JP2015536158A - 原生動物におけるカブトガニc因子タンパク質の組み換え生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、カブトガニ由来のC因子(Factor C)タンパク質をC因子タンパク質発現寄生性原生動物を用いて組み換え生産するための新規の方法を提供する。したがって、本発明は、カブトガニC因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有する寄生性原生動物宿主細胞およびこの寄生性原生動物宿主細胞を、カブトガニC因子タンパク質を発現する条件下で培養する工程を含むC因子を生産する方法を提供する。本発明は、この新規の方法によって生産される組み換えカブトガニC因子タンパク質ならびに内毒素の検出および/または除去におけるその使用を提供する。
[1] C因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有することによって特徴づけられる、寄生性原生動物。
[2] ポリヌクレオチドが、寄生性原生動物宿主細胞に導入された核酸分子、好ましくはベクターに含まれる、項目[1]の寄生性原生動物。
[3] トリパノゾマチダ(Trypanosomatida)目のメンバーである、項目[1]または[2]の寄生性原生動物。
[4] リーシュマニア(Leishmania)属のメンバーである、項目[1]〜[3]のいずれかの寄生性原生動物。
[5] リーシュマニア・タレントラエ(Leishmania tarentolae)である、項目[1]〜[4]のいずれかの寄生性原生動物。
[6] ポリヌクレオチドが、リムルス・ポリフェムス(Limulus polyphemus)、カルシノスコーピウス・ロツンジカウダ(Carcinoscorpius rotundicauda)、タキプレウス・トリデンタトゥス(Tachypleus tridentatus)またはタキプレウス・ギガス(Tachypleus gigas)由来のC因子タンパク質をコードする、項目[1]〜[5]のいずれかの寄生性原生動物。
[7] ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有するC因子タンパク質をコードする、項目[1]〜[6]のいずれかの寄生性原生動物。
[8] C因子タンパク質を生産する方法であって:
(a)細胞がポリヌクレオチドによってコードされるC因子タンパク質を発現する条件下で項目[1]〜[7]のいずれかの寄生性原生動物を培養する工程;および
(b)工程(a)で生産されたC因子タンパク質を細胞培養物から回収する工程、
を含む、方法。
[9] C因子タンパク質が、細胞培養培地中に蓄積される、項目[7]または[8]の方法。
[10] 生産されたC因子タンパク質が、内毒素への結合によりセリンプロテアーゼ活性を示す、項目[8]または[9]の方法。
[11] 項目[8]の方法によって取得可能なC因子タンパク質。
[12] 内毒素検出方法または内毒素除去方法における項目[8]〜[10]のいずれかの方法によって生産されるC因子タンパク質の使用。
[13] 内毒素検出方法または内毒素除去方法における項目[11]のC因子タンパク質の使用。
[14] 内毒素検出または内毒素除去のためのアッセイまたはキットであって、項目[8]〜[10]のいずれかの方法によって生産されるC因子タンパク質または項目[11]のC因子タンパク質を含む、アッセイまたはキット。
[15] C因子タンパク質を生産する寄生性原生動物宿主細胞を作製する方法であって:
(a)C因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、好ましくはベクターを、寄生性原生動物、好ましくはトリパノゾマチダ目の寄生性原生動物、より好ましくはリーシュマニア属のメンバー、最も好ましくはリーシュマニア・タレントラエに導入する工程;および
(b)C因子タンパク質を発現する工程(a)で生産された1つまたは複数の宿主細胞を選択する工程、
を含む、方法。
[16] C因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、項目[15]の方法によって取得可能な寄生性原生動物宿主細胞であって、ポリヌクレオチドが、寄生性原生動物宿主細胞に導入された核酸分子、好ましくはベクターに含まれる、寄生性原生動物宿主細胞。
カブトガニ由来のC因子は、内毒素の検出および除去における使用に関して十分に確立されている。過去に、カブトガニ由来の血液細胞(アメーバ細胞)の水性抽出物である従来的なアメーバ細胞溶解産物に対する代替供給源として組み換え発現によりC因子を生産する試みがなされた。C因子の組み換え発現に対する当技術分野の多くの試みは、様々な宿主細胞において生産された組み換えC因子(rFC)が内毒素検出方法における使用に必要とされる生物活性を示さないことが示され、失敗に終わった。当技術分野で利用された宿主細胞は、原核生物細胞、単純真核生物細胞および高等真核生物細胞であり、何年もの集中的な調査の後、当技術分野の研究者によって、完全な生物学的活性を有するrFCの生産には原核生物または単純真核生物発現システムよりも昆虫細胞における発現が適していると結論づけられた。これに関連して、カブトガニおよび昆虫は同じ節足動物門に属しており、そのため昆虫細胞はそれらの生理学および生化学に関して酵母細胞よりもカブトガニの細胞により近いと考えられることが、研究者によって説明された。したがって、昆虫細胞において生産されるrFCは、カブトガニから精製されるタンパク質により近く、LPSによって活性化されるセリンプロテアーゼ活性を有するという生物活性を維持していると考えられる。
第1に、C因子タンパク質の組み換え生産のための昆虫細胞の使用は、高価な専用培養培地が必要とされるという事実から高い費用を伴うものであるのに対して、原生動物の使用は、必要とされる培地が安価であり、設備および培養条件が細菌の発酵と類似することから、安価である。加えて、原生動物の培養物は、比較的速く成長し(速い発生時間)、かつ規模拡大が容易である。さらに、ひとたびクローニングされれば、組み換え発現宿主は安定的でありかつ感染性ウイルスストックの継続的な調製を必要としない。本発明の原生動物培養物において生産される組み換えC因子タンパク質は、高収量かつ可溶性形態で分泌されることが示され、かつ培養上清から容易に精製することができる。具体的には、唯一のC因子の活性形態が分解産物なしに上清から精製される。発現される組み換えタンパク質は安定的であり、チモーゲン形態の保護のために添加物を必要としないことに注目されたい。
本発明は、異種C因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有することによって特徴づけられる寄生性原生動物を提供する。本発明によって提供される寄生性原生動物は、カブトガニ由来のC因子の組み換え生産に使用される。したがって、本発明は、異種C因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有することによって特徴づけられる、カブトガニC因子の組み換え生産のための寄生性原生動物宿主細胞を提供する。
本発明は、カブトガニ由来の異種C因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む原生動物宿主細胞を提供する。本明細書で使用される場合、異種タンパク質は、宿主細胞にとってネイティブでないタンパク質を意味する。本発明の原生動物宿主細胞は、カブトガニC因子タンパク質の組み換え生産のための発現システムを表す。したがって、本発明は、寄生性原生動物宿主細胞およびカブトガニ由来の異種C因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現システム、ならびにカブトガニ由来の異種C因子タンパク質の発現のための該発現システムの使用を提供する。様々な態様において、本発明によって提供される発現システムは別々の手段として宿主細胞およびポリヌクレオチドを含み得るが、本発明によって提供される発現システムは、異種カブトガニC因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドをすでに保持している寄生性原生動物宿主細胞を含むことが好ましい。
本発明において使用されるポリヌクレオチドによってコードされるC因子タンパク質は、異種C因子タンパク質である。本発明において使用されるポリヌクレオチドは、カブトガニ由来のC因子と同様の酵素活性を示すC因子をコードする核酸配列を含む。本発明の範囲は、その天然供給源において見出されるアミノ酸配列、すなわちカブトガニから取得可能なC因子のアミノ酸配列を有するC因子をコードするポリヌクレオチドの使用、および本明細書に記載されるC因子アミノ酸配列の変種をコードするポリヌクレオチドの使用を包含する。本発明の範囲はまた、その天然供給源において見出されるC因子核酸配列、すなわちカブトガニから取得可能なC因子核酸配列を含むポリヌクレオチドの使用、および本明細書に記載される変種C因子核酸配列を含むポリヌクレオチドの使用を包含する。いずれの場合も、本発明において使用されるポリヌクレオチドは、内毒素による活性化によりC因子様酵素活性を示すC因子タンパク質をコードする。「C因子様酵素活性」の定義は、本明細書の他箇所に示されている。
チモーゲン(またはプロ酵素)は、酵素の前駆体である。チモーゲンはときどき酵素の不活性前駆体と呼ばれるが、チモーゲンは、その活性を(異なる因子に起因して)失っているのではなく活性な酵素になるために活性化される必要がある分子であるという意味で、「不活性」ではない。
そのチモーゲン形態にあるカブトガニのC因子は、重(H)鎖および軽(L)鎖を含む(いわゆる2本鎖形態である)ことが公知である。本発明の組み換えC因子もまた、この2本鎖チモーゲン形態で生産される。具体的には、本発明によって提供される方法から得られるチモーゲンC因子もまた、H鎖およびL鎖を含む。したがって、「本発明のC因子」および「本発明のチモーゲンC因子」という用語は、本明細書で上述されているように、言い換え可能に使用され得る。あるいは、「本発明のチモーゲン(組み換え)C因子」は、「本発明のプロ酵素(組み換え)C因子」として指定され得る。いずれの場合も、本発明の方法から直接得られる組み換えC因子は、重(H)鎖および軽(L)鎖を含む2本鎖チモーゲン形態によって特徴づけられる。
様々な態様において、本発明にしたがう異種カブトガニC因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、寄生性原生動物宿主細胞に導入される核酸分子、好ましくはベクターに含まれる。換言すると、様々な態様において、本発明にしたがう異種カブトガニC因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクターまたはプラスミドに組み込まれる。様々な態様において、2つまたはそれ以上のそのようなベクターまたはプラスミドが使用される。様々な態様において、ベクターまたはプラスミドは、線状ベクターまたは線状プラスミドである。様々なさらなる態様において、ベクターまたはプラスミドは、環状ベクターまたは環状プラスミドであり得る。
本発明は、カブトガニ由来のC因子を生産する方法であって、(a)本発明の寄生性原生動物の細胞を、該寄生性原生動物の細胞がポリヌクレオチドによってコードされるC因子を発現する条件下で培養する工程、および(b)工程(a)において生産されたC因子を細胞培養物から回収する工程を含む方法を提供する。本発明にしたがうカブトガニC因子を生産する方法において使用される細胞は、本明細書に記載される宿主細胞である。したがって、本発明にしたがうカブトガニC因子を生産する方法において使用される宿主細胞が本明細書に記載されるカブトガニC因子をコードするポリヌクレオチドを含むことは明らかである。
本発明の方法によって生産されるC因子は、その天然供給源で見出される、すなわちカブトガニから取得可能な、C因子のアミノ酸配列を有するC因子タンパク質および本明細書に記載されるそれらの変種を包含する。同様に、本発明の方法によって生産されるC因子は、その天然供給源で見出される、すなわちカブトガニから取得可能な、C因子をコードする核酸配列と同一である核酸配列によってコードされるC因子タンパク質および本明細書に記載されるそれらの変種を包含する。いずれの場合も、本発明の方法によって生産されるC因子タンパク質は、内毒素(またはキモトリプシンもしくはリピドA)による活性化によりC因子様酵素活性を示す。
本明細書に記載されるように、本発明は、本発明にしたがう方法によって生産されるC因子を提供する。本発明にしたがう方法から得られるC因子は、クロマトグラフィー手段による任意の別個の精製を行うことなく、内毒素検出または内毒素除去方法に直接適用され得る。したがって、本明細書の他箇所にすでに記載されているように、本発明にしたがう方法から直接得られるC因子は、したがって、精製されたC因子とみなされ得る。本発明はまた、クロマトグラフィー手段によってさらに精製されるC因子を包含する、すなわち本発明にしたがう方法によって生産されるまたは本発明にしたがう方法から直接得られるC因子はクロマトグラフィー手段によってさらに精製される。クロマトグラフィー手段の適用は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない。
本発明はまた、本発明によって提供されるまたは本発明の方法から得られるC因子タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。好ましくは、抗体は、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する全長C因子に特異的に結合する。
本発明は、本発明の方法にしたがい生産される組み換えC因子タンパク質を含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸分子を含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明のベクターまたはプラスミドを含む組成物を提供する。本発明はさらに、本発明にしたがう寄生性原生動物宿主細胞を含む組成物を提供する。本発明はさらに、本発明にしたがう融合タンパク質またはキメラタンパク質を含む組成物を提供する。
本発明によって生産される組み換えC因子は、内毒素の高スループットスクリーンのための内毒素診断アッセイの基礎をなす。内毒素により活性化された組み換えC因子チモーゲンは、合成基質を触媒的に加水分解して測定可能な生産物を形成し、それによって内毒素が定量される。
本発明は、内毒素を除去する方法における本発明にしたがう方法によって生産されるC因子タンパク質の使用を提供する。そのような方法における本発明のC因子の使用は、水、緩衝液および細胞培養培地からの内毒素の除去を含むがこれらに限定されない。内毒素を除去する方法における本発明のC因子の使用に関する様々な他の態様は、生物学的および非生物学的調製物、好ましくは生物学的調製物、より好ましくは動物研究用の生物学的調製物からの内毒素の除去、細胞培養、移植、幹細胞技術、細胞選別ならびに他の哺乳動物細胞処置を含むがこれらに限定されない。内毒素を除去する方法における本発明のC因子の使用に関する様々なさらなる態様は、医療設備、医療装置、化粧品、食品および飲料品からの内毒素の除去を含むがこれらに限定されない。
内毒素の定量的測定を含む適用においては、既知の濃度を有する内毒素標準サンプルが、内毒素レベルと検出用基質の反応の程度(例えば、着色、蛍光放射等の程度)を相関付けるデータを生成するために使用され得る。これにより、得られた相関データに基づき本発明にしたがいアッセイしたいサンプル中に存在する内毒素を定量できるようになる。
本明細書で上述されているように、「内毒素検出方法」または「内毒素を検出する方法」等の用語は、「内毒素アッセイ」という用語と言い換え可能に使用され得る。したがって、本発明は、本明細書の他箇所に記載されている内毒素検出方法にしたがう本発明の方法によって生産される組み換えC因子の適用を含む内毒素アッセイを提供する。基本的に、本発明にしたがう内毒素アッセイは、本発明にしたがう内毒素検出方法と同じ方法の工程を含む。さらに、本発明は、本発明の組み換えC因子、すなわち本発明にしたがう方法によって生産されるC因子を含む内毒素検出キットを提供する。好ましくは、キットはさらに、本発明の内毒素検出方法または内毒素アッセイの指示書を含む。好ましくは、指示書は、マニュアルの形式である。
本発明は、組み換えC因子タンパク質を生産する寄生性原生動物宿主細胞を作製するプロセスであって:(a)異種カブトガニC因子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、好ましくはベクターまたはプラスミドを寄生性原生動物宿主細胞に導入する工程および(b)C因子タンパク質を発現する工程(a)で作製された1つまたは複数の宿主細胞を選択する工程を含むプロセスを提供する。好ましくは、本発明にしたがうベクターまたはプラスミド、すなわち異種カブトガニC因子タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターまたはプラスミドが、寄生性原生動物宿主細胞に導入される。さらに、寄生性原生動物宿主細胞は、好ましくは、キネトプラスチド寄生性原生動物宿主細胞である。より好ましくは、キネトプラスチド寄生性原生動物宿主細胞は、二生性トリパノゾマチド(すなわち、トリパノゾマチダ目の二生性メンバー)である。さらにより好ましくは、寄生性原生動物宿主細胞は、トリパノゾマチダ目の細胞である。さらにより好ましくは、寄生性原生動物宿主細胞は、リーシュマニア属の細胞である。最も好ましくは、寄生性原生動物宿主細胞は、リーシュマニア・タレントラエである。
本発明はまた、開示されるベクターおよび/またはプラスミドによって取得可能な安定的にトランスフェクトされた細胞株を提供する。好ましくは、トランスフェクトされた細胞株は、キネトプラスチド寄生性原生動物細胞の安定的なトランスフェクションから得られる細胞株である。より好ましくは、トランスフェクトされた細胞株は、トリパノゾマチダ目の細胞の安定的なトランスフェクションから得られる細胞株である。より好ましくは、トランスフェクトされた細胞株は、リーシュマニア属の細胞の安定的なトランスフェクションから得られる細胞株である。さらにより好ましくは、トランスフェクトされた細胞株は、リーシュマニア・タレントラエ種の細胞の安定的なトランスフェクションから得られる細胞株である。
全体として、本発明の方法にしたがい生産されるC因子または「本発明の方法にしたがい得られるC因子」または単に「本発明のC因子」に対する参照が本明細書でなされているときは常に、そのような参照は、C因子様酵素活性、すなわち本明細書の他箇所で記載されているようなカブトガニ由来のC因子と同様の酵素活性を有する本発明のC因子の任意のフラグメント、アナログまたは機能的誘導体を含む。
発現ベクターへのC因子遺伝子のクローニングの出発点は、タキプレウス・トリデンタトゥス由来のC因子配列(NCBIアクセッション番号P28175.1:そこでの参考文献1:Muta et al. 1991, J. Biol. Chem. 266(10):6554-6561)とした。アクセッション番号P28175.1の下で示されているT. トリデンタトゥス由来の野生型C因子タンパク質のアミノ酸配列は、1,019アミノ酸残基の長さを有する。このタンパク質の発現および分泌後に切断されるリーダー配列は、25アミノ酸残基の長さを有する(アクセッション番号P28175.1の下で示されているアミノ酸配列の残基1〜25)。リーダー配列を含まないT. トリデンタトゥス由来の野生型C因子タンパク質のアミノ酸配列が、SEQ ID NO:2に示されている。SEQ ID NO:2に示されるT. トリデンタトゥス由来の野生型C因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1で与えられる。
トランスフェクションのための発現ベクターの調製
SEQ ID NO:3のコドン最適化配列およびリーシュマニア宿主細胞における標的タンパク質の分泌発現のためのシグナルペプチド配列を含む、リーシュマニア宿主細胞特異的発現ベクターを調製した。リーシュマニア・タレントラエ由来の分泌シグナルペプチド配列のアミノ酸配列が、SEQ ID NO:5に示されている。リーシュマニアリーダー配列は、このタンパク質の発現および分泌後に切断される。
エレクトロポレーションによるリーシュマニアのトランスフェクションを含む、広範囲のトリパノゾマチドの安定的なDNAトランスフェクションは、当技術分野で報告されている(Beverly and Clayton 1993, Methods Mol. Biol. 21:333-348; Coburn et al. 1991, Mol. Biochem. Parasitol. 46: 169-179)。ここでは、リーシュマニア細胞の培養およびトランスフェクションを、High Voltageトランスフェクションプロトコル(Jena Bioscience GmbH, Jena, Germany)を適用して行った。具体的には、事前培養から得られたリーシュマニア細胞(リーシュマニア・タレントラエ)を、約6 x 107細胞/mlの細胞密度が達成されるまで(OD 1.4)培養した。細胞が生きていることおよび液滴様形状であることは、顕微鏡によって確認した。事前に凍結しておいた細胞を、0.1〜5μgの形質転換用DNAを含むチューブに添加し(氷上)、混合し、そしてエレクトロポレーションキュベットに移した(氷上)。パルス制御装置を有するジェネパルサー(genepulser)を用い、パルス間隔10秒間で2回、1,500V、25μFのパルス刺激(パルス時間約0.3ミリ秒)を行った。このキュベットを10分間氷上に戻し、そして電気穿孔された細胞を通気した組織培養フラスコに移し、その後に静的懸濁培養として26℃で一晩インキュベートした(約20時間、O.D.0.3〜0.4)。
クローンの選択は、選択用の抗生物質を補充した固体培地上にプレーティングすることによって行った。単クローンを次いで選択培地に展開させた。この目的で、10個までのクローンを、培養フラスコ中の各々10ml中で培養した。これらの培養物を、評価のために使用した。
トリパノゾマチド原生動物、特にリーシュマニアにおける組み換えタンパク質の発現は、当技術分野で報告されている(Breitling et al. 2002, Protein Expression and Purification 25:209-218; Basile and Peticca 2009, Mol. Biotechnol. 43:273-278)。ここでは、C因子タンパク質の発現および精製のためのリーシュマニアの培養および改変を、Jena Bioscience GmbH, Jena, Germanyによって提供される遺伝子発現キットを用いて行った。
生産株を、培養フラスコ中10ml量で、26℃の暗所にて培養した。生産株を、2〜3日ごとに、すべての添加物および挿入された遺伝子の選択のための抗生物質を含む新しい培養培地で、1:20または1:50連続希釈した。
生産株を新しい培地で1:50希釈し、そして培養フラスコ中、26℃の暗所で2〜3日インキュベートすることによって事前培養物を準備した。
3.3.1 カチオン交換クロマトグラフィー
発現からの上清を直接使用するかまたは穏やかに解凍した。2mM EDTAを添加した後、上清を、5.0〜5.5のpHおよび<5.5mS/cmの伝導度が達成されるまで20mM酢酸カリウム、2mM EDTA pH5で希釈した。
タンパク質を含む画分を、濃度および純度に関してゲルろ過およびSDS PAGEによって分析した。
1)6.4+/-0.4分の保持時間のピークのピーク面積がrFCピーク面積の10%を超えてはならない。
2)10.3+/-0.5分の保持時間のピークのピーク面積がrFCピーク面積の350%を超えてはならない。
3)rFCピークと10.3+/-0.5分の保持時間のピークの間の最小が9〜10分の間でなければならず、かつその最小の吸収値がrFCピークの最大の吸収値の30%を超えてはならない。
1mM PMSFをrFCプールに添加し、そして室温で4時間インキュベートした。その後、0.1% Pluronic(登録商標)F-127を添加し、そしてこの溶液を、5リットルの5mM酢酸カリウム、100mM塩化カリウム、0.1% Pluronic(登録商標)F-127、0.05mM EDTA pH5に対して4℃で透析した。透析は、各々12時間を3回行った。
透析したrFC溶液を滅菌ろ過し、そしてその濃度ををゲルろ過によっておよび純度をSDSゲルによって決定した。この溶液を4℃で保管した。
C因子の比活性を、Ding et al. 1993 (Biochimica et Biophysica Acta 1202:149-156)に記載されたアッセイにしたがい決定した。この文書は、カブトガニであるC.ロツンジカウダから単離されたC因子タンパク質の比活性を決定するために使用されたアッセイのために、米国特許US 5,712,144で引用されている。
リーシュマニアにおいて生産されたC因子タンパク質の分子量を、非還元および還元条件(SDS-PAGE)下で決定した。50μlの還元および非還元の両rFCサンプルならびに20μlの分子量標準を、10トラックのVarioGel(4〜12%)に投入した。垂直式ゲル電気泳動チャンバーにおいて電気泳動を行った後、ゲルを、製造元のプロトコルにしたがいready-to-use PageBlut(商標)タンパク質染色溶液(Fermentas)を用いて染色した。
Claims (16)
- カブトガニC因子(Factor C)タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有することによって特徴づけられる、寄生性原生動物。
- ポリヌクレオチドが、寄生性原生動物宿主細胞に導入された核酸分子、好ましくはベクターに含まれる、請求項1記載の寄生性原生動物。
- トリパノゾマチダ(Trypanosomatida)目のメンバーである、請求項1または2記載の寄生性原生動物。
- リーシュマニア(Leishmania)属のメンバーである、請求項1〜3のいずれか一項記載の寄生性原生動物。
- リーシュマニア・タレントラエ(Leishmania tarentolae)である、請求項1〜4のいずれか一項記載の寄生性原生動物。
- ポリヌクレオチドが、リムルス・ポリフェムス(Limulus polyphemus)、カルシノスコーピウス・ロツンジカウダ(Carcinoscorpius rotundicauda)、タキプレウス・トリデンタトゥス(Tachypleus tridentatus)またはタキプレウス・ギガス(Tachypleus gigas)由来のC因子タンパク質をコードする、請求項1〜5のいずれか一項記載の寄生性原生動物。
- ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有するC因子タンパク質をコードする、請求項1〜6のいずれか一項記載の寄生性原生動物。
- カブトガニC因子タンパク質を生産する方法であって:
(a)細胞がポリヌクレオチドによってコードされるC因子タンパク質を発現する条件下で請求項1〜7のいずれか一項記載の寄生性原生動物を培養する工程;および
(b)工程(a)で生産されたC因子タンパク質を細胞培養物から回収する工程、
を含む、方法。 - C因子タンパク質が、細胞培養培地中に蓄積される、請求項7または8記載の方法。
- 生産されたC因子タンパク質が、内毒素への結合によりセリンプロテアーゼ活性を示す、請求項8または9記載の方法。
- 請求項8の方法によって取得可能なカブトガニC因子タンパク質。
- 内毒素検出方法または内毒素除去方法における請求項8〜10のいずれか一項記載の方法によって生産されるカブトガニC因子タンパク質の使用。
- 内毒素検出方法または内毒素除去方法における請求項11記載のカブトガニC因子タンパク質の使用。
- 内毒素検出または内毒素除去のためのアッセイまたはキットであって、請求項8〜10のいずれか一項記載の方法によって生産されるカブトガニC因子タンパク質または請求項11記載のカブトガニC因子タンパク質を含む、アッセイまたはキット。
- カブトガニC因子タンパク質を生産する寄生性原生動物宿主細胞を作製する方法であって:
(a)カブトガニC因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、好ましくはベクターを、寄生性原生動物、好ましくはトリパノゾマチダ目の寄生性原生動物、より好ましくはリーシュマニア属のメンバー、最も好ましくはリーシュマニア・タレントラエに導入する工程;および
(b)カブトガニC因子タンパク質を発現する工程(a)で生産された1つまたは複数の宿主細胞を選択する工程、
を含む、方法。 - カブトガニC因子タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項15記載の方法によって取得可能な寄生性原生動物宿主細胞であって、ポリヌクレオチドが、寄生性原生動物宿主細胞に導入された核酸分子、好ましくはベクターに含まれる、寄生性原生動物宿主細胞。
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