DE102004042822A1

DE102004042822A1 - Verbindungen und Methoden zur Behandlung, Diagnose und Prognose bei Pankreaserkrankungen

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Publication number: DE102004042822A1
Application number: DE200410042822
Authority: DE
Inventors: Günter Prof. Dr. Klöppel; Jutta Prof. Dr. Lüttges; Holger Prof. Dr. Kalthoff; Ole Dr. Ammerpohl; Robert Dr. Grützmann; Christian Dr. Pilarsky; Hans Detlev Prof. Dr. Saeger; Ingo Dr. Alldinger
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2004-08-31
Filing date: 2004-08-31
Publication date: 2006-03-16
Also published as: DE112005002742B4; DE112005002742A5; WO2006024283A2; WO2006024283A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Diagnose und Prognose des Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms des Pankreas, Verfahren zum Screenen nach Wirkstoffen zur Therapie des Pankreaskarzinoms, sowie die Verwendung von Antisense-Konstrukten bzw. siRNA-Molekülen für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Pankreaskarzinoms. DOLLAR A Durch die vergleichende Untersuchung der Genexpression im Pankreaskarzinom und im normalen Pankreasepithelgewebe wurden insgesamt 1419 differentiell exprimierte Gene gefunden (650 hochregulierte und 769 herunterregulierte Gene). Von 1267 der gefundenen 1419 Gene war bisher nicht bekannt, dass sie im Zusammenhang mit Pankreastumor stehen. DOLLAR A Durch die Bestimmung der Menge an Genprodukt eines solchen differentiell exprimierten Gens in einer Probe biologischen Ursprungs eines Individuums und den Vergleich mit der Menge an üblicherweise im Pankreasgewebe vorliegendem Genprodukt kann ermittelt werden, ob ein Pankreaskarzinom vorliegt.

Description

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen sowie hierdurch kodierte Peptide bzw. Proteine, als auch die Verwendung von hieraus abgeleitenden Sequenzen zum Screenen nach daran bindenden Substanzen als auch die Verwendung von an den Nukleinsäuren und der daraus abgeleiteten Peptide bzw. Proteine bindenden Substanzen zur Diagnose, Prognose, sowie zur therapeutischen Behandlung bei Pankreastumoren, insbesondere beim duktalen Adenomakarzinom des Pankreas.

Das duktale Adenokarzinom des Pankreas ist eine der häufigsten krebsbedingten Todesursachen. In den USA werden jährlich ca. 30 000 Todesfälle dadurch verursacht und das Pankreaskarzinom rangiert auf Platz 5 unter den krebsbedingten Todesursachen. Die Diagnose eines Pankreaskarzinoms bei einem Patienten stellt eine infauste Prognose dar. Die Überlebenszeit aller Patienten mit einem duktalen Pankreaskarzinom beträgt im Mittel nur 1 Jahr, und nur etwa 4% der Patienten überleben einen Zeitraum von 5 Jahren. Neben der speziellen Biologie des Pankreaskarzinoms ist auch die späte Diagnose dieser Tumore ein Grund für die schlechte Überlebensrate.

Die histologische Differentialdiagnose von Pankreastumoren ist oft schwierig. Es existieren verschiedene in der pathologischen Routine angewendete Antikörper (z. B. gegen Zytokeratin 18), mit welchen aber nicht immer eine Prognose zum Krankheitsverlauf möglich ist. Bei der Untersuchung von Absiedelungen (Metastasen) von verschiedenen Karzinomen des Pankreas, der Gallenwege und der Gallenblase, wie auch der Papilla vateri ist meist die histologische Zuordnung zum Primärtumor nicht möglich. Eine Zuordnung dieser Metastasen zum Primärtumor ist zur Wahl einer angepassten palliativen Chemotherapie wichtig.

Für die Früherkennung, die laborchemische Differentialdiagnose von Pankreastumoren zu anderen Bauchspeicheldrüsenerkrankungen und der Verlaufskontrolle nach Operation gibt es bisher nur einen Marker, das CA19-9. Dieser im Blut zu bestimmende Tumormarker ist allerdings nicht sehr spezifisch und sensitiv, d.h. es gibt Patienten mit chronischer Pankreatitis (Bauchspeicheldrüsenentzündung), welche einen stark erhöhten Ca19-9 Wert haben und Patienten mit normalem Ca19-9, welche einen Pankreastumor haben.

Die Behandlung des duktalen Pankreaskarzinoms ist derzeit auf die Operation und Chemotherapie begrenzt. Die operative Entferung des Tumors bietet als einzige Option eine Heilungschance. Die Chemotherapie mit dem meist eingesetzten Chemotherapeutikum bietet nur in wenigen Fällen eine Lebensverbesserung, aber keine Heilung. Es können zur Zeit nur weniger als 40% der Patienten kurativ behandelt werden und selbst dieser Teil der Patienten stirbt im Durchschnitt nach 2 Jahren. Die typischen Symptome im Endstadium des Pankreaskarzinoms sind eine Auszehrung des Körpers und starke Schmerzen. Beide Faktoren beeinträchtigen die Lebensqualtität der Patienten erheblich.

In den letzten Jahren wurden einige mit der Krebsentstehung in Verbindung stehende Gene im duktalen Adenomakarzinom des Pankreas identifiziert. K-ras, DPC4, p53 und p16 scheinen dabei eine wichtige Rolle bei der Entstehung des Pankreaskarzinoms zu spielen (1-4). Seit kurzem werden auch Microarray-Techniken zur Untersuchung der tumorspezifischen Genexpression bei verschiedenen Krebsarten, u.a. auch beim Pankreaskarzinom, angewendet (5-20). Bisherige Untersuchungen der tumorspezifischen Genexpression beim Pankreaskarzinom wurden mit ganzen Gewebeproben oder mit Zelllinien durchgeführt. In Zelllinien können aber durch die Bedingungen in vitro Veränderungen in der Genexpression induziert werden, die so in vivo nicht vorliegen.

Sowohl der Tumor als auch das Pankreasnormalgewebe verfügen über eine heterogene Struktur. Gewebeproben aus dem duktalen Adenomakarzinom des Pankreas enthalten daher verschiedene Zelltypen, wie duktale Zellen, azinöse Zellen, Inselzellen, Entzündungs- und Nervenzellen, sowie fibrozystische Elemente. Wenn ganze Gewebeproben in Microarray-Untersuchungen eingesetzt werden, kann das erhaltene Expressionsprofil sowohl das Tumorgewebe als auch das benachbarte nicht-neoplastische Gewebe repräsentieren, was die erhaltenden Daten fragwürdig erscheinen läßt.

Aufgabe der Erfindung ist es, neue Verfahren für die Diagnose und Prognose sowie neue Verbindungen für die Behandlung des Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms des Pankreas, bereitzustellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur in vitro Diagnose eines Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms des Pankreas, wobei die Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Gene in einer Probe biologischen Ursprungs eines Individuums bestimmt wird. Die Menge an Genprodukt in der Probe biologischen Ursprungs eines Individuums wird mit der Menge des entsprechenden Genprodukts, die in normalem Pankreasepithelgewebe üblicherweise vorliegt, verglichen. Falls es sich um ein in der Tabelle 1 aufgeführtes Gen handelt, ist eine erhöhte Menge des Genprodukt ein Indiz für das Vorliegen eines Pankreaskarzinoms. Falls es sich um ein in der Tabelle 2 aufgeführtes Gen handelt, ist eine erniedrigte Menge des Genprodukts ein Indiz für das Vorliegen eines Pankreaskarzinoms.

Der Erfindung liegt eine Untersuchung zugrunde, in der ermittelt wurde, welche Gene im Pankreaskarzinom eine veränderte Expressionshöhe gegenüber dem normalen Pankreasephithelgewebe erfahren. Dazu wurde eine Mikrodissektion von humanem Pankreastumorgewebe und von normalem ductalem Pankreasepithelgewebe durchgeführt und anschließend eine vergleichende Untersuchung der Genexpression mittels des U133 Sets von Affymetrix (Affymetrix Human Genome U133 Set, Santa Clara, CA, USA, Bestellnummer: 900444) durchgeführt, das 45 000 Fragmente, die zu 33 000 bekannten Genen und 6 000 expressed sequence tags (ESTs) korrespondieren, enthält.

Auf diese Weise wurden Nukleinsäuresequenzen und Proteine identifiziert, die im Pankreaskarzinom eine veränderte Expressionshöhe gegenüber dem normalen Pankreasepithelgewebe erfahren. Die veränderte Expression dieser Gene ist ursächlich mit dem Pankreastumor verbunden.

Bei der Erfindung zugrunde liegenden wissenschaftlichen Untersuchung wurde das Verfahren der Mikrodissektion zur Probengewinnung angewandt, um sicherzustellen, dass die verwendeten Pankreastumorgewebeproben homogen sind und kein nicht-neoplastisches Gewebe enthalten. Aufgrund der reduzierten Heterogenität des mikrodissektierten Gewebes können auch kleinste Veränderungen in der Genexpression beobachtet werden.

Zudem wurde in den bisherigen Untersuchungen nur ein kleiner Teil des menschlichen Transkriptoms untersucht. Damit war es bisher nicht möglich, alle Gene, deren Expression beim duktalen Adenomakarzinom des Pankreas verändert ist, zu identifizieren. Bei der zugrundelegenden Untersuchung mit dem Affymetrix U133 Chip wurde hingegen das komplette Genom untersucht.

Beim Vergleich der erhaltenen Genexpressionsprofile wurden insgesamt 1419 differentiell exprimierte Gene gefunden (650 hochregulierte und 769 herunterregulierte Gene). Überraschenderweise war nur ein Bruchteil dieser Gene bereits zuvor von anderen Gruppen als mit Pankreastumor in Verbindung stehend beschrieben worden. Von 1267 der gefundenen 1419 Gene war hingegen nicht bekannt, dass sie im Zusammenhang mit Pankreastumor stehen.

In Tabelle 1 sind Gene aufgeführt, deren Expression im duktalen Adenomakarzinom des Pankreas im Mittel mindestens doppelt so hoch ist wie die Expression in normalem Pankreasepithelgewebe. D. h. der Quotient („Fold Change") aus den Expressionswerten im mikrodissektierten duktalen Adenomakarzinom des Pankreas (Mittel über 14 Patienten) und den Expressionswerten im gesunden mikrodissektierten duktalen Pankreasepithelgewebe (Mittel über 11 Personen) ist für diese Gene > 2. Wird für ein Gen der Quotient („Fold Change") 1000 angegeben, bedeutet dies, dass das Gen nur in dem Tumor-, aber nicht in dem Normalgewebe nachgewiesen werden konnte. Die Gene sind fortlaufend nummeriert. Zur Charakterisierung werden jeweils die Identifikationsnummer des Affymetrix-Probensets, das Gensymbol, der Gen-Name, die chromosomale Lokalisation, die repräsentative Identifikationsnummer (ID), die Identifikationsnummer des Transkriptes und die des zugehörigen Proteins angegeben (Veröffentlichungsnummern in der Entrez-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). Der q-Wert (in Prozent) gibt an, mit welchem statistischen Fehler das verwendete Auswerteprogramm eine differentielle Genexpression voraussagt.

In Tabelle 2 sind Gene aufgeführt, deren Expression im duktalen Adenomakarzinom des Pankreas im Mittel maximal halb so hoch ist wie die Expression in normalem Pankreasepithelgewebe. D. h. der Quotient („Fold Change") aus den Expressionswerten im mikrodissektierten duktalen Adenomakarzinom des Pankreas (Mittel über 14 Patienten) und den Expressionswerten im gesunden mikrodissektierten duktalen Pankreasepithelgewebe (Mittel über 11 Personen) ist für diese Gene < 0,5. Wird für ein Gen der Quotient („Fold Change") 1000 angegeben, bedeutet dies, dass das Gen nur im Normalgewebe, aber nicht im Tumorgewebe nachgewiesen werden konnte. Die Gene sind ab der Nummer 541 fortlaufend nummeriert. Zur Charakterisierung werden jeweils die Identifikationsnummer des Affymetrix-Probensets, das Gensymbol, der Gen-Name, die chromosomale Lokalisation, die repräsentative Identifikationsnummer (ID), die Identifikationsnummer des Transkriptes und die des zugehörigen Proteins angegeben (Veröffentlichungsnummern in der Entrez-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). Der q-Wert (in Prozent) gibt an, mit welchem statistischen Fehler das verwendete Auswerteprogramm eine differentielle Genexpression voraussagt.

Die Probe biologischen Materials, die zur Diagnose des Pankreaskarzinoms einem Patienten entnommen wird, ist eine Gewebe- oder Blut- oder Serumprobe, die Proteine und/oder Nukleinsäuren enthält. Bevorzugt enthält die Probe Pankreasgewebe, das durch während der operativen Entfernung oder einer Feinnadelbiopsie oder einer ERCP einem Patienten entnommen wird. Das entnommene Gewebe wird in flüssigen Stickstoff eingefroren oder in andere Flüssigkeiten z.B: RNAlater eingebracht, welche die Integrität der RNA, der DNA und der Proteine gewährleistet. Alsdann werden von dem gefrorenen Gewebeblock in einem Kryostaten einzelne Schnitte mit der größe von ca. 10 μm hergestellt. Diese Schnitte werden in Ethanol fixiert und mit Hematoxilin angefärbt. Unter dem Mikrospkop wird dann mittels eines spitzen Gegenstandes oder eines Laserstrahls das entsprechende interessierende Gewebe herausgelöst und in ein Behältnis gegeben. Dazu wird eine Flüssigkeit hinzugefügt, welche die in dem Gewebe enthaltene RNA, DNS, oder Protein- Moleküle konserviert.

Alternativ erfolgt die Bestimmung in einer Blutprobe oder Serum oder Plasma, das aus dem Blut des Patienten gewonnen wurde. Desweiteren erfolgt die Bestimmung in einer Probe des Stuhls, der Gallengangs- oder der Pankreasflüssigkeit die aus dem Patienten gewonnen wurde.

In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens wird zusätzlich die Menge an entsprechendem Genprodukt in einer Kontrollprobe untersucht und mit der Menge an Genprodukt in der Patientenprobe verglichen. Bei der Kontrollprobe handelt es sich bevorzugt um die entsprechende Gewebeprobe eines Gesunden oder gesundes Pankreasgewebe eines an Pankreaskarzinom Erkrankten.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens wird zusätzlich die Menge an Genprodukt mindestens eines Referenzgens bestimmt.

Bei dem Referenzgen handelt es sich vorzugsweise um ein Gen, das sowohl im Pankreaskarzinom als auch im normalen Pankreasepithelgewebe exprimiert wird und im Pankreaskarzinom keine veränderte Expressionshöhe gegenüber dem normalen Pankreasepithelgewebe erfährt. Bevorzugte Referenzgene sind konstitutiv exprimierte sog. household genes. Bevorzugte Referenzgene sind beta-Actin (NM_001101), Cyclophilin A (NM_021130) oder G6PD (NM_000402).

In den Tabellen 3 und 4 sind weitere Gene aufgeführt, die im Pankreaskarzinom eine veränderte Expressionshöhe gegenüber dem normalen Pankreasepithelgewebe erfahren.

Von diesen Genen war bereits vor der der Erfindung zugrundeliegenden Untersuchung des kompletten Transkriptoms bekannt, dass sie mit Pankreaskarzinom in Verbindung stehen.

In Tabelle 3 sind dabei Gene aufgeführt, deren Expression im duktalen Adenomakarzinom des Pankreas im Mittel mindestens doppelt so hoch ist wie die Expression in normalem Pankreasepithelgewebe. D. h. der Quotient („Fold Change") aus den Expressionswerten im mikrodissektierten duktalen Adenomakarzinom des Pankreas (Mittel über 14 Patienten) und den Expressionswerten im gesunden mikrodissektierten duktalen Pankreasepithelgewebe (Mittel über 11 Personen) ist für diese Gene > 2. Wird für ein Gen der Quotient („Fold Change") 1000 angegeben, bedeutet dies, dass, dass das Gen nur in dem Tumor-, aber nicht in dem Normalgewebe nachgewiesen werden konnte. Die Gene sind ab Nummer 1268 fortlaufend nummeriert. Zur Charakterisierung werden jeweils die Identifikationsnummer des Affymetrix-Probensets, das Gensymbol, der Gen-Name, die chromosomale Lokalisation, die repräsentative Identifikationsnummer (ID), die Identifikationsnummer des Transkriptes und die des zugehörigen Proteins angegeben (Veröffentlichungsnummern in der Entrez-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). Der q-Wert (in Prozent) gibt an, mit welchem statistischen Fehler das verwendete Auswerteprogramm eine differentielle Genexpression voraussagt.

In Tabelle 4 sind Gene aufgeführt, deren Expression im duktalen Adenomakarzinom des Pankreas im Mittel maximal halb so hoch ist wie die Expression in normalem Pankreasepithelgewebe. D. h. der Quotient („Fold Change") aus den Expressionswerten im mikrodissektierten duktalen Adenomakarzinom des Pankreas (Mittel über 14 Patienten) und den Expressionswerten im gesunden mikrodissektierten duktalen Pankreasepithelgewebe (Mittel über 11 Personen) ist für diese Gene < 0,5. Wird für ein Gen der Quotient („Fold Change") 1000 angegeben, bedeutet dies, dass das Gen nur im Normalgewebe, aber nicht im Tumorgewebe nachgewiesen werden konnte. Die Gene sind ab der Nummer 1378 fortlaufend nummeriert. Zur Charakterisierung werden jeweils die Identifikationsnummer des Affymetrix-Probensets, das Gensymbol, der Gen-Name, die chromosomale Lokalisation, die repräsentative Identifikationsnummer (ID), die Identifikationsnummer des Transkriptes und die des zugehörigen Proteins angegeben (Veröffentlichungsnummern in der Entrez-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). Der q-Wert (in Prozent) gibt an, mit welchem statistischen Fehler das verwendete Auswerteprogramm eine differentielle Genexpression voraussagt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt zusätzlich zur Bestimmung der Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Gene in einer Probe biologischen Ursprungs eines Individuums noch die Bestimmung der Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführten Gene. Die Menge an Genprodukt in der Probe biologischen Ursprungs eines Individuums wird mit der Menge des entsprechenden Genprodukts, die in normalem Pankreasepithelgewebe üblicherweise vorliegt, verglichen. Falls es sich um ein in der Tabelle 3 aufgeführtes Gen handelt, ist eine erhöhte Menge des Genprodukt ein Indiz für das Vorliegen eines Pankreaskarzinoms. Falls es sich um ein in der Tabelle 4 aufgeführtes Gen handelt, ist eine erniedrigte Menge des Genprodukts ein Indiz für das Vorliegen eines Pankreaskarzinoms.

Durch die Messung eines solchen zusätzlichen Markers (Gene aus Tabelle 3 und/oder Tabelle 4) wird die Aussagekraft des erfindungsgemäßen Verfahrens noch weiter erhöht.

Ein Genprodukt ist eine mRNA, die daraus durch reverse Transkription erhältliche cDNA, das kodierte Protein oder Fragmente davon. Die Quantifizierung der Genprodukte erfolgt dabei jeweils mit den gängigen Verfahren.

Die Genprodukte mRNA bzw. die durch reverse Transkription der mRNA erhältliche cDNA werden bevorzugt durch den Einsatz von Hybridisierungstechniken quantifiziert, beispielsweise durch einen Northern Blot, in situ Hybridisierung mit antisense-RNA, quantitative PCR (polymerase chain reaction) oder mit Hilfe eines Oligonukleotid- oder eines cDNA-Mikroarrays (z.B. DNA-Chip).

Die Oligonukleotide, die für die verschiedenen Nachweistechniken mittels Hybridisierung eingesetzt werden, haben Sequenzen, die komplementär zu Teilsequenzen des zu detektierenden Genprodukts sind, und sind vorzugsweise mit einem chromogenen, radioaktiven, fluoreszierenden oder durch andere gängige Methoden detektierbaren Markermolekül markiert. Beispiele für solche Markermoleküle sind Digoxygenin, Biotin, Fluorescein, ³²P ³³P, usw.

Bevorzugt erfolgt die quantitative Messung der Expression des Genprodukts mRNA mittels quantitativer RT-PCR. In dem bekannten Prozess der RT-PCR wird zunächst mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) basierend auf der isolierten RNA komplementäre DNA (cDNA) synthetisiert. Als Primer für die RT kann grundsätzlich ein Oligo-dT verwendet werden. Die Verwendung von Random-Hexamer-Primern für die RT führt jedoch zu einer deutlichen Erhöhung der Sensitivität. Das Random-Hexamer-Oligonukleotid enthält jeweils eine Mischung von A, G, T, C an allen sechs Positionen und hybridisiert unspezifisch mit mRNA-Sequenzen.

Einzelne cDNAs werden in der anschließenden PCR mit einem sequenzspezifischen Primerpaar amplifiziert. Die Primer für die PCR haben bevorzugt eine Länge von 15 bis 30 Basenpaaren und werden Intron-überlappend konzipiert, um im Falle einer Verunreinigung der RNA mit genomischer DNA nur cDNA zu amplifizieren.

Besonders bevorzugt wird die PCR als Real-time-PCR durchgeführt. Bekannte Real-time PCR Verfahren sind z. B. die TaqMan^®, FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer), LightCycler^® und Beacon-Verfahren. Durch die Verwendung von Fluoreszenz-markierten Primern oder den Einsatz von genspezifischen Oligonukleotiden als Hybridisierungsproben mit unterschiedlicher Farbstoff- oder Fluoreszenzmarker-Anbindung (TaqMan^®, FRET, Beacon) kann bei diesen Verfahren vorteilhaft das PCR-Produkt während der PCR spezifisch quantifiziert werden.

Die PCR-Verfahren eignen sich auch zur Durchführung als Multiplex-PCR. Bei einer Multiplex-PCR unterscheiden sich die Fluoreszenzfarbstoffe, mit denen die Primer bzw. Hybridisierungssonden markiert sind, in ihren Absorptions- und/oder Emissionsspektren. Dies ermöglicht beispielsweise eine parallele Quantifizierung der amplifizierten cDNAs verschiedener pankreastumorspezifischen Gene bzw. die parallele Quantifizierung der cDNA eines Referenzgens bzw. einer Referenzprobe.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose mittels RT-PCR wird bevorzugt ein diagnostischer Kit verwendet, der jeweils folgende Bestandteile enthält:

1) für die cDNA-Synthese: a) Random-Hexamer-Primer, b) Reverse Transkriptase;
2) für die PCR: a) mindestens zwei Primer, die mit der cDNA eines der Gene, ausgewählt aus den Gruppen der tumorspezifischen Gene aus den Tabellen Nr. 1 und/oder Nr. 2 hybridisieren; b) eine über 80°C beständige DNA-Polymerase, wie z. B. Taq-Polymerase; sowie dNTP-Mix (bevorzugt 10mmol/l), DDT, RNase-Inhibitor und entsprechende Reaktionspuffer.

In einer weniger bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit für die cDNA-Synthese oligo-dT anstelle des Random-Hexamers.

In einer alternativen Ausführungsform enthält das Kit zusätzlich mindestens zwei Primer, die mit der cDNA eines der Gene, ausgewählt aus den Gruppen der tumorspezifischen Gene aus den Tabellen 3 und 4 hybridisieren.

In einer Ausführungsform des Kits ist jeweils einer der Primer für das tumorspezifische Gen Fluoreszenz-markiert.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der diagnostische Kit zur Durchführung einer Real-Time PCR bevorzugt als zusätzliche Bestandteile:

c) eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde oder ein Paar Fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonden, die spezifisch mit einem tumorspezifischen Gen aus Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 hybridisieren, und
d) eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde oder ein Paar Fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonden, die spezifisch mit dem Referenzgen hybridisieren.

Sowohl als Primer, als auch als Hybridisierungssonden werden bevorzugt DNA-Oligonukleotide mit einer Länge von 10 bis 30 Nukleotiden gewählt.

In einer Ausführungsform enthält die Hybridisierungssonde neben dem Fluoreszenzfarbstoff einen weiteren Farbstoff, der durch einen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) die Fluoreszenz quencht, solange die Probe nicht mit der amplifizierten cDNA hybridisiert.

In einer alternativen Ausführungsform des Kits werden zwei Hybridisierungssonden eingesetzt, bei denen jeweils eine Sonde mit einem Farbstoff markiert ist. Ein solches Sondenpaar wird so gewählt, dass sie in einem geringen Abstand, bevorzugt im Abstand von 1-5 bp, auf der amplifizierten cDNA hybridisieren. Durch die Hybridisierung werden die Fluoreszenzfarbstoffe so nahe zueinander gebracht, dass FRET stattfindet und die cDNA quantifiziert werden kann. Anschließend werden (in der Extensionsphase der PCR), durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase, die Sonden von der cDNA abgetrennt. In einer bevorzugten Variante ist in einem Sondenpaar, die erste Sonde am 3'-Ende mit Fluoreszein (FL) und die andere an ihrem 5'-Ende mit LightCycler-Red-640 markiert.

Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonden sind z. B. als LightCycler^®, TaqMan^® oder „molecular beacons" auf dem Markt und ermöglichen eine Quantifizierung während der PCR.

Der Nachweis über Hybridisierung erfolgt in einer alternativen Ausführung des Verfahrens unter Verwendung eines Nukleinsäure-Arrays, z.B. eines DNA-Chips.

DNA-Chips, auch als DNA-Mikroarrays bekannt, sind miniaturisierte Träger, meist aus Glas oder Silizium, auf deren Oberfläche DNA-Moleküle bekannter Sequenz in einem geordneten Raster in hoher Dichte immobilisiert werden. Die oberflächengebundenen DNA-Moleküle werden mit komplementären, eventuell markierten Nukleinsäuren hybridisiert. Die Markierung ist vorzugsweise ein Fluoreszenzfarbstoff.

Bei Oligonukleotid-Chips stellen die Oligonukleotide, die auf einem erfindungsgemäßen DNA-Chip gebunden sein können, Teilsequenzen der Genprodukte (mRNA, bzw. daraus abgeleitete cDNA) in der sense- oder antisense-Richtung dar. Es können ein oder mehrere Oligonukleotide pro Gen auf dem DNA-Chip gebunden sein. Bevorzugt sind 25 Nukleotid lange Oligonukleotide, die aus dem nicht kodierenden Strang abgeleitet sind. Diese werden bevorzugt aus dem jeweiligen 3' untranslatierten Ende des Gens ausgewählt. Zur Detektion können Oligonukleotide von einem Gen, mehreren Genen oder allen Genen ausgewählt werden.

Die Erfindung betrifft daher weiterhin die Verwendung mindestens eines Oligonukleotids, das der vollständigen cDNA-Sequenz oder einer Teilsequenz bzw. komplementären Sequenz eines der in Tabelle 1 und/oder 2 aufgeführten Gene entspricht, zur Diagnoses des Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms des Pankreas. Das Oligonukleotid kann dazu als Primer in einer PCR oder als Hybridisierungssonde eingesetzt werden. Das verwendete Oligonukleotid bzw. die verwendeten Oligonukleotide sind dabei vorzugsweise auf einem festen Träger (DNA-Chip) immobilisiert.

In einer alternativen Ausführungsform wird zusätzlich mindestens ein Oligonukleotid, das der vollständigen cDNA-Sequenz oder einer Teilsequenz bzw. komplementären Sequenz eines der in Tabelle 3 und/oder 4 aufgeführten Gene entspricht, zur Diagnoses des Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms des Pankreas verwendet. Das verwendete Oligonukleotid bzw. die verwendeten Oligonukleotide sind dabei vorzugsweise auf einem Chip immobilisiert.

Ist das zu quantifizierende Genprodukt ein Protein oder ein Proteinfragment, erfolgt die Bestimmung der Menge an Genprodukt vorzugsweise durch Antikörper-basierte Nachweismethoden.

Dazu werden spezifische Antikörper gegen eines oder mehrere Proteine, die von den in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Genen kodiert werden, hergestellt. In einer alternativen Ausführungsform werden zusätzlich Antikörper gegen eines oder mehrere Proteine, die von den in Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführten Genen kodiert werden, eingesetzt.

Bei den Antikörpern handelt es sich beispielsweise um monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, single chain Antikörper oder Fragmente davon. Sie sind spezifisch für das gesamte Protein oder nur gegen Fragmente davon. Die Gewinnung eines solchen Antikörpers erfolgt nach Standardmethoden beispielsweise durch Immunisierung von Versuchstieren. Die Antikörper werden dann z.B. in einem ELISA (enzyme linked immunsorbent assay), in einem RIA (radio-immunoassay) oder in der Immunhistochemie zur Quantifizierung des Genprodukts verwendet.

Ein Antikörper-Array bzw. Antikörperchip, auf dessen Oberfläche mindestens ein Antikörper, der spezifisch für ein von den in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Genen kodiertes Protein ist, in einem geordneten Rahmen in hoher Dichte immobilisiert ist, eignet sich ebenfalls zur erfindungsgemäßen Diagnose des Pankreaskarzinoms. Die Dektektion der Protein-Protein-Interaktion erfolgt vorzugsweise durch Massenspektrometrie, Fluoreszenz oder surface plasmon resonance.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörper-Chips zur Diagnose des Pankreaskarzinoms.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Beurteilung des Krankheitsverlaufs, um z.B. den Erfolg einer Therapie zu bestimmen. In diesem Fall wird die Patientenprobe mit einer älteren Probe des Patienten verglichen.

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen nach Wirkstoffen, die zur Therapie des Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms des Pankreas, geeignet sind.

Dabei wird beispielsweise eine Zelllinie eines pankreatischen duktalen Adenomakarzinoms mit einer zu testenden Substanz kontaktiert. Anschließend wird die Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Gene bestimmt. Die Menge an Genprodukt wird dann mit der Menge des entsprechenden Genprodukts, die in einer entsprechenden nicht mit der Testsubstanz kontaktierten Zelllinie vorliegt, verglichen.

Falls es sich um ein in Tabelle 1 aufgeführtes Genprodukt handelt, ist eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie erniedrigte Menge des Genprodukts ein Hinweis darauf, dass die Testsubstanz ein potenzieller Wirkstoff für die Therapie des Pankreaskarzinoms ist. Falls es sich um ein in Tabelle 2 aufgeführtes Genprodukt handelt, ist eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie erhöhte Menge des Genprodukts ein Hinweis darauf, dass die Testsubstanz ein potenzieller Wirkstoff für die Therapie des Pankreaskarzinoms ist.

In einer alternativen Ausführungsform des Screeningverfahrens werden zusätzlich zur Expression von mindestens einem der in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Gene die Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführten Gene bestimmt.

Falls es sich um ein in Tabelle 3 aufgeführtes Genprodukt handelt, ist eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie erniedrigte Menge des Genprodukts ein Hinweis darauf, dass die Testsubstanz ein potenzieller Wirkstoff für die Therapie des Pankreaskarzinoms ist. Falls es sich um ein in Tabelle 4 aufgeführtes Genprodukt handelt, ist eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie erhöhte Menge des Genprodukts ein Hinweis darauf, dass die Testsubstanz ein potenzieller Wirkstoff für die Therapie des Pankreaskarzinoms ist.

Die Erfindung betrifft zudem die Verwendung mindestens eines Antisense-Konstrukts, das mindestens 12 Nukleotide einer kodierenden Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 1 aufgeführt ist, wobei die kodierende Sequenz bezüglich des Promotors, der ihre Expression kontrolliert, in 3' zu 5' Orientierung vorliegt, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen, wobei das Antisense-Produkt den Krebszellen verabreicht wird, so dass das Antisense-Konstrukt in den Krebszellen exprimiert wird.

Unter Antisense-Konstrukt wird dabei eine Sequenz verstanden, die zu der kodierenden Sequenz oder einer Teilsequenz der codierenden Sequenz komplementär ist, d. h. in der Lage ist mit der codierenden Sequenz über Basenpaarung einen Nukleinsäuredoppelstrang zu bilden.

In einer alternativen Ausführungsform wird zusätzlich mindestens ein Antisense-Konstrukt, das mindestens 12 Nukleotide einer kodierenden Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 3 aufgeführt ist, wobei die kodierende Sequenz bezüglich des Promotors, der ihre Expression kontrolliert, in 3' zu 5' Orientierung vorliegt, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen verwendet, wobei das Antisense-Produkt den Krebszellen verabreicht wird, so dass das Antisense-Konstrukt in den Krebszellen exprimiert wird.

Das Antisense-Konstrukt wird vorzugsweise durch chemische Synthese, auch unter Verwendung von stabilisierenden Nukleotidanaloga, gewonnen.

Teil der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung mindestens eines doppelsträngigen RNA-Konstrukts (siRNA – small interfering RNA), das mindestens 19 Basenpaare, besonders bevorzugt 21 oder 22 Basenpaare, maximal 29 Basenpaare, einer kodierenden Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 1 aufgeführt ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen. Die doppelsträngige RNA wird z.B. chemisch hergestellt oder mit bekannten biologische Verfahren, beispielsweise in vitro Transkription, den Einsatz von siRNA-Expressionvektoren oder PCR-Expressionskassetten.

In einem bevorzugten Verfahren wird dazu beispielsweise ein cDNA Klon verwendet. Aus diesem wird mittels PCR der kodierende Teil eines in Tabelle 1 aufgeführten Gens vervielfältigt und dann durch eine in vitro Transkription doppelsträngige RNA (dsRNA) hergestellt. Diese dsRNA wird dann mit dem Enzym Dicer verdaut. Dabei entstehen die für die Wirkung notwendigen kleinen Stücke in einer Länge von z.B. 21 bp. Das entstandene Gemisch wird dann zur Therapie eingesetzt. Dabei werden die siRNA Moleküle beispielsweise intravenös dem Patienten zugeführt. Die siRNA wirken hierbei gegen die Expression der im Pankreaskarzinom spezifisch überexprimierten Gene.

In einer alternativen Ausführungsform wird zusätzlich mindestens ein doppelsträngiges RNA-Konstrukt, das mindestens 19 Basenpaare, besonders bevorzugt 21 oder 22 Basenpaare, maximal 29 Basenpaare, einer kodierenden Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 3 aufgeführt ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen verwendet. Die doppelsträngige RNA ist dabei z.B. chemisch herstellbar oder über bekannte biologische Verfahren. Dazu wird beispielsweise ein cDNA Klon verwendet. Aus diesem wird mittels PCR der kodierende Teil eines in Tabelle 3 aufgeführten Gens vervielfältigt und dann durch eine in vitro Transkription dsRNA hergestellt. Diese dsRNA wird dann mit dem Enzym Dicer verdaut. Dabei entstehen die für die Wirkung notwendigen kleinen Stücke in einer Länge von z.B. 21 bp. Das entstandene Gemisch wird dann zur Therapie eingesetzt.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung mindestens eines Polynukleotids, das eine kodierende Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 2 aufgeführt ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen, wobei das Polynukleotid den Krebszellen verabreicht wird, so dass das Gen in den Krebszellen exprimiert wird.

In einer alternativen Ausführungsform wird zusätzlich mindestens ein Polynukleotid, das eine kodierende Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 4 aufgeführt ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen verwendet, wobei das Polynukleotid den Krebszellen verabreicht wird, so dass das Gen in den Krebszellen exprimiert wird.

Das Polynukleotid wird dazu in einen viralen Vektor eingebracht und den Patienten direkt in den Tumor oder intravenös appliziert. Das Polynukleotid, in Verbindung mit einem Promotor für die Transkription, kann auch als freie DNA dem Patienten in einem Komplex mit Lipiden oder ohne eine Lipid-Komplex dem Patienten intratumoral oder intra-venös zugeführt werden.

Durch nachfolgende Figuren und Ausführungsbeispiele werden die Erfindung und die der Erfindung zugrunde liegende wissenschaftliche Erkenntnis näher erläutert. Dabei zeigen

1:

1 zeigt photographische Aufnahmen einer manuellen Mikrodissektion von Pankreasgewebe. Dabei sind in der linken Spalte die Gewebeschnitte vor der Mikrodissektion und in der rechten Spalte nach der Mikrodissektion abgebildet. Die obere Zeile zeigt Gewebe aus duktalem Adenomakarzinom des Pankreas, die untere Zeile normales duktales Epithelgewebe.

2:

2 zeigt photographische Aufnahmen präparierter Gewebeschnitte nach immunhistochemischer Analyse.

2A, B zeigt eine Aufnahme eine CENPF-Proteinexpression in duktalen Adenokarzinomen des Pankreas (PDAC), während 2C die nicht vorhandene Expression des CENPF Proteins in normalem Pankreasgewebe zeigt.

2D, E zeigt eine Aufnahme eine MCM7-Proteinexpression in duktalen Adenokarzinomen des Pankreas (PDAC), während 2F die nicht vorhandene Expression des MCM7 Proteins in normalem Pankreasgewebe zeigt.

2G, H zeigt eine Aufnahme eine MCM2-Proteinexpression in duktalen Adenokarzinomen des Pankreas (PDAC), während 2I die nicht vorhandene Expression des MCM2 Proteins in normalem Pankreasgewebe zeigt.

3:

3 zeigt die Validierung der differentiellen Expression mittels RT-PCR.

3A: RT-PCR Analyse von 5 Genen in vier Tumor und korrespondierendem Normalgewebe. Die entstandenen PCR Produkte wurden mittels einem Agarosegel separiert und mit Ethidiumbromidanfärbung sichtbar gemacht.

3B: Überblick über die RT-PCR Ergebnisse von Tumor- und Normalgewebe (oben), als auch Pancreaszellinien (unten). Weiss: nicht untersucht; Hellgrau: kein verwertbares PCR Signal; Mittelgrau: schwaches PCR Signal nachweisbar; Dunkelgrau: mittelstarkes PCR-Signal und Schwarz: Starkes PCR Signal nachweisbar. Die Housekeepinggene GAPDH und G6PD dienten als Vergleichskontrolle.

Ausführungsbeispiel 1: Identifizierung von Pankreaskarzinom-assoziierten Genen
Es wurde nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff frisch eingefrorenes Gewebe aus duktalem Pankreaskarzinom (N=14) und aus normalem Pankreasgewebe (N=11) verwendet. Das Normalgewebe entstammte aus Proben des Hauptduktes, die keine sichtbaren dysplastischen Veränderungen enthielten.
Von den Gewebestücken wurden dann wenige 10 μm dicke Schnitte geschnitten und sofort in 70% Ethanol fixiert. Diese Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt und eingedeckt. Diese Probeschnitte dienten als Vorlage für die Mikrodissektion, da an ihnen die Areale eingezeichnet wurden, welche für die Mikrodissektion geeignet schienen. Von dem Gewebeblock wurden dann 5 μm dicke Serienschnitte angefertigt. Diese Schnitte wurden in RNase freiem 70% Ethanol fixiert und auch kurz mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Tumor- und Normale Zellen wurden aus diesen Gewebeschnitten mit einer sterilen Kanüle aus den Schnitten herausgekratzt. Pro Gewebestück wurden ca. 10000 bis 11000 Zellen isoliert, wobei darauf geachtet wurde, dass ca. 95% des mikrodisseziierten Gewebes aus Tumor bzw. normalen Epithelzellen bestand (1). Die Zellen wurden dann in eiskaltem GTC-Puffer (Guanidin-Thiocyanat-Puffer, Promege, Heidelberg) gesammelt. Aus den Zellen wurde dann die Poly-A+-RNA mittels eines Reaktionssystems (PolyAttract 1000, Promega, Heidelberg), gemäß der Anleitung, isoliert. Mit jeder Probe wurde dann dreimalig cDNA-Synthese mit anschliessender repetitiver in-vitro-Transkription durchgeführt (21). Zusammenfassend wird die cDNA-Synthese durch das Hybridisieren mit dem Affymetrix T7-oligo-dT Promoter-Primer in einer Konzentration von 0.1 mmol/l initiiert. Die Zweitstrang-Synthese geschieht durch internes Primen. Anschliessend wird eine in-vitro-Transkription unter Verwendung des Ambion Megascript T7 Reaktionssystem (Ambion, Huntington, UK) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die so hergestellte aRNA wird dazu verwendet, um erneut eine cDNA-Synthese zu initiieren, bei der die Zweitstrangsynthese durch Random-Hexamer Primer initiiert wird. Bei der dritten in-vitro-Transkription wird erneut so verfahren, allerdings werden dabei Biotin-markierte Nukleotide nach den Affymetrix-Herstellerangaben zugegeben. Die weitere Vorbereitung der Proben und die Hybridisierung verläuft nach den Angaben von Affymetrix.
Das Affymetrix 0133 Gene Chip Set besteht aus zwei GeneChips, auf welchen mehr als 44000 Probesets aufgetragen worden sind. Dadurch werden ca. 33.000 humane Gene und ca. 6000 humane ESTs repräsentiert. Nach der Hybridisierung werden die Signalintensitäten durch die Affymetrix MAS 5.0 Software ausgelesen und in der sogenannten Cel-Datei gespeichert. Diese wird dann zur weiteren Daten-Analyse verwendet. Zur Analyse werden die Dateien aller Experimente in das Programm dChip 1.3 (http://www.dchip.org) geladen, normalisiert und die Expressions-Werte, als auch die Werte für den Nachweis (Absolute Calls) werden mit dem PM/MM Modell bestimmt. Diese Werte werden dann in Excel und in SAM (http://www-stat.stanford.edu/ftibs/SAM/) eingelesen. Eine differentielle Expression wurde dann nachgewiesen, wenn folgende Kriterien erfüllt waren: Ein Quotient > 2 und ein q-Wert < 15% oder ein Presence call in wenigstens 60% eines Probentyps ohne einen Presence Call in dem anderen Probentyp (Tabellen 1 bis 4).
Von den 616 differentiell exprimierten Gene wurden folgende zur Validierung mittels RT-PCR ausgewählt (3):
PLAG1 (Gen-Nr. 159, Tabelle 1), PTTG1 (Gen-Nr. 1315, Tabelle 3), osf-2/POSTN (Gen-Nr. 1303, Tabelle 3), RAMP (Gen-Nr. 138, Tabelle 1), ECT2 (Gen-Nr. 506, Tabelle 1), CFLAR (Gen-Nr. 526, Tabelle 1), CCNB1 (Gen-Nr. 1287, Tabelle 3), CCNB2 (Gen-Nr. 203, Tabelle 1), UP/UPP1 (Gen-Nr. 176, Tabelle 1), MADD (Gen-Nr. 1269, Tabelle 3), LOXL2 (Gen-Nr. 184, Tabelle 1), HOXC6 (Gen-Nr. 158, Tabelle 1), EFNB2 (Gen-Nr. 186, Tabelle 1), IRAK1 (Gen-Nr. 370, Tabelle 1) und CENPF (Gen-Nr. 108, Tabelle 1). Die Housekeepinggene GAPDH und G6PD dienten als Vergleichskontrolle.
Für die RT-PCR Analyse wurden 9 Proben von Normalgewebe und 13 von PDAC-(pankreas ductal polyademona carcinom) Gewebe auf die Expression der ausgewählten Gene untersucht. Dazu wurde die RNA aus normalem pankreatischen Gewebe und von pankreatischem Tumorgewebe mit Hilfe des „Micro to Mini Total RNA Purification Kit" (Invitrogen) nach Herstellerangaben isoliert. Nach der reversen Transkription mit random Hexamer-Primern und der „Superscript" Reversen Transkriptase (Invitrogen) folgte eine PCR Amplifikation (58°C Annealing Temperatur, 27 Zyklen) unter Standardbedingungen. Die Primer für die PCR-Amplifikation wurden von MWG-Biotech, Ebersberg, synthetisiert. Es wurden folgende Primer eingesetzt:
Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese separiert und mit Ethidiumbromid angefärbt.
Die Gesamt-RNA aus pankreatischen Zelllinien wurde mit dem RNAeasy RNA isolation kit (Qiagen, Hilden) isoliert und wie oben in cDNA transkribiert. Zur quantitativen PCR-Detektion wurde ein ABI Sequence Detection System 7700 und der Sybr Green Master Mix (ABI, Weiterstadt) nach Herstellerangaben eingesetzt.
Ausführungsbeispiel 2: Immunhistochemie zum Nachweis der MCM2, der MCM7 oder der CENPF Proteinexpression in Pankreastumoren zur Diagnose:
2 zeigt die Ergebnisse einer immunohistochemischen Analyse der MCM2 (Gen-Nr. 107, Tabelle 1), MCM7 (Gen-Nr. 395, Tabelle 1) und der CENPF-Proteinexpression (Gen-Nr. 108, Tabelle 1) in Pankreasgewebeschnitten. Zur Herstellung dieser Schnitte wird Pankreasgewebe in einem operativen Eingriff entnommen und zur Fixierung in gepuffertem 4% Formalin eingelegt. Nach der Fixierung wird das Gewebe nach einer gängigen Methode in Paraffin eingebettet (22). Von diesem in Paraffin eingebetteten Gewebe werden Schnitte mit einer Dicke von 4 μm mit einem Mikrotom (Leica, Nussloch) angefertigt und auf speziell vorbereitete Objektträger (Superfrost; Menzel Gläser, Braunschweig) aufgezogen. Danach werden die Schnitte durch eine Inkubation in Xylol von dem Paraffin befreit. Danach werden die Schnitte durch die Inkubation in einer absteigenden Alkoholreihe (100% Ethanol bis 0% Ethanol) rehydriert.
Danach werden die Schnitte für 2 min in einem Schnellkochtopf gekocht während sie in einem Tris-EDTA-Citrat Puffer verbleiben und anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen. Danach werden die Schnitte mit einer Lösung eines MCM2, MCM7 oder CENPF spezifischen primären Antikörper versetzt. Dieser Antikörper, wie z. B. ein mit humanem CENPF (Klon D8; Abcam Ltd., Cambridge, UK), humanem MCM2 (Klon CRCT2; Novocastra, Newcastle, UK), oder humanem MCM7 (Klon CRCT7; Novocastra), werden dazu in definierten Konzentration in einer Lösung aus PBS welcher 2% Pferdeserum (erhältlich von Vector Laboratories, Alexis, Grünberg) enthält gelöst. Nach einer Inkubation der Schnitte mit der Antikörperlösung für 45 min bei Raumtemperatur, werder, die Schnitte 2 mal mit PBS für jeweils 5 min gewaschen.
Die Bindung dieser Antikörper an die jeweiliegen Zielmoleküle wird mit der folgenden Reaktion nachgewiesen:
Die Schnitte werden mit einem biotinylierten anti-Ziegen-IgG Antikörper (erhältlich als fertiges Reagenziensystem bei Vector Laboratories) in einer Konzentration von 5μg/ml inkubiert. Danach werden die Schnitte mit dem Reagenziensystem Avidin-Biotin Peroxidase (ABC ELITE, Vector Laboratories) inkubiert. Dabei wird nach der Beschreibung in den Reagenzienssystemen verfahren. Zum Schluss werden die Schnitte mit einer Lösung von Diaminobenzidin (Sigma, Taufkirchen) in 0,05 mol/l Tris-HCI pH7,0 bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden die Schnitte mit einem Standardverfahren mit Hematoxylin gefärbt und eingedeckt.
Die Färbung wird dann mikroskopisch beurteilt. Dabei steht eine positive Färbung für eine Proteinexpression.
Ein Tumor äußert sich dabei in der Anfärbung der Zellen für eines der drei Proteine, während nichtmalignes Gewebe keine oder nur vernachlässigbare geringe Anfärbung zeigt. Photographische Aufnahmen derart präparierter Gewebeschnitte werden in 2 dargestellt:
Ausführungsbeispiel 3: Nachweis CENPF-mRNA-Expression
Die Analyse der CENPF-mRNA-Expression (Gen-Nr. 108, Tabelle 1) erfolgt in isolierter RNA aus Gewebestücken des Pankreas zum Nachweis eines Tumors.
Dazu wird die RNA mit Standardverfahren und Reagenziensystemen aus Gewebestücken des Pankreas isoliert (RNeasy der Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland). Dabei wird nach dem Protokoll des Reagenziensystems verfahren. Danach wird die RNA mit dem Enzym Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Die dazu notwendige Transkriptionsinitiierung wird hierbei von „Random Hexameren" (Oligonucleotide bestehend aus je 6 Nukleotiden mit variabler Sequenz) übernommen (Invitrogen, Karlsruhe). Es werden zu dem Ansatz 100 pg der „Random Hexamere" gegeben. Die Synthese wird ansonsten gemäss der Beschreibung des Herstellers durchgeführt. Nach dieser Reaktion wird die cDNA in eine quantitative PCR eingesetzt. Dazu wird 1 μl der cDNA-Lösung verwendet. Die cDNA wird zu einem Ansatz von 24 μl aus einem Mastermix bestehend aus Puffer, Taq-DNA-Polymerase (Sybr Green PCR Mastermix der Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt) und den genspezifischen Primern 5'-GTCAGCGACAAAATGCAGAA-3' (SEQ-ID 33) und 5'-ACTCCTGGTCCAGTGTTTGG-3' (SEQ-ID 34) gegeben. Dabei liegen in dem Mix die Primer in einer Konzentration von 300 nmol/l vor. Zur Herstellung dieses Mixes werden für jede Bestimmung 12,5 μl des Sybr Green PCR Mastermix jeweils 1 μl der Primer aus einer Lösung mit einer Konzentration von 3 μmol/l und 9,5 μl destilliertes Wasser gemischt. Danach wird eine PCR unter Standardbedingungen im ABI Prism Sequence Detection System durchgeführt und die Werte für die enthaltene RNA Menge werden nach der Durchführung der PCR errechnet. Dabei wird die Fluoreszenz des in die entstehenden DNA Fragmente eingelagerten Sybr Greens während der PCR gemessen und die RNA-Menge analog zum TaqMan Verfahren errechnet.
Analog Ausführungsbeispiel 3 werden auch das Gen FOXM1 (Gen-Nr. 1272, Tabelle 3) mit den Primern 5'-ATCCAACATCCAGTGGCTTC-3' (SEQ-ID 35) und 5'-TCGAAGGCTCCTCAACCTTA3' (SEQ-ID 36), das Gen AATF (Gen-Nr. 391, Tabelle 1) mit den Primern 5'-CTTGGACACGGACAAAAGGT-3' (SEQ-ID 37) und 5'-CACACTCCTGTTCCTCAGCA-3' (SEQ-ID 38) und das Gen BCAR3 (Gen-Nr. 73, Tabelle 1) mit den Primern 5'-AAGTTCCTTCCCCCTGAGAA-3' (SEQ-ID 39) und 5'-CCTGCAGTCCATGCTCAGTA-3' (SEQ-ID 40) bestimmt.
Ausführungsbeispiel 4: Bestimmung der CKLF Menge im Serum zur Diagnose eines Pankreas-Karzinoms
Die Bestimmung der CKLF-Menge (Gen-Nr. 538, Tabelle 1) im Serum erfolgt nach Standardverfahren zum Nachweis von Proteinen im Serum. Das Serum wird von Patienten aus dem venösen Blut gewonnen und nach der Gerinnung verwendet. In einen mit Antikörpern gegen CKLF beschichtete Napf wird dann das Serum eingefüllt und 60 min gewartet, damit das Protein an die Antikörper binden kann. Danach wird der Napf mit PBS für dreimal gewaschen um überflüssiges Protein abzuwaschen. Diese Bindung wird dann mit einem zweiten gegen CKLF gerichteten Antikörper nachgewiesen. Dazu wird dieser Antikörper zu dem Napf gegeben und 60 min bei RT gewartet. Erneut wird der Napf dreimal mit PBS gewaschen. Die Bindung des zweiten Antikörpers wird durch die Zugabe eines dritten Antikörpers nachgewiesen. Dieser dritte Antikörper wird in den Napf gefüllt und es wird erneut 60 min abgewartet um die Bindung zu ermöglichen. Danach wird Peroxidase verbunden. Durch die Zugabe eines Substrates wird die gebundene Menge bestimmt.
Analog Ausführungsbeispiel 4 wird auch die KLK10 (Gen-Nr. 1279, Tabelle 3) im Serum bestimmt. Dazu wird in einen mit Antikörpern gegen KLK10 beschichteten Napf das Serum eingefüllt und 60 min gewartet, damit das Protein an den Antikörper binden kann. Danach wird der Napf dreimal mit PBS gewaschen, um überschüssiges Protein abzuwaschen. Diese Bindung wird dann mit einem zweiten gegen KLK10 gerichteten Antikörper nachgewiesen Dazu wird dieser Antikörper zu dem Napf gegeben und 60 min bei RT gewartet. Erneut wird der Napf dreimal mit PBS gewaschen. Die Bindung des zweiten Antikörpers wird durch die Zugabe eines dritten Antikörpers nachgewiesen. Dieser dritte Antikörper wird in den Napf gefüllt und es wird erneut 60 min abgewartet um die Bindung zu ermöglichen. Danach wird Peroxidase verbunden. Durch die Zugabe eines Substrates wird die gebundene Menge bestimmt.
Bei einer Untersuchung von acht Patienten mit Pankreaskarzinom wurde im Mittel eine Menge von 1,62 μg/L nachgewiesen, während bei Patienten mit einer gutartigen Pankreaserkrankung im Mittel nur 0,81 μg/L nachgewiesen werden konnten.
Ausführungsbeispiel 5: Therapie des Pankreaskarzinoms mittels siRNA-Molekülen
Zu der Therapie des Pankreaskarzinoms werden Patienten die siRNA Moleküle 5'-CCUUCUCUAGUGUCAAAGU-3' (SEQ-ID 41), 5'-CGAUAAGACCAAACUGGCU-3' (SEQ-ID 42), 5'-UGGACAAAGAGAGAUUACU-3' (SEQ-ID 43) und 5'-UGGAUGACCUUGGGAGCAG-3' (SEQ-ID 44) bzw. 5'-CAUGCCGGUGAAUCACCAG-3' (SEQ-ID 45), 5'-GCACGUACUGAGCAUGGAC-3' (SEQ-ID 46), 5'-CCAUUUGGCAACAGCGCGA-3' (SEQ-ID 47) und 5'-GAGCUACCUGCCGAUUGGC-3' (SEQ-ID 48) intravenös zugeführt. Die siRNAs der SEQ-Ids 41 bis 44 wirken hierbei gegen die Expression des Proteins AATF (Gen-Nr. 391, Tabelle 1) und die der SEQ-Ids 45 bis 48 gegen die Expression des Proteins BCAR3 (Gen-Nr. 73, Tabelle 1). Dieses Protein spielt bei der Signaltransduktion eine wichtige Rolle und ist im Pankreaskarzinom überexprimiert. Die siRNA wird chemisch synthetisiert. Dabei werden zunächst die komplementären Stränge des Moleküls einzeln gemäß Standardverfahren für die Synthese von Nukleinsäuren synthetisiert und dann in einem zweiten Schritt hybridisiert, damit so doppelsträngige siRNA-Moleküle entstehen.
Ausführungsbeispiel 6: Therapie des Pankreaskarzinoms mittels Antisense-Konstrukten
Als Antisense-Konstrukte für das Gen BCAR3 (Gen-Nr. 73, Tabelle 1) wird die Sequenz 5'-CATGCCGGTGAATCACCAG-3' (SEQ-ID 49), für das Gen AATF (Gen-Nr. 391, Tabelle 1) 5'-CCTTCTCTAGTGTCAAAGT-3' (SEQ-ID 50) eingesetzt.
Literatur:

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23 Carlos Thomas, Pathologie. Histopathologie. Lehrbuch und Atlas zur allgemeinen und speziellen Pathologie, Schattauer Verlag

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Ein Verfahren zur in vitro Diagnose eines Pankreaskarzinoms, bei dem 1) die Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Gene in einer Probe biologischen Materials eines Individuums bestimmt wird, 2) die Menge an Genprodukt in der Probe biologischen Materials mit der Menge des entsprechenden Genprodukts, die in normalem Pankreasepithelgewebe üblicherweise vorliegt, verglichen wird und 3) wobei, falls es sich um ein in der Tabelle 1 aufgeführtes Gen handelt, eine erhöhte Menge des Genprodukts, falls es sich um ein in der Tabelle 2 aufgeführtes Gen handelt, eine erniedrigte Menge des Genprodukts ein Indiz für das Vorliegen eines Pankreaskarzinoms ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Menge an Genprodukt von mindestens einem der in der Probe biologischen Materials eines Individuums untersuchten Gene in einer Kontrollprobe bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Menge an Genprodukt mindestens eines Referenzgens in der Probe biologischen Materials eines Individuums bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich 4) die Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführten Gene in der Probe biologischen Materials eines Individuums bestimmt wird, 5) die Menge an Genprodukt in der Probe biologischen Materials eines Individuums mit der Menge des entsprechenden Genprodukts, die in normalem Pankreasepithelgewebe üblicherweise vorliegt, verglichen wird und 6) wobei, falls es sich um ein in der Tabelle 3 aufgeführtes Gen handelt, eine erhöhte Menge des Genprodukts, falls es sich um ein in der Tabelle 4 aufgeführtes Gen handelt, eine erniedrigte Menge des Genprodukts ein Indiz für das Vorliegen eines Pankreaskarzinoms ist.
Verfahren zum Screenen nach Wirkstoffen zur Therapie des Pankreaskarzinoms, bei dem 1) eine Zelllinie eines pankreatischen duktalen Adenomakarzinoms mit einer zu testenden Substanz kontaktiert wird, 2) anschließend die Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Gene bestimmt 3) und die Menge an Genprodukt dann mit der Menge des entsprechenden Genprodukts, die in einer entsprechenden nicht mit der Testsubstanz kontaktierten Zelllinie vorliegt, verglichen wird, 4) wobei, falls es sich um ein in Tabelle 1 aufgeführtes Genprodukt handelt, eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie erniedrigte Menge des Genprodukts, falls es sich um ein in Tabelle 2 aufgeführtes Genprodukt handelt, eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie erhöhte Menge des Genprodukts ein Hinweis darauf ist, dass die Testsubstanz ein potenzieller Wirkstoff zur Therapie des Pankreaskarzinoms ist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass 5) zusätzlich die Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführten Gene bestimmt 6) und die Menge an Genprodukt dann mit der Menge des entsprechenden Genprodukts, die in einer entsprechenden nicht mit der Testsubstanz kontaktierten Zelllinie vorliegt, verglichen wird, 7) wobei, falls es sich um ein in Tabelle 3 aufgeführtes Genprodukt handelt, eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie erniedrigte Menge des Genprodukts, falls es sich um ein in Tabelle 4 aufgeführtes Genprodukt handelt, eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie erhöhte Menge des Genprodukts ein Hinweis darauf ist, dass die Testsubstanz ein potenzieller Wirkstoff zur Therapie des Pankreaskarzinoms ist.
Diagnostischer Kit zur Diagnose des Pankreaskarzinom mittels RT-PCR, der mindestens folgende Bestandteile enthält: für die cDNA-Synthese: a) Random-Hexamer-Primer oder oligo dT, b) Reverse Transkriptase; für die PCR: a) mindestens zwei Primer, die spezifisch mit der cDNA mindestens eines der Gene, ausgewählt aus den Gruppen der pankreastumorspezifischen Gene aus den Tabellen Nr. 1 und Nr.2 hybridisieren; b) eine über 80°C beständige DNA-Polymerase, sowie entsprechende Reaktionspuffer.
Diagnostischer Kit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass er als zusätzliche Bestandteile für die PCR enthält: c) eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde oder ein Paar Fluoreszenz markierter Hybridisierungssonden, die spezifisch mit dem pankreastumorspezifischen Gen aus Tabelle Nr. 1 oder Nr.2 hybridisieren.
Verwendung mindestens eines Oligonukleotids, das eine Teilsequenz eines der in den Tabellen 1 und/oder 2 aufgeführten Gene oder deren komplementären Sequenz umfasst, zur Diagnose des Pankreaskarzinoms.
Verwendung mindestens eines Oligonukleotids nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich mindestens ein Oligonukleotid, das eine Teilsequenz eines der in den Tabellen 3 und/oder 4 aufgeführten Gene oder deren komplementären Sequenz umfasst, zur Diagnose des Pankreaskarzinoms eingesetzt wird.
Verwendung eines Gens aus Tabelle 1 oder Tabelle 2 als spezifischer Marker zur Diagnose von Pankreaskarzinom.
Verwendung mindestens eines Antisense-Konstrukts, das mindestens 12 Nukleotide einer kodierenden Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 1 aufgeführt ist, wobei die kodierende Sequenz bezüglich des Promotors, der ihre Expression kontrolliert, in 3' zu 5' Orientierung vorliegt, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen, wobei das Antisense-Konstrukt den Krebszellen verabreicht wird, so dass das Antisense Konstrukt in den Krebszellen exprimiert wird.
Verwendung mindestens eines Antisense-Konstrukts nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich mindestens ein Antisense-Konstrukt, das mindestens 12 Nukleotide einer kodierenden Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 3 aufgeführt ist, wobei die kodierende Sequenz bezüglich des Promotors, der ihre Expression kontrolliert, in 3' zu 5' Orientierung vorliegt, eingesetzt wird.
Verwendung mindestens eines doppelsträngigen RNA-Konstrukts (siRNA), das mindestens 19 Basenpaare, besonders bevorzugt 21 oder 22 Basenpaare, maximal 29 Basenpaare, einer kodierenden Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 1 aufgeführt ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen.
Verwendung mindestens eines doppelsträngigen RNA-Konstrukts (siRNA) nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich mindestens ein doppelsträngiges RNA-Konstrukt, das mindestens 19 Basenpaare, besonders bevorzugt 21 oder 22 bp, maximal 29 Basenpaare, einer kodierenden Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 3 aufgeführt ist, eingesetzt wird.
Verwendung mindestens eines Polynukleotids, das eine kodierende Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 2 aufgeführt ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen, wobei das Polynukleotid den Krebszellen verabreicht wird, so dass das Gen in den Krebszellen exprimiert wird.
Verwendung mindestens eines Polynukleotids nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich mindestens ein Polynukleotid, das eine kodierende Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 4 aufgeführt ist, eingesetzt wird.