ES2525545T3 - Métodos y usos para identificar el origen de un carcinoma de origen primario desconocido - Google Patents

Abstract

Un método de identificar el origen de una metástasis de origen desconocido que comprende los pasos de a. medir los Biomarcadores asociados con al menos seis carcinomas diferentes en una muestra que contiene células metastásicas en donde los Biomarcadores son niveles de expresión de al menos los genes Marcadores siguientes: SP-B, TTF1, DSG3, PSCA, F5, HPT1, PSA, MGB/MG, WT1 y PDEF; b. combinar los datos de los Biomarcadores en un algoritmo donde el algoritmo i. normaliza los Biomarcadores frente a la referencia; y ii. impone un punto de corte que optimiza la sensibilidad y especificidad de cada Biomarcador, pondera la prevalencia de los carcinomas y selecciona un tejido de origen; c. determinar el origen en base a la probabilidad más alta determinada por el algoritmo o determinar que el carcinoma no se deriva de un conjunto particular de carcinomas; y d. medir opcionalmente los Biomarcadores específicos para uno o más carcinomas diferentes adicionales, y repetir los pasos c) y d) para los Biomarcadores adicionales.

Description

CAMPO DE LA INVENCION

La invención proporciona métodos para identificar el origen de un carcinoma de origen primario desconocido.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El carcinoma de origen primario desconocido (CUP) es un conjunto de tumores malignos confirmados por biopsia, heterogéneos, en donde la enfermedad metastásica presenta sin un sitio del tumor primario identificable o tejido de origen (toO). Este problema representa aproximadamente un 3-5% de todos los cánceres, haciendo de él el séptimo tumor maligno más común. Ghosh et al. (2005); y Mintzer et al. (2004). El pronóstico y régimen terapéutico de los pacientes son dependientes del origen del tumor primario, destacando la necesidad del sitio del tumos primario. Greco et al. (2004); Lembersky et al. (1996); y Schlag et al. (1994).

Se usan actualmente una variedad de métodos para resolver este problema. Varios métodos seguidos se esquematizan en las Figuras 1-2. Se pueden usar Marcadores tumorales séricos para diagnosis diferencial. Aunque carecen de especificidad adecuada, pueden ser usados en combinación con información patológica o clínica. Los métodos de Ghosh et al. (2005). Immunohistochemical (IHC) pueden ser usados para identificar el linaje tumoral pero pocos Marcadores IHC son 100% específicos. Por lo tanto, los patólogos usan a menudo un panel de Marcadores IHC. Varios estudios han demostrado precisiones del 66-88% usando de cuatro a 14 Marcadores IHC. Brown et al. (1997); DeYoung et al. (2000) y Dennis et al. (2005a). Estudios diagnósticos más caros incluyen métodos de obtención de imágenes como radiografía de tórax, tomografía computarizada (TC), y tomografías de emisión de positrones (PET). Cada uno de estos métodos puede identificar el primario en un 30 a 50% de los casos. Ghosh et al. (2005); y Pavlidis et al. (2003). A pesar de estas sofisticadas tecnologías, la capacidad de resolver casos de CUP es sólo del 20-30% ante mortem. Pavlidis et al. (2003); y Varadhachary et al. (2004).

Un nuevo enfoque prometedor reside en la capacidad de perfilado de expresión génica de todo el genoma para identificar el origen de los tumores. Ma et al. (2006); Dennis et al. (2005b); Su et al. (2001); Ramaswamy et al. (2001); Bloom et al. (2004); Giordano et al. (2001) y 20060094035. Estos estudios demostraron la factibilidad del tejido de identificación del origen en base al perfil de expresión génica. Para que estas tecnologías de perfilado de expresión sean útiles en el ámbito clínico, se deben superar dos obstáculos principales. Primero, como el perfilado de la expresión génica se realizó completamente en tejidos primarios, los candidatos a marcador de genes deben ser validados en tejidos metastásicos para confirmar que su expresión específica del tejido se conserva en la metástasis. Segundo, la tecnología de perfilado de expresión génica debe de ser capaz de usar tejido fijado en formalina, embebido en parafina (FFPE), ya que las muestras de tejido fijado son el material estándar en la práctica actual. Los fijación en formalina resulta en la degradación del ARN (Lewis et al. (2001) y Masuda et al. (1999)) por lo que los protocolos de micromatriz existentes no se realizarán con fiabilidad. Bibikova et al. (2004). Adicionalmente, la tecnología de perfilado debe ser robusta, reproducible y fácilmente accesible.

El RTPCR cuantitativo (qRTPCR) ha demostrado que genera resultados fiables de tejido FFPE. Abrahamsen et al. (2003); Specht et al. (2001); Godfrey et al. (2000) y Cronin et al. (2004). Por lo tanto, un enfoque más práctico sería usar un método de todo el genoma como una herramienta de descubrimiento y desarrollar un ensayo diagnóstico basado en una tecnología más robusta. Ramaswamy (2004). este paradigma, sin embargo, requiere un conjunto de genes más pequeño para ser desarrollado. Oien y sus compañeros usaron análisis en serie de la expresión génica (SAGE) para identificar 61 Marcadores tumorales de los que desarrollaron el método RTPCR en base a once genes para cinco tipos de tumores. Dennis et al. (2002). Otro estudio que acopla SAGE y qRTPCR desarrolló un panel de cinco genes para cuatro tipos de tumores y consiguió una precisión del 81%. Buckhaults et al. (2003). Un estudio más reciente acopló perfilado de micromatrices con qRTPCR, pero usó 79 Marcadores. Tothill et al. (2005).

RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invención proporciona un método para identificar el origen de una metástasis de origen desconocido en una muestra que contiene células metastásicas que comprende los pasos de a) medir los Biomarcadores asociados con al menos seis carcinomas diferentes en donde los Biomarcadores son niveles de expresión de genes Marcadores en donde los genes Marcadores son SP-B, TTFI, DSG3, PSCA, F5, HPT1, PSA, MGB/MB, WT1 y PDEF, b) combinar los datos de los Biomarcadores en un algoritmo donde el algoritmo: normaliza los Biomarcadores frente a la referencia; e impone un punto de corte que optimiza la sensibilidad y especificidad de cada Biomarcador, pondera la prevalencia de carcinomas y selecciona un tejido de origen; c)determinar el origen en base a la probabilidad más alta determinada por el algoritmo o determinar que el carcinoma no se deriva de un conjunto particular de carcinomas; y d) medir opcionalmente Biomarcadores específicas para uno o más carcinomas

diferentes adicionales, y repetir los pasos c) y d) como sea necesario para Biomarcadores adicionales.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Las Figuras 1-2 representan métodos del estado de la técnica para identificar el origen de una metástasis de origen desconocido. La Figura 3 representa el algoritmo de diagnóstico CUP actual. La Figura 4 representa datos de micromatrices que muestran intensidades de dos genes en un panel de tejidos. (A) Antígeno de células madre de próstata (PSCA). (B) Factor de coagulación V (F5). Los gráficos de barras muestran la intensidad en el eje y y el tejido en el eje x. Panc Ca, cáncer de páncreas; Panc N, páncreas normal. La Figura 5 representa electroferogramas obtenidos de un Bioanalizador Agilent. El ARN fue aislado de tejido FFPE usando una digestión de proteinasa K de tres horas (A) o dieciséis horas (B). La muestra C22 (roja) era un bloque de un año de edad mientras que la muestra C23 (azul) era un bloque de cinco años de edad. Se muestra una escala de tamaño en verde. La Figura 6 representa una comparación de valores de Ct obtenidos de tres métodos qRTPCR diferentes: cebado de hexámeros aleatorio en la transcripción inversa seguido por qPCR con el ADNc resultante (paso RH 2), cebado específico de genes (cebador inverso) en la transcripción inversa seguido por qPCR con el ADNc resultante (paso GSP 2), o cebado específico de genes y qRTPCR en una reacción de una etapa (paso GSP 1). Se dividió ARN de once muestran en los tres métodos y se midieron los niveles de ARN para los tres genes; β-actina (A), HUMSPB (B), y TTF (C). El valor de Ct mediano obtenido con cada método se indica por la línea sólida. La Figura 7 representa diagramas de placas de ensayo CUP. La Figura 8 es una serie de gráficos que representan el rendimiento del ensayo sobre un intervalo de concentraciones ARN. La Figura 9 es un diagrama de flujo de trabajo experimental; nominación y validación de candidatos a Marcadores (9A); y optimización de ensayos y construcción y prueba del algoritmo de predicción (9B). La Figura 10 representa la expresión de 10 candidatos a Marcadores de genes específicos de tejidos seleccionados en carcinomas metastásicos de FFPE y adenocarcinoma primario de próstata. Para cada gráfico el eje X representa el valor de expresión del Marcador normalizado. La Figura 11 representa la optimización del ensayo (a y B) Electroferogramas obtenidos de un Bioanalizador Agiletn. El ARN se aisló de tejido FFPE usando una digestión de proteinasa K de tres horas (A) o dieciséis horas. La muestra C22 (roja) era un bloque de un año de edad mientras que la muestra C23 (azul) era un bloque de cinco años de edad. Se muestra una escala de tamaño en verde. (C y D). Comparación de valores de Ct obtenidos de tres métodos qRTPCR diferentes: cebado de hexámeros aleatorio en la transcripción inversa seguido por qPCR con el ADNc resultante (paso RH 2), cebado específico de genes (cebador inverso) en la transcripción inversa seguido por qPCR con el ADNc resultante (paso GSP 2), o cebado específico de genes y qRTPCR en una reacción de una etapa (paso GSP 1). Se dividió ARN de once muestran en los tres métodos y se midieron los niveles de ARN para los dos genes; β-actina (C) y HUMSPB (D). El valor de Ct mediano obtenido con cada método se indica por la línea sólida. La Figura 12 es un mapa térmico que muestra los niveles de expresión relativos de los 10 paneles de Marcadores a través de 239 muestra. El rojo indica expresión más alta.

DESCRIPCION DETALLADA

El identificar el sitio primario en pacientes con carcinoma metastásico de origen primario desconocido (CUP) puede permitir la aplicación de regímenes terapéuticos específicos y puede prolongar la supervivencia. Los candidatos a marcador fueron entonces validados por reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) en 205 carcinomas metastásicos FFPE originarios de estos seis tejidos así como metástasis originarias de otros tipos ce cáncer para determinar la especificidad. Se seleccionó una firma de diez genes que predecía el tejido de origen de carcinomas metastásicos para estos seis tipos de cáncer. Después, se optimizaron los métodos de aislamiento de ARN y qRTPCR para estos diez Marcadores, y se aplicó el ensayo qRTPCR a un conjunto de 260 tumores metastásicos, generando una precisión general del 78%. Por último, se probó un conjunto independiente de 48 muestras metastásicas. Es importante destacar que treinta y siete muestras en este conjunto tenían o un primario conocido o se presentaban inicialmente como CUP pero se resolvieron posteriormente, y el ensayo demostró una precisión del 78%.

Un Biomarcador es cualquier indicio del nivel de expresión de un gen Marcador indicado. El indicio puede ser directo o indirecto y medir la sobre-o bajo-expresión del gen dados los parámetros fisiológicos y en comparación con un control interno, tejido normal u otro carcinoma. Los Biomarcadores incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos (tanto sobre y -bajo-expresión y directos e indirectos). Usar ácidos nucleicos como Biomarcadores puede incluir cualquier método conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, medir de la amplificación de ADN, ARN, micro ARN, pérdida de heterocigosidad (LOH), polimorfismos de nucleótido único (SNPs, Brookes (1999)), ADN de microsatélites, hipo-o hiper-metilación de ADN. Usar proteínas como Biomarcadores incluye cualquier método conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, medir la cantidad, actividad, modificaciones como glicosilación,

fosforilación, ADP-ribosilación, ubiquitinación, etc., o inmunohistoquímica (IHC). Otros Biomarcadores incluyen obtención de imágenes, recuento celular y Marcadores de apoptosis.

Los genes indicados proporcionados en la presente son los asociados con un tumor o tipo de tejido

5 particular. Un gen Marcador puede estar asociado con numerosos tipos de cáncer pero siempre que la expresión del gen esté lo suficientemente asociada con un tumor o tipo de tejido a ser identificado usando el algoritmo descrito en la presente para ser específico para un origen particular, el gen puede ser usado en la invención reivindicada para determinar el tejido de origen para un carcinoma de origen primario desconocido (CUP). Se conocen en la técnica numerosos genes asociados con uno o más cánceres. La presente invención proporciona genes Marcadores preferidos e incluso más preferido combinaciones de genes Marcadores. Estos se describen en la presente con detalle. "Origen" como se refiere en "tejido de origen" significa o el tipo de tejido "pulmón, colon, etc.) o el tipo histológico (adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, etc.) dependiendo de las circunstancias médicas particulares y se entenderá por cualquiera experto en la técnica.

15 Un gen Marcador corresponde a la secuencia designada por una SEQ ID NO cuando contiene esa secuencia. Un segmento o fragmento de gen corresponde a la secuencia de dicho gen cuando contiene una porción de la secuencia referenciada o su complemento suficiente para distinguirlo como de la secuencia del gen. Un producto de la expresión del gen corresponde a dicha secuencia cuando su ARN, ARNm o ADNc hibrida con la composición que tiene dicha secuencia (por ejemplo, una sonda) o, en el caso de un péptido o proteína, está codificado por dicho ARNm. Un segmento o fragmento de un producto de la expresión del gen corresponde a la secuencia de dicho gen o producto de expresión del gen cuando contiene una porción del producto de expresión del gen referenciado o su complemento suficiente para distinguirlo como de la secuencia del gen o producto de expresión del gen.

25 Los métodos de la invención descritos y reivindicados en esta especificación incluyen genes Marcadores, como se definen en las reivindicaciones. "Marcador" o "gen Marcador" se usa a lo largo de esta especificación para referirse a genes y productos de la expresión de genes que corresponden con cualquier gen la sobre-o bajoexpresión del cual está asociada con un tumor o tipo de tejido. Los genes Marcadores se describen con más detalle en la Tabla 1.

Tabla 1

Panel CUP

SEQ ID NO:

Nombre Designación del Chip secuencia

1

SP-B 209810_at

2

TTF1 211024_s_at

(continuada)

Panel CUP

SEQ ID NO:

Nombre Designación del Chip secuencia

3

DSG3 205595_at

4

HPT1 209847_at

5

PSCA 205319_at

6

F5 204713_s_at

7

MGB1 206378_at

(continuada)

Panel CUP

SEQ ID NO:

Nombre Designación del Chip secuencia

8

PDEF 220192_x_at

9

PSA 204582_s_at

10

WT1 206067_s_at

La presente invención proporciona un método para identificar el origen de una metástasis de origen

desconocido midiendo Biomarcadores asociados con al menos seis carcinomas diferentes en una muestra que

contiene células metastásicas en donde los Biomarcadores son niveles de expresión de genes y donde los genes

45 Marcadores son SP-8, JTFI, DSG3, PSCA, F5, HPT1, PSA, MGB/MG. WT1 y PDEF; combinando los datos de los Biomarcadores en un algoritmo donde el algoritmo: normaliza los Biomarcadores frente a la referencia; e impone un punto de corte que optimiza la sensibilidad y especificidad de cada Biomarcador, pondera la prevalencia de carcinomas y selecciona un tejido de origen; determina el origen en base a la probabilidad más alta determinada por el algoritmo o determina que el carcinoma no se deriva de un conjunto particular de carcinomas; y mide opcionalmente Biomarcadores específicos para uno o más carcinomas diferentes adicionales, y repite los pasos como sea necesario para Biomarcadores adicionales.

La presente invención proporciona un método para identificar el origen de una metástasis de origen desconocido en una muestra que contiene células metastásicas como se define en las reivindicaciones, que

55 comprende: medir los Biomarcadores asociados con al menos seis carcinomas diferentes; combinar los datos de los Biomarcadores en un algoritmo donde el algoritmo i) normaliza los Biomarcadores frente a la referencia; y ii) impone un punto de corte que optimiza la sensibilidad y especificidad de cada Biomarcador, pondera la prevalencia de carcinomas y selecciona un tejido de origen; determinar el origen en base a la probabilidad más alta determinada por el algoritmo o determinar que el carcinoma no se deriva de un conjunto particular de carcinomas; y medir opcionalmente Biomarcadores específicos para uno o más carcinomas diferentes adicionales, y repetir los pasos c) y d) para Biomarcadores adicionales.

Los genes Marcadores son i) SP-B, TTF1, DSG3, PSCA, F5, HPT1, PSA, MCB/MC, WT1 y PDEF. Los genes Marcadores pueden incluir además KRT6F, p73H, y/o SFTPC. 65

Preferiblemente, los genes Marcadores pueden además incluir ITGB6, KLK10, CLDN18, TR10 y/o FKB 10.

En otra realización, los genes Marcadores pueden además incluir CDX1 y/o FABP1.

En una realización, la expresión génica se mide usando al menos una de las SEQ ID NOs: 11-58.

La presente divulgación también proporciona métodos que miden la expresión génica obteniendo y midiendo la formación de al menos uno de los amplicones SEQ ID NOs: 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54 y/o

58.

En una realización, los genes Marcadores pueden comprender además un Marcador específico del género seleccionado de al menos uno de: i) en el caso de un paciente masculino KLK2, NGEP o NPY; o ii) en el caso de un paciente femenino PIP, B305D, B726 o GABA-Pi; y/o PAX8, STAR o EMX2. Preferiblemente los genes Marcadores comprenden además KLK2. En esta realización, los genes marcadores pueden comprender además NGEP y/o NPY. En una realización, en el caso de un paciente femenino, los genes Marcadores comprenden además PIP, B305D, B726 o GABA-Pi. En una realización, en el caso de un paciente femenino los genes Marcadores comprenden además, PAX8, STAR o EMX2.

La presente divulgación proporciona métodos para obtener información clínica adicional incluyendo el sitio de metástasis para determinar el origen del carcinoma; obtener conjuntos de biomarcadores óptimos para carcinomas que comprende los pasos de usar metástasis de origen conocido, determinar Biomarcadores para ello y comparar los Biomarcadores con Biomarcadores de metástasis de origen desconocido; proporcionar dirección de terapia determinando el origen de una metástasis de origen desconocido e identificar el tratamiento apropiado para ello; y proporcionar un pronóstico determinando el origen de una metástasis de origen desconocido e identificar el pronóstico correspondiente para ello.

La presente divulgación proporciona además métodos de encontrar Biomarcadores determinando el nivel de expresión de un gen Marcador en una metástasis particular, medir un Biomarcador para el gen Marcador para determinar la expresión del mismo, analizar la expresión del gen Marcador de acuerdo con cualquiera de los métodos proporcionados en la presente o conocidos en la técnica y determinar si el gen Marcador es efectivamente específico para el tumor de origen.

La presente divulgación proporciona además una composición que contiene al menos una secuencia aislada seleccionada de las SEQ ID NOs: 11-58. La presente invención proporciona además el uso de kits para realizar un ensayo de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente, en donde el kit comprende ARN o ADNc que hibrida con los genes marcadores de la invención, una micromatriz o un chip génico.

La presente invención proporciona además el uso de micromatrices o chips génicos para realizar los métodos descritos en la presente.

La presente divulgación proporciona además carpetas de diagnóstico/pronóstico que contienen secuencias de ácidos nucleicos aislados, sus complementos, o porciones de los mismos de una combinación de genes como se describe en la presente donde al combinación es suficiente para medir o caracterizar la expresión génica en una muestra biológica que tiene células metastásicas con respecto a células de carcinomas o tejido normal diferentes.

Cualquier método descrito en la presente invención puede además incluir medir la expresión de al menos un gen expresado constitutivamente en la muestra.

Los Marcadores para el cáncer de páncreas son factor de coagulación V (F5), antígeno de células madre de próstata (PSCA), integrina, β6 (ITGB6), calicreína 10 (KLK10), claudina 18 (CLDN18), isoforma trío (TR10), y proteína hipotética FLJ22041 similar a las proteínas de unión a FK506 (FKBP10). Los Biomarcadores para F5 y PSCA se miden juntos. Los Biomarcadores para ITGB6, KLK10,CLDN18, TR10, y FKBP10 se pueden medir además de para F55 y PSCA. El F5 se describe por ejemplo por 20040076955; 20040005563 y WO2004031412. El PSCA se describe por ejemplo por la WO1998040403; 20030232350 y WO2004063355. La ITGB6 se describe por ejemplo por la WO2004018999 y 6339148. La KLK 10 se describe por ejemplo por la WO20040770 y 20030235820. El CLDN18 se describe por ejemplo por la WO2004063355 y WO2005005601. El TR10 se describe por ejemplo por la 20020055627. El FKBP10 se describe por ejemplo por la WO2000055320.

Los genes Marcadores para el cáncer de colon son el transportador asociado a péptidos intestinal HPT-1 (CDF17), el factor de transcripción de la caja homeótica de tipo caudal 1 (CDX 1) y la proteína de enlace de ácidos grasos 1 (FABP1). Los Biomarcadores para CDX1 y FABP1 se pueden medir en adición a un Biomarcador para CDH 17. El CDH17 se describe por ejemplo por Takamura et al. (2004) y la WO2004063355. El CDX1 se describe por ejemplo por Pilozzi et al. (2004); 20050059008y la 20010029020. El FABP11 se describe por ejemplo por Borchers et al. (1997); Chan et al. (1985); Chen et al. (1986); y Lowe et al. (1985).

Los genes Marcadores para el cáncer de pulmón son la proteína surfactante B (SP-B), el factor de transcripción tiroideo (TTF), desmogleína 3 (DSG3), isoforma 6F de la queratina 6 (KRT6F), gen relacionado con el p53 (p73H), y la proteína surfactante C (SFTPC). Los Biomarcadores para SP-B, TTF y DSG3 se miden juntos. Los Biomarcadores para KRT6F, p73H y SFTPC se pueden medir en adición a cualquiera de los Biomarcadores para SP-B, TTF y/o DSG3. La SP-B se describe por ejemplo por Pilot-Mathias et al. (1989); 20030219760 y 20030232350. El TTF se describe por ejemplo por Jones et al. (2005); US20040219575; WO1998056953; WO2002073204; 20030138793 y WO2004063355. La DSG3 se describe por ejemplo por Wan et al. (2003); 20030232350; aWO2004030615; y WO2002101357. La KRT6F se describe por ejemplo por Takahashi et al. (1995); 20040146862 y 20040219572. El p73H se describe por ejemplo por Senoo et al. (1998) y 20030138793. La SFTPC se describe por ejemplo por Glasser et al. (1988).

Los genes Marcadores pueden ser seleccionados además de un Marcador específico del género como, en el caso de un paciente masculino KLK2, NGEP o NPY; o en el caso de un paciente femenino PIP, B305D, B726 o GABA-Pi; y/o PAX8, STAR o EMX2.

Los genes Marcadores para el cáncer de mama son el factor epitelial derivado de la próstata (PDEF), mamaglobina (MG), proteína prolactininducible (PIP), B305D, B726, y GABA-π. Los biomarcadores para PDEF y MG se miden juntos. Los Biomarcadores para PIP, B305D, B726 y GABA-Pi se pueden medir en adición a los Biomarcadores para PDEF y MG. El PDES se describe por ejemplo por la WO2004030615; WO2000006589; WO2001073032; Wallace et al. (2005); Feldman et al. (2003); y Oettgen et al. (2000). La MG se describe por ejemplo por la WO2004030615; 20030124128; Fleming et al (2000); Watson et al. (1996 and 1998) y 5668267. La PIP se describe pro ejemplo por Autiero et al. (2002); Clark et al. (1999); Myal et al. (1991) y Murphy et al. (1987). B305D, B726 y GABA-Pi se describen por Reinholz et al. (2005). El NGEP se describe por ejemplo por Bera et al. (2004).

Los Marcadores para el cáncer de ovarios son el tumor de Wilm I (WT1), PAX8, proteína reguladora aguda esteroidogénica (STAR) y EMX2. Preferiblemente, se miden los Biomarcadores para WT1. Los Biomarcadores para STAR y EMX2 pueden ser medidos en adición a los Biomarcadores para WT1. El WT1 se describe por ejemplo por 350840; 6232073; 6225051; 20040005563 y Bentov et al. (2003). El PAX8 se describe por ejemplo por 20050037010; Poleev et al. (1992); Di Palma et al. (2003); Marques et al. (2002); Cheung et al. (2003); Goldstein et al. (2002); Oji et al. (2003); Rauscher et al. (1993); Zapata-Benavides et al. (2002) y Dwight et al. (2003). La STAR se describe por ejemplo por Gradi et al. (1995) y Kim et al. (2003). El EMX2 se describe por ejemplo por Noonan et al. (2001).

Los Marcadores para el cáncer de próstata son KLK3, KLK22, NGEP y NPY. Se miden los Biomarcadores para KLK3. Los Biomarcadores para KLK2, NGEP y NPY pueden ser medidos en adición a KLK3. El KLK2 y KLK3 se describen por ejemplo por Magklara et al. (2002). El KLK2 se describe por ejemplo por US 20030215835 y US 5786148, El KLK3 se describe por ejemplo por US 6261766.

El método puede también incluir obtener información clínica adicional que incluya el sitio de metástasis para determinar el origen del carcinoma. En la Figura 3 se proporciona un diagrama de flujo.

La divulgación proporciona además un método para obtener conjuntos de Biomarcadores óptimos para carcinomas usando metástasis de origen conocido, determinando Biomarcadores para ello y comparando los Biomarcadores con Biomarcadores de metástasis de origen desconocido.

La divulgación proporciona además un método para proporcionar dirección de terapia determinando el origen de una metástasis de origen desconocido de acuerdo con los métodos descritos en la presente e identificando el tratamiento apropiado para ello.

La divulgación proporciona además un método para proporcionar un pronóstico determinando el origen de una metástasis de origen desconocido de acuerdo con los métodos descritos en la presente e identificando el pronóstico correspondiente para ello.

La divulgación proporciona además un método para encontrar Biomarcadores que comprende determinar el nivel de expresión de un gen Marcador en una metástasis particular, medir un Biomarcador para el gen Marcador para determinar la expresión del mismo, analizar la expresión del gen Marcador de acuerdo con los métodos descritos en la presente y determinar si el gen Marcador es efectivamente específico para el tumor de origen.

La divulgación proporciona además composiciones que comprenden al menos una secuencia aislada seleccionada de las SEQ ID NOs: 11-58.

La invención proporciona además el uso de kits, micromatrices o chips génicos para llevar a cabo los ensayos descritos en la presente, como se define en las reivindicaciones.

Se ha encontrado sólo en raras ocasiones que la mera presencia o ausencia de secuencias de ácidos nucleicos particulares en una muestra de tejido tenga valor diagnóstico o de pronóstico. La información sobre la expresión de varias proteínas, péptidos o ARNm, por otro lado, se considera cada vez más como importante. La mera presencia de secuencias de ácidos nucleicos que tienen el potencial de expresar proteínas, péptidos o ARNm (tales secuencias referidas como "genes") dentro del genoma por sí mismo no es determinante de si una proteína, péptido a ARNm se expresa en una célula dada. Si un gen dado capaz de expresar proteínas, péptidos o ARNm lo hace y a que extensión tiene lugar tal expresión, en todo caso, se determina por una variedad de factores complejos. Independientemente de las dificultades de entender y evaluar estos factores, el ensayar la expresión génica puede proporcionar información útil sobre la ocurrencia de eventos importantes como tumorogénesis, metástasis, apoptosis, y otros fenómenos clínicamente relevantes. Las indicaciones relativas del grado a los que los genes son activos o inactivos puede encontrarse en los perfiles de expresión génica. Los perfiles de expresión génica obtenidos de los métodos de esta invención se usan para proporcionar diagnóstico y tratar pacientes de CUP.

La preparación de la muestra requiere la recogida de muestras de pacientes. Las muestras de pacientes usadas en el método de la invención son las que se sospecha que contienen células enfermas como las células tomadas de un nódulo en un aspirado de aguja fina (FNA) del tejido. La preparación del tejido bruto obtenido de una biopsia o espécimen quirúrgico y microdisección por captura láser también son adecuadas para el uso. La tecnología por microdisección por captura láser (LCM) es una manera de seleccionar las células a ser estudiadas, minimizando la variabilidad causada por la heterogeneidad del tipo celular. Consecuentemente, los cambios moderados o pequeños en la expresión del gen Marcador entre células normales o benignas y cancerosas pueden ser detectados fácilmente. Las muestras pueden también comprender células epiteliales circulantes extraídas de sangre periférica. Estas se pueden obtener de acuerdo con un número de métodos pero el método más preferido es la técnica de separación magnética descrita en la 6136182. Una vez que se ha obtenido la muestra que contiene las células de interés, se obtiene un perfil de expresión génica usando un Biomarcador, para los genes en las carpetas apropiadas.

Los métodos preferidos para establecer los perfiles de expresión génica incluyen determinar la cantidad de ADN que se produce por un gen que puede codificar para una proteína o péptido. Esto se consigue por PCR con transcriptasa inversa (TR-PCR), RT-PCR competitiva, RT-PCR en tiempo real, RT-PCR con visualización diferencial, análisis Northern Blot y otras pruebas relacionadas. Aunque es posible llevar a cabo estas técnicas usando reacciones de PCR individuales, es mejor amplificar el ADN complementario (ADNc) o el ARN complementario (ARNc) producido por el ARNm y analizarlo a través de micromatrices. Se conocen una variedad de configuraciones de matrices y métodos para su producción diferentes por los expertos en la técnica y se describen e por ejemplo, 5445934; 5532128; 5556752; 5242974; 5384261; 5405783; 5412087; 5424186; 5429807; 5436327; 5472672; 5527681; 5529756; 5545531; 5554501; 5561071; 5571639; 5593839; 5599695; 5624711; 5658734 y 5700637.

44 La tecnología de micromatrices permite la medición del nivel de ARNm en estado estacionario de miles de genes proporcionando simultáneamente una herramienta poderosa para identificar efectos como el inicio, detención

o modulación de la proliferación celular no controlada. Hay actualmente en uso generalizado dos tecnologías de micromatrices, ADNc y matrices de oligonucleótidos. Aunque existen diferencias en la construcción de estos chips, esencialmente todo el análisis de datos secuencia abajo y salida son lo mismo. El producto de estos análisis son típicamente mediciones de la intensidad de la señal recibida de una sonda etiquetada usada para detectar una secuencia de ADNc de la muestra que hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos en una localización conocida en la micromatriz. Típicamente, la intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de ADNc, y por lo tanto de ARNm, expresada en las células de la muestra. Un gran número de dichas técnicas están disponibles y son útiles. Los métodos preferidos para determinar la expresión génica se pueden encontrar en 6271002; 6218122; 6218114 y 6004755.

El análisis de los niveles de expresión se lleva a cabo comparando dichas intensidades de señal. Esto se hace mejor generando una matriz de relación de las intensidades de la expresión de los genes en una muestra de prueba frente a las de las muestras de control. Por ejemplo, las intensidades de la expresión génica de un tejido enfermo se pueden comparar con las intensidades de la expresión generadas de tejido benigno o normal del mismo tipo. Una relación de estas intensidades de expresión indica las veces de cambio en la expresión génica entre las muestras de prueba y control.

La selección se puede basar en pruebas estadísticas que producen listas clasificadas relacionadas con la evidencia de significancia de cada expresión diferencial del gen entre factores relacionados con el sitio de origen original del tumor. Ejemplos de tales pruebas incluyen ANOVA y Kruskal-Wallis. Las clasificaciones pueden ser usadas como ponderaciones en un modelo diseñado para interpretar la suma de dichas ponderaciones, hasta un punto de corte, como la preponderancia de la evidencia a favor de una clase sobre otra. La evidencia anterior como se describe en la bibliografía también se puede usar para ajustar las ponderaciones.

En la presente invención, se eligieron 10 marcadores que mostraron evidencia significativa de expresión diferencial entre 6 tipos de tumores. El proceso de selección incluía una recogida ad-hoc de pruebas estadísticas, optimización de varianza media y conocimiento experto. En una realización alternativa los métodos de extracción de características podrían ser automatizados para seleccionar y probar marcadores a través de enfoques de

aprendizaje supervisados. A medida que crece la base de datos, la selección de marcadores se puede repetir para producir la precisión de diagnóstico más alta posible en cualquier estado dado de la base de datos.

Una realización preferida es normalizar cada medición identificando un conjunto de control estable y modificando a escala este conjunto a varianza cero en todas las muestras. Este conjunto de control se define como cualquier transcripción endógena individual o conjunto de transcripciones endógenas afectadas por el error sistemático en el ensayo, y que no se conoce que cambie independientemente de este error. Todos los marcadores son ajustados por el factor específico de la muestra que genera la varianza cero para cualquier estadística descriptiva del conjunto de control, como la media o mediana, o para una medición directa. Alternativamente, si la premisa de variación de los controles relacionados sólo con el error sistemático no es cierta, todavía el error de clasificación resultante es menor que cuando se realiza la normalización, el conjunto de control todavía se usará como se ha expuesto. Los controles pico no endógenos también podrían ser útiles, pero no se prefieren.

Después de la selección de marcadores, estas variables seleccionadas se usan en un clasificados diseñado para producir una precisión de clasificación tan alta como sea posible. Se puede usar un algoritmo de aprendizaje supervisado diseñado para relacionar un conjunto de mediciones de entrada con un conjunto de salidas de predictores a fin de construir un modelo de las 10 entradas para predecir el tejido de origen. El problema se puede plantear como: dado los datos de aprendizaje {(x1, y), ..., (xn, y)} producir un clasificador h: χ→γ que mapea una muestra x ∈ χ de su tejido de etiqueta de origen y ∈ γ. Las predicciones se basan en casos anteriormente resueltos que están contenidos en la base de datos y por lo tanto componen el conjunto de aprendizaje.

El algoritmo de aprendizaje supervisado debería encontrar parámetros en base a las relaciones de las variables de entrada con las salidas conocidas que minimizarán el error de clasificación esperados. Estos parámetros pueden ser entonces usados para predecir el tejido de origen de una nueva entrada de la muestra. Ejemplos de estos algoritmos incluyen modelos de clasificación lineal, clasificadores cuadráticos, métodos basados en árbol, redes neuronales y métodos prototipo como un clasificador de elemento afín k o algoritmos de cuantificación del vector de aprendizaje.

Una realización específica al modelo de 10 marcadores normalizados es el método LDA, usando parámetros por defecto, como se describe en Venables y Ripley (2002). Este método se basa en el Análisis discriminante lineal de Fisher, donde las medias dadas µy=0, µy=1 y las covarianzas Σy=0, Σy=1 para las etiquetas clases y 0 y 1, buscamos una combinación lineal de w.x que tendría medias w.µy=i y varianzas wTΣy=iw que maximizarán la proporción de la varianza entre las cales con la varianza dentro de las clases.

La LDA puede ser generalizada a un análisis discriminante de clase múltiple, donde y tiene N estados posibles, en lugar de sólo dos. Las medias y varianzas de clase se estiman de los valores contenidos en la base de datos para los marcadores elegidos. En una realización preferida, la matriz de la covarianza es ponderada por probabilidades anteriores iguales de cada tipo de tumor sometido a lo siguiente. Los pacientes masculinos se predicen por un modelo donde los anteriores son cero para cada para cada grupo de tumor de órgano reproductor femenino. Igualmente, los pacientes femeninos se predicen por un modelo donde el anterior es cero para los órganos reproductores masculinos. En la presente invención, los anteriores son cero para pruebas en mujeres para próstata y cero para varones probados para mama y ovarios. Además, las muestras con un antecedente idéntico a una etiqueta de clase se prueban por un modelo donde la probabilidad anterior es cero para esa etiqueta de clase particular.

El problema anterior se pude ver como una maximización del cociente de Rayleigh manejado como un problema de valor propio generalizado. El subespacio reducido se usa en la clasificación calculando cada distancia de la muestra al centroide en el subespacio elegido. El modelo puede ser ajustado por probabilidad máxima, y las probabilidades posteriores se calculan usando el teorema de Bayes.

Un método alternativo puede incluir encontrar un mapa de un espacio característico n-dimensional, donde n es el número de variables usadas, a un conjunto de etiquetas de clasificación que implicará particionar el espacio característico en regiones, asignando después una clasificación para cada región. Las puntuaciones de estos algoritmos de tipo afines están relacionadas con la distancia entre los límites de decisión y no se traducen necesariamente en probabilidades de clase.

Si hay demasiadas variables de las que seleccionar, y muchas de ellas son ruido aleatorio, entonces la selección de variable y el riesgo del modelo ajustan en exceso el problema. Por lo tanto, se usan a menudo listas

clasificadas en varios puntos de corte como entradas a fin de limitar el número de variables. También se pueden usar algoritmos de búsqueda como un algoritmo genético para seleccionar un sub-conjunto de variables ya que ponen a prueba una función de costes. Se puede intentar hibridación simulada para limitar el riesgo de tomar la función de coste en un mínimo local. Sin embargo, estos procedimientos deben ser validados con muestras independientes al proceso de selección y de modelado.

También se pueden usar enfoques variables latentes. Se puede usar cualquier algoritmo de aprendizaje sin supervisar para estimar variedades de baja dimensión de espacio de alta dimensión para descubrir asociaciones entre las variables de entrada y lo bien que pueden encajar un conjunto más pequeño de variables latentes. Aunque las estimaciones de la efectividad de estas reducciones son subjetivas, se puede aplicar un algoritmo supervisado en el conjunto de variables reducido a fin de estimar la precisión de la clasificación. Por lo tanto un clasificador, que puede ser construido de las variables latentes, también se puede construir de un conjunto de variables correlacionadas significativamente con las variables latentes. Un ejemplo de esto incluiría usar variables correlacionadas con los componentes principales, de un análisis de componentes principales, como entradas a cualquier modelo de clasificación supervisado.

Estos algoritmos se pueden implementar en cualquier código de software que tenga métodos para introducir las variables, aprender las muestras con una función, probar una muestra basada en el modelo, y extraer los resultados a una consola. R, Octave, C, C++, Fortran, Java, Perl y Python tienen todos bibliotecas disponibles bajo licencia de código abierto para realizar muchas de las funciones enumeradas anteriormente. Los paquetes comerciales como S+ y Matlab también incluyen muchos de estos métodos.

El código realiza los siguientes pasos en el orden siguiente usando la versión R 2.2.1 (http://www.rproject.org) con la biblioteca MASS (Venables et al. (2002)) instalada. El término LDA se refiere a la función Ida en el espacio de nombres MASS.

1) se almacenan valores de CT para 10 genes marcadores y 2 controles en un disco duro para todas las muestras del conjunto de aprendizaje disponibles. 2) Para cada muestra, restar la media específica de la muestra de los controles de cada marcador normaliza los 10 valores de genes marcadores. 3) El conjunto de datos de aprendizaje está compuesto de metástasis con sitios conocidos de origen donde cada muestra tiene al menos uno de sus marcadores objetivo específicos para el tejido etiquetado de origen con un valor de CT normalizado menor de 5. 4) El LDA construye 4 conjuntos de 2 modelos de LDA de los datos de aprendizaje en (3). En cada conjunto, un modelo es específico para varones, y tiene probabilidades anteriores para mama y ovario establecidas en cero así como las probabilidades anteriores para la próstata establecidas a los anteriores equivalentes de otras etiquetas de clase. El otro modelo en cada par es específico para mujeres con las probabilidades anteriores de próstata establecidas a cero, y con los anteriores para mama y ovario establecidos a los anteriores equivalentes encontrados en otras etiquetas de clase.

a.

El primer conjunto se usa para probar muestras de CUP encontradas en el colon, las probabilidades anteriores para el colon están establecidas a cero y todas las otras etiquetas de clase no reproductoras están establecidas a los anteriores equivalentes.

b.

Un segundo conjunto del modelo es específico para una CUP encontrado en el ovario, cono las probabilidades anteriores para el ovario establecidas a cero y todas las otras etiquetas de clase no reproductoras establecidas a anteriores equivalentes.

c.

Un tercer conjunto para un CUP encontrado en el pulmón, con las probabilidades anteriores para el pulmón establecidas a cero. Todas las otras etiquetas de clase no reproductoras tienen anteriores equivalentes.

d.

EL modelo general usado para todos los otros tejidos de fondo. Todos los anteriores están establecidos equivalentemente con la excepción de las etiquetas de clase específicas reproductoras que están establecidas como se define en 4.

Para probar una muestra, ejecutamos un programa R que realiza lo siguiente.

1) Lee en un conjunto de datos de prueba. 2) Genera una media específica de la muestra de ambos controles. 3) Para cada muestra, usa la media específica de la muestra para restarla de cada marcador. 4) Reemplaza cualquier CT normalizado generado de un CT bruto de 40 con 12. 5) Para cada muestra en el conjunto de prueba se prueban los siguientes.

a.

Si la media de ambos controles son mayores de 34 que la muestra es etiquetada con 'CTR_FALLO' con ceros para probabilidades posteriores.

b.

Se comprueban los antecedentes para colon, ovario o pulmón. Si se encuentra una coincidencia se comprueba también el género. El modelo específico de los antecedentes y género se usa entonces para

evaluar la muestra.

c.

Si se encuentra mama, páncreas, pulmón, SCC o próstata como la etiqueta de antecedentes, entonces se da una etiqueta de "FALLO-muestra_inelegible" a la muestra, y las probabilidades posteriores son todas establecidas en cero.

d.

El modelo general ya sea para varón o mujer se usa para todas las otras muestras.

Los resultados son formateados y escritos en un archivo.

La presente divulgación incluye carpetas de expresión génica obtenidos por este proceso.

Los perfiles de expresión génica se pueden mostrar de varias maneras. La más común es organizar las intensidades de fluorescencia brutas o matriz de relación en un dendograma gráfico donde las columnas indican las muestras de prueba y las filas indican los genes. Los datos son organizados de tal manera que los genes que tienen perfiles génicos similares están próximos entre sí. La relación de la expresión para cada gen se visualiza como un color. Por ejemplo, una relación de menos de uno (regulación hacia abajo) aparece en la porción azul del espectro mientras que una relación mayor de uno (regulación hacia arriba) aparece en la porción roja del espectro. Hay disponibles programas de software de ordenador comercialmente disponibles para mostrar dichos datos incluyendo "GeneSpring" (Silicon Genetics, Inc.) y "Discovery" e "Infer" (Partek, Inc.).

Las mediciones de la abundancia de especies de ARN únicas se recogen de tumores primarios o tumores metastásicos de primarios de origen desconocido. Estas lecturas junto con los registros clínicos incluyendo, pero no limitado a, edad del paciente, género, sitio de origen del tumor primario, y sitio de metástasis (si es aplicable) se usan para generar una base de datos relacional. La base de datos se usa para seleccionar transcritos de ARN y factores clínicos que pueden ser usados como variables de marcadores para predecir el origen primario de un tumos metastásico.

En el caso de medir niveles de proteínas para determinar la expresión génica, es adecuado cualquier método conocido en la técnica siempre que resulte en sensibilidad y especificidad adecuadas. Por ejemplo, los niveles de proteínas pueden ser medidor enlazándolas con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para la proteína y midiendo la cantidad de proteína enlazada al anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser etiquetados por reactivos radioactivos, fluorescentes u otros reactivos detectables para facilitar la detección. Los métodos de detección incluyen, sin limitación, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y técnicas de inmunotransferencia.

Los genes modulados usados en los métodos de la invención se describen en los Ejemplos. Los genes que son expresados diferencialmente son o regulados hacia arriba o regulados hacia abajo en pacientes con carcinomas de un origen particular en relación con los carcinomas de orígenes diferentes. Regulación hacia arriba y regulación hacia abajo son términos relativos que significan que se encuentra una diferencia detectable (más allá de la contribución del ruido en el sistema usado para medirla) en la cantidad de expresión de los genes en relación con alguna línea de base. En este caso, la línea de base se determina en base al algoritmo. Los genes de interés en las células enfermas son entonces o regulados hacia arriba o regulados hacia abajo en relación al nivel de la línea de base usando el mismo método de medición. Enfermo, en este contexto, se refiere a una alteración del estado de un cuerpo que interrumpe o perturba, o tiene el potencial de perturbar, el rendimiento adecuado de las funciones corporales como ocurre con la proliferación no controlada de células. Alguien es diagnosticado con una enfermedad cuando algún aspecto del genotipo o fenotipo de esa persona es consistente con la presencia de la enfermedad. Sin embargo, el acto de realizar un diagnóstico o pronóstico puede incluir la determinación de cuestiones de enfermedad/ estado como determinar la probabilidad de recaída, tipo de terapia y monitorización de la terapia. En la monitorización de la terapia, los juicios clínicos se hacen con respecto al efecto de un curso de terapia dado comparando la expresión de genes durante el tiempo para determinar si los perfiles de expresión génica han cambiado o están cambiado a patrones más consistentes con el tejido normal.

Los genes pueden ser agrupados de tal forma que la información obtenida sobre el conjunto de genes en el grupo proporcione una base sólida para hacer un juicio clínicamente relevante como un diagnóstico, pronóstico o elección de tratamiento. Estos conjuntos de genes componen las carpetas de la divulgación. Como con la mayoría de los Marcadores de diagnóstico, es a menudo deseable usar el menor número de Marcadores suficiente para hacer un juicio médico correcto. Esto evita un retraso en el tratamiento pendiente de análisis adicionales así como el uso improductivo de tiempo y recursos.

Un método de establecer carpetas de expresión génica es a través del uso de algoritmos de optimización como el algoritmo de varianza media usado ampliamente para establecer carteras de acciones. Este método se describe con detalle en la 20030194734. Esencialmente, el método designa el establecimiento de un conjunto de entradas (acciones en aplicaciones financieras, expresión medida por intensidad aquí) que optimizarán el retorno (por ejemplo, la señal que se genera) una vez que se recibe para su uso a la vez que se minimiza la variabilidad del retorno. Muchos programas de software comerciales están disponibles para realizar tales operaciones. Se prefiere el "Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application," referida como "Wagner Software" a lo largo de esta

especificación. Este software usa funciones de la "Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library" para determinar una frontera eficiente y carpetas óptimas en el sentido de Markowitz se prefiere. Markowitz (1952). El uso de este tipo de software requiere que los datos de micromatrices sean transformados para que puedan ser tratados como una entrada en la manera en que las mediciones de riesgo y retorno de acciones son usadas cuando el software se usa para sus propósitos de análisis financieros pretendidos.

El proceso de seleccionar una carpeta también puede incluir la aplicación de reglas heurísticas. Preferiblemente, dichas reglas se formulan en base a la biología y una comprensión de la tecnología usada para producir resultados clínicos. Más preferiblemente, se aplican a una salida del método de optimización. Por ejemplo el método de la varianza media de la selección de carpetas se pude aplicar a datos de micromatrices para un número de genes expresados diferencialmente en sujetos con cáncer. La salida del método será un conjunto optimizado de genes que podrían incluir algunos genes que son expresados en la sangre periférica así como en tejido enfermo. Si las muestras usadas en el método de prueba se obtienen de sangre periférica y ciertos genes expresados diferencialmente en casos de cáncer podrían ser también expresados diferencialmente en sangre periférica, entonces se puede aplicar una regla heurística en la que una carpeta es seleccionada de la frontera eficiente excluyendo las que se expresan diferencialmente en sangre periférica. Por supuesto, la regla puede ser aplicada antes de la formación de la frontera eficiente, por ejemplo, aplicando la regla durante la pre-selección de datos.

Se pueden aplicar otras reglas heurísticas que no están necesariamente relacionadas con la biología en cuestión. Por ejemplo, alguien puede aplicar una regla de que sólo un porcentaje prescrito de la carpeta puede estar representado por un gen particular o grupo de genes. El software comercialmente disponible como el Wagner Software acomoda fácilmente estos tipos de heurísticos. Esto puede ser útil, por ejemplo, cuando factores distintos de la exactitud y precisión (por ejemplo, derechos de licencia anticipados) tienen un impacto en la deseabilidad de incluir uno o más genes.

Los perfiles de expresión génica de esta divulgación también pueden ser usados en conjunción con otros métodos de diagnóstico no genéticos útiles en el diagnóstico, pronóstico o monitorización del tratamiento del cáncer. Por ejemplo, en algunas circunstancias es beneficioso combinar el poder diagnóstico de la expresión génica basado en métodos descritos anteriormente con datos de Marcadores convencionales como Marcadores de proteínas de suero (por ejemplo Antígeno del cáncer 27.29 ("27.29")). Existe una variedad de tales Marcadores incluyendo analitos como el CA27.29. En uno de dichos métodos, la sangre se toma periódicamente de un paciente tratado y se somete entonces a un inmunoensayo enzimático para uno de los Marcadores de suero descritos anteriormente. Cuando la concentración del Marcador sugiere la vuelta de tumores o el fallo de la terapia, se toma una fuente de muestra susceptible al análisis de expresión génica. Cuando existe una masa sospechosa, se toma un aspirado de aguja fina (FNA) y los perfiles de expresión génica de células tomadas de la masa se analizan como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, se pueden tomar muestras de tejido de áreas adyacentes al tejido del que se ha retirado anteriormente el tumor. Este enfoque puede ser particularmente útil cuando otras pruebas producen resultados ambiguos.

Los kits hechos de acuerdo con la divulgación incluyen ensayos con formato para determinar los perfiles de expresión génica. Estos pueden incluir todos o algunos de los materiales necesarios para realizar los ensayos como reactivos e instrucciones y un medio a través del cual se ensayan los Biomarcadores.

Los artículos de esta divulgación incluyen representaciones de perfiles de expresión génica útiles para tratar, diagnosticar, pronosticar y evaluar de otras maneras enfermedades. Estas representaciones de perfiles se reducen a un medio que puede ser leído automáticamente por una máquina como un medio legible por ordenador (magnético, óptico y similar). Los artículos pueden incluir también instrucciones para evaluar los perfiles de expresión génica en dicho medio. Por ejemplo, los artículos pueden comprender un CD ROM que tiene instrucciones informáticas para comparar perfiles de expresión génica de las carpetas de genes descritas anteriormente. Los artículos pueden tener también perfiles de expresión génica grabados digitalmente en ellos de tal forma que pueden ser comparados con datos de expresión génica de muestras de pacientes. Alternativamente, los perfiles pueden ser grabados en un formato de representación diferente. Una inscripción gráfica es uno de dichos formatos. Los algoritmos de agrupación como los incorporados en el software "DISCOVERY" e "INFER" de Partek, Inc. mencionados anteriormente pueden ayudar mejor a la visualización de dichos datos.

Diferentes tipos de artículos de fabricación de acuerdo con la divulgación son medios o ensayos formateados usados para revelar los perfiles de expresión génica. Estos pueden comprender, por ejemplo, micromatrices en las que los complementos o sondas de secuencia están fijados a una matriz a la que las secuencias indicativas de genes de interés se combinan creando un determinante legible de su presencia. Alternativamente, los artículos de acuerdo con la divulgación pueden ser pueden ser modelados en kits de reactivos para realizar hibridación, amplificación y generación de señal indicativos del nivel de expresión de los genes de interés para detectar cáncer.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar pero no limitar la invención reivindicada.

Ejemplo 1

Materiales y Métodos

Descubrimiento de genes Marcadores de cáncer de páncreas

El ARN se aisló de tejidos de tumor de páncreas, páncreas normal, pulmón, colon, mama y ovario usando Trizol. El ARN se usó entonces para generar ARN etiquetado, amplificado (Lipshutz et al. (1999)) que fue después hibridado en matrices Affymetrix U133A. Los datos fueron después analizados de dos maneras.

En el primer método, este conjunto de datos se filtró para conservar sólo aquellos genes con al menos dos designaciones presentes a través del conjunto de datos completo. El filtrado dejó 14.547 genes. Se determinó que

2.736 genes estaban sobreexpresados en el cáncer de páncreas frente al páncreas normal con un valor de p menor de 0,05. Cuarenta y cinco genes de los 2.736 estaban también sobreexpresados al menos dos veces en comparación con la intensidad máxima encontrada en tejidos de pulmón y colon. Finalmente, se encontraron seis conjuntos de sonda que estaban sobreexpresados al menos dos veces en comparación con la intensidad máxima de tejidos de pulmón, colon, mama y ovarios.

En el segundo método, este conjunto de datos se filtró para conservar sólo aquellos genes con no más de dos designaciones presentes en tejidos de mama, colon, pulmón y ovario. Este filtrado dejó 4.654 genes. Se descubrió que 160 genes de los 4.654 genes tenían al menos dos designaciones presentes en tejidos de páncreas (normal y cáncer). Finalmente, se seleccionaron ocho conjuntos de sondas que mostraron la expresión diferencial mayor entre el cáncer de páncreas y los tejidos normales.

Muestras de tejido

Se adquirieron un total de 260 tejidos primario y de metástasis de FFPE de una variedad de vendedores comerciales. Las muestras probadas incluían: 30 metástasis de mama, 30 metástasis colorrectal, 56 metástasis de pulmón, 49metástasis de ovario, 43 metástasis de páncreas, 18 primarios de próstata y 2 metástasis de próstata y 32 de otros orígenes (6 de estómago, 6 de riñón, 3 de laringe, 2 de hígado, 1 de esófago, 1 de faringe, 1 de conducto biliar, 1 de pleura, 3 de vejiga, 5 de melanoma, 3 de linfoma).

Extracción de ARN

El aislamiento de ARN de secciones de tejido de parafina se basó en los métodos y reactivos descritos en el manual del High Pure RNA Paraffin Kit (Roche) con las siguientes modificaciones. Se seccionaron muestras de tejido embebidas en parafina de acuerdo al tamaño de la metástasis embebida (2-5mm = 9 X 10µm, 6-8mm = 6 X 10µm, 8 -≥ 10mm = 3 X 10 µm) y se colocaron en tubos Eppendorf de 1.5 ml de RNasa/DNasa. Las secciones se desparafinaron por incubación en 1ml de xileno durante 2-5 min a temperatura ambiente seguido por 10 a 20 segundos de agitación en vórtice. Los tubos fueron entonces centrifugados y se retiro el sobrenadante y se repitió el paso de desparafinización. Después de que el sobrenadante se hubo retirado, se añadió 1 ml de etanol y la muestra se agitó en vórtice durante1 minuto, se centrifugó y se retiro el sobrenadante. Este proceso se repitió una vez adicional. Se retiró el etanol residual y el pellet se secó en un horno a 55º C durante 5-10 minutos y se resuspendió en 100 µl de tampón de lisis de tejido, 16 µl de 10% SDS y 80 µl de Proteinasa K. Las muestras se agitaron en vórtice y se incubaron en un conjunto termomezclador a 400 rpm durante 2 horas a 55º C. Se añadieron 325 µl de tampón de unión y 325 µl de etanol a cada muestra que fue entonces mezclada, centrifugada y se añadió el sobrenadante en la columna de filtro. Se centrifugaron la columna de filtro junto con el tubo de recogida durante 1 minuto a 8000 rpm y se descartó el flujo a través. Se realizaron una serie de lavados secuenciales (500 µl de Tampón de Lavado I → 500 µl de Tampón de Lavado II →300 µl de Tampón de Lavado II) en los que se añadió cada solución a la columna, se centrifugó y se descartó el flujo a través. La columna fue entonces centrifugada a máxima velocidad durante 2 minutos, colocada en un tubo de 1,5 ml nuevo y se añadieron 90 µl de tampón de elución. El ARN se obtuvo después de 1 minutos de incubación a temperatura ambiente seguido por una centrifugación de 1 minuto a 8000 rpm. La muestra fue tratada con DNasa con la adición de 10 µl de tampón de incubación de DNasa, 2 µl de DNasa I y se incubó 30 minutos a 37º C. La DNasa fue inactiva después de la adición de 20 µl de tampón de lisis de tejido, 18 µl de 10% SDS y 40 µl de Proteinasa K. De nuevo, se añadieron 325 µl de tampón de unión y 325 µl de etanol a cada muestra que fue entonces mezclada, centrifugada y se añadió el sobrenadante en la columna de filtro. Los lavados secuenciales y la elución del ARN procedieron como se ha señalado anteriormente con la excepción de que se usaron 50µl de tampón de elución para eluir el ARN. Para eliminar la contaminación de fibra de vidrio arrastrada de la columna el ARN se centrifugó durante 2 minutos a toda velocidad y el sobrenadante se retiro a un tubo Eppendorf de 1,5 ml nuevo. Las muestras fueron cuantificadas por lecturas OD 260/280 obtenidas por un espectrómetro y las muestras se diluyeron a 50 ng/µl. El ARN aislado se almacenó en agua libre de RNasa a -80º C hasta su uso.

Cebador TaqMan y Diseño de la Sonda

Se usaron los números de acceso de la secuencia de referencia de ARNm apropiados en conjunción con Oligo 6.0 para desarrollar ensayos TaqMan® CUP (Marcadores pulmonares: proteína B asociada al pulmón surfactante humano (HUMPSPBA), factor de transcripción tiroideo 1 (TTF1), desmogleína 3 (DSG3), Marcador colorrectal: cadherina 17 (CDH17), Marcadores de mama: mamaglobina (MG), factor de transcripción ets derivado de próstata (PDEF), Marcador de ovario: tumor de Wilms 1 (WT1), Marcadores de páncreas: antígeno de células madre de próstata (LCSP), factor de coagulación V (F5), Marcador de próstata calicreína 3 (KLK3)) y ensayos domésticos de β actina, hidroximetilbilano sintasa (PBGD). Los cebadores y sondas de hidrólisis para cada ensayo se enumeran en la Tabla 2. La amplificación del ADN genómico se excluyó diseñando ensayos alrededor de sitios de corte y empalme exon-intron. Las sondas de hidrólisis se etiquetaron en el nucleótido 5' con FAM como el colorante indicador y en el nucleótido 3' con BHQ1-TT como el colorante de extinción interno.

Reacción en Cadena de Polimerasa en Tiempo Real Cuantitativa

La cuantificación de ARN específico del gen se llevo a cabo en una placa de 384 pocillos en el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). Para cada ejecución de termo-ciclador se amplificaron los calibradores y las curvas estándar. Los calibradores para cada Marcador consistieron de transcritos in vitro del gen objetivo que fueron diluidos en un ARN portador de riñón de rata a 1X105 copias. Las curvas estándar para Marcadores domésticos consistieron de transcritos in vitro del gen objetivo que fueron diluidos en serie en ARN portador de riñón de rata a 1X107, 1X105 y 1X103 copias. No se incluyeron controles del objetivo en cada ejecución del ensayo para asegurar la carencia de contaminación ambiental. Todas las muestras y controles se ejecutaron por duplicado. Se realizó qRTPCR con reactivos de uso de laboratorio en general en una reacción de 10µl que contenía: Tampón de RT-PCR (50 nM Bicina/KOH pH 8,2, 115nM KAc, 8% de glicerol, 2,5 mM de MgCl2, 3,5 mM de MnSO4, 0,5 mM cada uno de dCTP, dATP, dGTP y dTTP), aditivos (2 mM de Tris-Cl pH 8, 0,2 mM de albúmina bovina, 150 mM de trehalosa, 0,002% de Tween 20), mezcla de enzimas (2U Tth (Roche), 0,4 mg/µl Ab TP6-25), Cebador y mezcla de sondas (0,2 µM de Sondas, 0.5µM de cebadores). Siguieron los siguientes parámetros de ciclación; 1 ciclo a 95º C durante 1 minuto; 1 ciclo a 55º C durante 2 minutos; Desnivel 5%; 1 ciclo a 70º C durante 2 minutos; y 40 ciclos de 95º C durante 15 segundos; 58º C durante 30 segundos. Después de que se completó la reacción de PCR, se establecieron los valores de la línea de base y umbral en el software ABI 7900HT Prism y los valores de Ct calculados se exportaron a Microsoft Excel.

Reacción de Un Paso frente a Dos Pasos

La síntesis de la primera cadena se llevo a cabo usando o 100 ng de hexámeros aleatorios o cebadores específicos de genes por reacción. En el primer paso, se calentaron 11,5 µl de Mezcla-1 (cebadores y lug de ARN total) a 65º C durante 5 minutos y después se refrigeraron en hielo. Se añadieron 8,5 µl de Mezcla-2 (1x Tampón, 0,01 mM de DTT, 0,5 mM de cada dNTP, 0.25U/µl de RNasin®, 10 U/µl Superscript III) a Mezcla-1 y se incubó a 50º C durante 60 minutos seguido por 95º C durante 5 minutos. El ADNc fue almacenado a -20º C hasta que estaba listo para el uso. El qRTPCR para el segundo paso de la reacción de 2 pasos se realizo como se ha señalado anteriormente con los parámetros de ciclación: 1 ciclo a 95° C durante 1 minuto; 40 ciclos de 95° C durante 15 segundos, 58° C durante 30 segundos. El qRTPCR para la reacción de un paso se realizó exactamente como se ha señalado en el párrafo anterior. Las reacciones de tanto un paso como la de dos pasos se realizaron en 100 ng de plantilla (ARN/ADNc). Después de que se completó la reacción de PCR se establecieron los valores de línea de base y umbral en el software ABI 7900HT Prism y los valores de Ct calculados se exportaron a Microsoft Excel.

Generación de un mapa de calor

Para cada muestra, se calculo un ∆Ct tomando el Ct medio para cada Marcador de CUP y restando el Ct medio de una media de los Marcadores domésticos (∆Ct = Ct(Marcador de CUP) -Ct (Marcador Doméstico medio). El ∆Ct mínimo para cada tejido del conjunto de Marcadores de origen (pulmón, mama, próstata, colon, ovario y páncreas) se determinó para cada muestra. El tejido de origen con el ∆Ct mínimo general se obtuvo una vez y todos los otros tejidos de origen obtuvieron cero. Los datas fueron ordenados de acuerdo con el diagnóstico patológico. Se rellenó un Partek Pro con los datos de viabilidad modificados y se generó un gráfico de intensidad.

Resultados.

Descubrimiento de nuevo tumor de origen de páncreas y Marcadores del estado del cáncer

Primero se analizaron cinco candidatos para Marcador de páncreas: antígeno de células madre de próstata (PSCA), inhibidor de proteinasa de serina, miembro 1 de clade A (SERPINA1), citoqueratina 7 (KRT7), metaloproteasas de matriz 11 (MMP11), y mucin4 (MUC4) (Varadhachary et al (2004); Fukushima et al. (2004); Argani et al. (2001); Jones et al. (2004); Prasad et al. (2005); y Moniaux et al. (2004)) usando micromatrices de ADN y un panel de 13 adenocarcinomas ductales de páncreas, cinco tejidos de páncreas normales y 98 muestras de tumores de mama, colorrectales, pulmón y ovario. Solo el PSCA demostró sensibilidad moderada (se detectaron seis de trece o 46% de tumores) a un especificidad alta (se identificaron correctamente 91 de 98 o 93% como no ser de origen pancreático) (Figura 4A). Por el contrario KRT7, SERPINA1, MMP11 y MUC4 demostraron sensibilidades del

38%, 31%, 85% y 31% respectivamente, a especificidades del 66%, 91%, 82% y 81 % respectivamente. Estos datos se encontraban en buena concordancia con el qRTPCR realizado en 27 metástasis de origen pancreático y 39 metástasis de origen no pancreático para todos los Marcadores excepto el MMP11 que mostró una sensibilidad y especificidad más pobres con el qRTPCR y las metástasis. En conclusión, los datos de la micromatriz en tejido primario congelado rápidamente sirve como un buen indicador de la capacidad del Marcador para identificar a una metástasis de FFPE como pancreática en origen usando qRTPCR pero esos Marcadores adicionales pueden ser útiles para un rendimiento óptimo.

Como el adenocarcinoma ductal de páncreas se desarrolla de células epiteliales ductales que comprenden sólo un pequeño porcentaje de todas las células pancreáticas (con células acinares y células de los islotes que comprenden la mayoría) y como los tejidos de adenocarcinoma de páncreas contienen una cantidad significativa de tejido normal adyacente (Prasad et al. (2005) y Ishikawa et al. (2005)), ha sido difícil identificar Marcadores de cáncer de páncreas (es decir, regulados hacia arriba en cáncer) que también diferenciarían este órgano de los órganos. Para su uso en un panel CUP dicha diferenciación es necesaria. El primer método de consulta (ver Materiales y Métodos) devolvió seis conjuntos de sonda: factor de coagulación V (F5), una proteína hipotética FLJ22041 similar a las proteínas de unión a FK506 (FKBP10), integrina β 6 (ITGB6), transglutaminasa 2 (TGM2), ribonucleoproteina heterogénea nuclear A0 (HNRP0), y BAX delta (BAX). El segundo método de consulta (ver Materiales y Métodos) devolvió ocho conjuntos de sonda: F5, TGM2, factor de transcripción de homeodominio tipo emparejado 1 (PITX1), isoforma trío ARNm (TRIO), ARNm para p73H (P73), una proteína desconocida para MGC: 10264 (SCD), y dos conjuntos de sonda para claudina18. F5 y TGM2 estaban presentes en ambos resultados de consulta y, de los dos, el F5 parecía el más prometedor (Figura 4B).

Optimización de la preparación de las muestras y qRTPCR usando tejidos FFPE

Después del aislamiento de ARN y qRTPCR los métodos se optimizaron usando tejidos fijados antes de examinar el rendimiento del panel de Marcadores. Primero se analizó el efecto de reducir el tiempo de incubación de la proteinasa K de dieciséis horas a 3 horas. No hubo efecto en el rendimiento. Sin embargo, algunas muestras mostraron fragmentos más largos de ARN cuando se uso el paso de proteinasa K más corto (Figura 5). Por ejemplo, cuando el ARN se aisló de un bloque de un año (c2"), no se observó diferencia en los electroferogramas. Sin embargo, cuando el ARN se aisló de un bloque de cinco años (C23), se observó una fracción más grande de ARNs de peso molecular más alto, según lo evaluado por la protuberancia en el desnivel, cuando se usó la digestión de proteinasa K más corta. Esta tendencia se mantuvo generalmente cuando se procesaron otras muestras, independientemente del órgano de origen para la metástasis de FFPE. En conclusión, acortar el tiempo de digestión de la proteinasa K no sacrifica rendimientos de ARN y puede ayudar a aislar ARN menos degradado, más largo.

Después, se compararon tres métodos diferentes de transcripción inversa: transcripción inversa con hexámeros aleatorios seguido por qPCR (dos pasos), transcripción inversa con un cebador específico del gen seguido por qPCR (dos pasos), y un qRTPCR de un paso usando cebadores específicos de los genes. El ARN se aisló de once metástasis y se comparó con valores de Ct a través de los tres métodos para β-actina, proteína surfactante humana B (HUMSPB) y factor de transcripción tiroideo (TTF) (Figura 6). Hubo diferencias estadísticamente significativas (p<0,001) para todas las comparaciones. Para los tres genes, la transcripción inversa sin hexámeros aleatorios seguido por qPCR (reacción de dos pasos) dieron los valores de Ct más altos mientras que la transcripción inversa con un cebador específico del gen seguido por qPCR (reacción de dos pasos) dio valores de Ct ligeramente (pero estadísticamente significativos) más bajos que los correspondientes a la reacción de 1 paso. Sin embargo, el REPCR de 2 pasos con cebadores específicos de los genes tenía un paso de transcripción inversa más largo. Cuando los valores de Ct de HUMSPB y TTF se normalizaron al valor de β-actina correspondiente para cada muestra, no hubo diferencias en los valores de Ct normalizados a través de los tres métodos. En conclusión, la optimización de las condiciones de reacción de RTPCR pueden generar valores de Ct más bajos, lo que puede ayudar a analizar bloques de parafina más viejos (Cronin et al (2004)), y una reacción de RTPCR de un paso con cebadores específicos de los genes puede generar valores de Ct comparables a los generados en la reacción de dos pasos correspondiente.

Rendimiento de diagnóstico de un ensayo qRTPCR de CUP.

Después se realizaron 12 reacciones de qRTPCR (10 Marcadores y dos genes domésticos) en 239 metástasis de FFPE. Los Marcadores usados para el ensayo se muestran en la Tabla 2. Los Marcadores del pulmón eran proteína B asociada al pulmón surfactante humana (HUMPSPB), factor de transcripción tiroideo 1 (TTF1), y desmogleína 3 (DSG3). El Marcador colorrectal era cadherina 17 (CDH 17). Los Marcadores de mama eran mamaglobina (MG) y factor de transcripción derivado de la próstata Ets (PDEF). El Marcador de ovario era el tumor de Wilms 1 (WT1). Los Marcadores de páncreas eran antígeno de células madre de la próstata (PSCA) y factor de coagulación V (f5), y el Marcador de próstata era calicreína 3 (KLK3). Para la descripción de los genes, ver la Tabla

31.

55 5

El análisis de los valores de Ct normalizados en un mapa de calor reveló la alta especificidad de los Marcadores de mama y próstata, especificidad moderada de colon, pulmón y ovario, y especificidad algo menor de los Marcadores de páncreas. Combinar los datos qRTPCR normalizados con refinamiento computacional mejora el rendimiento del panel de Marcadores. Los resultados se obtuvieron de los datos de qRTPCR normalizados combinados con el algoritmo y se precisó la precisión del ensayo qRTPCR.

Discusión

En este ejemplo, la realización de perfiles de expresión basados en micromatrices se uso en tumores primarios para identificar Marcadores candidatos para su uso con metástasis. El hecho de que los tumores primarios puedan ser usados para descubrir tumores de Marcadores de origen para metástasis es consistente con varios descubrimientos recientes. Por ejemplo, Weigelt y sus colaboradores han demostrado que los perfiles de expresión génica de tumores de mama primarios se mantienen en metástasis distantes. Weigelt et al. (2003). Italiano y sus colaboradores descubrieron que el estado de EGFR, evaluado por IHC, era similar en 80 tumores colorrectales primarios y las 80 metástasis relacionadas. Italiano et al. (2005). Solo cinco de los 80 mostraron discordancia en el estado de EGFR. Italiano et al. (2005). Backus y sus colaboradores identificaron Marcadores putativos para detectar metástasis de cáncer de mama usando un análisis de expresión génica de genoma amplio de la mama y otros tejidos y demostraron que la mamaglobina y CK19 detectaron metástasis clínicamente procesable en ganglios linfáticos centinelas de mama con un 90% de sensibilidad y un 94% de especificidad. Backus et al. (2005).

Los estudios basados en micromatrices con tejido primario confirmaron la especificidad y sensibilidad de Marcadores conocidos. Como resultado, con la excepción de F5, todos los Marcadores usados tenían alta especificidad para los tejidos estudiados en la presente. Argani et al (2001; Backus et al. (2005); Cunha et al. (2005); Borgono et al. (2004); McCarthy et al. (2003); Hwang et al. (2004); Fleming et al. (2000); Nakamura et al. (2002) y Khoor et al. (1997). Un estudio reciente determinó que usando IHC, el PSCA se sobreexpresa en la metástasis del cáncer de próstata. Lam et al. (2005). Dennis et al. (2002) también demostró que el PSCA podría ser usado como un tumor de Marcador de origen para páncreas y próstata. Como se muestra en la presente, la expresión fuerte del PSCA se encuentra en algunos tejidos de próstata a nivel de ARN pero, como se incluye el PSA en el ensayo, ahora se pueden segregar los cánceres de próstata y cáncer. Un descubrimiento nuevo de este estudio fue el uso del F5 como un Marcador complementario (a PSCA) para el tejido pancreático de origen. En tanto el conjunto de datos de micromatrices con tejido primario como el conjunto de datos de qRTPCR con metástasis de FFPE, el F5 complementó al PSCA (Figura 4 y Tabla 3).

Tabla 3 datos de viabilidad

Mama

Colon Pulmón Otro Ovario Páncreas Próstata Total

Total probado

30 30 56 32 49 43 20 260

#Correcto

22 27 45 16 43 31 20 204

#Otro / No probado

1 1 3 n/a 1 4 0 10

#Incorrecto

7 2 8 16 5 8 0 46

% Probado

96.67 96.67 94.64 100 97.96 90.70 100 96.15

% Correcto de probados

75.86 93.10 84.91 0 89.58 79.49 100 81.60

Correcto del total (%)

73.33 90.00 80.36 50.00 87.76 72.09 100 78.46

Investigadores anteriores han generado ensayos de CUP usando IHC o micromatrices. Su et al. (2001); Ramaswamy et al. (2001) y Bloom et al. (2004). Más reciente, se ha acoplado SAGE a un panel de Marcadores qRTPCR pequeño. Dennis (2002) y Buckhaults et al. (2003). Este estudio es el primero en combinar perfiles de expresión basados en micromatrices con un panel pequeño de ensayos qRTPCR. Los estudios de micromatrices con tejido primario identificaron algunos, pero no todos, de los mismos Marcadores del tejido de origen como los identificados anteriormente por estudios SAGE. Algunos estudios han demostrado que existe un acuerdo modesto entre los datos de perfiles basados en micromatrices de ADN y SAGE y que la correlación mejora para genes con niveles de expresión más altos, van Ruissen et al. (2005) y Kim (2003). Por ejemplo, Dennis y sus colaboradores identificaron PSA, MG, PSCA y HUMSPB mientras Buckhaults y sus colaboradores (Dennis y otros, (2002)) identificaron PDEF. Se prefiere ejecutar el ensayo CUP usando qRTPCR ya que es una tecnología robusta y puede tener ventajas de rendimiento sobre el IHC. Al-Mulla et al. (2005); y Haas et al. (2005). Como se muestra en la presente, el protocolo de qRTPCR se mejoró a través del uso de cebadores específicos de genes en una reacción de un paso. Esta es la primera demostración del usos de cebadores específicos de genes en una reacción de qRTPCR de un paso con tejido de FFPE. Otros investigadores o han hecho un qRTPCR de dos pasos (síntesis de ADNc en una reacción seguido por qPCR) o han usado hexámeros aleatorios o truncado cebadores específicos de genes. Abrahamsen et al. (2003); Specht et al. (2001); Godfrey et al. (2000); Cronin et al. (2004) y Mikhitarian et al.

(2004).

Ejemplo 2

Protocolo de Aislamiento de ARN Total CUP FFPE (kit Highpure Cat#3270289)

Propósito

Aislamiento del ARN total del tejido de FFPE

Procedimiento: Preparación de soluciones de trabajo

1.

Proteinasa k (PK) en el kit

Disolver liofilizado en 4.5 ml de Tampón de Elución. Alícuota y almacenar a -20º , estable durante 12 meses. PK-4x250mg (cat #3115852) Disolver liofilizado en 12,5 ml de Tampón de Elución (1x Tampón TE (pH 7,4-7). Alícuota y almacenar a -20º C.

2.

Tampón de Lavado I Añadir 60 ml de etanol absoluto a Tampón de Lavado I, almacenar a temperatura ambiente.

3.

Tampón de Lavado II Añadir 200 ml de etanol absoluto a Tampón de Lavado II, almacenar a temperatura ambiente.

4.

DNasa I

Disolver liofilizado en 400 µl de Tampón de Elución. Alícuota y almacenar a -20º C, estable durante 12 meses.

Seccionar Bloques de Parafina de -30-45 minutos para 12 bloques (12 bloques x 2 tubos = 24 tubos)

Las secciones cortadas del bloque deberían ser procesadas inmediatamente para la extracción de ARN

1.

Usar una hoja de afeitar afilada limpia en Micrótomo para cortar secciones de 6 x 10 micras de grosor de bloques de tejido recortados (tamaño 3-4 x 5-10 mm). Nota: Bloque Nuevo-Descartar las secciones de cera hasta que se ha obtenido la sección del tejido. Bloques usados-Descartar las 3 primeras secciones de tejido

2.

Inmediatamente colocar el tejido cortado en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y tapar firmemente para minimizar la humedad.

3.

Se recomienda tomar el número de secciones en base al tamaño del tumor mostrado en la Tabla 4.

Tabla 4

Tamaño de

Secciones/Tubo

MET

8-10 mm

6

6-8 mm

12

2-4 mm

18

Desparafinización ~ 30-45 minutos

1.

Añadir 1.0 ml de xileno a cada muestra y agitar en vórtice vigorosamente durante 10-20 segundos e incubar RT durante 25 minutos. Centrifugar a toda velocidad 2 minutos. Retirar el sobrenadante con cuidado.

2.

Repetir el paso 1.

3.

Centrifugar a toda velocidad durante 2 minutos. Retirar el sobrenadante.

4.

Añadir 1 ml de etanol abs. y agitar en vórtice vigorosamente 1 min. Centrifugar a toda velocidad 2 minutos.

Retirar el sobrenadante.

5.

Repetir el paso 4.

6.

Secar el tubo brevemente en una toalla de papel para deshacerse de los residuos de etanol.

7.

Secar el pellet seco durante 5-10 minutos a 55º C en un horno. Nota: es crítico que el etanol sea retirado completamente y los pellets sean secados concienzudamente, el etanol residual puede inhibir la digestión de PK.

Nota: si la PK está a -20C, calentarla en RT 20-30 minutos

Extracción de ARN ~2,5-3 horas

1.

Añadir 100 µl de Tampón de Lisis de Tejido, 16 µl de 10% SDS y 80 µl de solución de trabajo de Proteinasa K a un pellet de tejido, agitar en vórtice brevemente en varios intervalos e incubar 2 horas a 55º C agitando a 400 rpm,

2.

Añadir 325 µl de Tampón de Unión y 325 µl de etanol abs. Mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo.

3.

Centrifugar el lisado a toda velocidad durante 2 minutos.

4.

Combinar el tubo de filtro y el tubo de colección (12 tubos), y pipetear el sobrenadante del lisado en el filtro.

5.

Centrifugar durante 30 segundos a 800 rpm y descartar el exceso de flujo.

Nota: El Paso 4-5 se puede repetir, si el ARN necesita ser agrupado con 2 preparaciones de pellet de tejido más.

6.

Repetir la centrifugación a 8000 rpm durante 30 segundos para secar el filtro.

7.

Añadir 500 µl de solución de trabajo de Tampón de Lavado I a la columna y centrifugar durante 15-30 segundos a 8000 rpm, descartar el exceso de flujo.

8.

Añadir 500 µl de solución de trabajo de Tampón de Lavado II. Centrifugar durante 15-30 segundos a 8000 rpm, descartar el exceso de flujo.

9.

Añadir 300 µl de solución de trabajo de Tampón de Lavado II, centrifugar durante 15-30 segundos a 8000 rpm, descartar el exceso de flujo.

10.

Centrifugar el filtro High Pure durante 2 minutos a máxima velocidad.

11.

Colocar el tubo del filtro High Pure en un tubo de 1,5 ml nuevo y añadir 90 µl de Tampón de Elución. Incubar durante 1-2 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar 1 minuto a 800 rpm. Tratamiento de DNasa I ~ 1,5 horas.

12.

Añadir 10 de µl de Tampón de Incubación de 10x DNasa y 1,0 µl de solución de trabajo de DNasa I al eluido y mezclar. Incubar durante 45 minutos a 37º C (o 2,0 µl de DNasa I durante 30 minutos).

13.

Añadir 20 µl de Tampón de Lisis de Tejido, 18 µl de 10% SDS y 40 µl de solución de trabajo de Proteinasa K. Agitar en vórtice brevemente. Incubar durante 30 minutos (30-60 minutos) a 55º C

14.

Añadir 325 µl de Tampón de Unión y 325 µl de etanol abs. Mezclar y pipetear en un tubo de filtro High Pure nuevo con tubo de recolección (12 tubos).

15.

Centrifugar durante 30 segundos a 8000 rpm y descartar el exceso de flujo.

16.

Repetir la centrifugación a 8000 rpm durante 30 segundos para secar el filtro.

17.

Añadir 500 µl de solución de trabajo de Tampón de Lavado I a la columna. Centrifugar durante 15 segundos a 8000 rpm, descartar el exceso de flujo.

18.

Añadir 500 µl de solución de trabajo de Tampón de Lavado II. Centrifugar durante 15 segundos a 8000 rpm, descartar el exceso de flujo.

19.

Añadir 300 µl de solución de trabajo de Tampón de Lavado II. Centrifugar durante 15 segundos a 8000 rpm, descartar el exceso de flujo.

20.

Centrifugar el filtro High Pure durante 2 minutos a máxima velocidad.

21.

Colocar el tubo del filtro High Pure en un tubo de 1,5 ml nuevo. Añadir 50 µl de Tampón de Elución; incubar durante 1-2 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar durante 1 minuto a 8000 rpm para recoger el ARN eluido.

22.

Centrifugar el eluido durante 2 minutos a toda velocidad y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo sin perturbar las fibras de vidrio en el fondo.

23.

Tomar la lectura de 260/280 OD y diluir a 50 ng/µl. Almacenar a -80º C.

Protocolo de Ensayo CUP ASR (ABI 7900)

Propósito: Usar qRTPCR para determinar el tejido de origen de una muestra de CUP

Configuración del Control:

1. Controles Positivos (Consultar la Tabla 5 y Placa C en la Configuración de Placas, Figura 7)

Tabla 5 diluciones en Serie de IVT -5µl 1X108 en 470 µl de H2O + 25µl de 10000 ARNr

Control IVT

CE/µl Muestra Agua ARNr de fondo

BACTIN

100E+05 50 425 25

CDH 17

100E+05 50 425 25

DSG3

100E+05 50 425 25

F5

100E+05 50 425 25

Hump

100E+05 50 425 25

MG

100E+05 50 425 25

PBGD

100E+05 50 425 25

PDEF

100E+05 50 425 25

PSCA

100E+05 50 425 25

TTF1

100E+05 50 425 25

WT1

100E+05 50 425 25

1E6. Tabla 5. Diluir 50,000 CE/µl de ARNr a 500 CE/µl -5µl 50,000 CE/µl + 495 µl H2O

Alícuotas 10 µl por tubo de tira (2 placas); Colocar la Mezcla a -80º C hasta que esté lista para el uso.

2. Curvas estándar (Consultar la Tabla 6 y la Placa C en la Configuración de Placas, Figura 7)

Paso 1: La curva estándar se configuro exactamente como se muestra en la Tabla 6.

Tabla 6. Solución Madre -1X108 IVT. Diluir 50,000 CE/µl de ARNr a 500 CE/µl -5ml 50,000 CE/µl + 495 µl H2O

Control IVT

CE/µl Muestra Agua ARNr de fondo

BACTIN-1

100E+07 50 425 25

BACTIN-2

100E+06 50 425 25

BACTIN-3

100E+05 50 425 25

BACTIN-4

100E+04 50 425 25

BACTIN-5

100E+03 50 425 25

PBGD-1

100E+07 50 425 25

PBGD-2

100E+06 50 425 25

PBGD-3

100E+05 50 425 25

PBGD-4

100E+04 50 425 25

PBGD-5

100E+03 50 425 25

Alícuotas 10 µl por tubo de tira (2 placas); Colocar la Mezcla a -80º C hasta que esté lista para el uso.

Mezcla de Enzimas:

1. Mezcla Maestra: Enzima (Tth) / Anticuerpo (TP6-25), ver Tabla 7.

Tabla 7

Reactivo

2x

Enzima Tth (5U/µl)

600.00

Anticuerpo: TP6-25 (1mg/ml)

600.00

Agua

300.00

Total

1500.00

Alícuota 500 µl/tubo y congelar a -20º C. 15 Mezcla Maestra CUP:

1. 2.5X Mezcla Maestra CUP (Tablas 8-11):

Tabla 8

Tabla 9

ml

5x Aditivos 2.5x Conc.

0.50

1M Tris-Cl pH 8 5mM

1.25

40mg/ml de Albumina, bovina 500µg/ml

37.50

1M Trehalosa madre 375mM

2.5

20%v Tween 20 0.50%

7.00

ddH2O

48.75

Permitir que el reactivo se mezcle completamente > 15 minutos

ml

5x Aditivos 2.5 x Conc

12.50

1M Bicina/Hidróxido de Potasio pH 8.2 125mM

5.75

5M Acetato de Potasio 287.5mM

20.00

Glicerol (V x D = M -> 19.6 x 1.26 = 24.6 g) 20%

1.25

500mM Cloruro de Magnesio 6.25mM

1.75

500mM Cloruro de Magnesio 8.75mM

5.00

ddH2O

46.25

Permitir que el reactivo se mezcle completamente > 15 minutos; Combinar las mezclas anteriores en un contenedor estéril añadir lo siguiente

Tabla 10

ml

5x Aditivos 2.5x Conc.

1.25

100mM dATP 1.25mM

1.25

100mM dCTP 1.25mM

1.25

100mM dTTP 1.25mM

1.25

100mM dGTP 1.25mM

100.00

Permitir que el reactivo se mezcle completamente > 15 minutos; Alícuota 1.8ml/tubo y congelar a -20°C

Tabla 11

Cebador/Sonda

Madre (µM) FC (µM) Σl

Cebador Directo

100 10 100.0

Cebador Inverso

100 10 100.0

Sonda (5’FAM/3’BHQ1-TT)

100 4 40.0

Agua DI

760.0

Total

1000.0

Mezcla de Cebador y Sonda:

Alícuota 250 µl/tubo y congelar a -20º C

35 Mezcla de la Reacción:

1. Mezcla Maestra de CUP (CMM): (Consultar las Tablas 12-14 y la Placa A en la Configuración de Placas, Figura 7)

Tabla 12

Reactivo

FC X1 (10µl) 450

2.5 x Mezcla Maestra CUP

1X 4.00 1800

ROX

1x 0.20 90

2x MezclaTthAb

2U 1.00 450

Agua

2.3 1035

Total

7.50 3375

Preferiblemente, cada ejecución/placa no tendrá más de 356 reacciones: 12 muestras con 12 Marcadores

(288 reacciones con 2 replicados para cada una) +10 controles de curva estándar por duplicado (20) + 2 controles

positivos y 2 negativos para cada Marcador (4X12=48).

Ajustar el agua para el volumen de muestra -4,3 µl Muestra MAX; Mezclar Bien

Tabla 13

Reactivo

FC X1 (10µl) 34

Cebadores 10µM/Sonda 4µM

0.5 µM/0.2 µM 0.50 17

CMM

1x 7.50 255

Total

8.00 272

2. Marcadores ToO: Mezclar Bien

Tabla 14

Reactivo

FC X1 (10µl) 44

Cebadores 10µM/Sonda 4µM

0.5µM/0.2µM 0.50 22

CMM

1x 7.50 330

Total

8.00 352

3. Marcadores de β-Actina y PBGD: Mezclar bien

Configuración de la Muestra:

Tabla 15

Muestra

ID de la Muestra Conc Agua Añadida = 50ng/µll

A1

A2

A3

A4

A5

A6

A7

A8

A9

A10

A11

A12

1. Muestras de CUP: 12 muestras en Placa de 96 pocillos: A1-A12 (Consultar la Tabla 16 y la Placa B en la Configuración de Placas, Figura 7); Alícuota 50 µl de 50 ng/µl (2µl/rxn)

Placa de Carga:

1. Configuración de Placa de 384 Pocillos: (Consultar la Placa D en la Configuración de Placas, Figura 7)

Se cargan 2 µl de muestra y 8 µl de CMM en la placa. (muestra=50ng/µl). Se cargan 4 µl de muestra y 6 µl de CMM en la placa. (muestra=25ng/µl). La placa se sella y se etiqueta. Centrifugar a 2000 rpm durante 1 minuto. Configuración de ABI 7900 HT:

Colocar en el ABI 7900. Seleccionar el programa "CUP 384" y presionar comenzar. 55

Tabla 16

Condiciones de termociclado

95C x 60s

55C x 2m

RAMP 5%

70C x 2m

40 ciclos de

95C x 15s

58C x 30s

ROX Encendido

Se analizan los datos, los de Ct extraídos e insertados en el Algoritmo.

Ejemplo 3

Algoritmo de CUP

Los valores de ∆Ct normalizados de actina para HPT, MGB, PDEF, PSA, SP-B, TFF, DSG, WT1, PSCA, y F5 se colocan en 6 conjuntos basados en el tejido de origen para el que fueron originalmente seleccionados. Las constantes 9.00, 11.00, 7.50, 5.00, 10.00, 9.50, 6.50, 8.00, 9.00, y 8.00 se restan de cada ∆Ct respectivamente. Después, para cada muestra se selecciona el valor de CT mínimo de cada uno de los 6 conjuntos (HPT, min (MGB,

o PDEF), PSA, min (SP-B, TFF, o DSG), WT1, and min (PSCA, o F5)) como la variable representativa para el grupo.

Estas variables, y el sitio de metástasis se usan para clasificar la muestra usando discriminantes lineales. se deben construir dos modelos diferentes, uno para hombres y uno para mujeres, de los datos de aprendizaje usando la función 'Ida' de ll librería MASS (Venables et al. (2002) en R (version 2.0.1). Se calcula entonces una probabilidad posterior para cada ToO usando la función 'predecir2 para cada modelo masculino o femenino.

Las variables usadas en los modelos masculinos son HPT, PSA, el mínimo de ('SP-B', 'TFF', 'DSG3'), el mínimo de ('LCSP', 'F5'), y el sitio de metástasis. La categoría del sitio de metástasis tiene 4 niveles correspondientes a colon, pulmón, ovario y todos los otros tejido. Para los modelos femeninos, las variables son HPT, el mínimo de ('MGB', 'PDEF'), el mínimo de ('SP-B', 'TFF', 'DSG3'), WT1, el mínimo de ('LCSP', 'F5'), y el sitio de metástasis.

Ejemplo de Código R

#Training the male model dat.m<-CUP2.MIN.NORM[,c (’HPT’,’PSA’,’SP.B.TTF.DSG3’,’PSCA.F5’,’Class’,’background’)] CUP.lda.m<lda(Class~.,dat.m,prior=c(0,0.09,0.23,0.43,0,0.16,0.02)/sum(c (0,0.09,0.23,0.43,0,0.16,0.02))) #Training the female model dat.f<-CUP2.MIN.NORM[,c (’HPT’,’MFB.PDEF’,’SP.B.TTF.DSG3’,’WT1’,’PSCA.F5’,’Class’,’back ground’)] CUP.lda.f<lda(Class~.,dat.f,prior=c(0.03,0.09,0.23,0.43,0.04,0.16,0)/sum(c (0.03,0.09,0.23,0.43.0.04,0.16,0))) #if unknown sample (i) is male predict(CUP.lda.m, CUP2.MIN.NORM.TEST[i,]) #if unknown sample (i) is female

predict(CUP.lda.f, CUP2.MIN.NORM.TEST[i,])

Para ejecutar este código, un marco de datos llamado CUP2.MIN.NORM necesita contener los datos de

aprendizaje con el valor mínimo calculado para cada conjunto de tejido de origen como se ha descrito anteriormente.

La clase se corresponde con el tejido de origen, y el fondo se corresponde con los sitios de metástasis descritos anteriormente.

Los datos de la prueba pueden ser contenidos en el CUP2.MIN.NORM.TEST, y una muestra específica en la fila i puede ser probada usando la función predecir. De nuevo, los datos de prueba deben estar en el mismo formato que el conjunto de aprendizaje y tener también los ajustes del valor mínimo aplicados a él.

Ejemplo 4

Muestras resueltas de CUP

Se compararon 48 muestras resueltas y no resultas de CUP para determinar la correlación con las muestras de CUP verdaderas. Los métodos usados fueron los descritos en los Ejemplos 1-3. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 17. Se probaron 11 muestras de CUP no resueltas, el diagnóstico se hizo en 8 muestras, 3 fueron de otra categoría.

Tabla 17

Categoría de la Muestra

Muestra # Correcta Incorrecta sin prueba % de precisión

ToO Conocido

15 11 3 1 79

CUP resuelto

22 17 4 1 81

CUP no resuelto

11 8 N/a 3 73

Ejemplo 5

Límites del Ensayo de CUP

La figura 8 representa los resultados obtenidos, usando los métodos descritos en los Ejemplos 1-3, para determinar los límites de los ensayos de CUP. El rendimiento del ensayo se probó sobre un intervalo de concentraciones de ARN y se descubrió que los ensayos de CUP son eficientes en el intervalo de 100 -12.5 ng de ARN.

Ejemplo 6

Ensayo de qRTPCR

Materiales y Métodos. Muestras de Tejido congeladas para Análisis de Micromatrices. Se usaron un total de 700 tejidos humanos primarios congelados para ella realización de perfiles de micromatrices de expresión génica. Las muestras se obtuvieron de una variedad de instituciones académicas, incluyendo la Universidad de Washington(St. Louis, MO), el Erasmus Medical Center (Rotterdam, Países Bajos), y compañías de banco de tejidos comerciales, incluyendo Genomics Collaborative, Inc (Cambridge, MA), Asterand (Detroit, MI), Oncomatrix (La Jolla, CA) y Clinomics Biosciences (Pittsfield, MA). Para cada espécimen, , se recogió también información demográfica del paciente, clínica y patológica. Las características histopatológicas de cada muestra se revisaron para confirmar el diagnóstico y para estimar la conservación de la muestra y el contenido tumoral.

Extracción de ARN e Hibridación del Chip Génico Affymetrix. Se diseccionaron y homogeneizaron muestras de cáncer congeladas con más de un 70% de células tumorales, muestras benignas y normales con homogeneizador mecánico (UltraTurrex T8, Alemania) en reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). El tejido fue homogeneizado en reactivo Trizol siguiendo el protocolo de Trizol estándar para el aislamientos de ARN de tejidos congelados (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de la centrifugación la fase de líquido superior se recogió y se precipitó el ARN total con alcohol isopropílico a -20º C. Los pellets de ARN se lavaron con 75% de etanol, se resolvieron en agua y se almacenaron a -80º C hasta su uso.

La calidad del ARN se examinó con un Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano Assay (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). El ARNc etiquetado se preparó e hibridó con el Chip Génico Hu133A de matriz de oligonucleótidos de alta densidad (Affymetrix, Santa Clara, CA) que contiene un total de 22.000 conjuntos de sonda de acuerdo con el protocolo del fabricante estándar. Las matrices fueron escaneadas usando protocolos y escáneres de Affymetrix. Para análisis posteriores, cada conjunto de sondas se consideró un gen separado. Los valores de expresión para cada gen se calcularon usando el software de análisis de Chip Génico de Affymetrix MAS 5.0. Todos los chips cumplían tres estándares de control de calidad: el porcentaje de designación "presente" para la matriz era mayor del 35%, el factor de escala era menor de 12 cuando se modificó a escala a una intensidad objetivo global de

600 y el nivel de fondo medio era menor de 150.

Selección de Candidatos a Marcadores. Para la selección de los candidatos a Marcadores del tejido de origen (ToO) para tejidos de pulmón, colon, mama, ovario y próstata, los niveles de expresión de los conjuntos de sondas se midieron en muestras de ARN que cubrían un total de 682 tejidos normales, benignos y cancerosos de mama, colon, pulmón, ovario, próstata. Los candidatos a Marcador específico del tejido fueron seleccionados en base al número de consultas estadísticas.

Para generar candidatos pancreáticos, se usaron perfiles de expresión génica de 13 adenocarcinomas ductales de páncreas primarios, 5 de páncreas normales y 98 especímenes de cáncer de pulmón, colon, mama y ovario para seleccionar los Marcadores de adenocarcinoma de páncreas. Se realizaron dos consultas. En la primera consulta, se creó un conjunto de datos que contenía 14547 genes con al menos 2 designaciones "presentes" en muestras de páncreas. Se identificó un total de 2736 genes que sobreexpresaban en cáncer de páncreas en comparación con el normal por prueba T (p<0,05). Se seleccionaron genes con expresión mínima en el percentil 11º de cáncer de páncreas que era al menos 2 veces más alto que el máximo en cáncer de colon y pulmón, haciendo 45 conjuntos de sondas. Como un paso final, se seleccionaron 6 genes con expresión máxima al menos 2 veces más alta que la expresión máxima en cánceres de colon, pulmón, mama y ovario. En una segunda consulta, se creó un conjunto de datos de 4654 conjuntos de sonda con un máximo de 2 designaciones "presentes" en especímenes de mama, colon, pulmón y ovario. Se seleccionaron un total de 160 genes que tenían al menos 2 designaciones "presentes" en muestras de cáncer y normal de páncreas. Fuera de los 160 genes, se seleccionaron 10 genes después de comparar su nivel de expresión entre tejidos de páncreas y normales. Los resultados de ambas consultas de páncreas se combinaron.

Además del análisis de los perfiles de expresión génica, se seleccionaron unos pocos Marcadores de la bibliografía. Los resultados de todas las consultas fueron combinados para hacer una lista corta de candidatos a Marcador de ToO para cada tipo de tejido. Se estimaron la sensibilidad y especificidad de cada Marcador. Los Marcadores que demostraron la mejor capacidad para diferenciar tejidos por su origen fueron nominados para pruebas de RT-PCR en base a la redundancia y complementariedad de los Marcadores.

Carcinoma metastásico de FFPE de origen conocido y tejidos de CUP. Se adquirieron un total de 386 carcinomas metastásicos de FFPE (Etapa III-IV) de origen conocido y 24 adenocarcinomas primarios de próstata de FFPE de una variedad de vendedores comerciales, incluyendo Proteogenex (Los Angeles, CA), Genomics Collaborative, Inc. (Cambridge, MA), Asterand (Detroit, MI), Ardais (Lexington, MA) y Oncomatrix (La Jolla, CA). se obtuvo un conjunto independiente de 48 carcinomas metastásicos de primario conocido y tejidos de CUP del Albany Medical College (Albany, NY). Para cada espécimen, se recogió información demográfica del paciente, clínica y patología. Se revisaron las características histopatológicas de cada muestra para confirmar el diagnóstico, y para estimar la conservación de la muestra y el contenido tumoral. Para las muestras metastásicas, se establecieron inequívocamente diagnósticos del carcinoma metastásico y ToO en base a la historia clínica del paciente y la evaluación histológica del carcinoma metastásico en comparación con los primarios correspondientes.

Asilamiento de ADN de muestras de FFPE. El aislamiento de ARN de secciones de tejido de parafina fue como se describe en el manual del High Pure RNA Paraffin Kit (Roche) con las siguientes modificaciones. Se seccionaron muestras de tejido embebidas en parafina de acuerdo al tamaño de la metástasis embebida (2-5mm = 9 X 10µm, 6-8mm = 6 X 10µm, 8 -≥ 10mm = 3 X 10 µm). Las secciones fueron desparafinadas como se describe en el manual del Kit, el pellet de tejido se seco en un horno a 55º C durante 5-10 minutos y se resuspendió en 100 µl de tampón de lisis de tejido, 16µl de 10% SDS y 80 µl de Proteinasa K. Las mezclas se agitaron en vórtice y se incubaron en un conjunto termomezclador a 400 rpm durante 2 horas a 55º C. El procesamiento de muestras posterior se realizó de acuerdo al manual del High Pure RNA Paraffin Kit. Se cuantificaron las muestras por lecturas de OD 260/280 obtenidas por un espectrómetro y las muestras se diluyeron a 50 ng/µl . El ARN aislado fue almacenado en agua libre de RNasa a 80º C hasta su uso.

qRTPCR para Pre-cribado de candidatos a Marcadores. Un µg de ARN total de cada muestra fue sometido a transcripción inversa con hexámeros aleatorios usando la transcriptasa inversa Superscript II de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se diseñaron cebadores y sondas MGB para los candidatos a Marcadores génicos probados y el gen de control ACTB usando software Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA) o ABI Assay-on-Demand (Applied Biosystems, Foster City, CA). Todos los cebadores y sondas diseñados internamente se probaron para eficiencia de amplificación óptima por encima del 90%. La amplificación por RT-PCR se llevó a cabo en una mezcla de reacción de 20 ml que contenía 200 ng de ADNc de plantilla, 2 x mezcla maestra de PCR universal TaqMan® (10 ml) (Applied Biosystems, Foster City, CA), 500 nM de cebadores directos e inversos, y 250 nM de sonda. Las reacciones se ejecutaron en un Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las condiciones de ciclación fueron: 2 minutos de activación de AmpErase UNG a 50º C, 10 minutos de activación de polimerasa a 95º C y 50 ciclos a 95º C durante 15 segundos y temperatura de hibridación (60º C) durante 60 segundos. En cada ensayo, el control "sin plantilla" junto con el ADNc de plantilla fue incluido por duplicado para tanto el gen de interés como el gen de control. La expresión relativa de cada gen objetivo fue representada como ∆Ct, que es igual al Ct del gen objetivo restado por el

Ct del gen de control (ACTB).

qRTPCR de un paso optimizado. Se usaron los números de acceso de secuencias de ARNm apropiadas en conjunción con Oligo 6.0 para desarrollar ensayos de CUP TaqMan® (Marcadores de pulmón, surfactante humano, proteína B asociada al pulmón (HUMPSPBA), factor de transcripción tiroideo 1 (TTF1), desmogleína 3 (DSG3), marcador colorrectal: cadherina 17 (CDH17), marcadores de mama: mamaglobina (MG), factor de transcripción ets derivado de la próstata (PDEF), Marcador de ovario: tumor de Wilms 1 (WT1), marcadores de páncreas: antígeno de células madre de próstata (LCSP), factor de coagulación V (F5), calicreína del marcador de próstata 3 (KLK3)) y actina beta (β-actina) de ensayos domésticos, hidroximetilbilano sintasa (PBGD). Los cebadores específicos de los genes y las sondas de hidrólisis para el ensayo qRT-PCR de un paso optimizado se enumeran en la Tabal 2 (SEQ ID NOs: 11-58). La amplificación del ADN genómico fue excluida diseñando los ensayos alrededor de sitios de escisión exón-intrón. Las sondas de hidrólisis fueron etiquetadas en el nucleótido 5' con FAM como el colorante indicador y en el nucleótido 3' con BHQ1-TT como el colorante de extinción interno.

La cuantificación de ARN específico del gen se llevo a cabo en una placa de 384 pocillos en el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). Para cada ejecución de termo-ciclador se amplificaron los calibradores y las curvas estándar. Los calibradores para cada Marcador consistieron de transcritos in vitro del gen objetivo que fueron diluidos en ARN portador de riñón de rata a 1X105 copias. Las curvas estándar para Marcadores domésticos consistieron de transcritos in vitro del gen objetivo que fueron diluidos en serie en ARN portador de riñón de rata a 1X107, 1X105 y 1X103 copias. No se incluyeron tampoco controles del objetivo en cada ejecución del ensayo para asegurar la carencia de contaminación ambiental. Todas las muestras y controles se ejecutaron por duplicado. Se realizó qRTPCR con reactivos de uso de laboratorio en general en una reacción de 10µl que contenía: Tampón de RT-PCR (50 nM Bicina/KOH pH 8,2, 115nM KAc, 8% de glicerol, 2,5 mM de MgCl2, 3,5 mM de MnSO4, 0,5 mM cada uno de dCTP, dATP, dGTP y dTTP), aditivos (2 mM de Tris-Cl pH 8, 0,2 mM de albúmina bovina, 150 mM de trehalosa, 0,002% de Tween 20), Mezcla de Enzimas (2U Tth (Roche), 0,4 mg/µl Ab TP6-25), Cebador y mezcla de sondas (0,2 µM de Sondas, 0.5µM de cebadores). Siguieron los siguientes parámetros de ciclación; 1 ciclo a 95º C durante 1 minuto; 1 ciclo a 55º C durante 2 minutos; Desnivel 5%; 1 ciclo a 70º C durante 2 minutos; y 40 ciclos de 95º C durante 15 segundos; 58º C durante 30 segundos. Después de que se completó la reacción de PCR, se establecieron los valores de la línea de base y umbral en el software ABI 7900HT Prism y los valores de Ct calculados se exportaron a Microsoft Excel.

Reacción de Un paso frente a Dos Pasos. Para la comparación de las reacciones de RT-PCR de dos pasos con la de un paso, se llevó a cabo la síntesis de la primera cadena de la reacción de dos pasos usando o 100 ng de hexámeros aleatorios o cebadores específicos del gen por reacción. En el primer paso, se calentaron 11,5 µl de Mezcla-1 (cebadores y 1 µg de ARN total) a 65º C durante 5 minutos y después se enfrió en hielo. Se añadieron 8,5 µl de Mezcla-2 (1x Tampón, 0,01 mM de DTT, 0,5 mM de cada uno de los dNTP, 0,25 U/µl de RNasin®, 10 U/µl de Superscript III) a la Mezcla-1 y se incubó a 50º C durante 60 minutos seguido por 95º C durante 5 minutos. El ADNc fue almacenado a -20º C hasta que estuvo listo para el uso, el qRTPCR para el segundo paso de la reacción de dos pasos se realizó como se ha indicado anteriormente con los siguientes parámetros de ciclación: 1 ciclo a 95° C durante 1 minuto; 40 ciclos de 95° C durante 15 segundos, 58° C durante 30 segundos. El qRTPCR para la reacción de un paso se realizó exactamente como se ha señalado en el párrafo anterior. Las reacciones de tanto un paso como la de dos pasos se realizaron en 100 ng de plantilla (ARN/ADNc). Después de que se completó la reacción de PCR se establecieron los valores de línea de base y umbral en el software ABI 7900HT Prism y los valores de Ct calculados se exportaron a Microsoft Excel.

Desarrollo del Algoritmo. se construyeron discriminadores lineales usando la función 'idea' de la biblioteca MASS (Venables y Ripley) en el lenguaje R (versión 2.1.1). El modelo usado es dependiente del tejido del que se extrajo la metástasis, así como del género del paciente. Cuando se encuentra un sitio de metástasis de pulmón, colon u ovario, el antecedente de clase es establecido a cero para la clase que es equivalente al sitio de metástasis. Además, las probabilidades anteriores son establecidas a cero para la clase de mama y ovario en pacientes masculinos, mientras que en pacientes femeninos, el antecedente de la clase de próstata es establecido a cero. Todas las otras probabilidades anteriores usadas en los modelos son equivalentes. Además, la clasificación para cada muestra se basa en la probabilidad posterior más alta determinada por el modelo para cada clase. Para estimar el rendimiento del modelo, se realizó una validación cruzada dejando uno fuera. Además de esto, los conjuntos de datos fueron divididos aleatoriamente en mitades., conservando la relación proporcional entre cada clase, en conjuntos de aprendizaje y prueba. Esta división aleatorio se repitió tres veces.

Resultados. El objetivo de este estudio era desarrollar un ensayo qRTPCR para predecir el tejido de origen de carcinoma metastásico. El trabajo experimental consistió de dos partes principales. La primera parte incluía la nominación de candidatos a Marcador específicos del tejido, su validación en tejidos de carcinoma metastásico de FFPE, y la selección de diez Marcadores para el ensayo (Figura 9A). La segunda parte incluía la optimización del ensayo qRTPCR seguido por la implementación del ensayo en otro conjunto de carcinomas metastásicos de FFPE, la construcción de un algoritmo de predicción, su validación cruzada y validación en un conjunto de muestras independiente. (Figura 9B).

Número Total

Edad Media

Género

Femenino

Masculino

Tejido de Origen

Pulmón

Páncreas

Colorrectal

Mama

Ovario

Próstata

Riñón

Estomago

Otro**

Carcinoma de Primario Desconocido

Diagnóstico Histopatológico Adenocarcinoma, moderadamente/bien diferenciado Adenocarcinoma, pobremente diferenciado carcinoma de células escamosas Carcinoma pobremente diferenciado Carcinoma de células pequeñas Melanoma Linfoma Carcinoma Hepatocelular Mesotelioma Otro***

Sitio de Metástasis Nódulos Linfáticos Cerebro Pulmón Hígado Región pélvica (ovario, vejiga, trompas de Falopio) Abdomen(epiplón (epiplón,mesenterio,colon,peritoneo) Otro (piel, tiroides, pared torácica, ombligo) Desconocido Primario (próstata)

Características de la Muestra. Se usó el ARN de un total de 700 muestras de tejido primario congeladas para la realización del perfil de expresión génico e identificación del gen específico del tipo de tejido. Las muestras incluían 545 carcinomas primarios (296 de pulmón, 13 de páncreas, 315 de mama, 128 colorrectales, 38 de próstata. 22 de ovario), 37 lesiones benignas (1 de pulmón, 4 colorrectales, 6 de mama, 26 de próstata) y 118 (36 de pulmón, 5 de páncreas, 36 colorrectales, 14 de mama, 3 de próstata, 24 de ovario) tejidos normales.

Se usaron en este estudio un total de 375 carcinomas metastásicos de origen conocido (Etapa III-IV) y 26 muestras de adenocarcinoma primario de próstata. Los carcinomas metastásicos se originaron a partir de pulmón, páncreas, colorrectal, de ovario, de próstata, así como otros tipos de cáncer. La categoría de muestra "otro" consintió de metástasis derivada de tejidos distintos de pulmón, páncreas, colon, mama, ovario y próstata. Las características de los pacientes se resumen en la Tabla 18.

Tabla 18

CUP Metastásico Conjunto de la

Muestra

401 48

57.8 ±11* 62.13 ±11.7 241 20 160 28

65 9 63 2 61 4 63 5 82 2 27 2 88 70 25 5

306 27 49 4 16 5 16 10

3 5 3 2 1

14 2

73 1 17 14 20 7 75 11 53 2 91 5 44 8

* La edad es desconocida para 26 pacientes

** esófago, vejiga, pleura, vesícula biliar del hígado, conductos biliares, laringe, faringe, linfoma no Hodgkin *** de células pequeñas, mesotelioma, hepatocelular, melanoma, linfoma

Las muestras fueron separadas en dos conjuntos: el conjunto de validación (205 especímenes) que fue usado para validar la expresión diferencial específica del tejido de los candidatos a Marcador y el conjunto de aprendizaje (260 especímenes) que fue usado para probar el procedimiento qRTPCR de un paso optimizado y para el aprendizaje de un algoritmo de predicción. El primer conjunto de 205 muestras incluía 25 de pulmón, 41 de páncreas, 31 colorrectales, 33 de mama, 33 de ovario, 1 de próstata, 23 otras metástasis de cáncer y 18 cánceres primarios de próstata. El segundo conjunto consistía de 260 muestras incluidos 56 de pulmón, 43 de páncreas, 30 colorrectales, 30 de mama, 49 de ovario, 32 otras metástasis de cáncer y 20 cánceres primarios de próstata. Sesenta y cuatro especímenes, incluyendo 16 de pulmón, 21 de páncreas, 15 otros metastásicos y 12 carcinomas primarios de próstata fueron del mismo paciente en ambos conjuntos.

El conjunto de muestra independiente obtenido del Albany Medical College estaba comprendido de 33 especímenes de CUP con un primario sugerido para 22 de ellos, y 15 carcinomas metastásicos de origen conocido. Para los CUPs que tenían un primario sugerido, se hizo un diagnóstico en base a características morfológicas y/o resultados de pruebas con un panel de Marcadores IHC. Las características demográficas del paciente, clínicas y de patología se presentan en la Tabla 18.

Selección de candidatos a Marcador. El análisis de los perfiles de expresión génica de 5 tipos de tejido primario (pulmón, colon, mama, ovario, próstata) resulto en la nominación de 13 candidatos a Marcador específicos del tejido para las pruebas qRTPCR. Los candidatos principales han sido identificados en estudios previos de cánceres in situ. Argani et al. (2001); Backus et al. (2005); Cunha et al. (2005); Borgono et al. (2004); McCarthy et al. (2003); Hwang et al. (2004); Fleming et al. (2000); Nakamura et al. (2002); y Khoor et al. (1997). Además del análisis de los datos de micromatrices, se seleccionaron dos Marcadores de la bibliografía, incluyendo un DSG3 Marcador de carcinoma de células escamosas de pulmón complementario y el Marcador de mama PDEF. Backus et al. (2005). Los datos de las micromatrices confirmaron la alta sensibilidad y especificidad de estos Marcadores.

Se uso un enfoque especial para identificar los Marcadores específicos del páncreas. Primero, se analizaron cinco candidatos a Marcador de páncreas: antígeno de células madre de próstata (PSCA), inhibidor de proteinasa serina, miembro de clade A 1 (SERPINA1), citoqueratina 7 (KRT7), metaloproteasas de matriz 11 (MMP11), y mucina 4 (MUC4) (Varadhachary et al. (2004); Argani et al. (2001); Jones et al. (2004); Prasad et al. (2005) y Moniaux et al. (2004)) usando micromatrices de ADN y un panel de 13 adenocarcinomas ductales de páncreas, cinco tejidos de páncreas normal y 98 muestras de tumores de mama, colorrectales, pulmón, y ovario. Sólo el PSCA demostró sensibilidad moderada (se detectaron seis de 13 o el 46% de los tumores de páncreas) a una alta especificidad (94 de 98 o el 93% fueron correctamente identificados como no siendo de origen pancreático). Por el contrario, KRT7, SERPINA1, MMP11, y MUC4 demostraron sensibilidades del 38%, 31%, 85% y 31%, respectivamente, a especificidades del 66%, 91%, 82% y 81%, respectivamente. Estos datos se encontraban en concordancia con el qRTPCR realizado en 27 metástasis de origen pancreático y 39 metástasis de origen no pancreático para todos los Marcadores excepto el MMP11 que mostró sensibilidad y especificidad más pobres con el qRTPCR que las metástasis. En conclusión los datos de las micromatriz en tejido primario congelado rápidamente sirve como un buen indicador de la capacidad del Marcador para identificar una metástasis de FFPE como pancreática en origen usando qRTPCR pero esos Marcadores adicionales pueden ser útiles para un rendimiento óptimo.

El adenocarcinoma ductal pancreático se desarrolla de células epiteliales ductales que comprende sólo un pequeño porcentaje de todas las células pancreáticas (con células acinares y células de los islotes que comprenden la mayoría) en el páncreas normal. Además, los tejidos de adenocarcinoma de páncreas contienen una cantidad significativa de tejido normal adyacente (Prasad et al. (2005) y Ishikawa et al. (2005)). Debido a esto los Marcadores de páncreas candidatos han sido enriquecidos para genes elevados en adenocarcinoma de páncreas en relación a las células de páncreas normales. El primer método de consulta devolvió seis conjuntos de sonda: factor de coagulación V (F5), una proteína hipotética FLJ22041 similar a las proteínas de unión a FK506 (FKBP10), integrina beta 6 (ITGB6), transglutaminasa 2 (TGM2), ribonucleoproteina heterogénea nuclear A0 (HNRP0), y BAX delta (BAX). El segundo método de consulta (ver Materiales y Métodos para los detalles) devolvió ocho conjuntos de sonda: F5, TGM2, factor de transcripción de homeodominio tipo emparejado 1 (PITX1), isoforma trío ARNm (TRIO), ARNm para p73H (P73), una proteína desconocida para MGC: 10264 (SCD), y dos conjuntos de sonda para claudina18.

Se seleccionaron un total de 23 candidatos a Marcador específicos del tejido para validación por RT-PCR adicional en tejidos de FFPE de carcinoma metastásicos por qRT-PCR. Los candidatos a Marcador se probaron en 205 carcinomas metastásicos de FFPE, de pulmón, páncreas, colon, mama, ovario, próstata y carcinomas primarios de próstata. La Tabla 19 proporciona los símbolos génicos de los Marcadores específicos de tejido seleccionados de la validación por RT-PCR y también resume los resultados de las pruebas realizadas con estos Marcadores.

Tabla 19

Tipo de Tejido

SEQ ID NOs Método de ID Filtros de selección de Marcador Marcador adecuado?

Micro matriz

Lit Baja expresión en Tejido met correspondiente Redundancia del Marcador Reactividad cruzada del Tejido

Pulmón

1/59 X X X

60

X X X

61

X X X

Páncreas

66 X X

67

X X

71

X X

72

X X

73

X

74

X

75

X

76

X

Colon

4/85 X X X

77

X X

78

X X X

79

X X X

Próstata

9/86 X X X

80

X X X

Mama

63 X X X

81

X X X

64

X X

Ovario

82 X X X

83

X X X

65

X X X

De los 23 marcadores probados, trece fueron rechazados en base a su reactividad cruzada, bajo nivel de expresión en los tejidos metastásicos correspondientes, o redundancia. Diez Marcadores se seleccionaron para la versión final del ensayo. Los Marcadores de pulmón eran proteína B asociada al pulmón surfactante humana (HUMPSPBA), factor de transcripción tiroideo 1 (TTF1) y desmogleína 3 (DSG3). Los Marcadores de páncreas eran antígeno de células madre de próstata (PSCA) y factor de coagulación V (F5), y el Marcador de próstata era calicreína 3 (KLK3). El Marcador colorrectal era cadherina 17 (CDH17) Lo Marcadores de mama eran mamaglobina (MG) y factor de transcripción ets derivado de próstata (PDEF). El Marcador de ovario era tumor de Wilms 1 (WT1). 55 Los valores de expresión relativos normalizados medios de los Marcadores seleccionados en diferentes tejidos metastásicos se presentan en la Figura 10.

Optimización de la preparación de la muestra y qRT-PCR usando tejidos de FFPE. Después los métodos de aislamiento de ARN y qRTPCR se optimizaron usando tejidos fijados antes de examinar el rendimiento del panel de Marcadores. Primero se analizó el efecto de reducir el tiempo de incubación de la proteinasa K de dieciséis horas a 3 horas. No hubo efecto en el rendimiento. Sin embargo, algunas muestras mostraron fragmentos más largos de ARN cuando su uso el paso de proteinasa K más corto (Figura 11A, B). Por ejemplo, cuando el ARN fue aislado de un bloque de un año (C22), no se observó diferencia en los electroferogramas. Sin embargo, cuando el ARN se aisló de un bloque de cinco años (C23), se observó una fracción más grande de ARNs de peso molecular más alto, según 65 lo evaluado por la protuberancia en el desnivel, cuando se usó la digestión de proteinasa K más corta. Esta

tendencia se mantuvo generalmente cuando se procesaron otras muestras, independientemente del órgano de origen para la metástasis de FFPE. En conclusión, acortar el tiempo de digestión de la proteinasa K no sacrifica rendimientos de ARN y puede ayudar a aislar ARN menos degradado, más largo.

Después se compararon tres métodos diferentes de transcripción inversa: transcripción inversa con hexámeros aleatorios seguida por qPCR (dos pasos), transcripción inversa con un cebador específico del gen seguida por qPCR (dos pasos) y una qRTPRC de un paso usando cebadores específicos de los genes. El ARN se aisló de once metástasis y se comparó con los valores de Ct a través de tres métodos con β-actina, HUMSPB (Figuras 11C, D) y TTF. Los resultados mostraron diferencias estadísticamente significativas (p<0,001) para todas las comparaciones. Para ambos genes, la transcripción inversa con hexámeros aleatorios seguida por qPCR (reacción de dos pasos) dio los valores de Ct más altos mientras que la transcripción inversa con un cebador específico del gen seguida por qPCR (reacción de dos pasos) dio valores de Ct ligeramente más bajos (pero estadísticamente significativos) que la reacción de un paso correspondiente. Sin embargo, la RTPCR de dos pasos con cebadores específicos de los genes tuvo un paso de transcripción inversa más largo. Cuando los valores de Ct de HUMSPB se normalizaron al valor de β-actina correspondiente para cada muestra, no hubo diferencias en los valores de Ct normalizados a través de los tres métodos. En conclusión, la optimización de las condiciones de reacción de RTPCR pueden generar valores de Ct más bajos, lo que ayuda a analizar bloques de parafina más viejos (Cronin et al (2004)), y una reacción de RTPCR de un paso con cebadores específicos de los genes puede generar valores de Ct comparables a los generados en la reacción de dos pasos correspondiente.

Rendimiento de diagnóstico de un ensayo qRTPCR de CUP. Después se realizaron 12 reacciones de qRTPCR (10 Marcadores y dos genes domésticos) en un nuevo conjunto de 260 metástasis de FFPE. Veintiún muestras dieron valores de Ct altos para los genes domésticos por lo que sólo se usaron 238 en el análisis de mapa de calor. El análisis de valores de Ct normalizados en un mapa de calor reveló la alta especificidad de los Marcadores de mama y próstata, especificidad moderada de colon, pulmón y ovario, y especificidad algo más baja de los Marcadores de páncreas (Figura 12). Combinar los datos de qRTPCR normalizados con el refinamiento computacional mejora el rendimiento del panel de Marcadores.

Usando valores de expresión, normalizados a medios de la expresión de dos genes domésticos, se desarrolló un algoritmo para predecir el tejido de origen de la metástasis combinado los datos de qRTPRC normalizados con el algoritmo y se determinó la precisión del ensayo de qRTPCR realizando un test de validación cruzada dejando uno fuera (LOOCV). Para los seis tipos de tejido incluidos en el ensayo, se estimó separadamente tanto el número de designaciones falso-positivas, cuando se predijo una muestra erróneamente como otro tipo de tumor incluido en el ensayo (páncreas como colon, por ejemplo, como el número de veces que una muestra no fue predicha como de los incluidos en los tipos de tejido del ensayo (otros). Los resultados del LOOCV se presentan en la Tabla 20.

Tabla 20

Tejido de Origen

Predicción

Mama Colon Pulmón Ovario Páncreas Próstata Otro Total

Mama

22 0 2 1 1 0 0

Colon

1 27 3 2 4 0 4

Pulmón

1 2 45 2 3 0 5

Otro

1 1 3 1 4 0 16

Ovario

5 0 0 43 0 0 1

Páncreas

0 0 3 0 31 0 6

Próstata

0 0 0 0 0 20 0

Total

30 30 56 49 43 20 32 260

# Correctos

22 27 45 43 31 20 16 204

Precisión

72.3 90.0 87.8 87.8 72.1 100.0 50.0 78.5

El tejido de origen se predijo correctamente para 204 de las 260 muestras probadas con una precisión total del 78%. Una proporción significativa de las designaciones de falso positivo se debieron a la reactividad cruzada de los Marcadores en tejidos histológicamente similares. Por ejemplo, tres carcinomas metastásicos de células escamosas originados de faringe, laringe y esófago fueron previstos erróneamente como de pulmón debido a la

expresión de DSG3 en estos tejidos. La expresión positiva de CDH17 en carcinomas GI distintos de colon, incluyendo estómago y páncreas, causo la clasificación falsa de 4 de las 6 de estomago probadas y de 3 de las 43 metástasis de cáncer de páncreas probadas como de colon.

Además de un test LOOCV, los datos fueron divididos aleatoriamente en 3 pares separados de conjuntos de aprendizaje y prueba. Cada división contenía aproximadamente un 50% de las muestras para cada clase. A 50/50 divisiones en tres pares separados de conjuntos de aprendizaje y prueba, las precisiones de clasificación totales del ensayo fueron del 77%, 71% y 75%, confirmando la estabilidad del rendimiento del ensayo.

Por último, se probó otro conjunto independiente de 48 carcinomas metastásicos de FFPE que incluía carcinomas metastásicos de primario conocido, especímenes de CUP con un diagnóstico del tejido de origen suministrado por evaluación patológica incluyendo IHC, y especímenes de CUP que permanecieron CUP después de las pruebas IHC. La precisión del predicción del tejido de origen fue estimada separadamente para cada categoría de muestras. La Tabla 21 resume los resultados del ensayo.

Tabla 21

Probados

correctos Precisión

Mets conocidas

15 11 73.3

CUP Resueltos

22 17 77.3

CUP sin resolver

11

La predicción del tejido de origen fue, con solo unas pocas excepciones, consistente con el primario conocido o diagnóstico del tejido de origen evaluado por evaluación clínica/patológica incluyendo IHC. De manera similar al conjunto de aprendizaje, el ensayo no fue capaz de diferenciar carcinomas de células escamosas originados de fuentes diferentes y los predijo falsamente como de pulmón.

El ensayo también hizo diagnósticos de tejido de origen putativo para ocho de las once muestras que permanecieron como CUP después de la prueba de diagnóstico estándar. Uno de los casos de CUP fue especialmente interesante. Un paciente masculino con una historia de cáncer de próstata fue diagnosticado con carcinoma metastásico en el pulmón y la pleura. Las pruebas de PSA en suero e IHC con anticuerpos de PAS en tejido metastásico fueron negativas, por lo que el diagnóstico del patólogo fue CUP con una inclinación hacia tumores gastrointestinales. El ensayo predijo fuertemente (probabilidad posterior de 0,99) el tejido de origen como colon. Discusión: En este estudio, la realización de perfiles de expresión basados en micromatrices en tumores primarios se usó para identificar candidatos a Marcador para su uso con metástasis. El hecho de que los tumores primarios puedan ser usado para descubrir Marcadores de tumores de origen para metástasis es consistente con varios descubrimientos recientes. Por ejemplo, Weigelt y sus colaboradores han demostrado que los perfiles de expresión génica de tumores de mama primarios se mantienen en metástasis distantes. Weigelt et al. (2003). Backus y sus colaboradores identificaron Marcadores putativos para detectar metástasis de cáncer de mama usando un análisis de expresión génica de genoma amplio de la mama y otros tejidos y demostraron que la mamaglobina y CK19 detectaron metástasis clínicamente procesable en ganglios linfáticos centinelas de mama con un 90% de sensibilidad y un 94% de especificidad. Backus et al. (2005).

Durante el desarrollo del ensayo, la selección se enfocó en seis tipos de cáncer, incluyendo pulmón, páncreas y colon que están entre los más prevalentes en CUP (Ghosh et al. (2005); y Pavlidis et al. (2005)) y mama, ovario y próstata para los que el tratamiento podría ser más beneficioso para los pacientes. Ghosh et al. (2005). Sin embargo, los tipos de tejidos y Marcadores adicionales pueden ser añadidos al panel siempre que la precisión total del ensayo no se comprometa y, si es aplicable, las logísticas de las reacciones de RTPCR no se entorpezcan.

Los estudios basados en micromatrices con tejido primario confirmaron la especificidad y sensibilidad de los Marcadores conocidos. Como resultado, la mayoría de los Marcadores específicos de tejido tienen alta especificidad para los tejidos aquí estudiados. Un estudio reciente descubrió que, usando IHC, el PSCA se sobreexpresa en metástasis de cáncer de próstata. Lam et al. (2005). Dennis et al. (2002) también demostraron que el PSCA podría ser usado como un Marcador de tumor de origen para el páncreas y próstata. La fuerte expresión del PSCA en algunos tejidos de próstata a nivel de ARN estaba presente pero, debido a la inclusión de PSA en el ensayo, los cánceres de próstata y páncreas pueden ser ahora segregados. Un nuevo descubrimiento de este estudio fue el uso de F5 como un Marcador complementario (al PSCA) para tejido de origen pancreático. En tanto el conjunto de datos de micromatrices con tejido primario como el conjunto de datos de qRTPCR con metástasis de FFPE, se descubrió que el F5 complementa al PSCA.

Investigadores anteriores han generado ensayos de CUP usando IHC (Brown et al. (1997); DeYoung et al. (2000); y Dennis et al. (2005a)) o micromatrices. Su et al. (2001); Ramaswamy et al. (2001); y Bloom et al. (2004). Más recientemente, el SAGE ha sido acoplado a un panel de Marcadores de qRTPCR pequeño. Dennis et al.

(2002); y Buckhaults et al. (2003). Este estudio es el primero en combinar realización de perfiles de expresión basados en micromatrices con un panel pequeño de ensayos de qRTPCR. Los estudios de micromatrices con tejido primario identificaron algunos, pero no todos, de los mismos Marcadores de tejido de origen que los identificados previamente por estudios SAGE. Este descubrimiento no es sorprendente dados los estudios que han demostrado que existe una concordancia modesta entre los datos de realización de perfiles basados en micromatrices de ADN y SAGE y que la correlación mejora para los genes con niveles de expresión más altos. van Ruissen et al. (2005); y Kim et al. (2003). Por ejemplo, Dennis y sus colaboradores identificaron el PSA, MG, PSCA y HUMSPC mientras que Buckhaults y sus colaboradores (Buckhaults et al. (2003)) identificaron el PDEF.

La ejecución de un ensayo CUP es preferible por qRTPCR porque es una tecnología robusta y puede tener ventajas de rendimiento sobre el IHC. Al-Mulla et al. (2005); y Haas et al. (2005). Además, como se demuestra en la presente, el protocolo qRTPCR ha sido mejorado a través del uso de cebadores específicos de genes en una reacción de un paso. Esta es la primera demostración del uso de cebadores específicos de genes en una reacción de qRTPCR de un paso con tejido de FPPE. Otros investigadores han hecho o una qRTPCR de dos pasos (síntesis de ADNc en una reacción seguida por qPCR) o han usado hexámeros aleatorios o cebadores específicos de genes truncados. Abrahamsen et al. (2003); Specht et al. (2001); Godfrey et al. (2000); Cronin et al.(2004); y Mikhitarian et al. (2004).

En resumen, la precisión total del 78% del ensayo para seis tipos de tejido se compara favorablemente con otros estudios. Brown et al. (1997); DeYoung et al. (2000); Dennis et al. (2005a); Su et al. (2001); Ramaswamy et al. (2001); y Bloom et al. (2004).

Ejemplo 7

En este estudio se construyeron clasificadores usando carpetas de marcadores génicos eligiéndolos de MVO y usando este clasificador para predecir el tejido de origen y el estado del cáncer para cinco tipos de cáncer principales incluyendo mama, colon, pulmón, ovario y próstata. Se analizaron trescientos setenta y ocho canceres primarios, 23 lesiones epiteliales proliferativas benignas y 103 especímenes de tejido humano congelado rápidamente normales para sustraer la expresión génica enmascarada potencialmente por la co-expresión en células de fondo de leucocitos. Se desarrolló un método bioinformático basado en OMV nuevo para seleccionar las carpetas de marcadores génicos para tejido de origen y estado del cáncer. Los datos demostraron que un panel de 26 genes podría ser usado como un clasificador para predecir con precisión el tejido de origen y estado del cáncer entre los 5 tipos de cáncer. Por lo tanto se puede obtener un método de clasificación multi-cáncer determinando los perfiles de expresión génica de un número razonablemente pequeño de marcadores génicos. La Tabla 22 muestra los Marcadores identificados para los orígenes de tejido indicados. Para las descripciones génicas ver la Tabla 31.

Tabla 22

Tejido

SEQ ID NO: Nombre

Pulmón

59 SP-B

60

TTF1

61

DSG3

Páncreas

66 PSCA

67

F5

71

ITGB6

(continuada)

Tejido

SEQ ID NO: Nombre

72

TGM2

84

HNRPA0

Colon

85 HPT1

77

FABP1

78

CDX1

79

GUCY2C

Próstata

86 PSA

80

hKLK2

Mama

63 MGB1

81

PIP

64

PDEF

Ovario

82 HE4

83

PAX8

65

WT1

El conjunto de la muestra incluía un total de 299 muestras de carcinomas de colon, mama, páncreas, ovario, próstata, pulmón y otros metastásicos y cáncer primario de próstata. Se implementó el QC basado en evaluación histológica, el rendimiento de ARN y la expresión de beta-actina del gen de control. Otra categoría de muestras incluía metástasis originadas de carcinomas de estomago (5), riñón (6), colangio/vesícula biliar (4), hígado (2), cabeza y cuello (4), íleon (1) y un mesotelioma. La Tabla 23 resume los resultados.

35 Tabla 23

Tipo de tejido

Recogido QC Histologia QC Aislamiento ARN QC Punto de corte ACTB

Pulmón

41 37 36 25

Páncreas

6 3 57 49 41

Colon

4 5 42 42 31

Mama

40 35 35 34

Ovario

37 36 35 33

Próstata

2 7 27 25 19

Otros

4 6 34 29 23

Total

299 268 251 205

Probar las muestras anteriores resultó en la reducción del conjunto de Marcadores a los de la Tabla 24 con los resultados observados en la Tabla 25

Tabla 24

Tabla de Marcadores Finales

Pulmón

Proteína asociada a surfactante SP-B

factor de transcripción tiroideo 1

TTF1

desmogleína 3

DSG3

Páncreas

antígeno de células madre de próstata PSCA

(continuada)

Tabla de Marcadores Finales

factor de coagulación 5

F5

Colon

Transportador asociado a péptido intestinal HPT1

Próstata

prostate-specific antigen PSA

Mama

mamaglobina MGB

Factor de transcripción Ets

PDEF

Ovario

tumor de Wilms 1 WT1

Tabla 25

Cáncer

Muestras# Marcador Correctas % de Sens. Incorrectas % de Espec

Pulmón

25/180 SP-B 13/25 52 0/180 100

TTF

12/25 48 1/180 99

DSG3

5/25 20 0/180 100

Páncreas

41/164 PSCA 24/41 59 6/164 96

F5

6/41 15 4/164 98

Colon

31/174 HPT1 22/31 71 2/174 99

Mama

33/172 MGB 23/33 70 3/172 98

PDEF

16/3 48 1/172 99

Próstata

19/186 PSA 19/19 100 0/186 100

PDEF

19/19 100 2/186 99

Ovario

33/172 WT1 24/33 71 1/172 99

Total

205

Los resultados mostraron que de 205 tumores metastásicos embebidos en parafina; 166 muestras (81%) tenían resultados de ensayo conclusivos, Tabla 26.

Tabla 26

Candidato

Correctos Incorrectos Nº Precisión (%)

Pulmón

SP-B + TFF+DSG3 19 0 6 76

Páncreas

PSCA+F5 27 1 13 66

Colon

HPT1 24 2 5 78

Próstata

PSA 19 0 0 100

Mama

MGB + PDEF 23 3 7 70

Ovario

WT1 23 2 8 70

Otros

20 3 87

Total

155 11 39 76

De los resultados de falso positivo, muchos falsos se derivaron de tejidos histológicamente y embriológicamente similares, Tabla 27.

Tabla 27

ID de la muestra

Diagnóstico Previsto

OV_26

Ovario Mama

Br_24

Mama Colon

Br_37

Mama Colon

CRC_25

Colon Ovario

Pn_59

Páncreas Colon

Cont_27

Estomago páncreas

Cont_34

Estomago Colon

Cont_35

Estomago Colon

Cont_43

Conducto biliar Páncreas

Cont_44

Conducto biliar Páncreas

Cong_25

Hígado páncreas

25 Se consideraron los siguientes parámetros para el desarrollo del modelo:

Separar los Marcadores en conjuntos femeninos y masculinos y calcular la probabilidad de CUP de forma separada para pacientes masculinos y femeninos. El conjunto masculino incluía: SP_B, TTF1, DSG3, PSCA, F5, PSA, HPT1; el conjunto femenino incluía: SP_B, TTF1, DSG3, PSCA, F5, HPT1, MGB, PDEF, WT1. La expresión de fondo se excluyó de los resultados del ensayo: Pulmón: SP_B, TTF1, DSG3; Ovario: WT1; y Colon: HPT1.

El modelo CUP se ajusto a la prevalencia de CUP (5). pulmón 23, páncreas 16, colorrectal 9, mama 3, ovario 4, próstata 2, otros 43. La prevalencia de mama y ovario ajustada a 0% para pacientes masculinos, y la de 35 próstata ajustada a 0% para pacientes femeninos.

Se tomaron los siguientes pasos: colocar marcadores en escala similar; reducir el número de variables de 12 a 8 seleccionando el valor mínimo de cada conjunto específico de tejido; dejar fuera 1 muestra; construir el modelo de las muestras restantes; probar la muestra dejada fuera; repetir hasta que el 100% de las muestras estén probadas dejas fuera aleatoriamente ~50% de las muestras (~50% por tejido); construir el modelo de las muestras restantes; probar el ~50% de las muestras y repetir para 3 divisiones aleatorias diferentes.

La precisión de la clasificación se ajusto a la prevalencia de tipos de cáncer para producir los resultados resumidos en la Tabla 28 con los datos brutos mostrados en la Tabla 29. 45

Tabla 28

Mama

Colon Pulmón Otros Ovario Panc próstata Total Ajustado

Correcto

23 29 22 19 24 35 19 171

No Probado

3 2 2 2 3 0 12

Incorrecto

7 0 1 4 7 3 0 22

Prevalencia

0.03 0.09 0.23 0.43 0.04 0.16 0.02

Probado/total%

91 94 92 100 94 93 100 94 95

Correcto/total%

70 94 88 83 73 85 100 89 89

No Probado%

9 6 8 n/a 6 7 0 6 5

Correcto

23 25 19 20 20 24 19 150

No Probado%

7 6 5 10 15 0 43

Incorrecto

3 0 1 3 3 2 0 12

Prevalencia

0.03 0/09 0.23 0.43 0.04 0.16 0.02

Probado/total%

79 81 80 100 70 63 100 79 83

Correcto/total%

70 81 76 87 61 59 100 73 76

Correcto/probado %

88 100 95 87 87 92 100 93 91

No Probado%

21 19 20 n/a 30 37 0 21 17

55 5

Ejemplo 8

Estudio de la firma del gen prospectivo de cáncer metastásico de CUP con sitio primario desconocido para predecir el tejido de origen

El objetivo específico de este estudio era determinar la capacidad de la firma de 10 genes para predecir el tejido de origen de carcinoma metastásico en pacientes con carcinoma de primario desconocido (CUP).

Objetico primario: Confirmar la factibilidad de realizar un análisis génico de muestras de biopsia del núcleo en pacientes consecutivos con CUP.

Objetivo secundario: Correlacionar los resultados del ensayo de RT-PCR de la firma de 10 genes con el trabajo de diagnóstico hecho en el M.D. Anderson Cancer Center (MDACC). Tercer objetivo: Correlacionar la prevalencia de 6 tipos de cáncer previstos por ensayo con la prevalencia derivada de la bibliografía y la experiencia del MDACC.

El método descrito en la presente se usó para realizar un análisis de expresión génica de micromatrices de 700 carcinomas primarios congelados, y especímenes benignos y normales y candidatos a marcador génicos identificados, específicos para carcinomas de pulmón, páncreas, colon, mama, próstata y ovario. Los candidatos a marcador génico fueron probados por RT-PCR en 205 especímenes fijados en formalina, embebidos en parafina (FFPE) de carcinoma metastásico (Etapa III-IV) originados de pulmón, páncreas, colon, mama, ovario y próstata así como metástasis originadas de otros tipos de cáncer para el control de especificidad. Otros tipos de cáncer metastásico incluían carcinomas gástrico, de células renales, hepatocelular, colangio vesícula biliar y de cabeza y cuello. Los resultados permitieron seleccionar la firma de 10 genes que predijo el tejido de origen de carcinoma metastásico y dio una precisión total del 76%. El CV medio para mediciones repetidas en experimentos RT-PCR es del 1,5%, calculado en base a 4 puntos de datos replicados. La beta-actina (ACTB) se usó como gen doméstico y su expresión mediana fue similar en muestras metastásicas de origen diferente (CV=5,6%).

El objetivo específico para este estudio era validar la capacidad de la firma de 10 genes de predecir el tejido de origen de carcinoma metastásico en los pacientes CUP en comparación con el trabajo de diagnóstico exhaustivo.

Elegibilidad del Paciente

El paciente debe ser de al menos 18 años de edad con un estado de rendimiento ECOG de 0-2. Se aceptaron los pacientes con adenocarcinoma de diagnóstico o diagnóstico de carcinoma pobremente diferenciado. El grupo de pacientes con adenocarcinoma incluyo tumores, bien, moderadamente y pobremente diferenciados.

Los pacientes han cumplido los criterios para el CUP: sin primario detectado después de una evaluación completa que es definida como la historia completa y examen físico, examen de laboratorio detallado, estudios de imágenes y estudios invasivos de síntomas o dirigidos al sitio. Solo se permitieron pacientes no tratados en el estudio.

Si un paciente ha sido tratado con quimioterapia o radiación, la participación en el estudio se permite si hay tejido anterior (al tratamiento) disponible como bloques archivados dentro de un periodo temporal de 10 años.

Los pacientes proporcionaron consentimiento/autorización escrita para participar en este estudio.

Diseño del Estudio

A los pacientes con diagnóstico de CUP que han experimentado una biopsia de escisión o con aguja gruesa de la lesión metastásica más accesible se les permitió en el estudio. Los pacientes con una biopsia FNA sólo no fueron elegibles. Los primeros 60 pacientes presentados consecutivos que cumplieron con los criterios de inclusión y consintieron con el estudio fueron inscritos. Si se requiere biopsia repetida en el MDACC para propósitos de diagnóstico para su tratamiento, se obtuvo tejido adicional para el estudio si el paciente dio consentimiento. Todos los participantes fueron registrados en el protocolo en el institutional Protocol Data Management System (PDMS).

El trabajo de diagnóstico completo, incluyendo las evaluaciones clínicas y patológicas, se realizó en todos los pacientes inscritos de acuerdo con los estándares del MDACC. La parte de patología del trabajo de diagnóstico puede tener incluidos ensayos inmunohistoquímicos (IHC) con marcadores incluyendo CK-7, CK-20, TTF-1 y otros según se considere indicado por el patólogo. Esto es parte del trabajo rutinario de todos los pacientes que se presentan con CUP.

Recogida de la muestra de tejido

El estudio incluyo especímenes de carcinoma metastásico fijados en formalina, embebidos en parafina recogidos de pacientes con CUP.

Se usaron seis secciones de 10 µm para el aislamiento del ARN, especímenes de tejido más pequeños requerirán nueve secciones de 10 µm. El diagnóstico histopatológico y el contenido tumoral se confirmaron para cada muestra usada para el aislamiento del ARN en una sección adicional teñida con hematoxilina y eosina (HE). La muestra del tumor debería haber tenido un contenido tumoral mayor del 30% en la sección HE.

Los datos clínicos fueron suministrados de forma anónima a Veridex e incluyen la edad del paciente, el sexo, la histología del tumor mediante microscopía óptica, el grado tumoral (diferenciación), sitio de la metástasis, la fecha de obtención del espécimen, la descripción del trabajo de diagnóstico realizado para cada paciente individual.

Procesamiento del tejido y experimentos RT-PCR

Se extrajo el ARN total de cada muestra de tejido usando el protocolo descrito anteriormente. Sólo las muestras que produjeron más de 1 µm de ARN total de la cantidad estándar de tejido se usaron para pruebas de RT-PCR posteriores. Las muestras con menos rendimiento de ADN se consideraron degradadas y excluidas de experimentos posteriores. Se implemento el control de integridad del ARN en base a la expresión doméstica para excluir las muestras con ARN degradado, de acuerdo con el procedimiento Veridex estándar.

El ensayo RT-PCR que incluye el panel de 10 genes y 1-2 genes de control se usó para el análisis de las muestras de ARN. La transcripción inversa y el ensayo PCR se completaron usando los protocolos descritos anteriormente.

El valor de la expresión relativa para cada gen probado presentado como ∆Ct, que es igual al CT del gen objetivo sustraído por Ct de los genes de control, se calculó y usó para la predicción del tejido de origen.

Tamaño de la muestra e interpretación de datos

Se estudió un tamaño de la muestra limitado de 60 pacientes debido a la naturaleza exploratoria del estudio piloto. Hasta la fecha, se han probado 22 pacientes. Una de las muestras de pacientes no consiguió producir suficiente ARN para la prueba RT-PCR y 3 no consiguieron pasar el control de calidad evaluado por el RE-PCR con los genes de control. Se usaron un total de 18 pacientes para determinar la probabilidad de lesión metastásica del paciente.

El modelo estadístico se usó para determinar la probabilidad del tejido de origen del carcinoma metastásico de la siguientes siete categorías: pulmón, páncreas, colon, mama, próstata, ovario y sin prueba (otros). Para cada muestra, las probabilidades para cada categoría se calculan de un modelo de clasificación lineal. Los resultados del ensayo se resumen en la Tabla 30.

La probabilidad de una lesión metastásica del paciente (con primarios conocidos) proviniendo de un estos 6 sitios (colon, páncreas, pulmón, próstata, ovario, mama) es de alrededor del 76%. Este número está derivado de la bibliografía dada la incidencia de varios cánceres y potencial de esparcimiento y datos no publicados generados en el M.D. Anderson de registros tumorales. Para las muestras probadas, la prevalencia de los 6 sitios fue del 67% (12 de 18 muestras probadas), que es muy consistente con observaciones anteriores.

Tabla 30

Datos del paciente

Probabilidad posterior de ToO (%)

ID

M/F predicción Mama Colon Pulmón PulmónSCC Otro Ovario Páncreas próstata

1

M Otro 0.00 0.00 0.81 0.00 98.68 0.00 0.51 0.00

4

F Colon 0.00 99.70 0.00 0.00 0.09 0.20 0.01 0.00

5

M Pulmón 0.00 33.29 52.27 0.01 13.30 0.00 1.13 0.00

6

F Colon 0.00 99.91 0.00 0.00 0.09 0.00 0.00 0.00

2

M Colon 0.00 93.19 0.01 0.00 2.90 0.00 3.90 0.00

10

F Otro 0.02 2.04 0.03 0.03 61.43 1.12 35.34 0.00

16

F Colon 0.00 48.59 0.01 1.57 47.62 0.17 2.05 0.00

22

M PulmónSCC 0.00 8.85 0.01 71.69 11.84 0.00 7.62 0.00

23

M Colon 0.00 99.27 0.01 0.00 0.72 0.00 0.00 0.00

24

F Colon 0.00 90.59 0.00 0.00 2.36 0.00 7.04 0.00

26

F Pulmón 0.00 0.00 99.93 0.00 0.06 0.00 0.01 0.00

17

M Otro 0.00 0.07 0.02 0.09 94.06 0.00 5.77 0.00

19

F Otro 0.02 0.11 0.04 0.22 76.36 23.24 0.01 0.00

21

F Páncreas 0.00 6.97 0.00 0.00 2.37 8.43 82.23 0.00

27

F Otro 0.00 0.04 0.04 0.59 99.06 0.14 0.13 0.00

11

M Otro 0.00 0.23 0.07 0.09 99.52 0.00 0.09 0.00

32

F Ovario 0.00 0.01 0.00 0.00 7.23 92.63 0.13 0.00

34

M PulmónSCC 0.00 0.03 0.00 65.64 7.96 0.00 26.38 0.00

3

F Fallo ctr 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

8

M Fallo ctr 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

20

F Fallo ctr 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no deben interpretarse como limitantes del 45 ámbito de la invención.

Tabla 31

Nombre

SEQ ID NOs Acceso Descripción

CDH17

62 NM_004063 Cadherina 17

CDX1

78 NM_001804 Factor de transcripción de caja homeopática 1

DSG3

61/3 NM_001944 Desmogleína 3

F5

67/6 NM_000130 Factor de coagulación V

FABP1

71 NM_001443 Proteína de Unión de Ácidos grasos 1, hígado

GUCY2C

79 NM_004963 Guanilato ciclasa 2C

HE4

82 NM_006103 Marcador de carcinoma de ovario Putativo

KLK2

80 BC005196 Calicreína 2, de próstata

HNRPA0

84 NM_006805 Ribonucleoproteína nuclear heterogénea A0

(continuada)

55 5

HPT1

85/4 U07969 Transportador asociado a péptidos intestinal

ITGB6

71 NM_000888 Integrina, beta 6

KLK3

68 NM_001648 Calicreína 3

MGB1

63/7 NM_002411 Mamaglobina 1

PAX8

83 BC001060 Gen de caja emparejado 8

PBGD

70 NM_000190 Hidroximetilbilano sintasa

PDEF

64/8 NM_012391 Factor de transcripción Ets que contiene el dominio

PIP

81 NM_002652 Proteína inducida por prolactina

PSA

86/9 U17040 Precursor del antígeno específico de la próstata

PSCA

66/5 NM_005672 Antígeno de células madre de próstata

SP-B

59/1 NM_198843 Proteína B asociada a surfactante pulmonar

TGM2

72 NM_004613 Transglutaminasa 2

TTF1

60/2 NM_003317 Similar al factor de transcripción tiroideo 1

WT1

65/10 NM_024426 Tumor de Wilms 1

β-actina

69 NM_001101

β-actina

KRT6F

87 L42612 Isoforma de queratina 6

p73H

88 AB010153 Proteína p53-relacionada

SFTPC

89 NM_003018 Proteína C asociada al pulmón, surfactante

KLK10

90 NM_002776 Calicreína 10

CLDN18

91 NM_016369 Claudina 18

TR10

92 BD280579 Receptor del factor de necrosis tumoral

B305D

93

B726

94

GABA-pi

95 BC109105 Receptor del ácido gamma-aminobutírico A, pi

StAR

96 NM_01007243 regulador agudo esteroidogénico

EMX2

97 NM_004098 homólogo de espiráculos vacío 2 (Drosophila)

NGEP

98 AY617079 Variante larga de NGEP

NPY

99 NM_000905 Neuropéptido Y

SERPINA1

100 NM_000295 inhibidor de peptidasa serpina, miembro 1 de clado A

KRT7

101 NM_005556 queratina 7

MMP11

102 NM_005940 metalopeptidasa de la matriz 11 (estromalisina 3)

MUC4

103 NM_018406 Mucina 4 asociada a la superficie celular

FLJ22041

104 AK025694

BAX

105 NM_138763 ∆ de la variante de transcripción de proteínas X asociada a BCL2

PITX1

106 NM_002653 Factor trans del homeodominio tipo emparejado 1

MGC:10264

107 BC005807 estearoil-CoA desaturasa (∆-9-desaturasa)

REFERENCIAS

Publicaciones de solicitudes de patentes y patentes US

5242974 5700637 20030194733 5350840 5786148 20030198970 5384261 6004755 20030215803 5405783 6136182 20030215835 5412087 6218114 20030219760 5424186 6218122 20030219767 5429807 6225051 20030232350 5436327 6232073 20030235820 5445934 6261766 20040005563 5472672 6271002 20040009154 5527681 6339148 20040009489 5529756 20010029020 20040018969 5532128 20020055627 20040029114 5545531 20020068288 20040076955 5554501 20020168647 20040126808 5556752 20030044859 20040146862 5561071 20030087818 20040219572 5571639 20030104448 20040219575 5593839 20030124128 20050037010 5599695 20030124579 20050059008 5624711 20030138793 20060094035

5658734 20030190656

Publicaciones de patentes y patentes extranjeras

WO1998040403

WO2001073032 WO2004030615

WO1998056953

WO2002046467 WO2004031412

WO2000006589

WO2002073204 WO2004063355

WO2000055320

WO2002101357 WO2004077060

WO2001031342

WO2004018999 WO2005005601

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5 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Veridex, LLC

<120> Métodos y Materiales para Identificar el origen de un Carcinoma de origen Primario Desconocido

<130> P054566EP

<150> US60/718,501 15 <151> 2005-09-19

<150> US60/725,680

<151> 2005-10-12

<160> 107

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 25 <211> 476

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 493

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 545

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4 45 <211> 284

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 394

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (58)..(58)

<223>n es a,c,g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (95)..(95)

<223>n es a,c,g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (99)..(99)

<223>n es a,c,g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (119)..(119)

<223>n es a,c,g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (123)..(123)

<223>n es a,c,g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (130)..(130)

<223>n es a,c,g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (151)..(151)

<223>n es a,c,g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (155)..(155)

<223>n es a,c,g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (161)..(161)

<223>n es a,c,g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (212)..(212)

<223>n es a,c,g, o t

<400> 5

15 <210> 6

<211> 470

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223>n es a,c,g, o t

25 <220>

<221> misc_feature

<222> (82)..(82)

<223>n es a,c,g, o t

<400> 6

<210> 7

<211> 396

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8 15 <211> 491

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 265

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 9

55 <210> 10

<211> 441

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 11 cacagccccg acctttgatg a 21

<210> 12 25 <211> 19

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 12 ggtcccagag cccgtctca 19

<210> 13

<211> 26

<212> ADN 35 <213> Homo sapiens

<400> 13 agctgtccag ctgcaaagga aaagcc 26

<210> 14

<211> 75

<212> ADN

<213> Homo sapiens

45 <400> 14

<210> 15

<211> 17

<212> ADN 55 <213> Homo sapiens

<400> 15 ccaacccaga cccgcgc 17

<210> 16

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

65 <400> 16

cgcccatgcc gctcatgttc a 21

<210> 17

<211> 21 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 17 cccgccatct cccgcttcat g 21

<210> 18

<211> 78

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 18

25

<210> 19 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 19 gagagaagga gaagataact caa 23

35

<210> 20 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 20 actccagaga ttcggtaggt ga 22

<210> 21 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens

45

<400> 21 attgccaaga ttacttcaga ttacca 26

<210> 22 <211> 97 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 22

55

<210> 23

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 23 tccctcggca gtggaagctt a 21

15 <210> 24

<211> 24

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 24 tcctcaaact ctgtgtgcct ggta 24

<210> 25

<211> 29 25 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25 ccaaaatcaa tggtactcat gcccgactg 29

<210> 26

<211> 95

<212> ADN

<213> Homo sapiens 35

<400> 26

<210> 27

<211> 21 45 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 27 agttgctgat ggtcctcatg c 21

<210> 28

<211> 24

<212> ADN

<213> Homo sapiens 55

<400> 28 cacttgtgga ttgattgtct tgga 24

<210> 29

<211> 23

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 29 ccctctccca gcactgctac gca 23

<210> 30

<211> 107

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 31 25 cgcccacctg gacatctgga 20

<210> 32

<211> 23

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 32 cactggtcga ggcacagtag tga 23

35 <210> 33

<211> 25

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 33 gtcagcggcc tggatgaaag agcgg 25

<210> 34

<211> 86 45 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 34

55 <210> 35

<211> 23

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 35 gcggagccca atacagaata cac 23

<210> 36 5 <211> 19

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 36 cggggctact ccaggcaca 19

<210> 37

<211> 25

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 37 tcagaggcat tcaggatgtg cgacg 25

<210> 38

<211> 80

<212> ADN

<213> Homo sapiens

25 <400> 38

<210> 39

<211> 20

<212> ADN 35 <213> Homo sapiens

<400> 39 ctgttgatgg caggcttggc 20

<210> 40

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

45 <400> 40 ttgctcacct gggctttgca 20

<210> 41

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 41

gcagccaggc actgccctgc t 21 55

<210> 42

<211> 74

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 42

5

<210> 43 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 43 tgaagaaata tcctgggatt attca 25

15

<210> 44 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 44 tatgtggtat cttctggaat atcatca 27

25

<210> 45 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 45 acaaagggaa acagatattg aagactc 27

<210> 46 <211> 87 <212> ADN <213> Homo sapiens

35

<400> 46

<210> 47

<211> 19

<212> ADN

<213> Homo sapiens 45

<400> 47 cccccagtgg gtcctcaca 19

<210> 48

<211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 48 55 aggatgaaac aagctgtgcc ga 22

<210> 49

<211> 26

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 49 caggaacaaa agcgtgatct tgctgg 26

<210> 50

<211> 82

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51

<211> 19

<212> ADN

<213> Homo sapiens

25 <400> 51 gccctgaggc actcttcca 19

<210> 52

<211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 52

cggatgtcca cgtcacactt ca 22 35

<210> 53

<211> 25

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 53 cttccttcct gggcatggag tcctg 25

<210> 54 45 <211> 100

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 55 ccacacacag cctactttcc aa 22

<210> 56

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 56 tacccacgcg aatcactctc a 21

<210> 57

<211> 27

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 57 aacggcaatg cggctgcaac ggcggaa 27

<210> 58

<211> 103

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 58

<210> 59

<211> 2724

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 59

<210> 60

<211> 2352

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 60

<210> 61

<211> 3336

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 3697

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 62

<210> 63

<211> 503

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 64

<211> 1894

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 64 <210> 65

<211> 3029

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 65

<210> 66

<211> 1064

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 66

<210> 67

<211> 6962

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 67

<210> 68

<211> 1464

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 68 <210> 69

<211> 1793

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 69 <210> 70

<211> 1526

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 70 <210> 71

<211> 2397

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 71

<210> 72

<211> 2118

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 72

<210> 73

<211> 2832

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 73

<210> 74

<211> 1607

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 74

<210> 75

<211> 1753

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 75 <210> 76

<211> 2255

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 76

<210> 77

<211> 462

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 77

<210> 78

<211> 2108

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 78

<210> 79

<211> 3745

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 79

<210> 80

<211> 901

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 80 <210> 81

<211> 618

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 81

<210> 82

<211> 594

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 82

<210> 83

<211> 1372

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 83 <210> 84

<211> 2983

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 84

<210> 85

<211> 3345

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 85

<210> 86

<211> 990

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 86 <210> 87

<211> 1805

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 87 <210> 88

<211> 2820

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 88

<210> 89

<211> 991

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 89 <210> 90

<211> 1580

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 90 <210> 91

<211> 3359

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 91

<210> 92

<211> 733

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 92

<210> 93

<211> 1076

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 93 <210> 94

<211> 3675

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 94

<210> 95

<211> 2658

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 95

<210> 96

<211> 2531

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 96

<210> 97

<211> 6164

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (2851)..(2851)

<223>n is a,c,g, ort

<220>

<221> misc_feature

<222> (2856)..(2856)

<223>n es a,c,g, o t

<400> 97

<210> 98

<211> 551

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 98

<210> 99

<211> 1607

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 99 <210> 100

<211> 1753

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 100 <210> 101

<211> 2276

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 101

<210> 102

<211> 7381

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 102

<210> 103

<211> 2323

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 103

<210> 104

<211> 741

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 104 <210> 105

<211> 2373

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 105

<210> 106

<211> 1314

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 106 <210> 107

<211> 476

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 107

Claims (13)

1. Reivindicaciones

   1. Un método de identificar el origen de una metástasis de origen desconocido que comprende los pasos de

   a.

   medir los Biomarcadores asociados con al menos seis carcinomas diferentes en una muestra que contiene células metastásicas en donde los Biomarcadores son niveles de expresión de al menos los genes Marcadores siguientes: SP-B, TTF1, DSG3, PSCA, F5, HPT1, PSA, MGB/MG, WT1 y PDEF;

   b.

   combinar los datos de los Biomarcadores en un algoritmo donde el algoritmo

   i. normaliza los Biomarcadores frente a la referencia; y

   ii. impone un punto de corte que optimiza la sensibilidad y especificidad de cada Biomarcador, pondera la prevalencia de los carcinomas y selecciona un tejido de origen;

   c.

   determinar el origen en base a la probabilidad más alta determinada por el algoritmo o determinar que el carcinoma no se deriva de un conjunto particular de carcinomas; y

   d.

   medir opcionalmente los Biomarcadores específicos para uno o más carcinomas diferentes adicionales, y repetir los pasos c) y d) para los Biomarcadores adicionales.

2. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde los genes Marcadores comprenden además

   (a)

   KRT6F, p73H, y/o SFTPC; y/o

   (b)

   ITGB6, KLK10, CLDN18, TR10 y/o FKBP10; y/o

   (c)

   CDX1 y/o FABP1

3. 3.

   El método de una de las reivindicaciones 1 ó 2 en donde la expresión génica se mide usando al menos una de las SEQ ID NOs: 11-58.

4. 4.

   El método de la reivindicación 3 en donde los genes Marcadores comprenden además genes Marcadores específicos del género seleccionados de al menos uno de

   i. en el caso de un paciente masculino KLK2, NGEP o NPY; o

   ii. en el caso de un paciente femenino PIP, B305D, B726 o GABA-Pi; y/o PAX8, STAR o EMX2.

5. 5.

   El método de la reivindicación 4 en donde, en el caso de un paciente masculino, los genes Marcadores comprenden además KLK2.

6. 6.

   El método de la reivindicación 5 en donde, en el caso de un paciente masculino, los genes Marcadores comprenden además NGEP y/o NPY.

7. 7.

   El método de la reivindicación 4 en donde, en el caso de un paciente femenino, los genes Marcadores comprenden además, PIP, B305D, B726 o GABA-Pi.

8. 8.

   El método de la reivindicación 4 en donde, en el caso de un paciente femenino, los genes Marcadores comprenden además PAX8, STAR o EMX2.

9. 9.

   El método de la reivindicación 8 en donde, en el caso de un paciente femenino, los genes Marcadores comprenden además PIP, B305D, B726 o GABA-Pi.

10. 10.

    El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2, o 4-9 que comprende además medir la expresión de al menos un gen expresado consecutivamente en la muestra.

11. 11.

    El método de la reivindicación 1 que comprende además obtener información clínica adicional incluyendo el sitio de metástasis para determinar el origen del carcinoma.

12. 12.

    Un método de proporcionar un pronóstico o dirección de terapia determinando el origen de una metástasis de origen desconocido de acuerdo con la reivindicación 1 e identificar el pronóstico correspondiente para el mismo o el tratamiento apropiado para el mismo.

13. 13.

    El uso de un kit para realizar el método de la reivindicación 1, en donde el kit comprende: ARN o ADNc que hibrida con los genes marcadores de la reivindicación 1, una micromatriz o un chip génico.