JP2003513632A - 非病原性キネトプラスチダエのタンパク質発現システム - Google Patents
非病原性キネトプラスチダエのタンパク質発現システムInfo
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Abstract
Description
宿主細胞に関する。特に、本発明は組み換えタンパク質、特に酵素の高い水準の
発現に使用可能な、キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)類の選択された非
病原性の種の宿主細胞に関する。
の原核および真核生物に転移するのにうまく用いられてきた。現今では、原核お
よび真核の宿主を含めて、ある与えられたタンパク質の産生のために選択できる
、発現システムの選択可能性がある。適切な発現システムの選択においては、し
ばしば関心のあるタンパク質を活性な状態で十分な量を産生する宿主細胞の能力
のみならず、該タンパク質の使用目的によって大部分が決定されるだろう。
),のような十分な因子と共に希望するタンパク質遺伝子を、ゲノムあるいはエ
ピソームへ統合することによって異種の遺伝子発現を媒介することができる。こ
の技術は、バクテリア、酵母、糸状菌類、培養細胞あるいは昆虫および哺乳類の
組織全体のようなおおくの種類の細胞でうまく適用されている。これらの発現シ
ステムのそれぞれは、タンパク質収率、純度およびコストに関して特有の有用性
と欠点がつきものであり、タンパク質発現のための万能な宿主は存在しない。
容易に操作できるべきである。さらに、宿主は活性なタンパク質を大量に産生し
、その抽出を許容すべきである。
かる原始的な鞭毛状の原生動物である。それらのいくつかは植物から脊椎動物の
範囲の生物に病気を引き起こす。キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)の進
化的な位置づけおよび種の分類型は他に記載されている(たとえば、AdoutteとP
hilippe, 1993)。キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)の二つの主な亜種は
、レイシュマニア(Leishmania)およびトリパノソマチダエ(Trypanosomatidae
)である。キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)は、RNAエディティング
(Stuart, 1991)、mRNAトランススプライシング(PerryおよびAgabian, 19
91)、タンパク質へのグリコシルホスファチジルイノシトール−アンカリング(
Krakow ら、1986)、抗原性変異(BorstおよびRudenko, 1994)、およびテロマ
ーの構成(Blackburn, 1991)のような基本的な分子のあるいは細胞の現象の研
究に特に大切であった。真核生物の中では独特であるトリパノソマチダエ(Tryp
anosomatidae)の特徴は多シストロン性の転写単位である。これらの単位では、
一連の遺伝子が一列に並んで配置された形であり、RNAポリメラーゼによって
単一の50-100kbの転写物として転写される(Myler ら, 1999; Teixeira, 1998
)。そのような転写物はその後、トランススプライシングとして知られる過程に
よる5’末端へのキャップされたミニ−エキソンの付加につづいて3’末端の切
断とポリアデニル化によって、単一遺伝子のmRNAへと加工される。キネトプ
ラスチダエ(Kinetoplastidae)の遺伝子発現およびその制御は他の真核生物の
それらとは大きく逸脱しているように見える。ごくわずかな場合、たとえばトリ
パノソーマ ブルセイ(Trypanosoma brucei)では、VSGおよびPARPプロ
モーターのような時期特異的プロモーターが同定された(Barry ら, 1998; Hotz
ら, 1998)。これまでに報告されたすべての他の真核生物とは反対に、これら
のプロモーターはタンパク質をコードする遺伝子についてはRNAポリメラーゼ
IIではなくRNAポリメラーゼIを採用する(Teixeira, 1998)。レイシュマ
ニア(Leishmania)種のケースではリボソーマルRNAプロモーターを除けばプ
ロモーターに類似する因子が同定されておらず、現今のモデルによるとRNAポ
リメラーゼIIによるレイシュマニア(Leishmania)の転写開始はランダムな過
程である。そのような遺伝子の構成の結果から、遺伝子制御のほとんどは転写後
の段階で起こる(Teixeira, 1998)。
伝学(reversed gennetics)の方法論の確立について大きな進歩があった。最初
は、トリパノソーマ クルジィ(Trypanosoma cruzi)において一過性の外来遺
伝子の発現を許容するベクターが報告された(LuおよびBuck, 1991)。NEO遺伝
子を薬物耐性マーカーとしてトランスファーベクターに供給した形質転換は安定
となり、つづいていくつかの他の種についても報告された(Coburnら, 1991)。
DNA構築物の移行はエレクトロポレーションあるいは粒子衝突によって成功した
(BeverleyおよびClayton, 1993; Sbicego ら, 1998)。キネトプラスチダエ(K
inetoplastidae)は、外来およびゲノム由来のプラスミドの両方を複製できるこ
とが示された(Coburnら, 1991; Patnaik ら, 1994; ten Asbroek ら,1993)(P
apadopoulou ら, 1994)。機能性の遺伝子の一方もしくは両方の対立遺伝子の相
同組み換えにより欠失させ、そして新しい遺伝子をゲノム中に統合できることが
明らかにされた(Cruzら、1991; RayとHines, 1995)。レイシュマニア(Leishm
ania)およびトリパノソマチダエ(Trypanosomatidae)中で細胞質のまたは分泌
タンパク質の発現を許容する様々な方法が開発された。これらの構築物は大まか
に3つの分類: A)エピソームのプラスミドが、レイシュマニア(Leishmania)のケースにおい
て定義されたプロモーターを持たないもの、あるいはトリパノソーマ ブルシィ
(Trypanosoma bruci)のケースにおいて時期特異的なプロモーターをもたない
もの(LeBowitzら、1990)(La Flammeら、1996)、 B)活発に転写される遺伝子クラスター(チューブリン遺伝子、小サブユニット
リボソームRNA遺伝子、大サブユニットリボソームRNA遺伝子)中に統合される構
築物(Misslitz A. ら、1999; TobinおよびWirth、1992; Wirtzら、1999)、 C)外来のポリメラーゼ遺伝子の活発に転写される座への統合と、目的遺伝子の
このポリメラーゼ(特にT7またはT3ポリメラーゼ)による転写、 に分けることができる。
的に活性であることが明らかにされた: ・レイシュマニア ドノバニ(Leishmania donovani)中でのp53(Zhangら、199
5)、 ・レイシュマニア マジョール(Leishmania major)中でのインターフェロン−
ガンマ(TobinおよびWirth、1992)、 ・トリパノソーマ クルジィ(Trypanosoma cruzi)中でのインターロイキン−
2(La Flammeら、1996)、 ・レイシュマニア マジョール(Leishmania major)およびレイシュマニア ド
ノバニ(Leishmania donovani)中でのGFP(Haら、1996)、 ・レイシュマニア マジョール(Leishmania major)中でのβ−ガラクトシダー
ゼ(LeBowitzら、1990)、 ・トリパノソーマ ブルセイ(Trypanosoma brucei)中でのルシフェラーゼ(Bi
ebingerら、1997)、 ・トリパノソーマ ブルセイ(Trypanosoma brucei)中でのT7およびT3ポリメラ
ーゼ(Witzら、1994)。
ンター)上での生育を含む、多くのキネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)のi
n vitro培養の方法に関連する出版物も含む(Alfonzoら、1998)。ほとんど
の場合では、培地は必須アミノ酸の選択されたものおよび微量元素を含み、子ウ
シ血清またはウシ血液が添加された(BeverleyおよびClayton、1993;Hill
およびFahey、1987)。いくつかの種は血清の非存在下で単純な非合成培地
で生育することが示された。もっともよく記述され研究された、レイシュマニア
タレントラエ パロット(Leishmania tarentolae Parrot)(ヤモリの寄生体
)、タレントラ マウリタニカ(Tarentola mauritanica)およびタレントラ
アニュラリス(Tarentola annularis)(Elwasila、1988);あるいはカである
キュレックス ピピエンス(Culex pipiens)の寄生体であるクリシジア ファ
スシウラタ レゲール(Crithidia fasciulata Leger)(Leger、1902)は、bra
in heart infusion(BHI)培地(Alfonzoら、1998)またはLuria-Bertani(LB)
培地上で培養できる。これらの種は大きなファーメンター中でよく育つこともま
た示された。レイシュマニア タレントラエ(Leishmania tarentolae)は、15
L標準ファーメンター中で後静止期に1mlあたり2x108 細胞の密度に到達し、1L
の培養液あたり10 g乾燥細胞重量を得ることができた(Alfonzoら、1998)。
パノソマチダエ(Trypanosomatidae)およびレイシュマニア(Leishmania)−は
、それに伴う健康上のリスク、遅い生育速度あるいは一般的でない、高価な培地
のために、異種のタンパク質発現について有用であることは示されていない。
生的に大量に合成され、分泌される宿主のタンパク質が実質的になく、そして、
高いタンパク質発現のレベルに達することができるものである。
ivoで用いており、組み換えタンパク質を単離する試みはなされていなかった。 本発明者らの実験は、所望する異種のタンパク質発現がキネトプラスチダエ(
Kinetoplastidae)の非病原性の種、特にレイシュマニア タレントラエ(Leish
mania tarentolae)、クリシジア ファスシキュラタ(Crithidia fasciculata
)、ワラセイナ インコンスタンス(Wallaceina inconstans)(旧名プロテオ
モナス インコンスタンス(Proteomonas inconstans))、レプトモナス コロ
ス(Leptomonas collos)、レプトモナス(Leptomonas)sp. Cfm、レプトモナス
(Leptomonas)sp. Nfm、あるいはレプトモナス セイモウリ(Leptomonas sey
mouri)、を用いて確立できることを示した。
な培地上で優れた生育速度を示し、したがってタンパク質生産のための宿主とし
ての有用性の証拠となった。
に用いることができる、非病原性キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)の新
しい発現および送達システムおよび/またはタンパク質発現宿主を提供すること
にある。
シュマニア タレントラエ(Leishmania tarentolae)、クリシジア ファスシ
キュラタ(Crithidia fasciculata)、ワラセイナ インコンスタンス(Wallace
ina inconstans)(旧名プロテオモナス インコンスタンス(Proteomonas inco
nstans))、レプトモナス コロス(Leptomonas collos)、レプトモナス(Lep
tomonas)sp. Cfm、レプトモナス(Leptomonas)sp. Nfm、およびレプトモナス
セイモウリ(Leptomonas seymouri)、のような非病原性キネトプラスチダエ
(Kinetoplastidae)宿主細胞によって成し遂げられる。 特に好ましいものは下記の通りである: 昆虫カロコリス セクスグッタトゥス(Calocoris sexguttatus)(ヘミプテ
ラ(Hemiptera)、ミリダエ(Miridae))の寄生体である、ワラセイナ インコ
ンスタンス(Wallaceina inconstans)(旧名プロテオモナス インコンスタン
ス(Proteomonas inconstans))、これは小サブユニットリボソームRNA遺伝子
(Gene Bankアクセス番号AF153044)の部分配列で特徴づけられる。
ラ(Hemiptera)、ナビダエ(Nabidae))の寄生体であるレプトモナス(Leptom
onas)sp. Cfm、これは小サブユニットリボソームRNA遺伝子(Gene Bankアクセ
ス番号AF153041)の部分配列で特徴づけられる。
rridae))の寄生体であるレプトモナス コロソーマ(Leptommonas collosoma
)、これは小サブユニットリボソームRNA遺伝子(Gene Bankアクセス番号AF1530
38)の部分配列で特徴づけられる。
ラ(Hemiptera)、ナビダエ(Nabidae))の寄生体であるレプトモナス(Leptom
monas)sp. Nfm、これは小サブユニットリボソームRNA遺伝子(Gene Bankアクセ
ス番号AF153043)の部分配列で特徴づけられる。
Hemiptera)、ピルロコリダエ(pyrrhocoridae))からのレプトモナス セイモ
ウリ(Leptomonas seymouri)、これは小サブユニットリボソームRNA遺伝子(Ge
ne Bankアクセス番号AF153040)の部分配列で特徴づけられる。
ATCC番号30143およびクリシジア ファスシキュラタ レゲール(Crithidia fas
ciculata Leger)ATCC番号12857(米国型培養収集番号(American Type Culture
Collection number)。
配列を変える修飾が施された天然のタンパク質を意味する。望ましい態様として
は、そのようなタンパク質は異種の酵素である。したがって、異種核酸コード配
列は、選択された宿主細胞中で核酸配列の発現を指示することができる適切なプ
ロモーター配列および、適切ならば、転写後シグナル配列に機能可能なように連
結される。
)、クリシジア ファスシキュラタ(Crithidia fasciculata)、ワラセイナ
インコンスタンス(Wallaceina inconstans)、レプトモナス コロス(Leptomo
nas collos)、レプトモナス(Leptomonas)sp. Cfm、レプトモナス(Leptomona
s)sp. Nfm、あるいはレプトモナス セイモウリ(Leptomonas seymouri)、の
ようなキネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)目の生物は、鞭毛の基底小体の
近くに位置し、数千の小さな連動する環状DNAのネットワークを含んでいる、そ
のただ一つのミトコンドリアに付随のキネトプラストという独特の細胞小器官を
持つ。キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)は50−400ミクロンのサイ
ズである。
して真菌でさえ及ばないほどずっと昔にさかのぼる、最古の真核生物に属する。
キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)の種は、植物から動物までにおよぶ非
常に広い範囲の宿主に寄生する。キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)のた
くさんの代表は単離され、培地中で長期間維持された。培養は、完全にあるいは
部分的に規定された液体および固体培地の両方で行うことができる(Melo, 1981
)。液体培地中で生育したキネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)は、懸濁液
を形成し、一方、固体培地上にプレーティングするとコロニーの形成を誘導する
(HillおよびFahey、1987)。
astidae)」という言葉の使用は、前述の種を含む生物/宿主だけでなく、先に
定義した同じ形態学的および培養上の特質あるいは特徴を有し、「非病原性キネ
トプラスチダエ(Kinetoplastidae)」と同義語と考えうる代わりの分類体系の
種も表すことが理解されるだろう。
S. department of Health and Human Services)のガイドライン(HHS出版番号
(CDCD 93-8395)またはhttp://www.niehs.nih.gov/odhsb/biosafe/bio.htm)に
基づく生物学的安全性レベル1にあるものと定義する。
切なプレーティング技術および抗体選択の条件あるいは限定希釈技術によって行
われる。形質転換効率は選択された種によって幅広く広がり、レイシュマニア(
Leishmania)種でもっとも高くなり、10-4/細胞に到達する(Kaplerら、1990)
(Coburnら、1991)。一つの細胞は、それらすべてが異なる選択マーカーを持っ
ているなら、いくつかの発現構築物を維持することができる(Wirtzら、1999)
。発現のレベルは、選択された宿主および構築物に依存して有意に変化し、エピ
ソームのプラスミドはもっとも低い規模であるが、それにも関わらず組み換えタ
ンパク質を細胞の全タンパク質の1%まで産生できる(LeBowitzら、1990)。
できることを示している。したがって、この能力は一つの系統に限定されたもの
ではなく、むしろこの種のグループ全体の特徴であると理解される。当業者はこ
れらの種の他の系統のものもまた異種のタンパク質の発現に使えることを認識す
るだろう。たくさんの系統は公的に入手可能である。たとえば、レイシュマニア
タレントラエ パロット(Leishamania tarentolae Parrot)ATCC番号30143お
よびクリシジア ファスシキュラタ レゲール(Crithidia fasciculata Leger
)ATCC番号12857がある。
クター、プロモーター、および選択マーカーの使用に限定されるものではないこ
とを認識するだろう。それらの技術もまた、本発明の宿主細胞と関連した有用な
ものとして、含まれる。
マイシンとの組み合わせのヒグロマイシン ホスホトランスフェラーゼ(HYG)
遺伝子、G418との組み合わせのネオマイシン ホスホトランスフェラーゼ(NEO
)遺伝子、フレオマイシンとの組み合わせのストレプトアロテイクス ヒンドゥ
スタヌス(Streptoalloteichts hindustanus)BLE遺伝子(BLE)、およびノル
セオスリシンとの組み合わせのストレプトスリシンアセチルトランスフェラーゼ
をコードする(SAT)遺伝子を含む技術を含むがこれらに限定されない。さらに
、カルモジュリン、ジヒドロフォレート レダクターゼ−チミジレート シンタ
ーゼ、およびシステイン プロテイナーゼ遺伝子のような、宿主の活発に転写さ
れる遺伝子の5’および3’遺伝子間の領域を含むが限定しない。
スチダエ(Kinetoplastidae)遺伝子の5’および3’UTRを側面に接しており、
効率のよいトランススプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含み、およ
び適切ならば選択マーカーを含んでいる、非病原性キネトプラスチダエ(Kineto
plastidae)、特に前述の望ましい種に形質転換可能なベクターも提供する。
ベクターまたはプラスミドあるいは二つまたはそれ以上のベクターまたはプラス
ミドのシステムであってよい。ベクターまたはプラスミドは直線上または閉環上
の分子であってよい。
よび活発に転写される宿主の遺伝子の断片を側面に接した耐性マーカー遺伝子と
機能可能に連結した、活発に転写される宿主のタンパク質の遺伝子間領域を側面
に接した、関心のあるタンパク質をコードする異種の核酸を望ましくは含む。そ
のような遺伝子は、小サブユニットリボソームRNA遺伝子、大サブユニットリボ
ソームRNA遺伝子、αまたはβ−チューブリン遺伝子、カルモジュリン遺伝子、
あるいはgp63遺伝子などを含むがこれらに限定されない。その構築物は小サブユ
ニットリボソームRNA遺伝子クラスター、大サブユニットリボソームRNA遺伝子ク
ラスター、アルファまたはベータ−チューブリン遺伝子クラスターのような活発
に転写されるクラスター中に相同組み換え、および適切な抗生物質による選択に
よって統合される。
酸およびrRNA遺伝子クラスターの転写されないスペーサーからのDNAのフラグメ
ントを側面に接した耐性マーカー遺伝子と機能可能に連結した、活発に転写され
る宿主のタンパク質の遺伝子間領域を側面に接した、関心のあるタンパク質をコ
ードする異種の核酸を望ましくは含む。関心のあるタンパク質をコードする遺伝
子はリボソームRNA遺伝子プロモーターおよび、いくつかの場合においては、Tet
またはLacリプレッサー応答因子を含むがそれらに限定されない制御因子の後に
置かれる。その構築物はrRNA遺伝子領域の転写されないスペーサー中に相同組み
換え、および適切な抗生物質による選択によって統合される。
な環状プラスミド核酸および耐性マーカーが機能可能に連結した活発に転写され
る宿主タンパク質の遺伝子間領域に側面を接した関心のあるタンパク質をコード
する異種の遺伝子をのぞましくは含む。その構築物は、抗生物質選択の圧力の下
で生物体の中にエピソーム的に維持され、転写産物はランダム開始および疑似(
runaround)転写によって生じる。
られる環状プラスミド核酸および耐性マーカーが機能可能に連結した、活発に転
写される宿主タンパク質の遺伝子間領域を側面に接する、関心のあるタンパク質
をコードする異種の核酸を望ましくは含む。関心のある遺伝子をコードする核酸
は、リボソーマルプロモーターおよびその制御因子か、あるいはT7、T3などを含
むがそれらに限定されない外来のRNAポリメラーゼのプロモーターかのいずれか
が前に置かれる。構築物は、抗生物質選択の圧力化でエピソーム的に生物体の中
に維持され、リボソームRNA遺伝子プロモーターである場合RNAポリメラーゼIに
よって転写物が生成する。他のプロモーター(T7、T3など)の場合は、転写はゲ
ノム中に統合した外来のポリメラーゼによって行われる。
れ、一つは活発に発現される宿主のタンパク質の遺伝子間の領域に、耐性マーカ
ー遺伝子が機能可能に連結され、そして活発に転写される宿主の遺伝子セグメン
トを側面に接した、外来のRNAポリメラーゼの遺伝子(例えば、T7またはT3ポリ
メラーゼ)を含む。この構築物は相同組み換えにより、宿主の活発に転写される
遺伝子クラスター中に統合される。
リプレッサーをコードする異種のDNAを含み、その前にプロモーター、望ましく
はT3あるいは減衰させたT7プロモーターを含む。この修飾Tetリプレッサー遺伝
子は抗生物質耐性マーカー遺伝子に機能可能に結合し、そして構築物全体は活発
に転写される宿主の遺伝子のセグメントを側面に接する。この構築物は相同組み
換えによって宿主の活発に転写される遺伝子クラスターに統合される。
み、活発に発現する宿主のタンパク質の遺伝子間の領域を側面に接し、そして望
ましくはT3あるいはT7特異的なプロモーターを先に示した所望するタンパク質の
遺伝子の5’末端に有する、エピソームとして可能なプラスミドを含む。このプ
ロモーターには、転写のテトラサイクリン依存的な対照標準を許容するためのTE
Tリプレッサー認識配列が付加的に供給される。得られた構築物は抗生物質耐性
マーカー遺伝子に機能可能に連結し、エピソーム的に維持されるあるいは構造体
全体の側面に接する適切なターゲット配列とともに供給され、そして転写されな
いrRNA遺伝子スペーサーのような宿主ゲノムの転写的に静的な部分に統合される
。
ンパク質の発現に用いることができ、望ましくは真核生物のタンパク質を発現す
るために用いる。たとえば、この新規の発現および送達システムは、カタラーゼ
、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ
、セルラーゼ キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エ
ステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼおよびその他のタンパク質分解酵素、ア
ミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナ
ーゼおよびその他のペクチン分解酵素、アミラーゼ グルコアミラーゼ、α−ガ
ラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダ
ーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、
リボヌクレアーゼ、キチナーゼ、およびデオキシリボヌクレアーゼのような酵素
を発現するのに用いることができる。当業者は、「酵素」とは天然型の酵素だけ
ではなく、アミノ酸置換、欠損、付加、あるいは活性促進、熱安定性、pH耐性な
どを向上させる修飾によって修飾された酵素を含むことを理解するだろう。
産に用いてもよい。そのような使用の例として、非病原性キネトプラスチダエ(
Kinetoplastidae)型の天然のタンパク質をそのタンパク質の発現を促進するた
めに異なるプロモーターの制御下に置くこと、関心のある天然のタンパク質の細
胞外への輸送をシグナル配列を用いて促進すること、あるいは対象の宿主細胞が
標準的に生産しているタンパク質のコピー数を増加させることを含むが、それら
に限定されない。したがって、本発明はまた、そのような発現が宿主細胞に非天
然型である遺伝子の因子の使用、あるいは宿主細胞では通常観察されない挙動で
機能するように操作された天然型の因子の使用を含む発現である限り、そのよう
な同種のタンパク質の組み換え生産も含む。
細胞による発現した産物の分解可能性の程度を最小にするため、産物は細胞から
分泌されることが望ましい。望ましい態様では、関心のある遺伝子は、発現した
産物を細胞の分泌経路に導くことができるシグナルあるいはリーダーペプチドの
ような前領域のDNA配列に融合される。その前領域はどんな生物体の分泌タンパ
ク質の遺伝子に由来してもよく、あるいは望ましくは選ばれた種のまたは選ばれ
たタンパク質の天然型の前領域である。それは哺乳類のインターフェロン−ガン
マの分泌シグナル配列、レイシュマニア メキシカーナ(Leishmania mexicana
)由来の分泌性アシッドホスファターゼの分泌シグナル配列、レイシュマニア
ドノバニ(Leishmania donovani)由来の溶解性アシッドホスファターゼの分泌
シグナル配列、L.タレントラエ(L. tarentolae)の9P63遺伝子の分泌シグナル
配列、あるいは他の分泌タンパク質の分泌シグナルを含むがこれに限定されない
。
る安定に形質転換された細胞系列をも提供する。 本発明のさらなる特徴をさらに以下に詳細に記述する。
述べる産物や態様と同じものに制限されるわけではない。
る前癌Miz-1の発現 前癌Miz-1遺伝子のpIRベクターへのクローニング: pIRベクター(Hubel A.およびBeverley、1999){Wirtz、Lealら、1999 ID:
267}は、 ・複製のためのColE1オリジンおよび大腸菌(E. Coli)中での増殖と選択のため
のアンピシリン耐性遺伝子(Amp)、 ・所望するタンパク質遺伝子のmRNAのトランススプライシングおよびポリアデニ
ル化シグナルを伴う、レイシュマニア(Leishmania)のcys2(システイン プロ
テイナーゼ)およびLPG1(グリコシルトランスフェラーゼ)の遺伝子間領域に側
面を接した、遺伝子カセット挿入のためのBgl IIサイト、 ・レイシュマニア(Leishmania)のLPG1およびDHFR-TS(ジヒドロフォレート レ
ダクターゼ−チミジレート シンターゼ)遺伝子の遺伝子間領域を側面に接した
、レイシュマニア(Leishmania)に抗生物質ノルセオスリシン(nourseothricin
)耐性を与える、トランスポゾンTn7由来のストレプトスリシン アセチルトラ
ンスフェラーゼ(sat)遺伝子、 ・sat耐性マーカーに連結された発現シグナルを一括し、そしてssu-ボックスの
間のDNAを、相同組み換えに続く組み換えpIRベクターの制限酵素SmiIによる切断
により、レイシュマニア タレントラエ(Leishmania tarentolae)のゲノム中
に統合することを可能にする、レイシュマニア(Leishmania)の小リボソームサ
ブユニットRNA(ssu)のためのおよそ1kb(5'と3'の部分)の遺伝子の二つの
セグメント、を含む。
によってMiz-1タンパク質のN'末端に余分のヘキサヒスチジンタグの遺伝子情報
が与えられているプラスミド原料(pFH50)からPCRにより増幅した。以下のプラ
イマーは、2.6 kbのPCR断片の両末端に制限酵素Bcl Iの認識配列を導入するため
に用いた: ・F2460 miz-1フォーワードプライマー: CTG CAG TGA TCA GTC GCC ACC ATG CG
G GGT TCT CAT CAT CAT C(配列番号1、開始コドンは下線で示した)および、 ・F2461 miz-1リバースプライマー: CTG CAG TGA TCA AGA TCT TCA CTC GGC AG
G CGG GGG AC(配列番号2、終止コドンは下線で示した)。
を適用した。PCR断片の末端ははじめにBcl Iで切断し、そしてそのPCR産物はBgl
IIで直線化したベクターpIRに連結した。連結反応混合物による大腸菌(E.coli
)TG1の形質転換に続いて、正しい方向付けでmiz-1が挿入された組み換えpIRを
含むクローン(pIRmiz1)は、pIRのBgl IIサイトの上流にアニーリングするプラ
イマーF2718(pIR-Bgl II-フォーワード)CTG CAC CGT GGT CGA CTG C(配列番
号3)およびプライマーF2461(miz-1リバース、先述した)を用いてコロニー−
PCRにより同定した。プラスミドDNAは陽性のクローンから抽出し、pIRmiz1の正
しい構造と配列を制限解析および配列解析によって確認した。大スケールのプラ
スミド調製はプラスミド マキシ キット(Plasmid Maxi Kit)(Qiagen)によ
り行った。
質転換: ssu−クラスター中へのmiz-1遺伝子の染色体統合では、約10μgのpIRmiz1
を制限酵素SmiIで切断し、0.5 μg/μlに再懸濁し、エレクトロポレーションに
よりレイシュマニア タレントラエ(Leishmania tarentolae)細胞に導入した
。
)を用いて発売元のプロトコルに従って行った。形質転換ごとに1.0 mlの増殖中
のL.タレントラエ(L. tarentolae)のBHI肉汁および5μg/mlヘミン中の培養液
(OD600 = 1.0)を遠心分離(1分間、5000xg)により回収し、ハイポ
オスモラリック(hypoosmolaric)緩衝液(HOP)(Eppendorfカタログ番号4308
070 501)中で一度洗浄し、1.0 mlのHOP中に再懸濁した。形質転換ごとに0.4 ml
のこの細胞懸濁液を用いた。細胞は氷上に10分間保ち、DNAを加えて、キュベ
ット中でd = 2 mmで1000 Vおよび160μsec.でエレクトロポレーションを行った
。パルスに続いて細胞は氷上で10分間保ち、5μg/mlヘミンを含む10 ml BHI中に
再懸濁し、26℃でインキュベートした。100μg/mlノウルセオスリシン(nourseo
thricin)による選択を20時間後に行い、形質転換された系列が限界希釈法によ
り選択した。形質転換L.タレントラエ(L. tarentolae)::pIRmiz1細胞の期
待した染色体構造(異種のmiz-1遺伝子の発現ユニットがssuクラスターに統合さ
れたもの)は、3つの特異的なプライマー対を用いてこれらの細胞のゲノムDNA
のPCR診断によって確認した。一つ目のプライマー対は、組み換え領域の内側(p
IRのsat遺伝子)とアニーリングするsatフォーワードプライマーF2999(CCT AGT
ATG AAG ATT TCG GTG ATC)(配列番号4)および組み換え領域の外側(pIR上
にはない3' ssu遺伝子領域)とアニーリングするssuリバースプライマーF3002(
CTG CAG GTT CAC CTA CAG CTA C)(配列番号5)からなり、天然型対照標準に
は現れない特徴的な2.3 kbpフラグメントが生じる。他の二つのプライマー対は
、pIRmiz1の統合されたセグメントに特異的で、特異的な2.6 kbp miz-1 PCRフラ
グメントを生じる、先述したF2460 miz-1フォーワードプライマーおよびF2461 m
iz-1リバースプライマーを含む。三番目のプライマー対は、先述したF2460 miz-
1フォーワードプライマーおよびF3000 satリバースプライマー(GGC TAG TTA GG
C GTC ATC CTG A)(配列番号6)であり、satおよびmiz-1遺伝子を包含する特徴
的な4 kbpのPCRフラグメントを生じる。
に連なる領域を、形質転換L.タレントラエ(L. tarentolae)::pIRmiz1細胞の
ゲノムDNAから、先述したF2718 pIR-Bgl II-forw.およびpIRmiz1のBgl IIサイ
トと側面を接するF2719 pIR-Bgl II-rev.(GGC CGA TTC ATT AAT GCA GGA C)(
配列番号7)のプライマー対を用いてPCR増幅した。3 kbpのPCR産物は配列解析
し、予想したヌクレオチド配列と一致することを見いだした。
ifco)中で培養した。細胞は24穴プレートを用いて静置培養するか、2リットル
フラスコを用いて活発に混合する培養によって培養した。振盪速度は50 rpmある
いはそれ以下に設定した。培養物の扱いは(Alfonzoら、1998)およびその参考
文献に記されている標準的な方法に従って行った。
ミンを含む10 mlのBHI肉汁に植え付け、26℃でインキュベートした。2mlの増殖
中の培養液をOD600が1.0を示したところで遠心分離(1分間、10000x gで)によ
って回収し、ペレット状の細胞を200 μlのラエムリ(Laemmli)サンプル緩衝液
中で溶菌し、10 μlのサンプルを用いてタンパク質電気泳動を10% SDS-PAGE上で
標準的な手順に従って行った。Miz-1タンパク質は、Miz-1のN末端に導入したヘ
キサヒスチジンタグに対するモノクローナル抗体(Qiagenカタログ番号34610)
および精製Miz-1に対して作製したウサギ ポリクローナル抗体を用いて、ウエス
タンブロッティングによって同定した。
胞について、列Tは全溶菌液、列Pは1%トリトンX-100不溶画分を、および列S
は1%トリトンX-100可溶画分を示す。列Mは分子量マーカーを、列Cは対照標準
細胞の溶菌液を示す。
(Epo)の例 レイシュマニア タレントラエ(Leishmania tarentolae)T7 RNA-ポリメラー
ゼ(T7 RNAP)株の構築。
ら、;TobinおよびWirth、1992;Wirtzら、1999)からSV40ウイルスの核局在シ
グナルに融合されたT7 RNAP遺伝子をBgl IIおよびBamH Iサイトで切り取り、pIR
-SATベクターのBgl II サイト中に標準的な分子生物学的手法を用いてサブクロ
ーニングして構築した。オープンリーディングフレームの完全性は配列解析によ
って確かめた。レイシュマニア タレントラエ(Leishmania tarentolae)を、
得られたベクターを用いて実施例1で記述したように形質転換し、薬物耐性クロ
ーンを選択した。T7 RNAPタンパク質の存在は、形質転換した細胞の全溶菌液か
ら、T7 RNAPに対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングに
よって同定した。
ルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、ヒグロマイシン ホスホトランス
フェラーゼに置き換え、およびT7プロモータをSSU領域の5'に導入した。シグナ
ル配列を含むヒト エリスロポエチン前駆物質の完全長をコードする配列(EMBL
アクセス番号;X02158)をプラスミド源(pcDNA3.1/GS-epo, Invitrogen)より
、プライマーの両末端に制限酵素BamH Iの配列を含むプライマーを用いて、標準
的な手法によりPCRにより増幅した。Epo遺伝子をベクターpIR-Hyg中のBgl IIサ
イト中に挿入するためには、標準的な分子クローニング技術を用いた。陽性クロ
ーンの同定は、上に述べたように行った。得られたプラスミドは、DNAがエピソ
ーム性に保持されることを確実にするために、直線化処理は行わなかったことを
除いては実施例1に記述したように、レイシュマニア タレントラエ(Leishman
ia tarentolae)T7 RNAP株にエレクトロポレーションした。陽性クローンは実施
例1に記述したように選択したが、但し選択には50μg/mlのヒグロマイシンを
使用した。耐性クローンを選択し、50μg/mlヒグロマイシンを含むBHI培地中に
分散し、細胞並びに培養上清も特異的なポリクローナル抗体を用いてウエスタン
ブロッティングによって解析した。その結果は図3Bに示す。列Tは培地の上清
がポリクローナル抗体と明確に反応するタンパク質を含むことを示す。上清中に
回収されたタンパク質はゆっくりと泳動した。この挙動はEpoに典型的な転写後
グリコシル化によるものであり、ヌロミダーゼ(nuromidase)による脱グリコシ
ル化によってより小さい種が現れた結果により確認した。列M(図3B)は分子
量マーカーを示し、列Cは対照標準細胞の溶菌液を示す。
統的な証拠のまとめとリボソームRNA配列解析からの知見(The major lines of
metazoan evolution: summary of traditional evidence and lessons from rib
osomal RNA sequence analysis)。EXS. 63, 1-30。
と特性の記述。ミトコンドリアに関連するレイシュマニア タレントラエ由来の
リボヌクレアーゼ(Purification and characterization of MAR1. Amitochondr
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流中で毒性遺伝子産物の発現を誘発できるベクターと前期トリパノソーマ ブル
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g)。
体レイシュマニア マジョールの安定なトランスフェクションは染色体外の複製
と発現に十分な30キロベースの領域を描写する(Stable transfection of the
human parasite leishmania major delineates a 30-kilobase region suffici
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シュマニア メキシカーナのアマスティゴートでのベータ−ガラクトシダーゼお
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actosidase and GFPin amastigotes of Leishmania mexicana)。ドイツにおけ
るトリパノソーマとレイシュマニアに関する研究の第2回コロキウム予稿集(Ab
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子の異常な配置を持つ(Leishmania major Friedlin chromosome 1 has an unus
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テリアDNAプラスミドオリゴマーの自主的な複製(Autonomous replication of b
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)。トリパノソーマ ブルセイのエピソームは広い範囲のトリパノソマチド中で
染色体外因子として存在できるが、安定な複製には異なる要求性を示す(An epi
some of Trypanosoma brucei can exist as an extrachromosomal element in a
broad range of trypanosomatids but shows different requirements for sta
ble replication)。Mol. Biochem. Parasitol. 66, 153-156。
セッシング(mRNA processing in the Trypanosomatidae)。Experientia 47, 1
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H1遺伝子の破壊はリボヌクレアーゼHの二つの活性型を失う結果となる(Disrupt
ion of the Crithidia fasciculata RNH1 gene results in the loss of two ac
tive forms of ribonuclease H)。Nucleic Acids Res. 23, 2526-2530。
シュマニアの一過性および安定なトランスフェクション(Transient and stable
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リパノソーマ ブルセイの安定な形質転換(Stable transformation of Trypano
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ィのための配列挿入を目的とするベクター(A sequence insertion targeting v
ector for Leishmania enriettii)。J. Biol. Chem. 267, 4742-4758。
ノソームでのバクテリオファージT3およびT7 RNAポリメラーゼに媒介される遺伝
子発現(Gene expression mediated by bacteriophage T3 and T7 RNA polymera
se in transgenic trypanosomes)。Nucleic Acids Res. 22, 3887-3894。
ソーマ ブルセイ中での条件付き遺伝子ノックアウトおよび優性−劣性遺伝学の
ための厳しく規定された誘導発現システム(A Tichtly regulated inducible ex
pression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative ge
netics in Trypanosoma brucei)[過程の引用]。Mol. Biochem. Parasitol. 99,
89-101。
ア細胞での生物学的に活性なヒトp53の発現:組み換えタンパク質を生産する新
規な真核細胞システム(The expression of biologically active human p53 in
Leishmania cells: a novel eukaryotic system to produce recombinant prot
eins)。Nucleic Acids Res. 23, 4073-4080。
クターからのタンパク質発現を示す。 キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)種における異種遺伝子発現のための
エピソームプラスミドベクターの概略の表示。そのプラスミドは原核生物の複製
オリジンと原核生物の耐性マーカー遺伝子(Amp)を含む。関心のある遺伝子は
宿主の遺伝子間の領域および真核生物の選択マーカー遺伝子(Hyg)に側面を接
している。転写はランダムに開始し、ランダムな長さの転写物を生じる。
に媒介されるタンパク質発現を示す。 ファージのポリメラーゼに基づき、そしてTet応答因子に制御されるキネトプ
ラスチダエ(Kinetoplastidae)における異種遺伝子発現の概略の表示。T7 RNA
ポリメラーゼおよびTetリプレッサー遺伝子は活発に転写される座、望ましくは
、強く転写される遺伝子クラスターの中に統合される。関心のある遺伝子は、T7
プロモーターおよびTet応答因子の制御下で、ゲノムの転写的に静止している領
域に統合される。関心のある遺伝子の転写は培地へのテトラサイクリンの添加に
より開始する。トランススプライシング、ポリアデニル化、および成熟mRNAの関
心のあるタンパク質への翻訳がつづく。
B)を発現したレイシュマニア タレントラエ(Leishmania tarentolae)細胞の
ウエスタンブロットを示す。 前癌(proto-oncogen)Miz-1を発現したレイシュマニア タレントラエ(Leis
hmania tarentolae)細胞のウエスタンブロット(A)。pIR-miz構築物によって
形質転換された細胞は、抗生物質耐性によって選択され、100 mg/Lのノウルセオ
スリシン(nourseothricin)を含むBHI肉汁中に分散した。細胞は遠心分離によ
って回収し、ラエムリ(Laemmli)バッファー中で直接煮沸するか、あるいは最
初にトリトンX-100で可溶および不溶画分に分離した。その溶菌液は10% SDS-PAG
Eで分離し、ニトロ−セルロースに転写し、組み換えMizをポリクローナル抗miz-
1抗体によって調べた。 列T(図 3A)は、mizを発現しているL.タレントラエ(L. tarentolae)細胞の
全溶菌液を示す。 列P(図3A)は、mizを発現しているL.タレントラエ(L. tarentolae)細胞の
1%トリトンX-100不溶画分を示す。 列S(図 3A)は、mizを発現しているL.タレントラエ(L. tarentolae)細胞
の1%トリトンX-100可溶画分を示す。 列Mは、分子量マーカー、列Cは対照標準細胞の溶菌液を示す。 ヒト エリスロポエチンを発現したレイシュマニア タレントラエ(Leishmani
a tarentolae)細胞の培養上清のウエスタンブロット(B)。エリスロポエチン
の発現のために、200マイクロリットルの培養上清を10%TCA(Tri-Chlor-Acetic
acid:トリクロロ酢酸)により沈殿させ、15% SDS-PAGE上で分離し、ニトロ−セ
ルロース上に転写して組み換えエリスロポエチンをポリクローナル抗エリスロポ
エチン抗体で調べた。 列T(図 3B)は、ヒトEpo.を発現しているL.タレントラエ(L. tarentolae
)の培養上清の異なる量を示す。 列Mは分子量マーカーを、列Cは対照標準細胞の溶菌液を示す。
Claims (27)
- 【請求項1】 非病原性キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)型の宿主
およびプロモーターに機能可能であるように連結した異種のタンパク質をコード
する核酸配列を含む発現および送達システム。 - 【請求項2】 非病原性キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)型宿主が
レイシュマニア タレントラエ(Leishmania tarentolae)、クリシジア ファ
スシキュラタ(Crithidia fasciculata)、ワルラセイナ インコンスタンス(W
allaceina inconstans)、レプトモナス コルロス(Leptomonas collos)、レ
プトモナス(Leptomonas)sp. Cfm、レプトモナス(Leptomonas)sp. Nfm、また
はレプトモナス セイモウリ(Leptomonas seymouri)からなるグループから選
択される、請求項1に記載の発現および送達システム。 - 【請求項3】 異種の核酸配列が、活発に転写されるキネトプラスチダエ(
Kinetoplastidae)遺伝子の5’および3’UTRを側面に接した、請求項1ま
たは請求項2に記載の発現および送達システム。 - 【請求項4】 異種の核酸配列が、活発に転写されるキネトプラスチダエ(
Kinetoplastidae)遺伝子の、効果的な分泌、トランススプライシング、および
ポリアデニル化のためのシグナル配列を側面に有する、請求項1から3のいずれ
か一項に記載の発現および送達システム。 - 【請求項5】 異種の核酸配列が、線状または環状のベクターあるいはプラ
スミドに組み込まれた、請求項1から4のいずれか一項に記載の発現および送達
システム。 - 【請求項6】 二つないしはそれ以上のベクターあるいはプラスミドが組み
込まれた、請求項1から5のいずれか一項に記載の発現および送達システム。 - 【請求項7】 異種のタンパク質が、カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノール
オキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナー
ゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、
プロテアーゼおよびそのほかの蛋白質分解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキ
シペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン分解
酵素、アミラーゼ グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラ
ーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼお
よびデオキシリボヌクレアーゼからなるグループから選択された酵素である、請
求項1から6のいずれか一項に記載の発現および送達システム。 - 【請求項8】 非病原性キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)型宿主ま
たは組み込まれたベクターもしくはプラスミドが選択可能なマーカー遺伝子を含
む、請求項1から7のいずれか一項に記載の発現および送達システム。 - 【請求項9】 マーカー遺伝子が、ヒグロマイシンと共同したヒグロマイシ
ン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子(HYG)、G418と共同したネオマイ
シン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子(NEO)、フレオマイシンと共同した
ストレプトアロテイクス ヒンドゥスタヌス(Streptoalloteichus hindustanus
)BLE遺伝子(BLE)の産物およびナーセオスリシン(nourseothricin)と
共同したストレプトスリシン アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子
(SAT)からなるグループから選択される、請求項8に記載の発現および送達
システム。 - 【請求項10】 プロモーターが活発に転写されるキネトプラスチダエ(Ki
netoplastidae)遺伝子プロモーターあるいは強力に転写を開始する異種のプロ
モーターである、請求項1から9のいずれか一項に記載の発現および送達システ
ム。 - 【請求項11】 異種の核酸の転写が、組み込まれそして発現されたリプレ
ッサー遺伝子に関連するリプレッサー応答因子によって制御される、請求項1か
ら10のいずれか一項に記載の発現および送達システム。 - 【請求項12】 少なくとも1コピーの異種の核酸が、キネトプラスチダエ
(Kinetoplastidae)宿主細胞の活発に転写される遺伝子クラスター内に位置す
る、請求項1から11のいずれか一項に記載の発現および送達システム。 - 【請求項13】 活発に転写される遺伝子クラスターがrRNA遺伝子クラスタ
ーである、請求項12に記載の発現および送達システム。 - 【請求項14】 異種の核酸がエピソーム的に転写されるプラスミド中に位
置する、請求項1から11のいずれか一項に記載の発現および送達システム。 - 【請求項15】 前にプロモーターが置かれ、活発に転写されるキネトプラ
スチダエ(Kinetoplastidae)遺伝子の5’および3’UTRを側面に接した異
種の核酸を含むベクターまたはプラスミド。 - 【請求項16】 活発に転写されるキネトプラスチダエ(Kinetoplastidae
)遺伝子の効果的な分泌、トランススプライシングおよび/またはポリアデニル
化のためのシグナル配列を含む、請求項15に記載のベクターまたはプラスミド
。 - 【請求項17】 選択マーカー遺伝子を含む、請求項15または16に記載
のベクターまたはプラスミド。 - 【請求項18】 異種の核酸で安定に形質転換された、請求項1または2に
記載の非病原性キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)細胞系列。 - 【請求項19】 請求項15から17のいずれかに記載の異種の核酸を含む
ベクターまたはプラスミドで安定に形質転換された、請求項1または2に記載の
非病原性キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)細胞系列。 - 【請求項20】 a)選択可能なマーカーの遺伝子をコードするDNA配列
および、 b)活発に転写される遺伝子の中に機能可能であるように連結および統合された
関心のあるタンパク質をコードする異種のDNA配列、 を含む、安定に形質転換された非病原性キネトプラチダエ(Kinetoplastidae)
細胞系列を、異種遺伝子の構成的な発現のための選択培地上で培養することを含
む、請求項1または2に記載のキネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)宿主細
胞で異種のタンパク質を産生する方法。 - 【請求項21】 a)選択可能なマーカー遺伝子をコードするDNA配列お
よび、 b)エピソーム的に維持されるプラスミドDNA中に、活性なプロモーターとと
もに機能可能であるように連結および統合された関心のあるタンパク質をコード
する異種のDNA配列、 を含む、安定に形質転換された非病原性キネトプラチダエ(Kinetoplastidae)
細胞系列を、異種遺伝子の構成的な発現のために選択培地上で培養することを含
む、請求項1または2に記載のキネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)宿主細
胞で異種のタンパク質を産生する方法。 - 【請求項22】 a)活発に転写される遺伝子クラスターに統合された、異
種のRNAポリメラーゼをコードするDNA配列および、 b)活発に転写される遺伝子クラスターに統合された、選択可能なマーカーをコ
ードするDNA配列および、 c)活発に転写される遺伝子クラスターに統合された、転写リプレッサー遺伝子
をコードするDNA配列および、 d)異種のRNAポリメラーゼプロモーターおよびリプレッサー応答因子を前に
おく、所望のタンパク質をコードする異種のDNA配列、 を含む、安定に形質転換された非病原性キネトプラチダエ(Kinetoplastidaee
)細胞系列を、選択可能なマーカーとともに培養し、異種のリプレッサーの阻害
剤によって異種遺伝子の発現を誘導することを含む、請求項1または2に記載の
キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)宿主細胞で異種のタンパク質を産生す
る方法。 - 【請求項23】 異種のRNAポリメラーゼがT7またはT3 RNAポリ
メラーゼである、請求項22に記載の方法。 - 【請求項24】 リプレッサーが異種のTetまたはLacリプレッサーで
ある、請求項22に記載の方法。 - 【請求項25】 異種のタンパク質の発現のための、請求項1に記載の発現
および/または送達システムの使用。 - 【請求項26】 非病原性キネトプラスチダエ(Kinetoplastidae)型宿主
によるトランスフェクションによる植物細胞および動物細胞への異種タンパク質
の送達のための、請求項1に記載の発現および/または送達システムの使用。 - 【請求項27】 異種の真核生物のタンパク質の発現および/または送達の
ための、請求項1に記載の発現および/または送達システムの使用。
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