはアポトーシスを誘導するための作用物質、好ましくは抗癌剤に関する。
好ましくは、本発明によれば、「アントラサイクリン」という用語は、一般に、以下の環構造：
を有し、その類似体および誘導体、医薬的塩、水和物、エステル、コンジュゲートならびにプロドラッグを含む化合物のクラスを指す。
アントラサイクリンおよびアントラサイクリン類似体の例には、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、ロドマイシン、ピラルビシン、バルルビシン、Ｎ−トリフルオロ−アセチルドキソルビシン−１４−バレレート、アクラシノマイシン、モルホリノドキソルビシン（モルホリノ−ＤＯＸ）、シアノモルホリノ−ドキソルビシン（シアノモルホリノ−ＤＯＸ）、２−ピロリノ−ドキソルビシン（２−ＰＤＯＸ）、５−イミノダウノマイシン、ミトキサントロンおよびアクラシノマイシンＡ（アクラルビシン）が含まれるが、これらに限定されない。ミトキサントロンはアントラセンジオンクラスの化合物の成員であり、前記クラスの化合物は、アントラサイクリンの糖部分を欠くが、ＤＮＡへのインターカレーションを許容する平面多環式芳香族環構造を保持するアントラサイクリン類似体である。
本発明によるアントラサイクリンとして特に好ましいのは、以下の式：
［式中、
Ｒ１は、ＨおよびＯＨから成る群より選択され、Ｒ２は、ＨおよびＯＭｅから成る群より選択され、Ｒ３は、ＨおよびＯＨから成る群より選択され、ならびにＲ４は、ＨおよびＯＨから成る群より選択される］
の化合物である。
１つの実施形態では、Ｒ１はＨであり、Ｒ２はＯＭｅであり、Ｒ３はＨであり、およびＲ４はＯＨである。別の実施形態では、Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＯＭｅであり、Ｒ３はＨであり、およびＲ４はＯＨである。別の実施形態では、Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＯＭｅであり、Ｒ３はＯＨであり、およびＲ４はＨである。別の実施形態では、Ｒ１はＨであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＨであり、およびＲ４はＯＨである。
本発明に関連してアントラサイクリンとして特に企図されるのはエピルビシンである。エピルビシンは、以下の式：
を有するアントラサイクリン薬剤であり、米国ではＥｌｌｅｎｃｅの商品名で、および他のところではＰｈａｒｍｏｒｕｂｉｃｉｎまたはＥｐｉｒｕｂｉｃｉｎ Ｅｂｅｗｅの商品名で市販されている。特に、「エピルビシン」という用語は、化合物（８Ｒ，１０Ｓ）−１０−［（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−４−アミノ−５−ヒドロキシ−６−メチル−オキサン−２−イル］オキシ−６，１１−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−８−メチル−９，１０−ジヒドロ−７Ｈ−テトラセン−５，１２−ジオンを指す。エピルビシンは、副作用を引き起こすことがより少ないと考えられるので、一部の化学療法レジメンでは、最も一般的なアントラサイクリンであるドキソルビシンよりも好ましい。
本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質は、化学療法剤、特に癌治療において確立された化学療法剤であってよく、薬剤の組合せ、例えば癌治療における使用に関して確立された薬剤の組合せの一部であってよい。そのような薬剤の組合せは、化学療法において使用される薬剤の組合せであってよく、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ化学療法レジメンにおいて使用される薬剤の組合せであってよい。
ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ化学療法において使用される薬剤の組合せは、ロイコボリン、フルオロウラシル、イリノテカン（イリノテカン塩酸塩など）およびオキサリプラチンを含む。オキサリプラチンは、８５ｍｇ／ｍ２体表面積で投与され得；イリノテカンは１８０ｍｇ／ｍ２；ロイコボリンは４００ｍｇ／ｍ２で；およびフルオロウラシルはボーラスとして４００ｍｇ／ｍ２で投与され、次いで５−フルオロウラシルが好ましくは４６時間の持続注入として、好ましくは２週間ごとに２４００ｍｇ／ｍ２で投与され得る。
「フォリン酸」または「ロイコボリン」という用語は、化学療法剤５−フルオロウラシルとの相乗作用的組合せにおいて有用な化合物を指す。したがって、本明細書で５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグの投与に言及する場合、１つの実施形態では前記投与はフォリン酸と併用した投与を含み得る。フォリン酸は、以下の式：
を有する。
特に、この用語は、化合物（２Ｓ）−２−｛［４−［（２−アミノ−５−ホルミル−４−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロ−１Ｈ−プテリジン−６−イル）メチルアミノ］ベンゾイル］アミノ｝ペンタン二酸を指す。
γδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、その表面に独特のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小さなサブセットである。Ｔ細胞の大部分は、α−ＴＣＲ鎖およびβ−ＴＣＲ鎖と呼ばれる２本の糖タンパク鎖から成るＴＣＲを有する。これに対し、γδＴ細胞では、ＴＣＲは１本のγ鎖と１本のδ鎖で構成される。この群のＴ細胞は、通常、αβＴ細胞よりもはるかにまれである。ヒトγδＴ細胞は、感染症および自己免疫のようなストレス監視応答において重要な役割を果たす。腫瘍における形質転換誘導性変化も、γδＴ細胞によって媒介されるストレス監視応答を生じさせ、抗腫瘍免疫を増強することが示唆されている。重要な点として、抗原係合後、病変部位の活性化されたγδＴ細胞は、サイトカイン（例えばＩＮＦγ、ＴＮＦα）および／または他のエフェクター細胞の動員を媒介するケモカインを提供し、細胞傷害（細胞死受容体および細胞溶解性顆粒経路を介して）およびＡＤＣＣなどの即時エフェクター機能を示す。
末梢血中のγδＴ細胞の大部分はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞受容体（ＴＣＲγδ）を発現する。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞はヒトおよび霊長動物に特有であり、これらは多くの急性感染において劇的に増大し、例えば結核症、サルモネラ症、エールリヒア症、ブルセラ症、野兎病、リステリア症、トキソプラスマ症およびマラリアでは、数日以内に他のすべてのリンパ球を上回り得るので、侵入病原体による「危険」を感知する際に早期で必須の役割を果たすと推測される。
γδＴ細胞は、小さな非ペプチドリン酸化抗原（ホスホ抗原）、例えば細菌において合成されるピロリン酸塩およびメバロン酸経路を介して哺乳動物細胞において産生されるイソペンテニルピロリン酸塩（ＩＰＰ）に応答する。正常細胞中のＩＰＰ産生はγδＴ細胞の活性化には十分でないが、腫瘍細胞におけるメバロン酸経路の調節不全はＩＰＰの蓄積およびγδＴ細胞の活性化をもたらす。ＩＰＰはまた、メバロン酸経路の酵素であるファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）を阻害する、アミノビスホスホネートによって治療的に増大させることもできる。数ある中でも、ゾレドロン酸（ＺＡ、ゾレドロネート、Ｚｏｍｅｔａ（商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）はそのようなアミノビスホスホネートの代表であり、既に骨粗しょう症および転移性骨疾患の治療のために臨床的に患者に投与されている。インビトロでのＰＢＭＣの処置後、ＺＡは特に単球によって取り込まれる。ＩＰＰは単球中に蓄積し、γδＴ細胞の発現を刺激する抗原提示細胞へと分化する。この状況では、活性化γδＴ細胞のための増殖および生存因子としてインターロイキン２（ＩＬ−２）の添加が好ましい。最後に、特定のアルキル化アミンはインビトロでＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を活性化すると記述されているが、わずかにミリモル濃度である。
本発明によれば、「γδＴ細胞を刺激する作用物質」という用語は、インビトロおよび／またはインビボで、特にγδＴ細胞の活性化と増殖を誘導することによって、γδＴ細胞、特にＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の発現を刺激する化合物に関する。好ましくは、この用語は、哺乳動物細胞において産生されるイソペンテニルピロリン酸塩（ＩＰＰ）を、好ましくはメバロン酸経路の酵素、ファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）を阻害することによって、インビトロおよび／またはインビボで増大させる化合物に関する。
γδＴ細胞を刺激する１つの特定の群の化合物は、ビスホスホネート、特に窒素含有ビスホスホネート（Ｎ−ビスホスホネート；アミノビスホスホネート）である。
例えば、本発明における使用のための適切なビスホスホネートは、その類似体および誘導体、医薬的塩、水和物、エステル、コンジュゲートならびにプロドラッグを含む、以下の化合物の１またはそれ以上を包含し得る：
［１−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）エタン−１，１−ジイル］ビス（ホスホン酸）、ゾレドロン酸、例えばゾレドロネート；
（ジクロロ−ホスホノ−メチル）ホスホン酸、例えばクロドロネート；
｛１−ヒドロキシ−３−［メチル（ペンチル）アミノ］プロパン−１，１−ジイル｝ビス（ホスホン酸）、イバンドロン酸、例えばイバンドロネート；
（３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ジイル）ビス（ホスホン酸）、パミドロン酸、例えばパミドロネート；
（１−ヒドロキシ−１−ホスホノ−２−ピリジン−３−イル−エチル）ホスホン酸、リセドロン酸、例えばリセドロネート；
（１−ヒドロキシ−２−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル−１−ホスホノエチル）ホスホン酸、ミノドロン酸；
［３−（ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ジイル］ビス（ホスホン酸）、オルパドロン酸；
［４−アミノ−１−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシ−オキシド−ホスホリル）−ブチル］ホスホン酸、アレンドロン酸、例えばアレンドロネート；
［（シクロヘプチルアミノ）メチレン］ビス（ホスホン酸）、インカドロン酸；
（１−ヒドロキシエタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホン酸）、エチドロン酸、例えばエチドロネート；および
｛［（４−クロロフェニル）チオ］メチレン｝ビス（ホスホン酸）、チルドロン酸。
本発明によれば、ゾレドロン酸（ＩＮＮ）またはゾレドロネート（Ｚｏｍｅｔａ、Ｚｏｍｅｒａ、ＡｃｌａｓｔａおよびＲｅｃｌａｓｔの商品名でＮｏｖａｒｔｉｓによって市販されている）は特に好ましいビスホスホネートである。Ｚｏｍｅｔａは、多発性骨髄腫および前立腺癌などの癌を有する患者において骨折を予防するため、ならびに骨粗しょう症を治療するために使用される。また、悪性の高カルシウム血症を治療するためにも使用でき、骨転移からの疼痛を治療するのにも役立ち得る。
１つの特に好ましい実施形態では、本発明によるγδＴ細胞を刺激する作用物質はＩＬ−２と併用して投与される。そのような組合せは、γ９δ２Ｔ細胞の増殖および活性化を媒介するのに特に有効であることが示されている。
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、免疫系におけるサイトカインシグナル伝達分子の一種であるインターロイキンである。リンパ球を誘引するタンパク質であり、微生物感染に対する、および異物（非自己）と自己を識別するうえでの身体の天然応答の一部である。ＩＬ−２は、リンパ球によって発現されるＩＬ−２受容体に結合することによってその作用を媒介する。
本発明に従って使用されるＩＬ−２は、γδＴ細胞の刺激を支持するまたは可能にする任意のＩＬ−２であってよく、任意の種、好ましくはヒトに由来し得る。Ｉｌ−２は、単離され得るか、組換え生産され得るかまたは合成ＩＬ−２であってよく、天然に存在するＩＬ−２または修飾ＩＬ−２であってよい。
「抗原」という用語は、免疫応答が向けられるおよび／または向けられるべきであるエピトープを含有するタンパク質またはペプチドなどの作用物質に関する。好ましい実施形態では、抗原は、ＣＬＤＮ１８．２などの腫瘍関連抗原、すなわち細胞質、細胞表面および細胞核に由来し得る癌細胞の成分、特に細胞内でまたは癌細胞上の表面抗原として、好ましくは大量に、産生される抗原である。
本発明に関連して、「腫瘍関連抗原」という用語は、好ましくは、正常条件下では限られた数の組織および／もしくは器官においてまたは特定の発生段階で特異的に発現され、１またはそれ以上の腫瘍または癌組織中で発現されるまたは異常発現されるタンパク質に関する。本発明に関連して、腫瘍関連抗原は、好ましくは癌細胞の細胞表面に関連し、好ましくは正常組織中では全く発現されないかまたはまれにしか発現されない。
「エピトープ」という用語は、分子中の抗原決定基、すなわち免疫系によって認識される、例えば抗体によって認識される分子中の部分を指す。例えば、エピトープは、免疫系によって認識される、抗原上の別々の三次元部位である。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基群から成り、通常は特定の三次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。立体配座エピトープと非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合は失われるが後者への結合は失われないことによって区別される。ＣＬＤＮ１８．２などのタンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続部分または不連続部分を含み、好ましくは５〜１００、好ましくは５〜５０、より好ましくは８〜３０、最も好ましくは１０〜２５アミノ酸長であり、例えばエピトープは、好ましくは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸長であり得る。
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指し、その抗原結合部分を含む任意の分子を包含する。「抗体」という用語は、限定されることなく、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、例えばｓｃＦｖ、ならびにＦａｂおよびＦａｂ'フラグメントなどの抗原結合抗体フラグメントを含む、モノクローナル抗体および抗体のフラグメントまたは誘導体を包含し、またすべての組換え形態の抗体、例えば原核生物において発現される抗体、非グリコシル化抗体、ならびに本明細書で述べる任意の抗原結合抗体フラグメントおよび誘導体も包含する。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域を含む。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域が間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各々のＶＨとＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲから成る：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
本明細書で述べる抗体はヒト抗体であり得る。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を包含することが意図されている。本明細書で述べるヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばインビトロでランダムまたは部位特異的突然変異誘発によってまたはインビボで体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種からの免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子を指し、ここで分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメインを含み得るか、または可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）だけを含み得る。抗原結合部位は、野生型であり得るかまたは１もしくはそれ以上のアミノ酸置換によって修飾されていてもよい、例えばヒト免疫グロブリンにより密接に類似するように修飾されていてもよい。ヒト化抗体の一部の形態は、すべてのＣＤＲ配列を保存する（例えばマウス抗体からの６つのＣＤＲ全部を含むヒト化マウス抗体）。他の形態は、もとの抗体に比べて変化した１またはそれ以上のＣＤＲを有する。
「キメラ抗体」という用語は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の各々の一部分が、特定の種に由来するまたは特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に相同であり、鎖の残りのセグメントは別の抗体中の対応する配列に相同である抗体を指す。典型的には、軽鎖と重鎖の両方の可変領域が哺乳動物の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣し、定常部分は別の種に由来する抗体の配列に相同である。そのようなキメラ形態の１つの明らかな利点は、可変領域を、例えばヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて、容易に入手可能な非ヒト宿主生物からのＢ細胞またはハイブリドーマを用いて現在公知の供給源から好都合に誘導できることである。可変領域は調製の容易さという利点を有し、その特異性は供給源に影響されないが、ヒトである定常領域は、抗体を注射した場合、非ヒト供給源からの定常領域よりもヒト被験体からの免疫応答を惹起する可能性が低い。しかし、その定義はこの特定の例に限定されない。
抗体の「抗原結合部分」（もしくは単に「結合部分」）または抗体の「抗原結合フラグメント」（もしくは単に「結合フラグメント」）という用語または同様の用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１またはそれ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体のフラグメントによって実行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインから成る一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから成る、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）場合により合成リンカーによって連結されていてもよい２またはそれ以上の単離されたＣＤＲの組合せ、が含まれる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、それらを、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価分子を形成する一本鎖タンパク質（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３参照）として作製することを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いてそれらを連結することができる。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に包含されることが意図されている。さらなる例は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域、を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域であり得る。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、さらに、米国特許出願第２００３／０１１８５９２号および同第２００３／０１３３９３９号に開示されている。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来技術を用いて得られ、フラグメントは、無傷抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。
「二重特異性分子」という用語は、２つの異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質複合体もしくはペプチド複合体を包含することが意図されている。例えば、前記分子は、（ａ）細胞表面抗原および（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、に結合し得るまたはこれらと相互作用し得る。「多重特異性分子」または「ヘテロ特異性分子」という用語は、３つ以上の異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質複合体もしくはペプチド複合体を包含することが意図されている。例えば、前記分子は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体および（ｃ）少なくとも１つの他の成分、に結合し得るまたはこれらと相互作用し得る。したがって、本発明は、ＣＬＤＮ１８．２および他の標的、例えばエフェクター細胞上のＦｃ受容体に対する二重特異性、三重特異性、四重特異性および他の多重特異性分子を包含するが、これらに限定されない。「二重特異性抗体」という用語はダイアボディも包含する。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが１本のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を許容するには短すぎるリンカーを使用し、それによりそれらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させて、２つの抗原結合部位を創製する、二価の二重特異性抗体である（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３参照）。
抗体は、細胞毒、薬剤（例えば免疫抑制剤）または放射性同位体などの治療成分または作用物質に結合し得る。細胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞に有害であり、特に細胞を死滅させる任意の作用物質を包含する。例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似体またはホモログが含まれる。抗体コンジュゲートを形成するための適切な治療薬には、代謝拮抗物質（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）（シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸***薬（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、治療薬は細胞傷害性物質または放射性毒性物質である。別の実施形態では、治療薬は免疫抑制剤である。さらに別の実施形態では、治療薬はＧＭ−ＣＳＦである。好ましい実施形態では、治療薬は、ドキソルビシン、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミドまたはリシンＡである。
抗体はまた、放射性同位体、例えばヨウ素１３１、イットリウム９０またはインジウム１１１に結合して、細胞傷害性放射性医薬品を生成することもできる。
本発明の抗体コンジュゲートは、所与の生物学的応答を調節するために使用することができ、薬剤成分は古典的化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば薬剤成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質には、例えば酵素活性毒素もしくはその活性フラグメント、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素もしくはジフテリア毒素；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロンγなどのタンパク質；または生物学的応答調節剤、例えばリンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）もしくは他の増殖因子などが含まれ得る。
そのような治療成分を抗体に結合するための技術は周知であり、例えばＡｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ"，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，"Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ"，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ"，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ '８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；"Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ"，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ"，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）参照。
本明細書で使用される場合、抗体は、その抗体が動物を免疫することによってまたは免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングすることによって得られる場合、特定の生殖細胞系配列に「由来」し、前記スクリーニングにおいて選択される抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに一層好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一である。典型的には、特定の生殖細胞系配列に由来する抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０個以下のアミノ酸相違、より好ましくは５、またはさらに一層好ましくは４、３、２または１個以下のアミノ酸相違を示す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロ抗体」という用語は、そのうちの少なくとも２つが異なる特異性を有する、共に連結された２またはそれ以上の抗体、その誘導体または抗原結合領域を指す。これらの異なる特異性には、エフェクター細胞上のＦｃ受容体に対する結合特異性、および標的細胞、例えば腫瘍細胞上の抗原またはエピトープに対する結合特異性が含まれる。
本明細書で述べる抗体はモノクローナル抗体であり得る。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は単一結合特異性および親和性を示す。１つの実施形態では、モノクローナル抗体は、不死化細胞に融合した、非ヒト動物、例えばマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
本明細書で述べる抗体は組換え抗体であり得る。「組換え抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え手段によって作製される、発現される、創製されるまたは単離されるすべての抗体、例えば（ａ）免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマルである動物（例えばマウス）またはそれから作製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、および（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって作製された、発現された、創製されたまたは単離された抗体、を包含する。
本明細書で述べる抗体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒトを含むがこれらに限定されない、様々な種に由来し得る。
本明細書で述べる抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を包含し、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２などのＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤ抗体を含む。様々な実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１抗体、より特定するとＩｇＧ１、カッパまたはＩｇＧ１、ラムダアイソタイプ（すなわちＩｇＧ１、κ、λ）、ＩｇＧ２ａ抗体（例えばＩｇＧ２ａ、κ、λ）、ＩｇＧ２ｂ抗体（例えばＩｇＧ２ｂ、κ、λ）、ＩｇＧ３抗体（例えばＩｇＧ３、κ、λ）またはＩｇＧ４抗体（例えばＩｇＧ４、κ、λ）である。
「トランスフェクトーマ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体を発現する組換え真核生物宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、植物細胞、または酵母細胞を含む真菌細胞を包含する。
本明細書で使用される場合、「異種抗体」は、そのような抗体を産生するトランスジェニック生物に関して定義される。この用語は、トランスジェニック生物から構成されず、および一般にトランスジェニック生物以外の種に由来する生物において認められるものに対応するアミノ酸配列またはコード核酸配列を有する抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物起源の軽鎖と重鎖を有する抗体を指す。例えば、マウス軽鎖と結合したヒト重鎖を有する抗体はヘテロハイブリッド抗体である。
本発明は、本発明の目的上「抗体」という用語に包含される、本明細書で述べるすべての抗体および抗体の誘導体を包含する。「抗体誘導体」という用語は、抗体の任意の修飾形態、例えば抗体と別の作用物質もしくは抗体とのコンジュゲート、または抗体フラグメントを指す。
本明細書で述べる抗体は、好ましくは単離されている。本明細書で使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図されている（例えば、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する単離された抗体は、ＣＬＤＮ１８．２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ヒトＣＬＤＮ１８．２のエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合する単離された抗体は、しかし、他の関連抗原、例えば他の種からの関連抗原（例えばＣＬＤＮ１８．２種ホモログ）に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、実質的に他の細胞物質および／または化学物質不含であり得る。本発明の１つの実施形態では、「単離された」モノクローナル抗体の組合せは、異なる特異性を有し、十分に定義された組成物または混合物中で組み合わされている抗体に関する。
本発明による「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。
本発明によれば、抗体が標準的なアッセイにおいて所定の標的に有意の親和性を有し、および前記所定の標的に結合する場合、前記抗体は前記所定の標的に結合することができる。「親和性」または「結合親和性」は、しばしば平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される。好ましくは、「有意の親和性」という用語は、１０−５Ｍもしくはそれ以下、１０−６Ｍもしくはそれ以下、１０−７Ｍもしくはそれ以下、１０−８Ｍもしくはそれ以下、１０−９Ｍもしくはそれ以下、１０−１０Ｍもしくはそれ以下、１０−１１Ｍもしくはそれ以下、または１０−１２Ｍもしくはそれ以下の解離定数（ＫＤ）で所定の標的に結合することを指す。
抗体が標準的なアッセイにおいて標的に有意の親和性を有さず、および前記標的に有意に結合しない、特に検出可能に結合しない場合、前記抗体は前記標的に（実質的に）結合することができない。好ましくは、抗体が、最大２μｇ／ｍｌまで、好ましくは１０μｇ／ｍｌまで、より好ましくは２０μｇ／ｍｌまで、特に５０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌ以上までの濃度で存在する場合、前記抗体は前記標的に検出可能に結合していない。好ましくは、抗体が、その抗体が結合することができる所定の標的への結合に関するＫＤよりも少なくとも１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍または１０６倍高いＫＤで前記標的に結合する場合、前記抗体は前記標的に有意の親和性を有さない。例えば、抗体が結合することができる標的への結合に関するＫＤが１０−７Ｍである場合、前記抗体が有意の親和性を有さない標的への結合に関するＫＤは、少なくとも１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍ、１０−３Ｍ、１０−２Ｍまたは１０−１Ｍである。
抗体が、所定の標的に結合することができるが、他の標的には結合することができない、すなわち標準的なアッセイにおいて他の標的には有意の親和性を有さず、および他の標的に有意に結合しない場合、前記抗体は前記所定の標的に特異的である。本発明によれば、抗体が、ＣＬＤＮ１８．２に結合することができるが、他の標的には（実質的に）結合することができない場合、前記抗体はＣＬＤＮ１８．２に特異的である。好ましくは、そのような他の標的に対する親和性および結合が、ＣＬＤＮ１８．２に無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または非クローディン膜貫通タンパク質、例えばＭＨＣ分子もしくはトランスフェリン受容体、または何らかの他の特定のポリペプチドに対する親和性または結合を有意に上回らない場合、前記抗体はＣＬＤＮ１８．２に特異的である。好ましくは、抗体が、その抗体が特異的でない標的への結合に関するＫＤよりも少なくとも１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍または１０６倍低いＫＤで所定の標的に結合する場合、前記抗体は前記所定の標的に特異的である。例えば、抗体が特異的である標的への結合に関するＫＤが１０−７Ｍである場合、前記抗体が特異的でない標的への結合に関するＫＤは、少なくとも１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍ、１０−３Ｍ、１０−２Ｍまたは１０−１Ｍである。
標的への抗体の結合は、任意の適切な方法：例えばＢｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ"Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）参照、および本明細書で述べる方法を用いて実験的に決定することができる。親和性は、従来の技術を用いて、例えば平衡透析によって；製造者によって概説される一般的手順を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００装置を使用することによって；放射性標識標的抗原を用いた放射性免疫検定法によって；または当業者に公知の別の方法によって、容易に決定し得る。親和性データは、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ，５１：６６０（１９４９）の方法によって解析し得る。特定の抗体抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件下で、例えば異なる塩濃度、ｐＨの下で測定された場合、異なり得る。したがって、親和性および他の抗原結合パラメータ、例えばＫＤ、ＩＣ５０の測定は、好ましくは抗体および抗原の標準溶液および標準緩衝液を使用して行われる。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプスイッチ」は、抗体のクラスまたはアイソタイプがある１つのＩｇクラスからその他のＩｇクラスの１つに変化する現象を指す。
物体に適用される場合の本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体を自然界で見出すことができるという事実を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができる生物（ウイルスを含む）中に存在し、実験室においてヒトによって意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
本明細書で使用される「再編成された」という用語は、基本的にそれぞれ完全なＶＨまたはＶＬドメインをコードする立体配座においてＶセグメントがＤ−ＪまたはＪセグメントに直接隣接して位置する、重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の立体配置を指す。再編成された免疫グロブリン（抗体）遺伝子座は、生殖細胞系ＤＮＡとの比較によって同定することができ、再編成された遺伝子座は、少なくとも１つの組み換えられた７量体／９量体相同性エレメントを有する。
Ｖセグメントに関して本明細書で使用される「再編成されていない」または「生殖細胞系立体配置」という用語は、Ｖセグメントが、ＤまたはＪセグメントに直接隣接するように組み換えられていない立体配置を指す。
本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、ＣＬＤＮ１８．２中に存在するエピトープ、好ましくはＣＬＤＮ１８．２の細胞外ドメイン内、特に第一細胞外ドメイン内、好ましくはＣＬＤＮ１８．２のアミノ酸位置２９〜７８内に位置するエピトープに結合することができる抗体である。特定の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、（ｉ）ＣＬＤＮ１８．１上には存在しないＣＬＤＮ１８．２上のエピトープ、好ましくは配列番号：３、４および５、（ｉｉ）ＣＬＤＮ１８．２−ループ１上に局在するエピトープ、好ましくは配列番号：８、（ｉｉｉ）ＣＬＤＮ１８．２−ループ２上に局在するエピトープ、好ましくは配列番号：１０、（ｉｖ）ＣＬＤＮ１８．２−ループＤ３上に局在するエピトープ、好ましくは配列番号：１１、（ｖ）ＣＬＤＮ１８．２−ループ１およびＣＬＤＮ１８．２−ループＤ３を包含するエピトープ、または（ｖｉ）ＣＬＤＮ１８．２−ループＤ３上に局在する非グリコシル化エピトープ、好ましくは配列番号：９、に結合することができる抗体である。
本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有するが、ＣＬＤＮ１８．１に結合する能力は有さない抗体である。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体はＣＬＤＮ１８．２に特異的である。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、好ましくは細胞表面に発現されたＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体である。特定の好ましい実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、生細胞の表面に存在するＣＬＤＮ１８．２の天然エピトープに結合する。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、配列番号：１、３〜１１、４４、４６および４８〜５０から成る群より選択される１またはそれ以上のペプチドに結合する。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、前述したタンパク質、ペプチドまたはその免疫原性フラグメントもしくは誘導体に特異的である。ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、配列番号：１、３〜１１、４４、４６および４８〜５０から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはペプチド、または前記タンパク質もしくはペプチドを発現する核酸もしくは宿主細胞で動物を免疫する工程を含む方法によって入手し得る。好ましくは、抗体は、癌細胞、特に前述した癌型の細胞に結合し、および好ましくは、非癌性細胞には実質的に結合しない。
好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体の、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞への結合は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の死滅を誘導または媒介する。ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞は、好ましくは癌細胞であり、特に腫瘍形成性胃癌、食道癌、膵癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝癌、頭頸部癌および胆嚢癌細胞から成る群より選択される。好ましくは、抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）媒介性溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介性溶解、アポトーシスおよびＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の増殖の阻害の１またはそれ以上を誘導することによって細胞の死滅を誘導または媒介する。好ましくは、細胞のＡＤＣＣ媒介性溶解はエフェクター細胞の存在下で起こり、エフェクター細胞は、特定の実施形態では単球、単核細胞、ＮＫ細胞およびＰＭＮから成る群より選択される。細胞の増殖の阻害は、ブロモデオキシウリジン（５−ブロモ−２−デオキシウリジン、ＢｒｄＵ）を使用したアッセイにおいて細胞の増殖を定量することによってインビトロで測定できる。ＢｒｄＵは、チミジンの類似体である合成ヌクレオシドであり、複製中の細胞の新たに合成されたＤＮＡに組み込まれることができ（細胞周期のＳ期の間に）、ＤＮＡ複製の間にチミジンと置き換わる。例えばＢｒｄＵに特異的な抗体を使用して、組み込まれた化学物質を検出することにより、そのＤＮＡを活発に複製していた細胞が示される。
好ましい実施形態では、本明細書で述べる抗体は、以下の特性：
ａ）ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性；
ｂ）約１００ｎＭまたはそれ以下、好ましくは約５〜１０ｎＭまたはそれ以下、より好ましくは約１〜３ｎＭまたはそれ以下のＣＬＤＮ１８．２に対する結合親和性；
ｃ）ＣＬＤＮ１８．２陽性細胞上でＣＤＣを誘導または媒介する能力；
ｄ）ＣＬＤＮ１８．２陽性細胞上でＡＤＣＣを誘導または媒介する能力；
ｅ）ＣＬＤＮ１８．２陽性細胞の増殖を阻害する能力；
ｆ）ＣＬＤＮ１８．２陽性細胞のアポトーシスを誘導する能力
の１つまたはそれ以上を特徴とし得る。
特に好ましい実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、ＤＳＭＺ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，３１８２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；新住所：Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，３１８２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託された、以下の名称およびアクセッション番号を有するハイブリドーマによって産生される：
ａ．１８２−Ｄ１１０６−０５５、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７３７、２００５年１０月１９日寄託
ｂ．１８２−Ｄ１１０６−０５６、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７３８、２００５年１０月１９日寄託
ｃ．１８２−Ｄ１１０６−０５７、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７３９、２００５年１０月１９日寄託
ｄ．１８２−Ｄ１１０６−０５８、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７４０、２００５年１０月１９日寄託
ｅ．１８２−Ｄ１１０６−０５９、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７４１、２００５年１０月１９日寄託
ｆ．１８２−Ｄ１１０６−０６２、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７４２、２００５年１０月１９日寄託
ｇ．１８２−Ｄ１１０６−０６７、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７４３、２００５年１０月１９日寄託
ｈ．１８２−Ｄ７５８−０３５、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７４５、２００５年１１月１７日寄託
ｉ．１８２−Ｄ７５８−０３６、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７４６、２００５年１１月１７日寄託
ｊ．１８２−Ｄ７５８−０４０、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７４７、２００５年１１月１７日寄託
ｋ．１８２−Ｄ１１０６−０６１、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７４８、２００５年１１月１７日寄託
ｌ．１８２−Ｄ１１０６−２７９、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８０８、２００６年１０月２６日寄託
ｍ．１８２−Ｄ１１０６−２９４、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８０９、２００６年１０月２６日寄託
ｎ．１８２−Ｄ１１０６−３６２、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８１０、２００６年１０月２６日寄託。
本発明による好ましい抗体は、上述したハイブリドーマによって産生されるおよび上述したハイブリドーマから得られるもの、すなわち１８２−Ｄ１１０６−０５５の場合は３７Ｇ１１、１８２−Ｄ１１０６−０５６の場合は３７Ｈ８、１８２−Ｄ１１０６−０５７の場合は３８Ｇ５、１８２−Ｄ１１０６−０５８の場合は３８Ｈ３、１８２−Ｄ１１０６−０５９の場合は３９Ｆ１１、１８２−Ｄ１１０６−０６２の場合は４３Ａ１１、１８２−Ｄ１１０６−０６７の場合は６１Ｃ２、１８２−Ｄ７５８−０３５の場合は２６Ｂ５、１８２−Ｄ７５８−０３６の場合は２６Ｄ１２、１８２−Ｄ７５８−０４０の場合は２８Ｄ１０、１８２−Ｄ１１０６−０６１の場合は４２Ｅ１２、１８２−Ｄ１１０６−２７９の場合は１２５Ｅ１、１８２−Ｄ１１０６−２９４の場合は１６３Ｅ１２、および１８２−Ｄ１１０６−３６２の場合は１７５Ｄ１０；ならびにそのキメラおよびヒト化形態である。
好ましいキメラ抗体およびそれらの配列を以下の表に示す。
好ましい実施形態では、抗体、特に本発明によるキメラ形態の抗体は、配列番号：１３によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントなどのヒト重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（ＣＨ）を含む抗体を包含する。さらなる好ましい実施形態では、抗体、特に本発明によるキメラ形態の抗体は、配列番号：１２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントなどのヒト軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む抗体を包含する。特定の好ましい実施形態では、抗体、特に本発明によるキメラ形態の抗体は、配列番号：１３によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントなどのヒトＣＨに由来するアミノ酸配列を有するＣＨを含み、および配列番号：１２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントなどのヒトＣＬに由来するアミノ酸配列を有するＣＬを含む抗体を包含する。
１つの実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、マウスκ可変軽鎖、ヒトκ軽鎖定常領域アロタイプＫｍ（３）、マウス重鎖可変領域、ヒトＩｇＧ１定常領域、アロタイプＧ１ｍ（３）を含むキメラマウス／ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。
特定の好ましい実施形態では、キメラ形態の抗体は、配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９およびそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を含み、ならびに／または配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８およびそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体を包含する。
特定の好ましい実施形態では、キメラ形態の抗体は、以下の可能性（ｉ）〜（ｉｘ）から選択される重鎖と軽鎖の組合せを含む抗体を包含する：
（ｉ）重鎖は配列番号：１４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、および軽鎖は配列番号：２１によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｉｉ）重鎖は配列番号：１５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、および軽鎖は配列番号：２０によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｉｉｉ）重鎖は配列番号：１６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、および軽鎖は配列番号：２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｉｖ）重鎖は配列番号：１８によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、および軽鎖は配列番号：２５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｖ）重鎖は配列番号：１７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、および軽鎖は配列番号：２４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｖｉ）重鎖は配列番号：１９によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、および軽鎖は配列番号：２３によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｖｉｉ）重鎖は配列番号：１９によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、および軽鎖は配列番号：２６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｖｉｉｉ）重鎖は配列番号：１９によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、および軽鎖は配列番号：２７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、ならびに
（ｉｘ）重鎖は配列番号：１９によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、および軽鎖は配列番号：２８によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。
上記で使用される「フラグメント」または「アミノ酸配列のフラグメント」は、抗体配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮された抗体配列であり、抗体中で前記抗体配列に置き換わった場合、前記抗体のＣＬＤＮ１８．２への結合および好ましくは本明細書で述べる前記抗体の機能、例えばＣＤＣ媒介性溶解またはＡＤＣＣ媒介性溶解を保持する配列に関する。好ましくは、アミノ酸配列のフラグメントは、前記アミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８から成る群より選択されるアミノ酸配列のフラグメントは、好ましくはＮ末端の１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個のアミノ酸が除去されている前記配列に関する。
好ましい実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、配列番号：２９、３０、３１、３２、３３、３４およびそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
好ましい実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、配列番号：３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３およびそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
特定の好ましい実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、以下の可能性（ｉ）〜（ｉｘ）から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）の組合せを含む：
（ｉ）ＶＨは配列番号：２９によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＬは配列番号：３６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｉｉ）ＶＨは配列番号：３０によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＬは配列番号：３５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｉｉｉ）ＶＨは配列番号：３１によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＬは配列番号：３７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｉｖ）ＶＨは配列番号：３３によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＬは配列番号：４０によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｖ）ＶＨは配列番号：３２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＬは配列番号：３９によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｖｉ）ＶＨは配列番号：３４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＬは配列番号：３８によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｖｉｉ）ＶＨは配列番号：３４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＬは配列番号：４１によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｖｉｉｉ）ＶＨは配列番号：３４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＬは配列番号：４２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、
（ｉｘ）ＶＨは配列番号：３４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＬは配列番号：４３によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。
好ましい実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、以下の実施形態（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のセットを含有するＶＨを含む：
（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号：１４の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号：１４の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号：１４の１１６〜１２５位、
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号：１５の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号：１５の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号：１５の１１６〜１２６位、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号：１６の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号：１６の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号：１６の１１６〜１２４位、
（ｉｖ）ＣＤＲ１：配列番号：１７の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号：１７の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号：１７の１１６〜１２６位、
（ｖ）ＣＤＲ１：配列番号：１８の４４〜５１位、ＣＤＲ２：配列番号：１８の６９〜７６位、ＣＤＲ３：配列番号：１８の１１５〜１２５位、および
（ｖｉ）ＣＤＲ１：配列番号：１９の４５〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号：１９の７１〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：１９の１１７〜１２８位。
好ましい実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、以下の実施形態（ｉ）〜（ｉｘ）から選択される相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のセットを含有するＶＬを含む：
（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号：２０の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号：２０の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：２０の１１５〜１２３位、
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号：２１の４９〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号：２１の７１〜７３位、ＣＤＲ３：配列番号：２１の１１０〜１１８位、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号：２２の４７〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号：２２の７０〜７２位、ＣＤＲ３：配列番号：２２の１０９〜１１７位、
（ｉｖ）ＣＤＲ１：配列番号：２３の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号：２３の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：２３の１１５〜１２３位、
（ｖ）ＣＤＲ１：配列番号：２４の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号：２４の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：２４の１１５〜１２３位、
（ｖｉ）ＣＤＲ１：配列番号：２５の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号：２５の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：２５の１１５〜１２２位、
（ｖｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号：２６の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号：２６の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：２６の１１５〜１２３位、
（ｖｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号：２７の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号：２７の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：２７の１１５〜１２３位、および
（ｉｘ）ＣＤＲ１：配列番号：２８の４７〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号：２８の７０〜７２位、ＣＤＲ３：配列番号：２８の１０９〜１１７位。
好ましい実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、以下の実施形態（ｉ）〜（ｉｘ）から選択される相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のセットをそれぞれ含有するＶＨとＶＬの組合せを含む：
（ｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号：１４の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号：１４の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号：１４の１１６〜１２５位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号：２１の４９〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号：２１の７１〜７３位、ＣＤＲ３：配列番号：２１の１１０〜１１８位、
（ｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号：１５の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号：１５の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号：１５の１１６〜１２６位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号：２０の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号：２０の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：２０の１１５〜１２３位、
（ｉｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号：１６の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号：１６の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号：１６の１１６〜１２４位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号：２２の４７〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号：２２の７０〜７２位、ＣＤＲ３：配列番号：２２の１０９〜１１７位、
（ｉｖ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号：１８の４４〜５１位、ＣＤＲ２：配列番号：１８の６９〜７６位、ＣＤＲ３：配列番号：１８の１１５〜１２５位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号：２５の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号：２５の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：２５の１１５〜１２２位、
（ｖ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号：１７の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号：１７の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号：１７の１１６〜１２６位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号：２４の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号：２４の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：２４の１１５〜１２３位、
（ｖｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号：１９の４５〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号：１９の７１〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：１９の１１７〜１２８位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号：２３の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号：２３の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：２３の１１５〜１２３位、
（ｖｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号：１９の４５〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号：１９の７１〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：１９の１１７〜１２８位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号：２６の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号：２６の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：２６の１１５〜１２３位、
（ｖｉｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号：１９の４５〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号：１９の７１〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：１９の１１７〜１２８位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号：２７の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号：２７の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：２７の１１５〜１２３位、および
（ｉｘ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号：１９の４５〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号：１９の７１〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号：１９の１１７〜１２８位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号：２８の４７〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号：２８の７０〜７２位、ＣＤＲ３：配列番号：２８の１０９〜１１７位。
さらなる好ましい実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に対するモノクローナル抗体、好ましくは本明細書で述べるＣＬＤＮ１８．２に対するモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１またはそれ以上、好ましくは少なくともＣＤＲ３可変領域を含み、ならびに好ましくは、本明細書で述べる重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１またはそれ以上、好ましくは少なくともＣＤＲ３可変領域を含む。１つの実施形態では、前記相補性決定領域（ＣＤＲ）の１またはそれ以上は、本明細書で述べる相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のセットから選択される。特に好ましい実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体は、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に対するモノクローナル抗体、好ましくは本明細書で述べるＣＬＤＮ１８．２に対するモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ならびに好ましくは、本明細書で述べる重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
１つの実施形態では、本明細書で述べる１またはそれ以上のＣＤＲ、ＣＤＲのセットまたはＣＤＲのセットの組合せを含む抗体は、それらの介在フレームワーク領域と共に前記ＣＤＲを含む。好ましくは、その部分は、１番目と４番目のフレームワーク領域のいずれかまたは両方の少なくとも約５０％を含み、前記５０％は、１番目のフレームワーク領域のＣ末端の５０％および４番目のフレームワーク領域のＮ末端の５０％である。組換えＤＮＡ技術によって行われる抗体の構築は、本発明の可変領域を免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えばダイアボディの作製において）またはタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列に連結するためのリンカーの導入を含む、クローニングまたは他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによってコードされる可変領域のＮ末端またはＣ末端側に残基の導入を生じさせ得る。
１つの実施形態では、本明細書で述べる１またはそれ以上のＣＤＲ、ＣＤＲのセットまたはＣＤＲのセットの組合せを含む抗体は、ヒト抗体フレームワーク内に前記ＣＤＲを含む。
抗体の重鎖に関して特定の鎖または特定の領域もしくは配列を含む抗体への本明細書における言及は、好ましくは前記抗体のすべての重鎖が前記特定の鎖、領域または配列を含む状況に関する。これは抗体の軽鎖にも対応して適用される。
「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含することが意図されている。核酸は一本鎖または二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
本発明によれば、「発現」という用語はその最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡの産生またはＲＮＡとタンパク質／ペプチドの産生を包含する。この用語は核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過性にまたは安定に実施され得る。
特定のアミノ酸配列、例えば配列表に示すものに関して本明細書で与えられる教示は、前記特定配列と機能的に等価である配列、例えば特定のアミノ酸配列の特性と同一または類似の特性を示すアミノ酸配列を生じさせる前記特定配列の変異体にも関するように解釈されるべきである。１つの重要な特性は、抗体のその標的への結合を保持することまたは抗体のエフェクター機能を維持することである。好ましくは、特定の配列に関して変異体である配列は、それが抗体中で前記特定配列に置き換わる場合、前記抗体のＣＬＤＮ１８．２への結合および好ましくは本明細書で述べる前記抗体の機能、例えばＣＤＣ媒介性溶解またはＡＤＣＣ媒介性溶解を保持する。
特にＣＤＲ、超可変領域および可変領域の配列は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を失わずに修飾され得ることが当業者に認識される。例えば、ＣＤＲ領域は、本明細書で特定される抗体の領域に同一または高度に相同である。「高度に相同」により、１〜５、好ましくは１〜４、例えば１〜３または１もしくは２個の置換がＣＤＲ内で為されていてもよいことが企図される。加えて、超可変領域および可変領域は、本明細書で特定して開示される抗体の領域と実質的な相同性を示すように修飾され得る。
本発明の目的上、アミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を包含する。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列内に１または２またはそれ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１またはそれ以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列内の特定の部位に挿入されているが、生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダムな挿入も可能である。
アミノ酸付加変異体は、１またはそれ以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合を含む。
アミノ酸欠失変異体は、配列からの１またはそれ以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失はタンパク質の任意の位置であり得る。
アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質もしくはペプチドの間で保存されていないアミノ酸配列内の位置に修飾が存在することおよび／またはアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換されることが好ましい。好ましくは、タンパク質変異体内のアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち類似の荷電または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換を包含する。天然に存在するアミノ酸は、一般に４つのファミリー：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時として芳香族アミノ酸として一緒に分類される。
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性の程度、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域に関して与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸から成る場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸に関して与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は参照アミノ酸配列の全長に関して与えられる。配列類似性、好ましく配列同一性を決定するためのアラインメントは、当分野で公知のツールを用いて、好ましくは最良配列アラインメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ニードル、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、キャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を用いて実施することができる。
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換であるアミノ酸のパーセントを示す。２つのアミノ酸配列の間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるアミノ酸のパーセントを示す。
「同一性パーセント」という用語は、最良のアラインメント後に得られる、比較しようとする２つの配列の間で同一であるアミノ酸残基のパーセントを表すことが意図されており、このパーセントは純粋に統計的であって、２つの配列間の相違はランダムにおよびそれらの全長にわたって分布している。２つのアミノ酸配列の間の配列比較は、従来これらの配列を最適に整列した後で比較することによって実施され、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとにまたは「比較ウィンドウ」ごとに実施される。比較のための配列の最適アラインメントは、手作業による以外に、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって作成され得る。
同一性パーセントは、比較する２つの配列の間で同一の位置の数を決定し、これら２つの配列間の同一性パーセントを得るためにこの数を比較する位置の数で除して、得られた結果に１００を乗じることによって計算される。
「トランスジェニック動物」という用語は、１またはそれ以上の導入遺伝子、好ましくは重鎖および／もしくは軽鎖導入遺伝子、または導入染色体（動物の天然ゲノムＤＮＡに組み込まれているかもしくは組み込まれていない）を含むゲノムを有し、好ましくは導入遺伝子を発現することができる動物を指す。例えばトランスジェニックマウスは、マウスが、ＣＬＤＮ１８．２抗原および／またはＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞で免疫化された場合、ヒト抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を産生するように、ヒト軽鎖導入遺伝子と、ヒト重鎖導入遺伝子またはヒト重鎖導入染色体のいずれかを有し得る。ヒト重鎖導入遺伝子は、ＨＣｏ７もしくはＨＣｏｌ２マウスなどのトランスジェニックマウス、例えばＨｕＭＡｂマウスの場合のように、マウスの染色体ＤＮＡに組み込まれ得るか、またはヒト重鎖導入遺伝子は、国際公開第０２／４３４７８号に記載されているトランスクロモソーマル（例えばＫＭ）マウスの場合のように、染色体外に維持され得る。そのようなトランスジェニックおよびトランスクロモソーマルマウスは、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよびアイソタイプスイッチを受けることによってＣＬＤＮ１８．２に対するヒトモノクローナル抗体の多数のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＥ）を産生し得る。
本明細書で使用される「低減する」または「阻害する」は、レベル、例えば細胞の発現のレベルまたは増殖のレベルの、好ましくは５％またはそれ以上、１０％またはそれ以上、２０％またはそれ以上、より好ましくは５０％またはそれ以上、最も好ましくは７５％またはそれ以上の全体的な低下または全体的な低下を引き起こす能力を意味する。
「増大させる」または「増強する」などの用語は、好ましくは少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに一層好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％またはさらにそれ以上の増大または増強に関する。
ｍＡｂの作用機構
以下は、本発明の抗体の治療効果の基礎となる機構についての考察を提供するが、これはいかなる意味においても本発明への限定とみなされるべきではない。
本明細書で述べる抗体は、好ましくはＡＤＣＣまたはＣＤＣを介して、好ましくは免疫系の成分と相互作用する。本明細書で述べる抗体は、ペイロード（例えば放射性同位体、薬剤もしくは毒素）を標的して腫瘍細胞を直接死滅させるためにも使用でき、または伝統的な化学療法剤と相乗作用的に使用して、Ｔリンパ球への化学療法剤の細胞傷害性副作用のために損なわれた可能性がある抗腫瘍免疫応答を含み得る補完的な作用機構を介して腫瘍を攻撃することもできる。しかし、本明細書で述べる抗体はまた、単に細胞表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合することによって、したがって、例えば細胞の増殖をブロックすることによっても作用を及ぼし得る。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
ＡＤＣＣは、本明細書で述べるエフェクター細胞、特にリンパ球の細胞死滅能力を表し、これは、好ましくは標的細胞が抗体によって印づけられることを必要とする。
ＡＤＣＣは、好ましくは、抗体が腫瘍細胞上の抗原に結合し、抗体Ｆｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と係合した場合に起こる。Ｆｃ受容体のいくつかのファミリーが同定されており、特定の細胞集団は、規定されたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、抗原提示および腫瘍に対するＴ細胞応答の誘導をもたらす様々な程度の即時腫瘍破壊を直接誘導する機構とみなすことができる。好ましくは、ＡＤＣＣのインビボ誘導は、腫瘍に対するＴ細胞応答および宿主由来の抗体応答をもたらす。
補体依存性細胞傷害
ＣＤＣは、抗体によって指令され得るもう１つの細胞死滅方法である。ＩｇＭは補体活性化のために最も有効なアイソタイプである。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３も、どちらも古典的補体活性化経路によってＣＤＣを指令するのに非常に有効である。好ましくは、このカスケードにおいて、抗原抗体複合体の形成は、ＩｇＧ分子などの関与する抗体分子のＣＨ２ドメイン上のごく近接する多数のＣ１ｑ結合部位の露出を生じさせる（Ｃ１ｑは補体Ｃ１の３つのサブ成分の１つである）。好ましくは、これらの露出されたＣ１ｑ結合部位は、それまでの低親和性Ｃ１ｑ−ＩｇＧ相互作用を高いアビディティの相互作用へと変換し、それが、一連の他の補体タンパク質を含む事象のカスケードを開始させ、エフェクター細胞化学走性／活性化物質Ｃ３ａおよびＣ５ａのタンパク質分解性放出を導く。好ましくは、補体カスケードは、細胞内へのおよび細胞から外への水と溶質の自由な通過を促進する細胞膜の細孔を作り出す、膜傷害性複合体の形成で終了する。
抗体の作製および試験
本明細書で述べる抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えばＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が原則として好ましいが、モノクローナル抗体を作製するための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス形質転換もしくは発癌性形質転換または抗体遺伝子のライブラリを用いたファージディスプレイ技術も使用することができる。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するための好ましい動物系はマウスの系である。マウスにおけるハイブリドーマの作製は極めて広く確立された手順である。免疫プロトコルおよび融合のために免疫脾細胞を単離する技術は当分野で公知である。融合パートナー（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するための他の好ましい動物系は、ラットおよびウサギの系である（例えばＳｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９３４８（１９９５）に記載されている；またＲｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２４：２９５（２００５）も参照のこと）。
さらに別の好ましい実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなくヒト免疫系の一部分を担持するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウスを使用して作製できる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソーマルマウスは、それぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスとして公知のマウスを含み、本明細書では集合的に「トランスジェニックマウス」と称する。そのようなトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の生産は、国際公開第２００４／０３５６０７号の中でＣＤ２０に関して詳述されているように実施することができる。
モノクローナル抗体を作製するためのさらに別の方策は、定義された特異性を有する抗体を産生するリンパ球から抗体をコードする遺伝子を直接単離することであり、例えばＢａｂｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｆ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ参照。組換え抗体工学の詳細については、Ｗｅｌｓｃｈｏｆ ａｎｄ Ｋｒａｕｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８およびＢｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．Ｌｏ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＩＳＢＮ １−５８８２９−０９２−１も参照のこと。
抗体を作製するため、上述したように、抗原配列、すなわちそれに対して抗体が向けられるべき配列に由来する担体結合ペプチド、組換え発現された抗原もしくはそのフラグメントの富化調製物および／または抗原を発現する細胞でマウスを免疫することができる。あるいは、抗原またはそのフラグメントをコードするＤＮＡでマウスを免疫することができる。抗原の精製または富化調製物を使用した免疫が抗体を生じない場合は、免疫応答を促進するために抗原を発現する細胞、例えば細胞株でマウスを免疫することもできる。
免疫プロトコルの経過中、尾静脈または眼窩後採血によって得られる血漿および血清試料に関して免疫応答を観測することができる。免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合のために使用できる。特異的抗体を分泌するハイブリドーマの割合を高めるため、犠死および脾切除の３日前に抗原発現細胞を用いてマウスを腹腔内または静脈内経路で追加免疫することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するため、免疫マウスからの脾細胞およびリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株に融合することができる。生じたハイブリドーマを、次に、抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングすることができる。その後個々のウェルを、ＥＬＩＳＡによって抗体を分泌するハイブリドーマに関してスクリーニングすることができる。抗原発現細胞を使用した免疫蛍光法およびＦＡＣＳ分析により、抗原に対して特異性を有する抗体を同定できる。抗体を分泌するハイブリドーマを再度プレートし、再びスクリーニングして、モノクローナル抗体に関してまだ陽性である場合は限界希釈によってサブクローニングすることができる。その後、安定なサブクローンをインビトロで培養し、特徴づけのために組織培養培地中で抗体を作製することができる。
抗体はまた、例えば当分野で周知の組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを用いて（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）、宿主細胞トランスフェクトーマ中で産生させることもできる。
例えば、１つの実施形態では、関心対象の遺伝子、例えば抗体遺伝子を、国際公開第８７／０４４６２号、同第ＷＯ８９／０１０３６号および欧州特許第３３８ ８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系または当分野で周知の他の発現系によって使用されるような真核生物発現プラスミドなどの発現ベクターに連結することができる。クローニングした抗体遺伝子を含む精製プラスミドを、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３細胞などの真核生物宿主細胞、あるいは植物由来細胞、真菌または酵母細胞のような他の真核細胞に導入することができる。これらの遺伝子を導入するのに使用される方法は、電気穿孔、リポフェクチン、リポフェクタミンその他のような当分野で記述されている方法であり得る。宿主細胞へのこれらの抗体遺伝子の導入後、抗体を発現する細胞を同定し、選択することができる。これらの細胞はトランスフェクトーマであり、その後これらを発現レベルに関して増幅し、抗体を生産するためにスケールアップすることができる。これらの培養上清および／または細胞から組換え抗体を単離し、精製することができる。
あるいは、クローニングした抗体遺伝子を、微生物、例えば大腸菌などの原核細胞を含む、他の発現系において発現させることができる。さらに、抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えばヒツジおよびウサギからの乳もしくは雌鶏からの卵において、またはトランスジェニック植物において生産することができる；例えばＶｅｒｍａ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２１６：１６５−１８１；Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：１４７−１５７；およびＦｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：８２５−８３９参照。
キメラ化
マウスモノクローナル抗体は、毒素または放射性同位体で標識した場合、ヒトにおいて治療用抗体として使用することができる。非標識マウス抗体は、反復適用した場合ヒトにおいて高度に免疫原性であり、治療効果の低下をもたらす。主たる免疫原性は重鎖定常領域によって媒介される。ヒトにおけるマウス抗体の免疫原性は、それぞれの抗体をキメラ化またはヒト化した場合、低減するまたは完全に回避することができる。キメラ抗体は、その異なる部分が異なる動物種に由来する抗体、例えばマウス抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するものである。抗体のキメラ化は、マウス抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をヒト重鎖および軽鎖の定常領域と連結することによって達成される（例えばＫｒａｕｓ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｓｅｒｉｅｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８によって記述されている）。好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトκ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製される。同じく好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトλ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製できる。キメラ抗体の作製のための好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。キメラ抗体の作製のための他の好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＭである。
ヒト化
抗体は、主として、６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個々の抗体間でＣＤＲの外側の配列よりも多様である。ＣＤＲ配列は大部分の抗体−抗原相互作用に関与するので、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された、特定の天然に存在する抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；およびＱｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３参照）。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースから入手することができる。これらの生殖細胞系配列は、Ｂ細胞の成熟の間にＶ（Ｄ）Ｊ連結によって形成される、完全に構築された可変遺伝子を含まないので、成熟抗体遺伝子配列とは異なる。生殖細胞系遺伝子配列はまた、高親和性二次レパートリー抗体の配列とも、可変領域全体にわたって均一に個別に異なる。
抗原に結合する抗体の能力は、標準的な結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、免疫蛍光法およびフローサイトメトリ分析）を用いて決定することができる。
抗体を精製するため、選択したハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用の２リットルスピナーフラスコ中で増殖させることができる。あるいは、透析に基づくバイオリアクターにおいて抗体を生産することができる。上清をろ過し、必要に応じて濃縮した後、プロテインＧ−セファロースまたはプロテインＡ−セファロースによるアフィニティクロマトグラフィに供することができる。溶出したＩｇＧを、純度を保証するためにゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィによって検査できる。緩衝液をＰＢＳに交換し、１．４３の吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を決定することができる。モノクローナル抗体をアリコートに分け、−８０℃で保存することができる。
選択したモノクローナル抗体がユニークなエピトープに結合するかどうかを判定するため、部位指定または多部位指定突然変異誘発が使用できる。
抗体のアイソタイプを決定するため、様々な市販のキット（例えばＺｙｍｅｄ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によるアイソタイプＥＬＩＳＡを実施できる。マイクロタイタープレートのウェルを抗マウスＩｇで被覆することができる。ブロックした後、プレートを周囲温度で２時間、モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と反応させる。次に、ウェルをマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂもしくはＩｇＧ３、ＩｇＡまたはマウスＩｇＭ特異的ペルオキシダーゼ結合プローブのいずれかと反応させることができる。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で展開し、４０５〜６５０のＯＤで分析することができる。あるいは、ＩｓｏＳｔｒｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１４９３０２７）を、製造者によって述べられているように使用し得る。
免疫したマウスの血清中の抗体の存在または抗原を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするために、フローサイトメトリを用いることができる。天然にまたはトランスフェクション後に抗原を発現する細胞株と抗原発現を欠く陰性対照（標準的な増殖条件下で増殖させた）を、ハイブリドーマ上清中または１％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中で様々な濃度のモノクローナル抗体と混合し、４℃で３０分間インキュベートすることができる。洗浄後、ＡＰＣ標識またはＡｌｅｘａ６４７標識抗ＩｇＧ抗体を、一次抗体染色と同じ条件下で抗原結合モノクローナル抗体に結合することができる。単一生細胞をゲートする側方光散乱特性を利用したＦＡＣＳ装置でのフローサイトメトリによって試料を分析することができる。単一測定において抗原特異的モノクローナル抗体を非特異的結合体から区別するために、同時トランスフェクションの方法が使用できる。抗原と蛍光マーカーをコードするプラスミドを一過性にトランスフェクトした細胞を上述したように染色することができる。トランスフェクトされた細胞は、抗体染色細胞とは異なる蛍光チャネルで検出できる。トランスフェクト細胞の大部分は両方の導入遺伝子を発現するので、抗原特異的モノクローナル抗体は蛍光マーカー発現細胞に選択的に結合し、一方非特異的抗体は同等の割合で非トランスフェクト細胞に結合する。蛍光顕微鏡検査を用いた選択的なアッセイをフローサイトメトリアッセイに加えてまたはその代わりに使用し得る。細胞を上述したように正確に染色し、蛍光顕微鏡法によって検査することができる。
免疫したマウスの血清中の抗体の存在または抗原を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするために、免疫蛍光顕微鏡分析を用いることができる。例えば、自然にまたはトランスフェクション後に抗原を発現する細胞株と抗原発現を欠く陰性対照を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、標準的な増殖条件下にチャンバースライド中で増殖させる。次に細胞をメタノールまたはパラホルムアルデヒドで固定するかまたは未処理のまま放置することができる。その後細胞を、２５℃で３０分間、抗原に対するモノクローナル抗体と反応させることができる。洗浄後、同じ条件下で細胞をＡｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と反応させることができる。その後蛍光顕微鏡法によって細胞を検査することができる。
抗原を発現する細胞からの細胞抽出物および適切な陰性対照を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、ブロックして、試験するモノクローナル抗体でプローブする。抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼを使用してＩｇＧ結合を検出し、ＥＣＬ基質で展開することができる。
抗体を、当業者に周知の方法で免疫組織化学によって、例えば通常の外科手術の間に患者から得た、または自然にもしくはトランスフェクション後に抗原を発現する細胞株を接種した異種移植腫瘍を担持するマウスから得た、非癌組織試料または癌組織試料からの、パラホルムアルデヒドもしくはアセトンで固定した凍結切片またはパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋組織切片を使用して、抗原との反応性をさらに試験することができる。免疫染色のために、抗原に対して反応性の抗体をインキュベートし、次いで供給者の指示に従ってホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ）と共にインキュベートすることができる。
抗体を、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の食作用および死滅を媒介するその能力に関して試験することができる。インビトロでのモノクローナル抗体活性の試験は、インビボモデルにおける試験に先立つ初期スクリーニングを提供する。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
簡単に述べると、健常ドナーからの多形核細胞（ＰＭＮ）、ＮＫ細胞、単球、単核細胞または他のエフェクター細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、次いで混入赤血球の溶解によって精製することができる。洗浄したエフェクター細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清または５％熱不活性化ヒト血清を添加したＲＰＭＩに懸濁し、ＣＬＤＮ１８．２を発現する５１Ｃｒ標識標的細胞と、エフェクター細胞対標的細胞の様々な比率で混合することができる。あるいは、標的細胞を蛍光増強リガンド（ＢＡＴＤＡ）で標識してもよい。死細胞から放出される増強リガンドを有するユウロピウムの高度蛍光キレートを蛍光光度計によって測定することができる。もう１つの選択的な技術は、ルシフェラーゼによる標的細胞のトランスフェクションを利用し得る。添加したルシファーイエローは、その後、生細胞によってのみ酸化され得る。次に精製抗ＣＬＤＮ１８．２ ＩｇＧを様々な濃度で添加することができる。無関係なヒトＩｇＧを陰性対照として使用できる。アッセイは、使用するエフェクター細胞型に依存して３７℃で４〜２０時間実施できる。培養上清中の５１Ｃｒ放出またはＥｕＴＤＡキレートの存在を測定することによって試料を細胞溶解に関して検定することができる。あるいは、ルシファーイエローの酸化から生じるルミネセンスは生細胞の評価尺度であり得る。抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体はまた、細胞溶解が複数のモノクローナル抗体で増強されるかどうかを判定するために様々な組合せで試験することもできる。
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）
モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を、様々な公知の技術を用いてＣＤＣを媒介するその能力に関して試験することができる。例えば、補体のための血清は、当業者に公知の方法で血液から入手できる。ｍＡｂのＣＤＣ活性を測定するために、種々の方法が使用できる。例えば５１Ｃｒ放出を測定することができ、またはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除アッセイを用いて膜透過性上昇を評価することができる。簡単に述べると、標的細胞を洗浄し、５×１０５／ｍｌを様々な濃度のｍＡｂと共に室温または３７℃で１０〜３０分間インキュベートすることができる。次に血清または血漿を２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加し、細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートすることができる。各々の試料からのすべての細胞をＦＡＣＳチューブ内のＰＩ溶液に添加することができる。その後ＦＡＣＳＡｒｒａｙを使用してフローサイトメトリ分析によって直ちに混合物を分析することができる。
選択的なアッセイでは、ＣＤＣの誘導を接着細胞で測定することができる。このアッセイの１つの実施形態では、細胞を、アッセイの２４時間前に組織培養平底マイクロタイタープレートに３×１０４／ウェルの密度で接種する。その翌日、増殖培地を取り出し、細胞を抗体と共に三つ組みでインキュベートする。対照細胞を、それぞれバックグラウンド溶解および最大溶解の測定のために増殖培地または０．２％サポニンを含有する増殖培地と共にインキュベートする。室温で２０分間インキュベートした後、上清を取り、ＤＭＥＭ中の２０％（ｖ／ｖ）ヒト血漿または血清（あらかじめ３７℃に温めておく）を細胞に添加して、３７℃でさらに２０分間インキュベートする。各々の試料からのすべての細胞をヨウ化プロピジウム溶液（１０μｇ／ｍｌ）に添加する。次に、上清を、２．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有するＰＢＳに交換し、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅを使用して５２０ｎｍ励起での蛍光放出を６００ｎｍで測定する。特異的溶解のパーセントを以下のように計算する：特異的溶解％＝（試料蛍光−バックグラウンド蛍光）／（最大溶解蛍光−バックグラウンド蛍光）×１００。
モノクローナル抗体によるアポトーシスの誘導および細胞増殖の阻害
アポトーシスを開始させる能力に関して試験するため、モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を、例えばＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍細胞、例えばＳＮＵ−１６、ＤＡＮ−Ｇ、ＫＡＴＯ−ＩＩＩまたはＣＬＤＮ１８．２トランスフェクト腫瘍細胞と共に３７℃で約２０時間インキュベートすることができる。細胞を採取し、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ結合緩衝液（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で洗浄して、ＦＩＴＣまたはＡＰＣと結合したＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に暗所で１５分間インキュベートすることができる。各々の試料からのすべての細胞をＦＡＣＳチューブ内のＰＩ溶液（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）に添加し、直ちにフローサイトメトリによって評価することができる（上記のように）。あるいは、モノクローナル抗体による細胞増殖の一般的な阻害は市販のキットで検出できる。ＤＥＬＦＩＡ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＤ０２００）は、マイクロプレートにおける増殖中の細胞のＤＮＡ合成の間の５−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の組込みの測定に基づく非同位体免疫検定法である。組み込まれたＢｒｄＵは、ユウロピウム標識モノクローナル抗体を用いて検出される。抗体検出を可能にするため、Ｆｉｘ液を用いて細胞を固定し、ＤＮＡ変性する。非結合抗体を洗い流し、ＤＥＬＦＩＡ誘導剤を添加して標識抗体からユウロピウムイオンを溶液中に解離し、溶液中で前記イオンはＤＥＬＦＩＡ誘導剤の成分と高度蛍光キレートを形成する。検出において時間分解蛍光光度法を利用して、測定された蛍光は、各々のウェルの細胞におけるＤＮＡ合成に比例する。
前臨床試験
ＣＬＤＮ１８．２に結合するモノクローナル抗体はまた、ＣＬＤＮ１８．２を発現する腫瘍細胞の増殖を制御するうえでのそれらの効果を測定するためにインビボモデルにおいて（例えばＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞株、ＤＡＮ−Ｇ、ＳＮＵ−１６もしくはＫＡＴＯ−ＩＩＩ、またはトランスフェクション後にＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞株、例えばＨＥＫ２９３を接種した異種移植腫瘍を担持する免疫不全マウスにおいて）試験することもできる。
ＣＬＤＮ１８．２を発現する腫瘍細胞を免疫無防備状態マウスまたは他の動物に異種移植した後のインビボ試験を、本明細書で述べる抗体を使用して実施することができる。腫瘍を有さないマウスに抗体を投与し、次いで腫瘍細胞を注射して、腫瘍の形成または腫瘍関連症状を予防する抗体の作用を測定することができる。腫瘍担持マウスに抗体を投与し、腫瘍の成長、転移または腫瘍関連症状を低減するそれぞれの抗体の治療効果を測定することができる。抗体の適用は、併用の相乗効果および潜在的毒性を測定するために他の物質、例えば細胞増殖抑制剤、増殖因子阻害剤、細胞周期ブロッカー、血管新生阻害剤または他の抗体の適用と組み合わせることができる。抗体によって媒介される毒性副作用を分析するため、動物に抗体または対照試薬を接種し、ＣＬＤＮ１８．２抗体治療に関連する可能性がある症状に関して十分に検討することができる。ＣＬＤＮ１８．２抗体のインビボ適用の起こり得る副作用には、特に、胃を含むＣＬＤＮ１８．２発現組織における毒性が含まれる。ヒトおよび他の種、例えばマウスにおいてＣＬＤＮ１８．２を認識する抗体は、ヒトにおけるモノクローナルＣＬＤＮ１８．２抗体の適用によって媒介される潜在的副作用を予測するために特に有用である。
抗体によって認識されるエピトープのマッピングは、Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ ＩＳＢＮ−０８９６０３−３７５−９による"Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）"およびＯｌｗｙｎ Ｍ．Ｒ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｆｒａｎｋ Ｃ．Ｈａｙによる"Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ"Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２４８において詳述されているように実施することができる。
本明細書で述べる化合物および作用物質は、任意の適切な医薬組成物の形態で投与し得る。
医薬組成物は、通常単位投与形態で提供され、それ自体公知の方法で調製され得る。医薬組成物は、例えば溶液または懸濁液の形態であり得る。
医薬組成物は、塩、緩衝物質、防腐剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含有してよく、それらすべてが、好ましくは医薬的に許容される。「医薬的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の無毒性を指す。
医薬的に許容されない塩は、医薬的に許容される塩を調製するために使用することができ、本発明に包含される。この種の医薬的に許容される塩は、非限定的に、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等から調製されるものを含む。医薬的に許容される塩はまた、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩としても調製され得る。
医薬組成物における使用のための適切な緩衝物質には、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸および塩中のリン酸が含まれる。
医薬組成物における使用のための適切な防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。
注射用製剤は、乳酸リンガー液などの医薬的に許容される賦形剤を含有し得る。
「担体」という用語は、適用を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然または合成の有機または無機成分を指す。本発明によれば、「担体」という用語はまた、患者への投与に適する、１またはそれ以上の適合性の固体または液体充填剤、希釈剤または被包物質も包含する。
非経口投与のために可能な担体物質は、例えば滅菌水、リンガー液、乳酸リンガー液、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーである。
本明細書で使用される場合の「賦形剤」という用語は、医薬組成物中に存在してよく、および活性成分ではないすべての物質、例えば担体、結合剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、着香剤または着色剤を指示することが意図されている。
本明細書で述べる作用物質および組成物は、任意の従来の経路によって、例えば注射または注入を含む非経口投与によって投与し得る。投与は、好ましくは非経口的であり、例えば静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内経路である。
非経口投与に適する組成物は、通常、好ましくは受容者の血液と等張である、活性化合物の滅菌水性または非水性調製物を含む。適合性担体および溶媒の例は、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、通常は滅菌の、固定油が溶液または懸濁液の媒質として使用される。
本明細書で述べる作用物質および組成物は有効量で投与される。「有効量」は、単独でまたはさらなる投与物と共に所望の反応または所望の作用を達成する量を指す。特定の疾患または特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の進行の阻止に関する。これは、疾患の進行を遅らせること、特に疾患の進行を妨げるまたは逆転させることを含む。疾患または状態の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の防止であり得る。
本明細書で述べる作用物質または組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、患者の年齢、生理的状態、大きさおよび体重を含む患者の個別のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路および同様の因子に依存する。したがって、本明細書で述べる作用物質の投与される用量は、そのような様々なパラメータに依存し得る。患者における反応が初期用量で不十分である場合は、より高用量（または異なる、より限局された投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用し得る。
本明細書で述べる作用物質および組成物は、本明細書で述べるような様々な障害を治療または予防するために、例えばインビボで、患者に投与することができる。好ましい患者には、本明細書で述べる作用物質および組成物を投与することによって矯正または改善することができる障害を有するヒト患者が含まれる。これには、ＣＬＤＮ１８．２の変化した発現パターンを特徴とする細胞に関わる障害が含まれる。
例えば、１つの実施形態では、本明細書で述べる抗体は、癌疾患、例えばＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞の存在を特徴とする本明細書で述べるような癌疾患を有する患者を治療するために使用できる。
本発明に従う、前述した医薬組成物および治療の方法は、本明細書で述べる疾患を予防するための免疫またはワクチン接種にも使用し得る。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、それらは本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
［実施例１］
実験材料および方法
１．抗体
２．免疫組織化学（ＩＨＣ）
組織切片（厚さ４μｍ）を使用時まで２〜８℃で保存した。
脱パラフィン工程の前に、パラフィンを溶融し、水を定量的に除去するために、切片を乾燥炉において５８〜６０℃で１時間インキュベートし、それによりスライドガラスへの組織の接着を改善した（「焼付け」）。
脱パラフィン
溶融および乾燥後、２つのキシロール工程（５分）を用いてスライドガラスを脱パラフィンし、漸減アルコールアレイを用いて再水和した（２０〜２７℃の周囲温度で）：
・キシレン浴中に５（±１）分間；
・この工程を新鮮浴中で１回反復した；
・過剰の液体；
・絶対エタノール中に５（±１）分間；
・この工程を新鮮浴で１回反復；
・過剰の液体を除去；
・９６％エタノール中に５（±１）分間；
・この工程を新鮮浴で１回反復；
・過剰の液体を除去；
・８０％エタノール中に５（±１）分間；
・過剰の液体を除去；
・７０％エタノール中に５（±１）分間；
・過剰の液体を除去；
・蒸留水または脱イオン水中に５分間。
エピトープの回収およびクエンチング
パラフィン除去後、熱誘導エピトープ回収手順を用いて標的エピトープを回収した。そのため、スライドガラスを、回収緩衝液（１０ｍＭクエン酸緩衝液；０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０；ｐＨ６）２００ｍｌを満たした染色ジャーに入れ、プレッシャークッカー（ＰＡＳＣＡＬ，Ｄａｋｏ）中で１２０℃にて１０分間インキュベートした。その後ジャーをクッカーから取り出し、室温で１０（±１）分間、エピトープ回収溶液中で冷却させた。スライドガラスを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ）中で洗った。
冷却後、切片を、クエンチング溶液（１×ＰＢＳ中０．３％ペルオキシダーゼ）２００ｍｌを満たした染色ジャーに移し、室温で１５分間インキュベートして、次いで新鮮洗浄緩衝液中で２×５分間の洗浄工程に供した。
ブロッキングおよび抗体のインキュベーション
過剰の洗浄緩衝液を除去し、スライドガラスをブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中１０％ヤギ血清）２００μｌで覆って、室温で３０分間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、希釈抗体溶液（ブロッキング緩衝液中で希釈）２００μｌに交換した。スライドガラスを一次抗体と共に２〜８℃で一晩インキュベートした：
その翌日、一次抗体溶液を除去し、切片を洗浄緩衝液で３×５分間洗浄した。その後過剰の洗浄緩衝液を除去し、すぐに使用できる二次抗体溶液２００μｌを添加した（Ｐｏｗｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ ＨＲＰヤギα−マウス；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ；ＮＬ）。スライドガラスを室温で３０分間インキュベートした。過剰の液体を除去し、スライドガラスを新鮮洗浄緩衝液中で３×５分間洗浄した。
基質反応および対比染色
過剰の洗浄緩衝液の除去後、切片を、新鮮調製した基質−色原体溶液（ＶｅｃｔｏｒＲｅｄ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）約５０〜１５０μＬで２分間覆った。過剰の基質を除去し、スライドガラスをジャー中で脱イオン水と共に１〜５分間インキュベートした。
その後、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン２００ｍｌを含有するジャーに切片を２分間液浸することによって組織の対比染色を実施した。その後、核を青く染めるために切片を５〜１０分間水道水中に置いた。
脱水および封入
対比染色を実施した後、漸増アルコールアレイを用いて切片を脱水した：
・７０％エタノール中に浸漬（約５〜１０秒間）
・８０％エタノール中に浸漬（約５〜１０秒間）
・９６％エタノール中に浸漬（約５〜１０秒間）
・９６％エタノール中に浸漬（約５〜１０秒間）
・絶対エタノール中に浸漬（約５〜１０秒間）
・キシレン中に５分間
・キシレン中に５分間。
試料の封入のために非水性封入剤（Ｘ−ＴＲＡ−Ｋｉｔ，Ｍｅｄｉｔｅ）を使用した。スライドガラスを最後のキシレン充填ジャーから直接封入し、室温で空気乾燥した。
３．培養
本明細書で提示する実験のために使用するすべての膵癌細胞株および付加的な対照細胞株は、起源のデータシートに従い、標準的な組織培養手順によって培地中で培養する。条件を表４に要約する。すべての新たに得られた細胞株に関して、細胞をマイコプラスマ汚染に関して試験し、マスターセルバンクを調製した。
４．膵細胞株のルシフェラーゼトランスフェクション
ＡＤＣＣアッセイのために膵癌細胞株をルシフェラーゼＲＮＡで一過性にトランスフェクトした。このルシフェラーゼＲＮＡ（ｐＳＴ１−ｌｕｃ２ｍｕｔ−２ｈＢｇＵＴＲ−Ａ１２１−ＥｃｉＩベクター（ｐＳＴ１−１０９））をＡＲＣＡキャップと共に作製し、Ｈ２Ｏに溶解した。ＲＮＡを２２μｌアリコート中で−８０℃にて保存した。すべての膵細胞株に関して、最適電気穿孔条件を決定し、最も高いトランスフェクション率と細胞の生存能を生じさせた。各々のアッセイにおいて、細胞をＰＢＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡで分離し、Ｘ−Ｖｉｖｏ ２５０μｌ中に溶解した２．５×１０６細胞を氷冷キュベット中でＲＮＡ １０μｇと混合した。細胞を直ちに電気穿孔し（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ，Ｂｉｏｒａｄ）、あらかじめ温めておいたアッセイ培地中に再懸濁して、細胞を５×１０５細胞／ｍｌに調整した。試験した電気穿孔条件はすべての細胞株について以下のとおりであった：
ＥＰ１：２５０Ｖ、４７５μＦ
ＥＰ２：２００Ｖ、３００μＦ
ＥＰ３：１５０Ｖ、３００μＦ
ＥＰ４：２００Ｖ、４００μＦ
ＥＰ５：２５０Ｖ、９５０μＦ
対照：０Ｖ、０μＦ。
細胞の生存能を、電気穿孔後にＣＡＳＹを用いて直接決定するかまたはトリパンブルーで細胞を染色し、ノイバウアー室において死細胞のパーセンテージを測定することによって決定した。細胞を白色９６ウェルプレート（２．５×１０４細胞／ウェル）中に四つ組で接種し、２４時間インキュベートした。その後、ルシフェリン混合物の添加後にルシフェラーゼ活性をルミノメータ（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００）で９０分間測定した。ＲＬＵ値＞１．０００が得られた場合は、トランスフェクションは成功であり、その結果としてＡＤＣＣは測定可能であった。
５．定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）
膵癌細胞株からＲＮＡを単離するために、細胞を１０ｃｍ皿に接種し、８０％の集密度まで２〜３日間増殖させた。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて提供される指示に従ってＲＮＡを単離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて提供される製造者の指示に従ってｃＤＮＡの調製を実施した。ＲＮＡおよびｃＤＮＡ試料を−８０℃で保存した。
ＣＬＤＮ１８．２転写産物の定量的分析を、ＣＬＤＮ１８．１アイソフォームとＣＬＤＮ１８．２アイソフォームを識別するＰＣＲプライマーＮｏ．５０５４ｓ（５'−ＡＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＧＴＧ−３'）およびＮｏ．５０６０ａｓ（５'−ＣＣＡＧＡＡＧＴＴＡＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＴＴＧＧ−３'）を使用して、４０サイクルのＰＣＲ反応においてオリゴ（ｄＴ）でプライムしたｃＤＮＡを増幅することによって実施した。反応物を、二本鎖ＤＮＡにインターカレートするＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。反応および測定は、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍの装置およびソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。
ＣＬＤＮ１８転写産物の相対発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴに関してΔΔＣＴ計算を用いてコンピュータで算出した。
６．ウェスタンブロット分析
膵癌細胞株のタンパク質の単離のために、細胞を１０ｃｍ皿に接種し、８０％の集密度まで２〜３日間増殖させた。４×ＳＤＳ試料緩衝液（３４％グリシン、２５０ｍＭトリス ｐＨ６．８、５％β−メルカプトエタノール、８．２％ＳＤＳ）８００μｌを添加して細胞を溶解した。ゲノムＤＮＡを分解するため、タンパク質試料を以下の条件下で超音波処理した：出力制御：レベル１、デューティサイクル：２０〜２５秒間７０％。タンパク質濃度を分光光度計（２８０ｎｍでの吸収）で測定し、試料を使用時まで−８０℃で保存した。
ウェスタンブロット法においてＣＬＤＮ１８．２発現を検出するため、分離用の１２．５％ポリアクリルアミドゲル（２つの小さなゲルについて、２９：１ アクリルアミド／ビス−アクリルアミド４．１ｍｌ、１０％ＳＤＳ １００μｌ、トリス ｐＨ８．８ ２．５ｍｌ、Ｈ２Ｏ ３．２ｍｌ、ＡＰＳ １００μｌ、ＴＥＭＥＤ １０μｌ）を２つの固定したガラスプレートの間で調製した。重合後、ゲルを濃縮ゲル（２９：１ アクリルアミド／ビス−アクリルアミド１．５ｍｌ、１０％ＳＤＳ １００μｌ、トリス ｐＨ６．８ ２．５ｍｌ、Ｈ２Ｏ ５．８ｍｌ、ＡＰＳ １００μｌ、ＴＥＭＥＤ １０μｌ）と重ね合わせ、ゲルコームをガラスプレートの間に置いた。重合後、（１：２０の）４×ＳＤＳ試料緩衝液（トリス−ＨＣＬ ２５０ｍＭ、３４％グリセリン、８．２％ＳＤＳ、ｐＨ６．８）の添加によって調製した各タンパク質試料７５μｇおよびサイズマーカー混合物（ＳｅａＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ ６μｌと混合したＭａｇｉｃ Ｍａｒｋ ＸＰ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １．５μｌ）７．５μｌをゲルに付加した。ゲルを１×ＳＤＳ泳動緩衝液（２５ｍＭトリス、０．１９２Ｍグリシン、０．１％ＳＤＳ）中で８０Ｖにて３０分間および１８０Ｖにて６０分間泳動させた。ニトロセルロース膜上のゲルのセミドライブロッティングを、１×転移緩衝液（２５ｍＭトリス、０．１９２ｍＭグリシン、２０％ＭｅＯＨ）中で１６０ｍＡにて９０分間実施した。ブロットを最初に５％粉乳／ＰＢＳ中でブロックし、一次抗体（０．２５μｇ／ｍｌ抗クローディン１８（Ｃ末端）または０．１μｇ／ｍｌ抗β−アクチン）を１％粉乳／ＰＢＳの溶液に添加した。ブロットを４℃で一晩インキュベートし、１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で１０分間ずつ３回洗浄して、次に１％粉乳／ＰＢＳ中で室温にて標識二次抗体（１：１０００希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＦＣ））と共に１時間インキュベートした。ブロットを再び１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で１０分間ずつ３回洗浄し、検出溶液（Ｐｉｃｏ ａｎｄ Ｄｕｒａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｉｅｒｃｅ））１〜３ｍｌの１分間の添加、およびＧＡ＿０５６＿Ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｚｅｎｚｅｎｔｗｉｃｋｌｅｒ ＬＡＳ３０００に従うＬＡＳ−３０００検出ボックス（増分：１０秒、時間間隔：１０秒、感度：高）におけるブロットのスキャニングにより、検出を実施した。
７．フローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）
細胞を、ＰＢＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡまたはトリプシン／ＥＤＴＡを用いて７０〜８５％集密度の指数増殖中の培養物から採取した。細胞を計数し、５分間遠心分離して（４６８ｇ）、ペレットをＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＣＳ、０．１％アジ化ナトリウム）中に再懸濁し、濃度を２×１０６／ｍｌに調整した。細胞１００μｌを丸底９６ウェルプレートに塗布し、再び遠心分離した（５分間、４６８ｇ）。ＩＭＡＢ３６２（またはアイソタイプ対照リツキシマブ）をＦＡＣＳ緩衝液５０μｌ中で０．１〜２００μｇ／ｍｌ（１１希釈段階＋抗体なし対照）に段階希釈し、４℃で３０分間細胞に添加した。次に、ＦＡＣＳ緩衝液２００μｌを各ウェルに添加し、プレートを遠心分離した（５分間、４６８ｇ）。上清を取り、洗浄を繰り返した。二次ヤギ抗ヒト抗体（ＦＣ特異的、ＡＰＣと結合したＦ（ａｂ'）２（Ｄｉａｎｏｖａ））をＦＡＣＳ緩衝液中に希釈し（１：１００）、３０μｌを各ウェルに添加した。プレートを４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを再びＦＡＣＳ緩衝液２００μｌで２回洗浄し、ペレットを、ＧＡ＿０１８＿ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｒａｙバイオアナライザに従ってＦＡＣＳ Ａｒｒａｙ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ）測定のために最終的にＦＡＣＳ緩衝液１００μｌに再懸濁した。
８．レンチウイルス形質導入
レンチウイルスベクターの構築：レンチウイルスは、***細胞と非***細胞の両方のヒトゲノムＤＮＡに安定に組み込まれる、ＲＮＡウイルスに属する。ベクターｐＬｅｎｔｉ６．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を骨格として使用した。前記ベクターは、確実に形質導入された細胞の選択のためにブラスチシジン遺伝子を含む。ＥＦ１αプロモーターに融合したＣＬＤＮ１８．２をベクターの組換え領域にクローニングし、ｐＬ６４Ｂ４２Ｅ（ＥＦ１α−ｈクローディン１８．２）−ブラスチシジンを作製した（図１）。
細胞株の選択：細胞株を文献データに従って、またはそれまでにインビボで試験されたデータに従って選択した。選択基準には、ヌードマウスにおける均一な皮下増殖および２０〜１００日間の治療ウィンドウが含まれた。既にＣＬＤＮ１８．２ ｍＲＮＡの弱い発現を示した３つの細胞株（ＤＡＮＧ、ＹＡＰＣおよびＢｘＰＣ３）および文献によれば転移することができる３つの細胞株（ＭｉａＰａＣａ−２、Ｐａｔｕ８９０２およびＳｕｉｔ−２）を組み込んだ。２つの他の細胞株（インビボで均一な皮下腫瘍として増殖することが公知）をランダムに選択した（ＨＰＡＣ、ＣＡＰＡＮ１）。
ブラスチシジン選択条件の決定：すべての細胞株に関して、形質導入を実施する前に、レンチウイルス形質導入後の細胞の選択に必要なブラスチシジン濃度を決定した。膵癌細胞を６ウェルプレートに高密度で接種し、２４時間後に８０〜９０％集密度を生じさせた。ブラスチシジン（原液：１０ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、０．５〜１２μｇ／ｍｌ（５希釈段階＋ブラスチシジンなし対照）の範囲の漸増濃度でウェルに添加した。３〜４日ごとに培地を交換し、細胞を顕微鏡で分析した後、培地を除去した。死細胞の量および生細胞の状態を記録した。細胞を１４日間培養した。１４日後に１００％のアポトーシス細胞を生じさせる最小ブラスチシジン濃度がレンチウイルス形質導入細胞の選択のために好ましかった。確立されたＬＶＴ細胞株の各々について必要なブラスチシジン濃度を表４に示す。
エンベロープの選択：レンチウイルス形質導入のために、ＧＦＰ−レンチウイルス対照ベクターｐＬ６４Ｂ４２Ｅ−（ＥＦ１ａ−ＧＦＰ）−ブラスチシジンを種々のエンベロープ粒子（ＶＳＶ−Ｇ、ＧＡＬＶ、ＲＤ１１４、Ｍｏｋｏｌａ−ＧおよびＲａｂｉｅｓ−Ｇ）にパッケージングした。エンベロープ中に存在するタンパク質および細胞膜の組成物に依存して、標的癌細胞への付着はおおむね効率的である。すべての膵癌細胞株に関して、ＶＳＶ−Ｇエンベロープは最も高い形質導入効率を示した（６８．５〜９１．２％）（表５）。その結果、ＣＬＤＮ１８．２発現ベクターｐＬ６４Ｂ４２Ｅ（ＥＦ１α−ｈクローディン１８．２）−ブラスチシジンをＶＳＶ−Ｇエンベロープにパッケージングした。プロデューサー細胞を感染させ、ウイルスを高力価（３．８６×１０７粒子／ｍｌ）で培地から単離した。ウイルス上清を−８０℃で保存した。
膵癌細胞株のレンチウイルス形質導入：膵癌標的細胞株の感染のために、２４ウェルプレートを１×レトロネクチン（登録商標）（２０μｇ／ｍｌ、Ｔａｋａｒａ Ｉｎｃ．）２００μｌで被覆し、プレートをパラフィルム（登録商標）で密封して、４℃で３〜１６時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ ２００ｍｌで洗浄し、ＰＢＳ／２％ＢＳＡで室温にて３０分間ブロックした。プレートを再び洗浄し、１５℃にて２５００ｒｐｍで２５分間の遠心分離によってウイルス上清３００μｌを負荷した。上清を除去し、負荷を３回反復した。プレートを最後にＰＢＳで１回洗浄し、低継代の標的細胞を各ウェルに接種した。すべての膵癌細胞株に関して、２４ウェルにつき５×１０５〜１×１０７細胞を接種した。プレートを３７℃で２日間インキュベートした。その後細胞を分離し、ＦＩＴＣ標識ＩＭＡＢ３６２抗体を使用してＦＡＣＳによって形質導入効率を決定した。細胞を増殖させ、マスターセルバンクを各細胞株について調製した。
９．ＡＤＣＣアッセイ
膵癌標的細胞を２日前にフラスコに接種し、ＡＤＣＣを開始する日に８０〜９０％集密培養物を得た。膵癌細胞をルシフェラーゼＲＮＡでトランスフェクトし、アッセイ培地（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加した表４に記載する培地）５０μｌ中１×１０４細胞／ウェルの密度で白色９６ウェルプレートに接種した。加えて、ＮＵＧＣ−４ ｓｕｂ １０ｃＨ１１ ｓｕｂＥ１０ Ｌｕｃｉ＃２細胞（８０００細胞／ウェル）をすべてのアッセイにおいて陽性対照として接種した。細胞を４〜６時間培養した後、抗体および精製ＰＢＭＣを添加した。
ＰＢＭＣを、健常ドナーから得た新鮮ヒト軟膜から調製した。約３×２０〜２５ｍｌ血液をＰＢＳで希釈し（１：２）、５０ｍｌファルコンチューブ内で４×１５ｍｌのＦｉｃｏｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に注意深く載せた。勾配を遠心分離した（２５分間、７００ｇ）。遠心分離後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を相間から収集し、ＰＢＳ／２ｍＭ ＥＤＴＡ中で洗浄して、遠心分離し（５分間、４６８ｇ）、再びＰＢＳ／２ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁して、遠心分離し（１０分間、２０８ｇ）、血小板を除去した。ペレットをＰＢＳ／２ｍＭ ＥＤＴＡ ５０ｍｌに再懸濁し、細胞を計数した。ＰＢＭＣを遠心分離し（５分間、４６８ｇ）、膵細胞への添加用には１．６×１０７細胞／ｍｌの濃度でおよびＮＵＧＣ−４ ｓｕｂ １０ｃＨ１１ ｓｕｂＥ１０ Ｌｕｃｉ＃２細胞への添加用には１．２８×１０７細胞／ｍｌの濃度でＸ−Ｖｉｖｏ−１５培地に再懸濁した。
抗体（ＩＭＡＢ３６２およびアイソタイプ対照抗体ｃｈ７８Ｈ１１ １Ｈ６）を１０回段階希釈し（４．５倍）、２００μｇ／ｍｌ〜０．２６ｎｇ／ｍｌの濃度範囲を生じさせた。各々の希釈物のうち２５μｌを四つ組で標的細胞に添加した。抗体を含まないＰＢＳを培地および溶解対照ウェルに添加した。その後、ＰＢＭＣ ２５μｌを各ウェルに添加し（Ｅ：Ｔ比＝４０：１）、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間±１時間インキュベートした。
翌日、８％トリトンＸ１００／ＰＢＳ溶液１０μｌを溶解対照ウェルに添加し、他のすべてのウェルにはＰＢＳ １０μｌを添加した。最後に、新鮮調製したルシフェリン原液５０μｌ（１６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１×ＰＢＳ、３．８４ｍｇ／ｍｌ Ｄ−ルシフェリン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を各ウェルに添加し、プレートを暗所で室温にて８０分間インキュベートした。生細胞のルシフェラーゼによるルシファーイエローの酸化から生じるルミネセンスを、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００，Ｔｅｃａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定した。細胞傷害のパーセンテージを、以下の式：
を用いて計算した。
１０．ＣＤＣ
ＣＤＣを以下のように実施した。
標的細胞（ＣＨＯ−Ｋ１ ｐ７４０ ＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ（２４Ｈ５）ｐ３１５１ Ｌｕｃｉ＃２Ａ５）を９６ウェル白色アッセイプレート中のアッセイ培地５０μｌに接種し（１０，０００細胞／ウェル）、３７℃、７．５％ＣＯ２および９５％相対湿度で２４時間＋２０分間増殖させた後、試料を添加した。各々の９６ウェルアッセイプレートは、３つの異なる陰性対照（熱不活性化血清、ＩＭＡＢ３６２を含む血清と含まない血清およびアイソタイプ対照抗体（リツキシマブ）を含む血清）ならびに５００ｎｇ／ｍｌ ＩＭＡＢ３６２を含む健常ヒト血清プール（ロット番号３１０３２０１１）の陽性対照の総数を含んだ。２番目の培地対照ウェルに０．８％トリトンＸ１００を添加して全溶解を生じさせることにより、付加的な陽性対照を反応の終了時に生成した。９６ウェルアッセイプレートの１つは、ＩＭＡＢ３６２の７回の段階的３．１６倍希釈（１００００〜３１．８ｎｇ／ｍｌ）によって生成した機能的陽性対照を含んだ。この対照は、標的細胞のＳ字状用量依存性溶解をもたらした。すべての試料を９６ウェルのディープウェル希釈プレート中で同時に調製した（それぞれ２００μｌ）。試料をリバースピペッティングによって各ウェルから３回採取し、アッセイプレート中で三つ組みを生成した。各試験物および対照物５０μｌをアッセイプレートに添加した後、プレートを３７℃、７．５％ＣＯ２および９５％相対湿度で８０＋５分間インキュベートした。
トリトン溶解対照ウェルを除き、各ウェルにＰＢＳ １０μｌを添加した。各々のトリトン溶解対照ウェルには、０．８％トリトン／ＰＢＳ溶液１０μｌを添加した。ルシフェリン基質溶液を調製した（Ａｑｕａ ｂｉｄｅｓｔ ６１１４μｌ、ＨＥＰＥＳ（１Ｍ）２４９６μｌ、１×ＤＰＢＳ １９９８μｌ、Ｄ−ルシフェリン原液（１２ｍｇ／ｍｌ））４９９２μｌ）。各ウェルにルシフェリン基質溶液５０μｌを添加した。プレートを３７℃、７．５％ＣＯ２および９５％相対湿度で４５分間インキュベートした。プレートをマイクロプレートリーダーで測定する。
・補体依存性溶解を、式：
を用いて計算した。
膵癌細胞株を試験するための変更：
・膵癌細胞を、最適化条件を用いてルシフェラーゼＲＮＡでトランスフェクトした。試験した各細胞株について、各ウェルにつき１．５×１０４細胞を接種した。
・大部分の膵癌細胞株は、分離し、単一化することが困難であるので、１日目にトリプシンを使用した。
・アッセイプレート中の膵癌細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
・化学療法剤で前処理した細胞に関するＣＤＣアッセイを以下のＩＭＡＢ３６２濃度またはアイソタイプ対照抗体としてのｃｈ７８Ｈ１１ １Ｈ６抗体濃度で実施した：６４００００、１６００００、４００００、１００００、２５００、６２５、１５６および３９ｎｇ／ｍｌ。
１１．増殖の阻害
各化学療法剤の用量反応曲線を分析するため、増殖アッセイを実施した。
細胞を９６ウェルプレートに接種し、４〜６時間後にゲムシタビンまたはオキサリプラチンを以下の濃度で添加した：１０００、５００、２５０、１００および２０ｎｇ／ｍｌ。増殖アッセイを３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートした。ＸＴＴ完全試薬（ＸＴＴ ５０部＋カップリング試薬 １部の割合で混合）５０μｌを添加し、３７℃でインキュベートした。吸光度（細胞＋上清）の測定を３時間後と４時間後にＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅで行った。１００％と設定した中央値と比較して増殖の阻害を計算した。ゲムシタビンおよびオキサリプラチンについてのＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍプログラムで計算した。
１２．ＡＤＣＣまたはＣＤＣのための化学療法剤と膵癌細胞株の培養
ＤＡＮＧ ４〜６Ｅ＋０６に関しては、細胞を接種し、培地中または培地＋１ｎｇ／ｍｌゲムシタビンもしくは１ｎｇ／ｍｌゲムシタビン＋１０ｎｇ／ｍｌオキサリプラチン中で２日間培養した。１〜１．４Ｅ＋０７ Ｐａｔｕ８９８８Ｓを接種し、１０ｎｇ／ｍｌゲムシタビンなしまたはこれと共に、もしくはオキサリプラチン１００ｎｇ／ｍｌと組み合わせた１０ｎｇ／ｍｌゲムシタビンと共に、またはこれらなしで培養した。
ＡＤＣＣを開始する日に、上述したプロトコルに従い、ＣＬＤＮ１８の細胞表面発現を上述したようにＦＡＣＳ分析において決定した。
１３．細胞周期分析
細胞を６ウェルプレートに塗布し、５〜６時間後に化学療法剤を２４時間、４８時間または３日間添加した。培地中に浮遊する細胞を接着細胞層と合わせ、これをトリプシン処理した。細胞を洗浄した。細胞周期分析を直接開始するか、または事前に上述したように細胞表面染色を行った。細胞をＰＢＳ １ｍｌに再懸濁し、４％ＰＦＡ ３ｍｌに添加する。細胞を室温で１５分間固定した後、細胞をペレット化し、洗浄する。ＲＮアーゼ処理のために細胞をＲＮアーゼ（１００００Ｕ／ｍｌ）プラス０．０５％トリトンＸ−１００ ２００μｌに再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ １ｍｌを添加し、試料を遠心分離して、ＰＢＳ／ＰＪ ５０μｇ／ｍｌ ２００μｌに再懸濁した。少なくとも３０分後、試料はフローサイトメトリによって分析する準備ができた。ＤＮＡ含量ヒストグラムを分析するＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて細胞周期分布を決定した。
１４．アポトーシスアッセイ
指示されている処理後、アポトーシスを、製造者（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって推奨されるようにアネキシンＶ結合によって（検出キットＩ）またはＤＮＡ断片化アッセイによって（Ａｐｏ−Ｄｉｒｅｃｔ）測定した。簡単に述べると、上清中に浮遊する細胞を接着画分と合わせ、これをトリプシン処理して、その後洗浄した。５Ｅ＋０５細胞のアリコートをアネキシンＶ−ＡＰＣおよびＰＩと共に暗所で室温にて１５分間インキュベートした。細胞を直ちにフローサイトメトリによって分析した。生細胞はアネキシンＶ−ＡＰＣおよびＰＩの両方を排除する。初期アポトーシス細胞はアネキシンＶ−ＡＰＣ陽性およびＰＩ陰性であるが、アポトーシスまたは壊死性細胞死のためにもはや生存可能でない細胞はアネキシンＶおよびＰＩの両方によって陽性染色される。各象限内の染色細胞のパーセンテージを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いて定量化した。
ＤＮＡ断片化に基づくアポトーシスアッセイを以下のように実施した。処理した細胞（接着および浮遊）を７０％氷冷ＥｔＯＨ中で一晩固定した。洗浄後、１０６固定細胞をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素（ＴｄＴ）およびＦＩＴＣ−ｄＵＴＰと共に３７℃で９０分間インキュベートし、ＤＮＡ断片を標識した。細胞を洗浄し、暗所で室温にて３０分間、ＲＮアーゼＡ／ヨウ化プロピジウム中でインキュベートして、全ＤＮＡを染色し、その後フローサイトメトリによって分析した。細胞ダブレットおよびクランプをゲーティングによって分析から除外した。
１５．インビボ試験
すべてのインビボ実験は、実験動物試験に関する国の規制および倫理指針に従って実施した。
１５．１ 異種移植片の処置
異種移植腫瘍を、雌性Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスの側腹部への、ＰＢＳ ２００μｌ中の腫瘍細胞の皮下注射によって接種した。腫瘍担持マウスを、０μｇ、２００μｇ、４００μｇまたは８００μｇ抗体を週１回ｉ．ｖ．注射するかまたは週２回交互にｉ．ｖ．／ｉ．ｐ．注射して処置した。化学療法剤を週１回または週２回ｉ．ｐ．適用した。腫瘍サイズと動物の健康状態を週２回観測した。化学療法処置の終了時に、腫瘍が＞１４００ｍｍ３の体積に達するかまたは腫瘍が潰瘍性になるまで抗体適用を続けた。腫瘍試料を、その後の分析のために凍結保存するかまたは４％ホルマリンに固定した。
１５．２ 転移アッセイ
種々の膵癌細胞株を、最初に、ヌードマウスにおいて細胞のｉ．ｖ．適用後に転移を形成するその能力に関して分析した。これらの生着分析のために、５〜１０匹のマウスの群に１×１０６細胞および／または２×１０６細胞を注射し、転移生着および成長の時点を見出すために種々の時点で１匹のマウスを犠死させた。
転移処置を各処置群につき１０〜１２匹のＨｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスに関して実施した。これらのマウスに２×１０６細胞（Ｐａｔｕ８９８８ＳまたはＳｕｉｔ２−ＬＶＴ）を静脈内注射した。転移疾患の最初の症状（体重減少、衰弱、息切れ）が現れるかまたは最初のマウスが死亡するとすぐに、すべてのマウスを同時点で犠死させた。
組織の調製：生着試験のために、種々の時点でまたはマウスが転移性疾患の明らかな生理的徴候（体重減少、衰弱、息切れ）を示すとすぐに、マウスを犠死させた。マウスのすべての器官を転移に関して肉眼で分析した。Ｐａｔｕ８９８８Ｓ細胞およびＳｕｉｔ−２細胞に関してのみ、肺および肺／肝臓がそれぞれ肉眼で見える転移を示した。これらの器官を４つの等しい小片に切断し、２つ（肺：右上葉および左下葉）をゲノムＤＮＡ単離のために保存した。その他の２つの小片はホルマリン固定し、ＩＨＣ分析のために保存した（図２）。
ゲノムＤＮＡの調製およびＱ−ＰＣＲ方法：ゲノムＤＮＡを肺または肝組織から抽出した。対照として、ヒト膵癌細胞Ｐａｔｕ８９８８ＳからもゲノムＤＮＡを単離し、ならびに注射していない陰性対照マウスのゲノムＤＮＡも単離した。
Ｑ−ＰＣＲ方法は、転移内に存在するヒトＤＮＡの増幅に基づく。マウス肺試料中のヒトＤＮＡの相対検出レベルは転移の量および／または大きさと直接相関する。この方法は、転移が肺の中で均一に拡大せず、時として１つの肺葉がその他の肺葉より強く侵襲されるという事実によってバイアスを受けるので、肺の２つの異なる領域を１つのＤＮＡ調製物中で混合した（図２）。
Ｑ−ＰＣＲ反応を、ヒト第１７番染色体中に存在するがマウスＤＮＡには存在しないα−サテライトＤＮＡを特異的に増幅するプライマー対、Ｎｏ．５８６１ ５'−ＧＧＧＡＴＡＡＴＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＡＣＡＧ−３'およびＮｏ．５８６２ ５'−ＴＴＣＣＧＴＴＴＡＧＴＴＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣ−３'を用いて実施した。標準曲線を作成するためおよび陽性対照として、Ｐａｔｕ８９８８Ｓ ＤＮＡをマウスＤＮＡと混合し、５倍希釈を調製して、マウスＤＮＡ中１００％、２０％、４％、０．８％、０．１６％、０．０３２％および０．００６４％ヒトＤＮＡとした。この曲線を使用して、マウス肺組織中に存在するヒト転移ＤＮＡの量を計算した（線形回帰）。Ｑ−ＰＣＲ反応を、マウス肺ＤＮＡ ２０μｌ（２００ｎｇ）、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ）２５μｌ、センスプライマー（１０μＭ）１．６μｌおよびアンチセンスプライマー１．６μｌならびにＨ２Ｏ １．８μｌから成る最終容量５０μｌ中で実施した。
［実施例２］
正常および腫瘍性ヒト膵組織におけるＣＬＤＮ１８．２発現
正常および膵腫瘍組織におけるＣＬＤＮ１８．２の発現レベルおよびパターンを分析するため、ＦＦＰＥ切片の組織学的染色を、２つのマウスモノクローナル抗体試薬を用いて実施した（図３）。
予備パイロット実験を、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）上でプロトタイプ抗体３５−２２Ａを使用することによって実施した。ＴＭＡの主要な難点は、スポットした組織の質の変動性および試料の小さなサイズ、したがって試料の特徴を代表しないことである。これが十分に最適化されない染色プロトコルと一緒になって、陽性症例の過小評価をもたらした可能性がある。
主実験は抗体４３−１４Ａを用いて実施した。これらの染色を、（ＴＭＡと比較して）より大きい、腫瘍細胞の存在に関して前評価した組織切片に関して実施した。
膵管から発生する前癌性病変を国際膵上皮内腫瘍（ｐａｎｃｒｅａｓ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ（ＰａｎＩＮ）システム（ＰａｎＩＮ−１Ａ、ＰａｎＩＮ−１Ｂ、ＰａｎＩＮ−２、ＰａｎＩＮ−３サブタイプ）に従って順位付けることができる。
ＰａｎＩＮ−１病変（図４Ａ）は、扁平で、丈の高い円柱状細胞から成り、基底部に局在する核および豊富な核上ムチンを有する。核は小さく、円形から楕円形の形状で、基底膜に対して垂直方向である。非腫瘍性の扁平な過形成病変と異型性を伴わない扁平な腫瘍性病変との間には組織学的重複が存在する。
ＰａｎＩＮ−１Ｂサブタイプの病変は、乳頭状、微小乳頭状または基底部に偽重層化した構造を有し、その他の点ではＰａｎＩＮ−１Ａと同じである（Ｈｒｕｂａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ．２００１ Ｍａｙ；２５（５）：５７９−８６．）。
ＰａｎＩＮ−２病変（図４Ｂ）は、扁平または乳頭状であり、極性の多少の喪失、核の密集、拡大した核、偽層化および過染色性を含む、典型的な核異常を有する。有糸***はまれであるが、存在する場合は非管腔（頂端でない）であり、異型ではない（Ｈｒｕｂａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ．２００１ Ｍａｙ；２５（５）：５７９−８６）。
ＰａｎＩＮ−３病変（図４Ｃ）は、通常は乳頭状または微小乳頭状であるが、まれに扁平であり得る。真性の篩状の、上皮細胞の小さなクラスターの管腔内への出芽および管腔壊死はＰａｎＩＮ−３の診断を示唆する。病変は、核の極性喪失、異栄養性杯細胞（管腔に向かう核と基底膜に向かう粘液性細胞質を有する杯細胞）、時として異常であり得る有糸***、核の不規則性および顕著な（マクロ）核小体を特徴とする（Ｈｒｕｂａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ．２００１ Ｍａｙ；２５（５）：５７９−８６）。
前癌性組織におけるＣＬＤＮ１８．２の発現を、様々な供給源の組織試料を使用して４３−１４Ａ抗体を用いて分析した。
ＣＬＤＮ１８．２は、ＰａｎＩＮ−１、ＰａｎＩＮ−２およびＰａｎＩＮ−３サブタイプのＰａｎＩＮ構造においてしばしば検出され、前癌性病変におけるＣＬＤＮ１８．２の早期発現を明らかにし（図４）、これは後期段階で保存される。これに対し、膵臓の管構造を含む正常膵組織試料中では発現を認めなかった。
結論として、ＣＬＤＮ１８．２は、膵管における初期悪性組織学的変化の早期マーカーである。
原発膵癌におけるＣＬＤＮ１８．２の発現を評価するために２つの試験を実施した。パイロット試験のために合計１４１の原発膵癌症例に関するいくつかのＴＭＡをモノクローナルＣＬＤＮ１８．２特異的抗体３５−２２Ａで染色した。分析したＴＭＡの全体的な質は満足のいかないものであった。多くのスポットが回収の間に部分的に失われ、ヘマトキシリンでの不均一な対比染色は、ＦＦＰＥ組織の最適以下の組織処理を示唆した。
全体として染色症例の＞４８．９％がＣＬＤＮ１８．２に対して陽性であり、膵管腺癌の４９．２％（６５／１３２）、腺房細胞癌の５０％（１／２）および７例の神経内分泌癌のうち３例が含まれた（表７）。腫瘍細胞膜を他の細胞型に関するバックグラウンドなしで染色した（図６）。
さらに、本発明者らは、ＣＬＤＮ１８．２発現の強度と腫瘍内の染色腫瘍細胞の割合との間に相関を認めた（表８、図５）。


２番目の試験は、品質管理組織切片を使用して高感受性抗体４３−１４Ａに関して最適化染色プロトコルで実施した。
合計で４２の原発膵管癌試料を分析した。これらの約９０％（４２例のうち３８例）はＣＬＤＮ１８．２に関して陽性であり（表１０）、その大部分（＞６０％）が＋＋＋の強いシグナル強度を示した（図７、表１１）。ここでもＣＬＤＮ１８．２発現レベルと陽性腫瘍細胞の割合との間に相関が認められた。分析した症例の大部分（６２％）がグレード３の腫瘍であった（表１２）。

膵癌は、大部分の患者において進行した病期で診断される。患者の腫瘍は既にリンパ節および他の器官、特に肝臓に転移している。主試験では、ＣＬＤＮ１８．２特異的４３−１４Ａ抗体を使用して、膵癌のリンパ節および肝転移の７９のＦＦＰＥ組織試料を免疫組織化学アッセイにおいて分析した。
リンパ節転移の７０．５％（３１／４４症例）および遠隔肝転移の６８．６％（２４／３５症例）は、ＣＬＤＮ１８．２に関する明確な腫瘍細胞染色を示した（表１３）。陽性腫瘍細胞の染色パターンは膜型であり、一部の症例では付加的なより弱い細胞質シグナルを伴った（図９）。原発腫瘍分析の結果と一致して、転移試料においてＣＬＤＮ１８．２発現レベルとＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍細胞の割合との間に相関が認められた（図８）。
分析した腫瘍のグレードとＣＬＤＮ１８．２の発現レベルまたは陽性腫瘍細胞の割合との間に相関は見出せなかった。
陽性原発腫瘍症例のＣＬＤＮ１８．２発現が同じ患者の転移において保存されているかどうかを試験するため、マッチする原発癌／リンパ節転移のダブレットを、抗体４３−１４Ａを用いてスクリーニングした。
２７の分析した対症例のうち２５例（９２．５％）において、原発性腫瘍とリンパ節転移対の両方がＣＬＤＮ１８．２に関して陽性であった。１症例では両方の組織が陰性であり、他の１例では原発性腫瘍はＣＬＤＮ１８．２陽性であったが、転移は陰性であった。
２６の陽性試験ダブレットのうち２１（８０．７％）において、原発性腫瘍細胞と転移性腫瘍細胞シグナル強度は同じであった。５例では、シグナル強度は＋＋＋から＋＋に低下した。
２５の対組織のうち１１（４４％）において、陽性腫瘍細胞の数は、原発性腫瘍と比較して転移ではより低かった（表１４）。
要約すると、原発性腫瘍細胞が転移段階へと進行する場合、ＣＬＤＮ１８．２発現は保存されると思われる。リンパ節転移における全体的な強度および陽性腫瘍細胞の割合は、原発性腫瘍と比較してわずかだけ低かった（図１０）。
原発性腫瘍に由来する少数の患者組織試料に関して、リンパ節転移および肝転移が入手可能であった。これらのマッチするトリプレットを、遠隔転移におけるＣＬＤＮ１８．２発現の保存を調べるために染色した。６つのマッチするトリプレットを抗体４３−１４Ａを用いて分析した。
６つのトリプレットのうち３つでは、３つの組織標本すべてがＣＬＤＮ１８．２についての陽性スコアに関して同等であった（図１１）。３症例では、原発性病変において腫瘍細胞の一部がＣＬＤＮ１８．２陽性であったが、転移性病変はＣＬＤＮ１８．２染色を示さなかった（表１５）。
［実施例３］
インビトロおよびインビボモデルならびに膵癌モデルのために使用したヒト膵癌細胞株における標的発現
細胞株の供給源
この前臨床評価試験の主要目的は、適切なモデル系においてＩＭＡＢ３６２処置の阻害作用を分析することであった。ＩＭＡＢ３６２作用のインビトロおよびインビボ特性付けに使用できるＣＬＤＮ１８．２陽性細胞株を同定するため、２６の市販の膵癌細胞株のセットをＣＬＤＮ１８．２発現に関してスクリーニングし、詳細に特性付けた。実験的使用のためのセルバンクを、各々の細胞株について到着後直ちに調製した。これらは、原発性膵腺癌（１０、そのうち６は粘液性腺癌）、原発癌（４）、肝臓（５）もしくは脾臓（１）への膵腺癌転移に由来するか、または腹水（５）から単離された（表１６参照）。これらの細胞株のいくつか（８）は、ＣＬＤＮ１８．２を発現するようにレンチウイルスで形質導入された。
ヒト膵癌細胞株におけるＣＬＤＮ１８．２転写産物発現
ＣＬＤＮ１８．２を発現する膵細胞株を同定するため、ＣＬＤＮ１８．２のエクソン１に結合する正プライマーおよびＣＬＤＮ１８のエクソン３に結合する逆プライマーを使用して、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）で転写産物レベルを測定した。内因性にＣＬＤＮ１８．２を発現するヒト胃癌細胞株ＫＡＴＯ−ＩＩＩおよびＣＬＤＮ１８．２陰性乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３を、それぞれ陽性対照および陰性対照として含めた。ＲＴ−ＰＣＲは、膵癌細胞株ＤＡＮＧ、Ｐａｎｃ０３．２７、Ｐａｎｃ０５．０４、Ｐａｔｕ８９８８ＳおよびＹＡＰＣにおいて１×１０５を超える相対レベルで明確な内因性ＣＬＤＮ１８．２発現を明らかにした。興味深いことに、Ｐａｔｕ８９８８Ｓ細胞は、胃癌ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞と同等のＣＬＤＮ１８．２発現レベル（約１×１０８）を示した（図１２Ａ）。結論として、本発明者らは、２２の膵癌細胞株のうち５つにおいて堅固なＣＬＤＮ１８．２発現を検出した。
内因性細胞株に加えて、ＣＬＤＮ１８．２を異所性に発現するＬＶＴ細胞株を転写産物レベルに関して分析した（図１２Ａ）。８つのＬＶＴ細胞株のうち６つに関して、１×１０８を上回る相対的ＣＬＤＮ１８．２発現レベルを検出した。ＨＡＰＣ−ＬＶＴおよびＳｕｉｔ２−ＬＶＴ細胞においてのみ、発現レベルは１×１０５より上であった。
本発明者らは、ＣＬＤＮ１８．２発現がインビトロ培養の間安定であるかどうかを検討した。Ｐａｔｕ８９８８Ｓ、Ｐａｎｃ０５．０４細胞およびレンチウイルス形質導入細胞株Ｓｕｉｔ２−ＬＶＴ、ＭｉａＰａＣａ２−ＬＶＴおよびＰａｔｕ８９０２−ＬＶＴを１５回まで継代し、ＣＬＤＮ１８．２転写産物を分析した（図１２Ｂ〜Ｄ）。本発明者らは、継代数が高くなると共に内因性細胞と形質導入細胞の両方においてＣＬＤＮ１８．２発現の喪失を認めた。発現の喪失は形質導入細胞において最も高かった。そのため、インビトロ実験には可能な限り初期継代を使用し、腫瘍異種移植片におけるＣＬＤＮ１８．２の発現を以下の生着実験において確認した。
ヒト膵癌細胞株におけるＣＬＤＮ１８．２タンパク質発現
全細胞溶解物におけるＣＬＤＮ１８．２の検出
転写産物分析に加えて、ＣＬＤＮ１８．２の発現をウェスタンブロット法とＩＦによってタンパク質レベルで分析した。ウェスタンブロット分析のために、２６の膵癌細胞株の細胞溶解物を、ＣＬＤＮ１８特異的抗体、抗クローディン１８（Ｃ末端）を用いてウェスタンブロット法（ＷＢ）によって検討した。ＳＫＢＲ−３細胞の溶解物を再び陰性対照として使用し、ＣＬＤＮ１８．２で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の溶解物（ＨＥＫ２９３−ｐ７４０）を陽性対照として使用した。ここで、本発明者らはＰａｔｕ８９８８Ｓ、ＤＡＮＧおよびＰａｎｃ０５．０４細胞における高タンパク質発現を検出し、ＲＮＡデータを確認した。Ｐａｎｃ０３．２７およびＢｘＰＣ３細胞溶解物においてかすかなバンドが検出可能であった。ＲＮＡレベルで陽性と同定されたＹＡＰＣ細胞は、ウェスタンブロット法ではより小さなサイズのかすかなバンドを示した。他のすべての細胞株は陰性であった（図１３）。
膵癌細胞におけるＣＬＤＮ１８の細胞発現
裏付けとなるタンパク質発現データを得るため、細胞の固定および透過処理後に、検出のために抗体３５−２２Ａを使用して、膵癌細胞株を免疫蛍光法（ＩＦ）によって検討した。ＩＦ分析は、先のＲＮＡおよびタンパク質データを確認し、大部分の膵癌細胞株がＣＬＤＮ１８．２染色に関して陰性であることを示した（図１４）。少数の細胞株（ＡｓＰＣ１、ＤＡＮＧ、ＨＵＰ−Ｔ３、ＨＵＰ−Ｔ４、Ｐａｎｃ０１など）において核ドットを認め、これはおそらく染色による人為的産物である。ＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルで低いＣＬＤＮ１８．２を特徴とすると同定されたＤＡＮＧ、Ｐａｎｃ０３．２７およびＢｘＰＣ３細胞は、より低い検出感度を有するＩＦ分析では陰性であった。これに対し、Ｐａｎｃ０５．０４、Ｐａｔｕ８９８８ＳおよびＫＡＴＯ−ＩＩＩ胃癌対照細胞の膜および細胞質は、ＣＬＤＮ１８．２に関して強く陽性に染まった。染色強度は各々の細胞について異なり、また集団の中で陰性細胞も検出された（図１４ＪおよびＮ）。ＬＶＴ細胞株において、本発明者らは、全細胞の８０％を超える強い膜染色を認めた。
膵癌細胞におけるＣＬＤＮ１８．２発現の確認
ＣＬＤＮ１８．２の発現を確認するためおよび細胞表面上のこの標的の量を評価するために、内因性細胞株Ｐａｎｃ０５．０４およびＰａｔｕ８９８８ＳならびにＬＶＴ細胞株を、ネイティブ染色プロトコルを用いてＩＭＡＢ３６２で染色した。Ｐａｔｕ８９８８Ｓ、Ｐａｎｃ０５．０４およびＫＡＴＯ−ＩＩＩ胃癌対照細胞のＩＭＡＢ３６２による染色はより弱く、陽性細胞のパーセンテージは３５−２２Ａでの染色細胞と比較して低かったが（図１６Ａ〜Ｆ）、ＩＦ分析は、ＣＬＤＮ１８．２が膵癌細胞の表面で発現されることを確認した。ＣＬＤＮ１８．２を異所性に発現する８つのＬＶＴ膵癌細胞株に関して、ほとんどのすべての細胞上で明確な膜染色が認められた（図１６Ｇ〜Ｌで６つのＬＶＴ細胞株について示すように）。
結論として、ＣＬＤＮ１８．２発現分析は、内因性発現膵癌細胞株Ｐａｎｃ０５．０４およびＰａｔｕ８９８８Ｓならびに８つすべてのレンチウイルス形質導入細胞株ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ、ＣＡＰＡＮ１−ＬＶＴ、ＤＡＮＧ−ＬＶＴ、ＭｉａＰａＣａ−２−ＬＶＴ、Ｓｕｉｔ−２−ＬＶＴ、Ｐａｔｕ８９０２−ＬＶＴおよびＹＡＰＣ−ＬＶＴを適切なＣＬＤＮ１８．２陽性細胞モデル系として同定した。
膵癌異種移植および転移モデルの開発
適切な皮下膵癌腫瘍モデルの同定のための生着試験
種々の膵癌細胞株に関する合計３７の生着試験を実施し、ＩＭＡＢ３６２のインビボ効果を試験するための適切な皮下異種移植モデルを同定した。試験したすべての細胞株のうちで、異所性にＣＬＤＮ１８．２を発現するＢｘＰＣ３−ＬＶＴ、ＣＡＰＡＮ１−ＬＶＴ、ＭｉａＰａＣａ−２−ＬＶＴ、ＨＰＡＣ−ＬＶＴ、ＤＡＮＧ−ＬＶＴおよびＹＡＰＣ−ＬＶＴ細胞株を皮下異種移植モデルのために選択し、これらは高い生着率と均一な腫瘍増殖を示した。加えて、内因性にＣＬＤＮ１８．２を発現する皮下異種移植モデルＰａｔｕ８９８８ＳおよびＤＡＮＧ細胞株を、インビボでＩＭＡＢ３６２効果を試験するために選択した。Ｐａｎｃ０５．０４細胞のＳ．ｃ．注射は皮下腫瘍の形成をもたらさなかった。

適切な転移モデルの同定のための生着試験
転移形成へのＩＭＡＢ３６２の作用を検討するため、転移性癌のモデルをヌードマウスにおいて確立した。膵癌細胞株を、ｉ．ｖ．適用後に転移するその能力に関して分析した。ＣＡＰＡＮ１−ＬＶＴ、ＭｉａＰａＣａ−２、Ｐａｔｕ８９８８Ｓ、Ｐａｔｕ８９０２およびＳｕｉｔ−２細胞を、Ｍｏｈａｎｔｙ ａｎｄ Ｘｕ ２０１０によって記述されたようにヌードマウスの尾静脈に注射した。転移生着の時点および増殖速度を測定するため、マウスを種々の時点で犠死させた（表１８）。
Ｐａｔｕ８９０２細胞およびＣＡＰＡＮ１−ＬＶＴの生着分析は、大部分のマウスがほとんどすぐに死亡したため、実施不可能であった。ＣＡＰＡＮ−ＬＶＴ細胞で攻撃誘発した５匹の生存マウスの肺と肝臓において、７２日後に肉眼で見える転移は検出されなかった。Ｓｕｉｔ−２およびＭｉａＰａＣａ２細胞注射は、対照的に、良好に耐容された。これらのマウスの肺組織を注射後種々の時点でＩＨＣ分析において分析した。ＭｉａＰａＣａ−２細胞で攻撃誘発したマウスでは、７３日後まで肺において転移は検出されず、そのためこの細胞株はＩＭＡＢ３６２処置モデルとして選択しなかった。Ｓｕｉｔ−２癌細胞はマウスの肺に転移した。多数の病巣が組織全体にわたって検出された。そのため、レンチウイルスでＣＬＤＮ１８．２を形質導入したＳｕｉｔ−２−ＬＶＴ細胞株を、転移形成へのＩＭＡＢ３６２処置の作用を分析するためのモデル系として選択した。
Ｓｕｉｔ−２に加えて、ＣＬＤＮ１８．２を内因性に発現するＰａｔｕ８９８８Ｓ細胞の転移を形成する能力も分析した。生着検査を、マウスにつき２つの異なる細胞数（１×１０６、２×１０６）をｉ．ｖ．注射して実施した。肺および肝臓を表１８に示す種々の時点で単離した。最初に、得られた種々の組織を、Ｑ−ＰＣＲを使用して分析した。７０日目までに得られた肺および肝臓を、第１７番染色体のヒトα−サテライトＤＮＡを増幅することによって分析した。肺の結果は、経時的なマウス肺におけるヒトＤＮＡのパーセンテージの明らかな増加を示し、これは注射した細胞数に依存しなかった。１×１０６または２×１０６細胞のｉ．ｖ．適用により、７０日後に５．８％および３．７％のヒトＤＮＡをそれぞれ検出することができた（図１９）。肝臓では、ヒトＤＮＡはほとんど増幅されなかった。７０日後にパーセンテージはわずかに増加したが、まだ０．００５％未満であった。
Ｐａｔｕ８９８８Ｓ転移におけるＣＬＤＮ１８．２発現を確認するため、マウス組織中のヒト細胞の検出のための抗ヒトＭＨＣクラスＩ抗体ならびに抗クローディン１８（中央）抗体を使用して肺組織を免疫組織化学的に染色した。ＭＨＣ−Ｉ染色は、明らかな転移病巣がマウス肺組織切片において検出可能であるが、肝切片では検出されないことを示した（図２０）。さらに、これらの病巣中の細胞の膜を抗クローディン１８（中央）抗体で染色し、これらの細胞におけるＩＭＡＢ３６２標的タンパク質の明らかな発現を示した。そのため、Ｓｕｉｔ２−ＬＶＴモデルに加えて、この内因性転移モデルをＩＭＡＢ３６２処置の検討のために選択した。
［実施例４］
ＩＭＡＢ３６２媒介性細胞死滅作用
ＩＭＡＢ３６２架橋は効率的なアポトーシスを誘導する
細胞表面標的への抗体結合は、細胞死を直接生じさせる異常なシグナル伝達を開始させ得る。そのようなシグナル伝達事象は、標的エピトープ、結合の原子価、および結合が標的の架橋に関連するかどうかに依存し得る。いくつかのＣＤ２０陽性リンパ腫細胞株に関して、例えばリツキシマブによるアポトーシスの誘導は架橋条件下でのみ認められる。そのような架橋は、高親和性Ｆｃ受容体陽性免疫細胞が抗体被覆された腫瘍細胞と相互作用する場合にインビボで起こり得る。
ＩＭＡＢ３６２の架橋は、ＴＵＮＥＬアッセイによって測定されるようにヒト胃癌細胞ＮＵＧＣ−４およびＫＡＴＯ−ＩＩＩにおいて１８〜４２時間以内に直接のアポトーシスを誘導する。アポトーシスの程度は、抗体の用量および癌細胞上の標的発現のレベルと相関する。ゲムシタビンでの処置は、腫瘍細胞の細胞周期停止、次いでアポトーシス性細胞死をもたらす。ゲムシタビンで処置した膵腫瘍細胞のアポトーシスを図２１に示す。
膵癌細胞に対するＩＭＡＢ３６２媒介性ＡＤＣＣ活性
ＩＭＡＢ３６２は、ナチュラルキラー細胞などのＦｃγ受容体陽性免疫エフェクター細胞を動員し、活性化するうえで極めて強力である。標的細胞へのＩＭＡＢ３６２の結合は、エフェクター細胞のＦｃγ受容体が抗体に結合したときにエフェクター細胞によって分泌されるグランザイムおよびパーフォリンによる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する。この作用機構の影響は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下でＩＭＡＢ３６２と共に２４時間インキュベートすることにより（エフェクター対標的比＝４０：１）、ルシフェラーゼ陽性およびＣＬＤＮ１８．２陽性胃癌細胞（ＮＵＧＣ−４およびＫＡＴＯ−ＩＩＩなど）に関して以前に示された。２００μｇ／ｍｌまでのＩＭＡＢ３６２の適用は８０〜１００％の最大溶解率を生じさせた。
ここで、本発明者らは、膵癌細胞株に対するＩＭＡＢ３６２のＡＤＣＣ活性を測定した。漸増濃度のＩＭＡＢ３６２を４０：１のＥ：Ｔ比で種々の細胞株と共にインキュベートした。各実験において種々のドナーのＰＢＭＣを添加した。すべての細胞株についての結果を表１９に要約する。５つの最初に同定されたＣＬＤＮ１８．２陽性膵細胞株のうちで、Ｐａｔｕ８９８８Ｓ、Ｐａｎｃ０５．０４およびＤＡＮＧだけがＩＭＡＢ３６２およびＰＢＭＣの添加によって効率的に死滅化された（図２２Ａ）。ＣＬＤＮ１８．２表面発現は、Ｐａｎｃ０５．０４およびＤＡＮＧについてはＦＡＣＳで検出可能ではなかったが、発現レベルはエフェクター細胞依存性死滅を引き起こすのに十分なだけ有意である（ＥＣ５０：Ｐａｔｕ８９８８Ｓ：０．０１〜１．４μｇ／ｍｌ、ＤＡＮＧ／Ｐａｎ０５．０４：０．１〜３８μｇ／ｍｌ）。これらのデータから、相対的ＲＮＡレベル＞５．５×１０５を発現する細胞だけが効率的に溶解されると結論付けることができる。
ＡＤＣＣ分析をＬＶＴ膵癌細胞株およびそれらの対応する親細胞株に関しても実施した（図２２Ｂ〜Ｆ）。ＣＬＤＮ１８．２陽性標的細胞だけがＩＭＡＢ３６２およびＰＢＭＣによって死滅化されるので、ＡＤＣＣはＩＭＡＢ３６２の標的への特異的結合に厳密に依存する。ＩＭＡＢ３６２によってヒト膵癌細胞において誘導される半最大死滅率および最大死滅率はＰＢＭＣドナーの間で異なり、ＣＬＤＮ１８．２の発現レベルに影響を及ぼす細胞の継代数にも依存した。
標的細胞の半最大死滅率ならびに最大死滅率を引き起こすＩＭＡＢ３６２濃度を図２２Ｇ〜Ｈに示す。ＬＶＴ膵癌細胞株は、少量の抗体の添加後に高い率で死滅したが、ＤＡＮＧおよびＰａｎｃ０５に関しては、約５０％の最大死滅率に達するのに最も高い抗体濃度が必要である。Ｐａｎｃ０５．０４については、サブクローン１５Ｄ３（Ｐａｎｃ０５．０４の限界希釈およびＦＡＣＳによって選択したＣＬＤＮ１８．２陽性クローン）に関して得られた結果を図面に含めており、ＬＶＴ細胞株と同等のＡＤＣＣ溶解率を示す。残念ながら、このクローンにおけるＣＬＤＮ１８．２発現は、細胞を継代した後インビトロで急速にサイレンシングし、したがってこのクローンはさらなる実験には使用しなかった。
膵癌細胞に対するＩＭＡＢ３６２媒介性ＣＤＣ活性
ＡＤＣＣアッセイにおいてＩＭＡＢ３６２で死滅した膵癌細胞を、ＩＭＡＢ３６２の補体依存性溶解活性に対する感受性に関して分析した。加えて、ＬＶＴ細胞株および親株をＣＤＣにおいて試験した。
ＣＤＣ活性は、抗原とＩｇＭもしくはＩｇＧ抗体の複合体によって（古典経路）または微生物表面によって（第二経路）活性化される。古典経路では補体Ｃ５がＣ５ｂに変換される。アナフィラトキシンＣ３ａ、Ｃ４ａおよびＣ５ｂが放出され、Ｃ５ｂ、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９の連続的な結合によって膜侵襲複合体（ＭＡＣ）が形成される。この経路は、可溶性であるが膜結合性でもあるタンパク質（例えばＣＲ１、ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＤ５９、ＣＤ５５、ＣＤ４６）によって阻害され、自己組織を保護する。
ＣＬＤＮ１８．２で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞（ｐ７４０）およびルシフェラーゼを各アッセイにおいてアッセイ陽性対照として使用した（図２３Ａ）。細胞株ＤＡＮＧ、ＢｘＰＣ３、ＹＡＰＣ、Ｐａｔｕ８９８８Ｓ、Ｐａｎｃ０５．０４、ＣＡＰＡＮ１およびＳｕｉｔ２は、ＩＭＡＢ３６２および健常ヒト血清プールの添加によって溶解されなかった（図２３Ｂ）。ＤＡＮＧ、Ｐａｔｕ８９８８ＳおよびＰａｎｃ０５．０４細胞は、先のすべての実験で示されたようにＣＬＤＮ１８．２陽性であるが、これらの細胞は補体依存的に溶解されなかった。これは、腫瘍細胞が１またはそれ以上の膜結合補体阻害性タンパク質（例えばＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９）を過剰発現するという事実に起因する可能性が最も高い（Ｇｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，２０１０ １０：９２２−９３１）。しかし、腫瘍細胞上のこれらの阻害性タンパク質の発現が抗体療法の臨床転帰に影響を及ぼすかどうかはまだ議論の余地がある（Ｄｚｉｅｔｃｚｅｎｉａ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．２０１０，２７：７４３−６；Ｗｅｎｇ ａｎｄ Ｌｅｖｙ ａｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００１ ９８：１３５２−７）。
内因性細胞株に加えて、すべてのＬＶＴ細胞株をＣＤＣアッセイにおいて試験した。図２３に示すように、ＭｉａＰａＣａ−２−ＬＶＴ、Ｓｕｉｔ２−ＬＶＴおよびＣＡＰＡＮ１−ＬＶＴへのＩＭＡＢ３６２および血清の添加は、０．３〜２．６μｇ／ｍｌの範囲のＥＣ５０値で用量依存的溶解を生じさせた。
ヒト膵癌細胞株におけるＣＬＤＮ１８．２発現の概観
［実施例５］
膵癌異種移植モデルへのＩＭＡＢ３６２の効果
４１の試験した膵癌異種移植モデルのうち１０を、インビボでのＩＭＡＢ３６２の効果を検討するために選択した。ＣＬＤＮ１８．２の高発現を有する膵異種移植モデルを使用して、ＩＭＡＢ３６２処置は高い抗腫瘍作用を示した。これを、左側腹部の皮下にＢｘＰＣ３−ＬＶＴまたはＭｉａＰａＣａ−２−ＬＶＴ異種移植片を担持するマウスの処置によって検討した。ＩＭＡＢ３６２ ２００μｇの週２回の注射による腫瘍接種の３日後に処置を開始した。ＩＭＡＢ３６２処置マウスは、生理食塩水対照で処置したマウスと比較して有意に阻害された腫瘍増殖を示した。加えて、ＩＭＡＢ３６２処置マウスの腫瘍増殖抑制は、平均生存期間の延長をもたらした（図２４および図２５）。ＩＭＡＢ３６２の効果は処置の期間と相関する。早期時点でのＩＭＡＢ３６２処置の開始は、確立された腫瘍への作用を検討するための後期の処置開始よりも、腫瘍増殖阻害に増大された作用を及ぼした。さらに、ＩＭＡＢ３６２の抗腫瘍作用はＣＬＤＮ１８．２標的発現の量に依存した。ＤＡＮＧおよびＰａｔｕ８９８８Ｓ異種移植片のような低いＣＬＤＮ１８．２発現の腫瘍のＩＭＡＢ３６２媒介性増殖阻害は、ＣＬＤＮ１８．２を高発現する異種移植腫瘍を使用した腫瘍増殖の阻害と比較して低かった。
［実施例６］
膵転移マウスモデルの処置
Ｓｕｉｔ２−ＬＶＴ転移モデル：
マウスに２×１０６のＳｕｉｔ２−ＬＶＴ細胞を静脈内注射し、表２０に示すようにＩＭＡＢ３６２ ２００μｇ、アイソタイプ対照抗体（ＩＭＡＢ０２７）またはＰＢＳで処置した。３５日後、最初のマウス（アイソタイプ対照群）が死亡した。その結果、すべてのマウスを４２日目に犠死させ、ＩＨＣおよびＱ−ＰＣＲ分析のために肝臓を採取した。
マウスの肺におけるヒトＤＮＡのＱ−ＰＣＲ分析を三つ組みで少なくとも２回反復した。得られたＣｔ値とヒトＤＮＡのパーセンテージの計算は、マウスをＩＭＡＢ３６２で処置した場合、ＰＢＳおよびアイソタイプ対照処置の両方と比較して肺において検出されるＳｕｉｔ２−ＬＶＴ転移の有意の減少（Ｐ＜０．０５）を明らかにした（図２６Ａ）。これらの結果を確認するため、肺試料の組織切片を調製し、ＭＨＣ−Ｉ抗体を用いて染色した。ＩｍａｇｅＪ Ｐｒｏｇｒａｍを用いて肺切片中の陽性染色細胞の表面を計算した。ＩＭＡＢ３６２処置に関して、ＰＢＳ処置と比較して有意の阻害（Ｐ＜０．０５）が認められ、Ｑ−ＰＣＲで得られた結果を確認した。アイソタイプ対照抗体については、しかしながら、差は有意ではなかった（図２６Ｂ）。この不一致は組織処理の相違に起因する可能性が高い：組織切片のＩＨＣ処理はＱ−ＰＣＲ分析に比べて肺の非常に小さな切片への洞察だけを提供し、Ｑ−ＰＣＲ分析にはゲノムＤＮＡを組織の半分から抽出する。
組織処理に加えて、結果が、ＣＬＤＮ６を標的とするアイソタイプ対照抗体の予期せぬ阻害作用を示している可能性がある。この選択肢を検討するため、Ｓｕｉｔ２−ＬＶＴ細胞をＦＡＣＳにおいてＣＬＤＮ６発現およびＩＭＡＢ０２７結合に関して分析した。Ｓｕｉｔ２−ＬＶＴ細胞への２００μｇ／ｍｌのＩＭＡＢ３６２の添加は細胞への強力な結合を確認し、一方２００μｇ／ｍｌのＩＭＡＢ０２７の添加はこれらの標的細胞への抗体の弱い結合をもたらし、ＣＬＤＮ６が実際にこれらの細胞で弱く発現されることを示した。これらの結果は、少なくとも２つの因子（組織処理および弱いＩＭＡＢ０２７阻害）がアイソタイプ対照抗体に関して認められた不一致をもたらしたことを示唆する。
Ｐａｔｕ８９８８Ｓ転移モデル
インビボでのＰａｔｕ８９８８Ｓ転移の発症および増殖へのＩＭＡＢ３６２処置の作用を分析するため、群につき１０匹のマウスに２×１０６のＰａｔｕ８９８８Ｓ細胞を注射した。最初の実験は、ＩＭＡＢ３６２処置をＰＢＳ処置マウスと比較することによって実施した。各々の群において１匹のマウスが細胞の注射後直ちに死亡した。その他の１８匹のマウスでは、生着実験と比較して転移が非常に迅速に発症した。６３日後、ＰＢＳ群の最初の２匹のマウスを健康状態の悪化のために犠死させた。他のすべてのマウスは６５日後に犠死させた。肺の光学的分析は、肺組織全体にわたって大きな転移を明らかにした。転移の量をＱ−ＰＣＲ実験で分析した（図２７）。結果は、ＩＭＡＢ３６２が肺組織における転移の増殖を阻害することを示す。
各群につき１１匹のマウスに関する２番目の実験は、ＩＭＡＢ３６２処置をアイソタイプ対照（リツキシマブ）処置と比較することによって実施した。この実験では、転移は、生着実験で認められたように緩やかに発症した。それにもかかわらず、整合性のためにこの２番目の実験は６５日後に終了させた。再び肺組織をＱ−ＰＣＲにおいて分析し、やはりＩＭＡＢ３６２は転移の成長を低減させた。ＩＭＡＢ３６２群の１匹のマウスが異常値と同定され、この異常値を除外することにより、ほぼ有意の（Ｐ＝０．０５８８）阻害となった。これらのデータは、Ｓｕｉｔ２−ＬＶＴ転移実験について述べたようにＩＨＣ表面分析によって確認された。ここでも同じ異常値を同定することができ、ｔ検定でこの値を除外すると、ＩＭＡＢ３６２の阻害はやはり有意の境界（Ｐ＝０．０６９１）であり、前記異常値は同じマウスのものであった。
［実施例７］
化学療法と併用したＩＭＡＢ３６２の一次薬力学
ゲムシタビンおよびオキサリプラチンに対する膵癌細胞の感受性
ＣＬＤＮ１８．２を構成的に発現する膵癌細胞株（ＤＡＮＧ、Ｐａｔｕ８９８８Ｓ）およびＣＬＤＮ１８．２を安定に形質導入した細胞（ＭｉａＰａＣａ−２−ＬＶＴ、ＢｘＰＣ３−ＬＶＴ）を使用して、化学療法剤オキサリプラチンまたはゲムシタビンと併用したＩＭＡＢ３６２の作用機構を検討した。
化学的に、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏによって市販されている）はヌクレオシド類似体である。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびピリミジンの他の類似体と同様に、ゲムシタビンの三リン酸類似体は、ＤＮＡ複製の間に核酸の構築ブロックの１つを置換する。この工程は、１個の付加的なヌクレオシドだけしか「欠陥」ヌクレオシドに結合することができないので、腫瘍増殖を停止させ、アポトーシスをもたらす。
オキサリプラチンは、ＤＮＡ中で鎖間架橋および鎖内架橋の両方を形成することによって機能する。ＤＮＡ中の架橋はＤＮＡの複製および転写を妨げ、細胞死をもたらす（Ｇｒａｈａｍ，Ｊｏａｎｎｅ；Ｍｕｓｈｉｎ，Ｍｏｈａｍｅｄ；Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ，Ｐｅｔｅｒ（Ｊａｎｕａｒｙ ２００４）．"Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ"．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ３（１）：１１−２）。
ゲムシタビンおよびオキサリプラチンの用量反応曲線は、試験した膵腫瘍細胞株の種々の感受性を示した（図２８および図２９）。
Ｐａｔｕ８９８８Ｓの細胞増殖を阻害するには、高濃度のゲムシタビン（ＩＣ５０＞１００ｎｇ／ｍｌ）またはオキサリプラチン（ＩＣ５０＞５００ｎｇ／ｍｌ）が必要である。ＤＡＮＧおよびＢｘＰＣ３−ＬＶＴはゲムシタビンに非常に鋭敏に反応するが、オキサリプラチンには鋭敏に反応しない。ＭｉａＰａＣａ−２−ＬＶＴ細胞はオキサリプラチンに対して最も鋭敏に反応するが、ゲムシタビンでの処置に対してはより感受性が低い（図２８、図２９および表２１）。
膵癌細胞株におけるＣＬＤＮ１８．２発現への化学療法剤の作用
ＩＭＡＢ３６２結合が引き金となる作用機構は、その標的であるＣＬＤＮ１８．２の存在と細胞表面密度に厳密に依存する。ゲムシタビン（Ｇｅｍ）ならびにオキサリプラチンと組み合わせたゲムシタビン（ＧｅｍＯｘ）でのＤＡＮＧおよびＰａｔｕ８９８８Ｓ細胞の前処置は、未処置細胞および化学療法で前処置した細胞のＲＴ−ＰＣＲ（図３０）およびウェスタンブロット（図３１）分析によって示されるＣＬＤＮ１８．２のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの上昇をもたらした。その結果として、ＧｅｍまたはＧｅｍＯｘで前処置した膵癌細胞株の表面上のＩＭＡＢ３６２によって標的可能なＣＬＤＮ１８．２タンパク質の量は、フローサイトメトリによって示されるように増大した（図３２）。
ゲムシタビンでのＤＡＮＧおよびＰａｔｕ８９８８Ｓの処置はＣＬＤＮ１８．２の上方調節を導く。Ｐａｔｕ８９８８Ｓは、ＧｅｍによるＣＬＤＮ１８．２の強力な上方調節およびＧｅｍＯｘによるより低い上方調節を示す。
細胞周期およびＣＬＤＮ１８．２発現への化学療法化合物の作用
細胞周期進行とは、細胞における１つの有糸***と別の有糸***との間の一連の事象を指す。静止期（Ｇ０／Ｇ１）に続いてＤＮＡ合成期（Ｓ）、次に細胞拡大期（Ｇ２）、およびＤＮＡ複製（Ｍ）の後に細胞の２個の子孫細胞への***が続く。細胞機構へのいかなる干渉も、細胞周期のいずれの期においてもすべての周期進行を阻止し得る。例えば、特定の化学療法剤は、Ｇ２もしくはＭ期のいずれかまたはＧ２とＭ期の両方（Ｇ２／Ｍ）で進行をブロックし得る。
ＤＡＮＧまたはＰａｔｕ８９８８Ｓのゲムシタビン処置は、Ｓ期での細胞周期停止をもたらす（図３３、図３４）。Ｇｅｍと共に培養したＰａｔｕ８９８８Ｓを分析した。ゲムシタビン処置は細胞周期停止をもたらすだけでなく、ＣＬＤＮ１８．２の発現も変化させる（図３４Ｂ）。ゲムシタビン処置後のＣＬＤＮ１８．２密度の変化は、Ｓ期の増殖中の細胞をＧ０／Ｇ１期の静止細胞と比較した場合さらに一層大きい（図３４Ｃ）。Ｐａｔｕ８９８８Ｓ細胞では、ＣＬＤＮ１８．２は細胞周期のすべての期で発現される。ゲムシタビンでの処置後、その発現はさらに増大し、細胞当たりのＣＬＤＮ１８．２の最高レベルはＳ期細胞集団で認められる。
腫瘍細胞表現型のこの変動は、治療用抗体の生物学的有効性に有意の影響を及ぼす。ＡＤＣＣおよびＣＤＣは用量関連性であり、それゆえ標的構造であるＣＬＤＮ１８．２の増加は、標準的な化学療法レジメンに相乗作用的利益を提供する。
ヒト胃腫瘍細胞株、Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞を、２０％ＦＣＳ（Ｐｅｒｂｉｏ）および２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３７℃および５％ＣＯ２にて細胞増殖抑制性化合物と共にまたは前記化合物なしで培養した。５−ＦＵ（ＮｅｏＣｏｒｐ ＡＧからのＮｅｏｆｌｕｏｒ）を１０または１００ｎｇ／ｍｌの濃度で試験し、オキサリプラチン（Ｈｏｓｐｉｒａ）を５０または５００ｎｇ／ｍｌの濃度で試験した。８×１０５ Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞を、培地交換なしで９６時間培養するか、または７２時間培養し、次に標準培地で２４時間培養して、６ウェル組織培養プレート中で３７℃、５％ＣＯ２にて細胞を細胞周期停止から解除した。細胞をＥＤＴＡ／トリプシンで採取し、洗浄して、分析した。
ＣＬＤＮ１８．２細胞の細胞外検出のために、細胞をモノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ＩＭＡＢ３６２（Ｇａｎｙｍｅｄ）またはアイソタイプがマッチする対照抗体（Ｇａｎｙｍｅｄ）で染色した。二次試薬としてＤｉａｎｏｖａからのヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＰＣを使用した。
細胞周期の段階を細胞のＤＮＡ含量の測定に基づいて決定した。これは、細胞周期のＧ１、ＳまたはＧ２期の細胞を識別することを可能にする。Ｓ期にはＤＮＡ複製が起こり、Ｇ２期には細胞が増殖し、有糸***の準備をする。細胞周期分析を、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＣｙｃｌｅＴＥＳＴ ＰＬＵＳ ＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを使用して製造者のプロトコルに従って行った。フローサイトメトリの獲得および分析は、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）ソフトウェアを用いて実施した。
図３５ａおよびｂ中の欄は、細胞周期のＧ１、ＳまたはＧ２期の細胞のそれぞれのパーセンテージを示す。培地で培養したＫａｔｏ ＩＩＩ細胞は、主としてＧ１期で細胞周期停止を示す。５−ＦＵで処置した細胞は主としてＳ期でブロックされる。オキサリプラチンで処置したＫａｔｏ ＩＩＩ細胞は、主としてＧ１およびＧ２期の細胞の富化を示す。図３５ｃに見られるように、Ｓ期またはＧ２期での細胞周期停止はＣＬＤＮ１８．２の安定化または上方調節をもたらす。細胞が細胞周期のいずれかの段階から解除されるとすぐに（図３５ｂ）、Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞の細胞表面でのＣＬＤＮ１８．２発現が上方調節される（図３５ｄ）。
Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞をイリノテカンまたはドセタキセルで４日間前処置し、ＣＬＤＮ１８．２発現および細胞周期停止に関して分析した。イリノテカンでの細胞の処置は、細胞増殖の用量依存的阻害およびＳ／Ｇ２期での細胞周期停止を生じさせた（図３６）。ドセタキセルでの細胞の処置は、細胞増殖の用量依存的阻害およびＧ２期での細胞周期停止をもたらした（図３６）。
ＩＭＡＢ３６２が誘導する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への化学療法の作用
ＩＭＡＢ３６２媒介性ＡＤＣＣへのゲムシタビン（Ｇｅｍ）またはゲムシタビン＋オキサリプラチン（ＧｅｍＯｘ）の作用を検討するため、構成的にＣＬＤＮ１８．２を発現する膵癌細胞株Ｐａｔｕ８９８８ＳおよびＤＡＮＧに関して一連の実験を実施した。前処置した細胞のＩＭＡＢ３６２媒介性細胞溶解についての用量反応曲線を培養培地と比較した。
Ｇｅｍ（１ｎｇ／ｍｌ）またはＧｅｍＯｘ（Ｇｅｍ １ｎｇ／ｍｌ＋Ｏｘ １０ｎｇ／ｍｌ）で前処置したＤＡＮＧ（２日間）の用量反応曲線は、未処置標的細胞と比較して上方および左側にシフトする（図３７Ａ）。ＧｅｍまたはＧｅｍＯｘでの腫瘍細胞の処置は、ＣＬＤＮ１８．２の上方調節およびＩＭＡＢ３６２媒介性ＡＤＣＣに対するより高い感受性をもたらす。本発明者らは、化学療法剤での処置後にＤＡＮＧ細胞においてＩＭＡＢ３６２媒介性ＡＤＣＣに関するＥＣ５０値の低下およびより高い最大細胞溶解を認めることができた（図３７Ｂ）。
健常ヒトドナーからのＮＫ細胞、単球、単核細胞または他のエフェクター細胞を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離によって精製した。洗浄したエフェクター細胞をＸ−Ｖｉｖｏ培地に接種した。ＣＬＤＮ１８．２を内因性に発現し、胃起源であるＫａｔｏ ＩＩＩ細胞をこの設定における標的細胞として使用した。標的細胞は、生細胞によってのみ酸化されるルシフェラーゼ、ルシファーイエローを安定に発現した。精製抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ＩＭＡＢ３６２を様々な濃度で添加し、アイソタイプ対照抗体として無関係なキメラヒトＩｇＧ１抗体を使用した。ＩＭＡＢ３６２が細胞傷害を誘導した後に残った生細胞の量についての値である、ルシファーイエローの酸化から生じるルミネセンスを測定することにより、試料を細胞溶解に関して検定した。イリノテカン（１０００ｎｇ／ｍｌ）、ドセタキセル（５ｎｇ／ｍｌ）またはシスプラチン（２０００ｎｇ／ｍｌ）で３日間前処置したＫａｔｏ ＩＩＩを未処置の培地培養した標的細胞と比較し、ＩＭＡＢ３６２誘導性ＡＤＣＣを定量化した。
イリノテカン、ドセタキセルまたはシスプラチンで３日間前処置したＫａｔｏ ＩＩＩ細胞は、培地培養した標的細胞に比べてより低いレベルの生細胞を示し（図３８ａ）、イリノテカン、ドセタキセルまたはシスプラチンで前処置した細胞におけるクローディン１８．２発現は培地培養細胞と比較して増大した（図３８ｂ）。
さらに、イリノテカン、ドセタキセルまたはシスプラチンでのＫａｔｏ ＩＩＩ細胞の前処置は、ＡＤＣＣを誘導するＩＭＡＢ３６２の効力を増大させた（図３８ｃ、ｄ）。
ＩＭＡＢ３６２誘導性ＣＤＣへの化学療法の作用
ＩＭＡＢ３６２のＣＤＣ効力を、補体の供給源としてヒト血清の存在下で標的細胞とのインキュベーションによって特性付けた。
培地培養したＭｉａＰａＣａ−２−ＬＶＴは、７６６５ｎｇ／ｍｌのというＩＭＡＢ３６２特異的溶解についてのＥＣ５０値を示す。Ｇｅｍでの処置は、最大溶解の増大と比較してＥＣ５０の４６７７ｎｇ／ｍｌへの低下をもたらす（図３９）。
ＩＭＡＢ３６２誘導性ＣＤＣへの化学療法剤の作用を、ＫＡＴＯ ＩＩＩ胃癌細胞を１０ｎｇ／ｍｌ ５−ＦＵおよび５００ｎｇ／ｍｌオキサリプラチン（５−ＦＵ＋ＯＸ）で４８時間前処置することによって分析した。化学療法剤で前処置したＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞を使用したＩＭＡＢ３６２誘導性ＣＤＣの代表的な用量反応曲線を図４０に示す。腫瘍細胞の４８時間の前処置は、ＣＤＣを誘導するＩＭＡＢ３６２の効力を増大させ、未処置細胞と比較して前処置した腫瘍細胞のより高い最大細胞溶解をもたらした。
［実施例８］
マウス腫瘍モデルにおける化学療法と併用したＩＭＡＢ３６２の効果
ＧｅｍまたはＧｅｍＯｘと併用したＩＭＡＢ３６２の抗腫瘍活性を、以前に単剤としてのＩＭＡＢ３６２の効果を試験するために使用した、皮下膵癌異種移植モデルにおいて検討した。
ＩＭＡＢ３６２で処置したＢｘＰＣ３−ＬＶＴまたはＭｉａＰａＣａ−２−ＬＶＴ腫瘍担持ヌードマウスは、生理食塩水対照で処置した対照マウスと比較して有意の腫瘍増殖遅延を示した。付加的なＩＭＡＢ３６２処置を伴わない１００ｍｇ／ｋｇまでのゲムシタビンによる化学療法は、ＢｘＰＣ３−ＬＶＴまたはＭｉａＰａＣａ−２−ＬＶＴ異種移植片に有意の治療効果を示さなかった。これに対し、５０〜１００ｍｇ／ｋｇゲムシタビンプラスＩＭＡＢ３６２での併用処置は、化学療法単独で処置したマウスと比較して腫瘍増殖阻害の有意の増大および腫瘍担持マウスの生存期間延長をもたらした（図４１、図４２、図４３）。これらの所見は、ゲムシタビンとＩＭＡＢ３６２免疫療法の併用による相乗作用的治療効果の存在を示す。
週当たり２×１５０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンの高用量を使用した場合、確立されたＭｉａＰａＣａ−２−ＬＶＴ異種移植腫瘍は、ＩＭＡＢ３６２処置とは無関係に腫瘍増殖を強力に阻害される（図４４Ａ）。しかし、ＩＭＡＢ３６２とゲムシタビンの併用療法で処置されたマウスは、単剤としてのゲムシタビンで処置されたマウスと比較して極めて有意の生存期間延長を示した（図４４Ｂ）。
［実施例９］
ＺＡ／ＩＬ−２処置はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の高い量の増殖をもたらす
ＰＢＭＣを、１μＭゾレドロン酸（ＺＡ）と共にまたはＺＡなしで３００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を添加したＲＰＭＩ培地で１４日間培養した。ＣＤ３＋リンパ球集団内のＶγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞のパーセンテージおよびＣＤ３＋Ｖγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞集団内のＣＤ１６＋細胞のパーセンテージを０日目と１４日目にマルチカラーＦＡＣＳによって測定した。
ＰＢＭＣ培養物へのＩＬ−２添加はリンパ球の生存と増殖のために必要である。リンパ球は、３００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を添加した培養物中で効率的に増殖する。Ｖγ９およびＶδ２特異的抗体を使用したＦＡＣＳ分析は、ＺＡ／ＩＬ−２の添加がＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の蓄積を特異的に誘導することを明らかにする。１４日後、ＣＤ３＋リンパ球集団は、８０％までのＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を含み得る。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の一部はＣＤ１６を発現するが、ＣＤ３＋リンパ球集団内でのこれらの細胞の富化は、ドナーに依存して１０〜７００倍である。培養物中のＣＤ１６＋Ｖγ９＋Ｖδ２＋Ｔ細胞の富化は、ＺＡなしで増殖させた培養物と比較して１０〜６００倍高い。本発明者らは、インビトロでのＰＢＭＣのＺＡ／ＩＬ−２処置が有意の割合のγδＴ細胞においてＡＤＣＣ媒介性ＦｃγＩＩＩ受容体ＣＤ１６の上方調節をもたらすと結論する。
ＮＫ細胞と同様に、ＺＡ／ＩＬ−２が増殖させたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、細胞結合抗体がそれを介してＡＤＣＣを始動させるＦｃγＲＩＩＩ受容体、ＣＤ１６に関して陽性である。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞がＩＭＡＢ３６２と共に強力なＡＤＣＣを誘導することができるかどうかを評価するために一連の実験を実施した。
２例の異なるドナー（Ｎｏ．１およびＮｏ．２）に由来するＰＢＭＣを、１μＭ ＺＡと共にまたはＺＡなしで３００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を添加した培地で培養した。１４日後、細胞を採取し、漸増濃度（０．２６ｎｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ）のＩＭＡＢ３６２と共に、ＣＬＤＮ１８．２を発現するＮＵＧＣ−４細胞に添加した。特異的死滅をルシフェラーゼアッセイにおいて測定した。ＡＤＣＣアッセイを、ＺＡと共にまたはＺＡなしで３００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２中で増殖させた２７例のドナーに関して実施し、ここでＮＵＧＣ−４を標的細胞として使用した。各ドナーについて、用量反応曲線から計算したＥＣ５０値および２００μｇ／ｍｌ ＩＭＡＢ３６２の用量での最大特異的死滅率を散布図において評価した。
強力なＩＭＡＢ３６２依存性ＡＤＣＣ活性が、ＺＡ／ＩＬ−２と共に１４日間培養したＰＢＭＣを使用して、ＣＬＤＮ１８．２陽性ＮＵＧＣ−４細胞に対して認められた。ＺＡ／ＩＬ−２処置したＰＢＭＣ培養物を使用して、ＡＤＣＣはＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の存在に依存する。細胞をＺＡなしで培養した場合、ＡＤＣＣ活性は大部分のドナーに関して低下する。これらの培養物において、残存ＡＤＣＣ活性はＮＫ細胞依存性である。２０例を超えるドナーを試験することにより、ＡＤＣＣアッセイは、ＰＢＭＣのＺＡ／ＩＬ−２処置が、ＩＬ−２単独と共に培養したＰＢＭＣと比較してＥＣ５０および最大特異的死滅率を改善することを明らかにする。
［実施例１０］
マウス転移モデルにおけるゲムシタビンと併用したＩＭＡＢ３６２の効果
Ｐａｔｕ８９８８Ｓ肺転移へのゲムシタビン処置と併用したＩＭＡＢ３６２の効果をインビボで分析するため、各群につき１２匹のＨｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスを、２×１０６ Ｐａｔｕ８９８８Ｓ細胞の尾静脈への静脈内注射で処置した。腫瘍細胞注射の１４日後に、マウスを週２回のＩＭＡＢ３６２ ２００μｇまたは対照としてＰＢＳ（ｉ．ｖ．／ｉ．ｐ．）プラス週１回の１００ｍｇ／ｋｇ用量のゲムシタビンｉ．ｐ．で４週間処置した。腫瘍細胞注射後７０日目にマウスを犠死させるまで、ＩＭＡＢ３６２またはＰＢＳでの処置を維持した。肺における異種移植した腫瘍量の分析を、調製した肺でのヒトＤＮＡのＱＰＣＲによって、および抗ヒトＭＨＣ−Ｉ抗体（クローンＥＰＲ１３９４Ｙ）での免疫組織学的染色の光学的分析によって実施した。結果は、ＩＭＡＢ３６２プラスゲムシタビンで処置したマウスがその肺に有意に低い量のヒトＤＮＡを有すること（図４５Ａ）およびヒトＭＨＣ−Ｉ複合体に対して染色した肺切片の表面が、無関係な抗体プラスゲムシタビンで処置したマウスの肺におけるよりも有意に小さいこと（図４５Ｂ）を示す。どちらの方法も、ＩＭＡＢ３６２プラスゲムシタビンで処置したマウスの肺におけるＰａｔｕ８９８８ｓ異種移植片の低い腫瘍量を明らかにし、ＩＭＡＢ３６２との併用がゲムシタビンでの単独療法を有意に上回ることを示す。

Claims (39)

  1. 患者において膵癌を治療または予防する方法であって、（ｉ）ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体および（ｉｉ）ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質を前記患者に投与することを含む方法。
  2. ＣＬＤＮ１８．２の発現が癌細胞の細胞表面において行われる、請求項１に記載の方法。
  3. ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる前記作用物質が、細胞周期の停止または細胞周期の１もしくはそれ以上の期、好ましくはＧ１期以外の細胞周期の１もしくはそれ以上の期、より好ましくはＧ２期および／もしくはＳ期の細胞の蓄積を誘導する作用物質を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる前記作用物質が、ヌクレオシド類似体、白金化合物、カンプトテシン類似体、タキサン類、そのプロドラッグ、その塩およびそれらの組合せから成る群より選択される作用物質を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる前記作用物質が、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、パクリタキセル、そのプロドラッグ、その塩およびそれらの組合せから成る群より選択される作用物質を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる前記作用物質が、免疫原性細胞死を誘導する作用物質を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 免疫原性細胞死を誘導する前記作用物質がオキサリプラチンを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記方法が、ゲムシタビンとオキサリプラチンの組合せ、ゲムシタビンとシスプラチンの組合せ、ゲムシタビンとカルボプラチンの組合せ、またはオキサリプラチン、５−フルオロウラシルもしくはそのプロドラッグとイリノテカンの組合せを投与することを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記方法が、フォリン酸、オキサリプラチン、５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグおよびイリノテカンを投与することを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 患者において癌を治療または予防する方法であって、（ｉ）ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体および（ｉｉ）ゲムシタビンを前記患者に投与することを含む方法。
  11. 前記癌が膵癌である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記方法が、γδＴ細胞を刺激する作用物質を投与することをさらに含み、前記γδＴ細胞が好ましくはＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. γδＴ細胞を刺激する前記作用物質がビスホスホネートである、請求項１２に記載の方法。
  14. γδＴ細胞を刺激する前記作用物質が窒素含有ビスホスホネート（アミノビスホスホネート）である、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. γδＴ細胞を刺激する前記作用物質が、ゾレドロン酸、クロドロン酸、イバンドロン酸、パミドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、オルパドロン酸、アレンドロン酸、インカドロン酸およびそれらの塩から成る群より選択される、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. γδＴ細胞を刺激する前記作用物質をインターロイキン２と組み合わせて投与する、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する前記抗体が、ＣＬＤＮ１８．２の第一細胞外ループに結合する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する前記抗体が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）媒介性溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介性溶解、アポトーシスの誘導および増殖の阻害の１つまたはそれ以上による細胞死滅を媒介する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する前記抗体が、（ｉ）アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７３７、ＤＳＭ ＡＣＣ２７３８、ＤＳＭ ＡＣＣ２７３９、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４０、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４１、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４２、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４３、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４５、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４６、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４７、ＤＳＭ ＡＣＣ２７４８、ＤＳＭ ＡＣＣ２８０８、ＤＳＭ ＡＣＣ２８０９またはＤＳＭ ＡＣＣ２８１０の下で寄託されたクローンによって産生されるおよび／または前記クローンから入手可能な抗体、（ｉｉ）（ｉ）に含まれる前記抗体のキメラ化またはヒト化形態である抗体、（ｉｉｉ）（ｉ）に含まれる前記抗体の特異性を有する抗体、ならびに（ｉｖ）（ｉ）に含まれる前記抗体の抗原結合部分または抗原結合部位、特に可変領域を含有し、および好ましくは（ｉ）に含まれる前記抗体の特異性を有する抗体から成る群より選択される抗体である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記方法が、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する前記抗体を１０００ｍｇ／ｍ２までの用量で投与することを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記方法が、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する前記抗体を３００から６００ｍｇ／ｍ２の用量で反復投与することを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記癌がＣＬＤＮ１８．２陽性である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. ＣＬＤＮ１８．２が配列番号：１に従うアミノ酸配列を有する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記膵癌が、原発癌、進行癌もしくは転移癌、または膵原発癌と転移癌の組合せなどのこれらの組合せを含む、請求項１から９および１１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記転移癌が、リンパ節、卵巣、肝臓もしくは肺、またはこれらの組合せへの転移を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記膵癌が膵管の癌を含む、請求項１から９および１１から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記膵癌が、腺癌もしくは癌腫、またはこれらの組合せを含む、請求項１から９および１１から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記膵癌が、膵管腺癌、粘液性腺癌、神経内分泌癌もしくは腺房細胞癌、またはこれらの組合せを含む、請求項１から９および１１から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記膵癌が、ゲムシタビン単独療法などのゲムシタビン治療に対して部分的または完全に抗療性である、請求項１から９および１１から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 膵癌を予防することが、膵癌の再発を予防することを含む、請求項１から９および１１から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記患者が膵癌のための手術を受けたことがある、請求項１から９および１１から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記患者が、前癌膵病変、特に膵管における初期の悪性組織学的変化を含む前癌膵病変を有する、請求項１から９および１１から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 膵癌を治療または予防するための医療製剤であって、（ｉ）ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体および（ｉｉ）ＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる作用物質を含有する医療製剤。
  34. ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する前記抗体を含有する第一容器およびＣＬＤＮ１８．２の発現を安定化するまたは増大させる前記作用物質を含有する第二容器を含むキットの形態で存在する、請求項３３に記載の医療製剤。
  35. 膵癌の治療または予防のための前記製剤の使用に関する印刷された指示書をさらに含む、請求項３３または３４に記載の医療製剤。
  36. （ｉ）ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する抗体および（ｉｉ）ゲムシタビンを含有する医療製剤。
  37. 癌、特に膵癌を治療または予防するためである、請求項３６に記載の医療製剤。
  38. ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する前記抗体を含有する第一容器およびゲムシタビンを含有する第二容器を含むキットの形態で存在する、請求項３６または３７に記載の医療製剤。
  39. 癌、特に膵癌の治療または予防のための前記製剤の使用に関する印刷された指示書をさらに含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の医療製剤。
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