JP2003513632A

JP2003513632A - 非病原性キネトプラスチダエのタンパク質発現システム

Info

Publication number: JP2003513632A
Application number: JP2001535578A
Authority: JP
Inventors: アレクサンドロフ，キリル; グラン，マティアス
Original assignee: イェーナ・バイオサイエンス・ゲーエムベーハー
Priority date: 1999-11-05
Filing date: 2000-11-02
Publication date: 2003-04-15
Also published as: ATE386128T1; EP1242602A1; EP1242602B1; WO2001032896A1; ES2301495T3; AU1997901A; CA2388151A1; DE60038045D1; CA2388151C; DE60038045T2; DK1242602T3

Abstract

(57)【要約】本発明の目的は、非病原性キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）寄生体（レイシュマニアタレントラエ（Leishmania tarentolae）、クリシジアファスシキュラタ（Crithidia fasciculata）、ワラセイナインコンスタンス（Wallaceina inconstans））（フォーマープロテオモナスインコンスタンス（former Proteomonas inconstans））、（レプトモナスコロス（Leptomonas collos）、レプトモナス（Leptomonas）sp. Cfm、レプトモナス（Leptomonas）sp. Nfm、あるいはレプトモナスセイモウリ（Leptomonas seymouri））を培養し、in vitroの組み換えタンパク質生産の方法である。これは、安価な培地上でこれらの生物体の大スケール培養を許容する、いくつかの種の培養条件の説明を含む。本発明の方法は、組み換えタンパク質の発現が可能な安定な形質転換された生物体の産出のための方法論と構築物の説明を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組み換えタンパク質の産生に有用な
宿主細胞に関する。特に、本発明は組み換えタンパク質、特に酵素の高い水準の
発現に使用可能な、キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）類の選択された非
病原性の種の宿主細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】組み換え技術は遺伝子をコードする異種のＤＮＡを多く
の原核および真核生物に転移するのにうまく用いられてきた。現今では、原核お
よび真核の宿主を含めて、ある与えられたタンパク質の産生のために選択できる
、発現システムの選択可能性がある。適切な発現システムの選択においては、し
ばしば関心のあるタンパク質を活性な状態で十分な量を産生する宿主細胞の能力
のみならず、該タンパク質の使用目的によって大部分が決定されるだろう。

【０００３】プロモーター、ポリアデニル化サイト、３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲｓ
），のような十分な因子と共に希望するタンパク質遺伝子を、ゲノムあるいはエ
ピソームへ統合することによって異種の遺伝子発現を媒介することができる。こ
の技術は、バクテリア、酵母、糸状菌類、培養細胞あるいは昆虫および哺乳類の
組織全体のようなおおくの種類の細胞でうまく適用されている。これらの発現シ
ステムのそれぞれは、タンパク質収率、純度およびコストに関して特有の有用性
と欠点がつきものであり、タンパク質発現のための万能な宿主は存在しない。

【０００４】タンパク質発現宿主が満たさなければならないいくつかの基準宿主は安価な培地上で容易に培養でき、標準的な分子生物学的な手法によって
容易に操作できるべきである。さらに、宿主は活性なタンパク質を大量に産生し
、その抽出を許容すべきである。

【０００５】キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）は、地上あるいは水中の環境で見つ
かる原始的な鞭毛状の原生動物である。それらのいくつかは植物から脊椎動物の
範囲の生物に病気を引き起こす。キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）の進
化的な位置づけおよび種の分類型は他に記載されている（たとえば、AdoutteとP
hilippe, 1993）。キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）の二つの主な亜種は
、レイシュマニア（Leishmania）およびトリパノソマチダエ（Trypanosomatidae
）である。キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）は、ＲＮＡエディティング
（Stuart, 1991）、ｍＲＮＡトランススプライシング（PerryおよびAgabian, 19
91）、タンパク質へのグリコシルホスファチジルイノシトール−アンカリング（
Krakow ら、1986）、抗原性変異（BorstおよびRudenko, 1994）、およびテロマ
ーの構成（Blackburn, 1991）のような基本的な分子のあるいは細胞の現象の研
究に特に大切であった。真核生物の中では独特であるトリパノソマチダエ（Tryp
anosomatidae）の特徴は多シストロン性の転写単位である。これらの単位では、
一連の遺伝子が一列に並んで配置された形であり、ＲＮＡポリメラーゼによって
単一の50-100kbの転写物として転写される（Myler ら, 1999; Teixeira, 1998
）。そのような転写物はその後、トランススプライシングとして知られる過程に
よる５’末端へのキャップされたミニ−エキソンの付加につづいて３’末端の切
断とポリアデニル化によって、単一遺伝子のｍＲＮＡへと加工される。キネトプ
ラスチダエ（Kinetoplastidae）の遺伝子発現およびその制御は他の真核生物の
それらとは大きく逸脱しているように見える。ごくわずかな場合、たとえばトリ
パノソーマブルセイ（Trypanosoma brucei）では、ＶＳＧおよびＰＡＲＰプロ
モーターのような時期特異的プロモーターが同定された（Barry ら, 1998; Hotz
ら, 1998）。これまでに報告されたすべての他の真核生物とは反対に、これら
のプロモーターはタンパク質をコードする遺伝子についてはＲＮＡポリメラーゼ
ＩＩではなくＲＮＡポリメラーゼＩを採用する（Teixeira, 1998）。レイシュマ
ニア（Leishmania）種のケースではリボソーマルＲＮＡプロモーターを除けばプ
ロモーターに類似する因子が同定されておらず、現今のモデルによるとＲＮＡポ
リメラーゼＩＩによるレイシュマニア（Leishmania）の転写開始はランダムな過
程である。そのような遺伝子の構成の結果から、遺伝子制御のほとんどは転写後
の段階で起こる（Teixeira, 1998）。

【０００６】９０年代初期からキネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）研究について逆遺
伝学（reversed gennetics）の方法論の確立について大きな進歩があった。最初
は、トリパノソーマクルジィ（Trypanosoma cruzi）において一過性の外来遺
伝子の発現を許容するベクターが報告された（LuおよびBuck, 1991）。NEO遺伝
子を薬物耐性マーカーとしてトランスファーベクターに供給した形質転換は安定
となり、つづいていくつかの他の種についても報告された（Coburnら, 1991）。
DNA構築物の移行はエレクトロポレーションあるいは粒子衝突によって成功した
（BeverleyおよびClayton, 1993; Sbicego ら, 1998）。キネトプラスチダエ（K
inetoplastidae）は、外来およびゲノム由来のプラスミドの両方を複製できるこ
とが示された（Coburnら, 1991; Patnaik ら, 1994; ten Asbroek ら,1993）（P
apadopoulou ら, 1994）。機能性の遺伝子の一方もしくは両方の対立遺伝子の相
同組み換えにより欠失させ、そして新しい遺伝子をゲノム中に統合できることが
明らかにされた（Cruzら、1991; RayとHines, 1995）。レイシュマニア（Leishm
ania）およびトリパノソマチダエ（Trypanosomatidae）中で細胞質のまたは分泌
タンパク質の発現を許容する様々な方法が開発された。これらの構築物は大まか
に３つの分類： A）エピソームのプラスミドが、レイシュマニア（Leishmania）のケースにおい
て定義されたプロモーターを持たないもの、あるいはトリパノソーマブルシィ
（Trypanosoma bruci）のケースにおいて時期特異的なプロモーターをもたない
もの（LeBowitzら、1990）（La Flammeら、1996）、 B）活発に転写される遺伝子クラスター（チューブリン遺伝子、小サブユニット
リボソームRNA遺伝子、大サブユニットリボソームRNA遺伝子）中に統合される構
築物（Misslitz A. ら、1999; TobinおよびWirth、1992; Wirtzら、1999）、 C）外来のポリメラーゼ遺伝子の活発に転写される座への統合と、目的遺伝子の
このポリメラーゼ（特にT7またはT3ポリメラーゼ）による転写、に分けることができる。

【０００７】それらの研究方法を用いていくつかの遺伝子は発現し、そしてその産物は機能
的に活性であることが明らかにされた：・レイシュマニアドノバニ（Leishmania donovani）中でのp53（Zhangら、199
5）、・レイシュマニアマジョール（Leishmania major）中でのインターフェロン−
ガンマ（TobinおよびWirth、1992）、・トリパノソーマクルジィ（Trypanosoma cruzi）中でのインターロイキン−
２（La Flammeら、1996）、・レイシュマニアマジョール（Leishmania major）およびレイシュマニアド
ノバニ（Leishmania donovani）中でのGFP（Haら、1996）、・レイシュマニアマジョール（Leishmania major）中でのβ−ガラクトシダー
ゼ（LeBowitzら、1990）、・トリパノソーマブルセイ（Trypanosoma brucei）中でのルシフェラーゼ（Bi
ebingerら、1997）、・トリパノソーマブルセイ（Trypanosoma brucei）中でのT7およびT3ポリメラ
ーゼ（Witzら、1994）。

【０００８】従来の技術は、固体（プレート）上および液体培地（フラスコまたはファーメ
ンター）上での生育を含む、多くのキネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）のi
n vitro培養の方法に関連する出版物も含む（Alfonzoら、１９９８）。ほとんど
の場合では、培地は必須アミノ酸の選択されたものおよび微量元素を含み、子ウ
シ血清またはウシ血液が添加された（BeverleyおよびClayton、１９９３；Hill
およびFahey、１９８７）。いくつかの種は血清の非存在下で単純な非合成培地
で生育することが示された。もっともよく記述され研究された、レイシュマニア
タレントラエパロット（Leishmania tarentolae Parrot）（ヤモリの寄生体
）、タレントラマウリタニカ（Tarentola mauritanica）およびタレントラ
アニュラリス（Tarentola annularis）（Elwasila、1988）；あるいはカである
キュレックスピピエンス（Culex pipiens）の寄生体であるクリシジアファ
スシウラタレゲール（Crithidia fasciulata Leger）（Leger、1902）は、bra
in heart infusion（BHI）培地（Alfonzoら、1998）またはLuria-Bertani（LB）
培地上で培養できる。これらの種は大きなファーメンター中でよく育つこともま
た示された。レイシュマニアタレントラエ（Leishmania tarentolae）は、15
L標準ファーメンター中で後静止期に1mlあたり2x10⁸ 細胞の密度に到達し、１L
の培養液あたり10 g乾燥細胞重量を得ることができた（Alfonzoら、1998）。

【０００９】しかしながら、キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）以外の種−特にトリ
パノソマチダエ（Trypanosomatidae）およびレイシュマニア（Leishmania）−は
、それに伴う健康上のリスク、遅い生育速度あるいは一般的でない、高価な培地
のために、異種のタンパク質発現について有用であることは示されていない。

【００１０】理想的な発現および送達システムは、プロテアーゼ、毒素、そしてその他の内
生的に大量に合成され、分泌される宿主のタンパク質が実質的になく、そして、
高いタンパク質発現のレベルに達することができるものである。

【００１１】従来の技術では、すべての実験および研究は病原性の種をin vitroまたはin v
ivoで用いており、組み換えタンパク質を単離する試みはなされていなかった。本発明者らの実験は、所望する異種のタンパク質発現がキネトプラスチダエ（
Kinetoplastidae）の非病原性の種、特にレイシュマニアタレントラエ（Leish
mania tarentolae）、クリシジアファスシキュラタ（Crithidia fasciculata
）、ワラセイナインコンスタンス（Wallaceina inconstans）（旧名プロテオ
モナスインコンスタンス（Proteomonas inconstans））、レプトモナスコロ
ス（Leptomonas collos）、レプトモナス（Leptomonas）sp. Cfm、レプトモナス
（Leptomonas）sp. Nfm、あるいはレプトモナスセイモウリ（Leptomonas sey
mouri）、を用いて確立できることを示した。

【００１２】上に示した種は他のキネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）と比較して安価
な培地上で優れた生育速度を示し、したがってタンパク質生産のための宿主とし
ての有用性の証拠となった。

【００１３】したがって本発明の目的は、組み換えタンパク質、特に酵素の高レベルの発現
に用いることができる、非病原性キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）の新
しい発現および送達システムおよび／またはタンパク質発現宿主を提供すること
にある。

【００１４】本発明の目的は、異種のタンパク質をコードする核酸配列を含んでいる、レイ
シュマニアタレントラエ（Leishmania tarentolae）、クリシジアファスシ
キュラタ（Crithidia fasciculata）、ワラセイナインコンスタンス（Wallace
ina inconstans）（旧名プロテオモナスインコンスタンス（Proteomonas inco
nstans））、レプトモナスコロス（Leptomonas collos）、レプトモナス（Lep
tomonas）sp. Cfm、レプトモナス（Leptomonas）sp. Nfm、およびレプトモナス
セイモウリ（Leptomonas seymouri）、のような非病原性キネトプラスチダエ
（Kinetoplastidae）宿主細胞によって成し遂げられる。特に好ましいものは下記の通りである：昆虫カロコリスセクスグッタトゥス（Calocoris sexguttatus）（ヘミプテ
ラ（Hemiptera）、ミリダエ（Miridae））の寄生体である、ワラセイナインコ
ンスタンス（Wallaceina inconstans）（旧名プロテオモナスインコンスタン
ス（Proteomonas inconstans））、これは小サブユニットリボソームRNA遺伝子
（Gene Bankアクセス番号AF153044）の部分配列で特徴づけられる。

【００１５】昆虫ナビキュラフラボマルジナタ（Nabicula flavomarginata）（ヘミプテ
ラ（Hemiptera）、ナビダエ（Nabidae））の寄生体であるレプトモナス（Leptom
onas）sp. Cfm、これは小サブユニットリボソームRNA遺伝子（Gene Bankアクセ
ス番号AF15304１）の部分配列で特徴づけられる。

【００１６】昆虫ジェルリス（Gerris）sp.（ヘミプテラ（Hemiptera）、ジェルリダエ（Ge
rridae））の寄生体であるレプトモナスコロソーマ（Leptommonas collosoma
）、これは小サブユニットリボソームRNA遺伝子（Gene Bankアクセス番号AF1530
38）の部分配列で特徴づけられる。

【００１７】昆虫ナビキュラフラボマルジナタ（Nabicula flavomarginata）（ヘミプテ
ラ（Hemiptera）、ナビダエ（Nabidae））の寄生体であるレプトモナス（Leptom
monas）sp. Nfm、これは小サブユニットリボソームRNA遺伝子（Gene Bankアクセ
ス番号AF153043）の部分配列で特徴づけられる。

【００１８】昆虫ディスデルクスストゥレルス（Dysdercus suturellus）（ヘミプテラ（
Hemiptera）、ピルロコリダエ（pyrrhocoridae））からのレプトモナスセイモ
ウリ（Leptomonas seymouri）、これは小サブユニットリボソームRNA遺伝子（Ge
ne Bankアクセス番号AF153040）の部分配列で特徴づけられる。

【００１９】レイシュマニアタレントラエパロット（Leishmania tarentolae Parrot）
ATCC番号30143およびクリシジアファスシキュラタレゲール（Crithidia fas
ciculata Leger）ATCC番号12857（米国型培養収集番号（American Type Culture
Collection number）。

【００２０】異種のタンパク質とは、宿主細胞にとっては天然型ではない、あるいは天然の
配列を変える修飾が施された天然のタンパク質を意味する。望ましい態様として
は、そのようなタンパク質は異種の酵素である。したがって、異種核酸コード配
列は、選択された宿主細胞中で核酸配列の発現を指示することができる適切なプ
ロモーター配列および、適切ならば、転写後シグナル配列に機能可能なように連
結される。

【００２１】非病原性の種であるレイシュマニアタレントラエ（Leishmania tarentolae
）、クリシジアファスシキュラタ（Crithidia fasciculata）、ワラセイナ
インコンスタンス（Wallaceina inconstans）、レプトモナスコロス（Leptomo
nas collos）、レプトモナス（Leptomonas）sp. Cfm、レプトモナス（Leptomona
s）sp. Nfm、あるいはレプトモナスセイモウリ（Leptomonas seymouri）、の
ようなキネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）目の生物は、鞭毛の基底小体の
近くに位置し、数千の小さな連動する環状DNAのネットワークを含んでいる、そ
のただ一つのミトコンドリアに付随のキネトプラストという独特の細胞小器官を
持つ。キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）は５０−４００ミクロンのサイ
ズである。

【００２２】キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）は、rRNA系統において動物、植物そ
して真菌でさえ及ばないほどずっと昔にさかのぼる、最古の真核生物に属する。
キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）の種は、植物から動物までにおよぶ非
常に広い範囲の宿主に寄生する。キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）のた
くさんの代表は単離され、培地中で長期間維持された。培養は、完全にあるいは
部分的に規定された液体および固体培地の両方で行うことができる（Melo, 1981
）。液体培地中で生育したキネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）は、懸濁液
を形成し、一方、固体培地上にプレーティングするとコロニーの形成を誘導する
（HillおよびFahey、1987）。

【００２３】本明細書および請求の範囲を通して「非病原性キネトプラスチダエ（Kinetopl
astidae）」という言葉の使用は、前述の種を含む生物／宿主だけでなく、先に
定義した同じ形態学的および培養上の特質あるいは特徴を有し、「非病原性キネ
トプラスチダエ（Kinetoplastidae）」と同義語と考えうる代わりの分類体系の
種も表すことが理解されるだろう。

【００２４】本発明の目的のために、「非病原性」は問題の生物の分類が、米国保健省（U.
S. department of Health and Human Services）のガイドライン（HHS出版番号
（CDCD 93-8395）またはhttp://www.niehs.nih.gov/odhsb/biosafe/bio.htm）に
基づく生物学的安全性レベル１にあるものと定義する。

【００２５】選択された種の形質転換は１−１００μｇの間の範囲のDNAの量を用いて、適
切なプレーティング技術および抗体選択の条件あるいは限定希釈技術によって行
われる。形質転換効率は選択された種によって幅広く広がり、レイシュマニア（
Leishmania）種でもっとも高くなり、10^-4／細胞に到達する（Kaplerら、1990）
（Coburnら、1991）。一つの細胞は、それらすべてが異なる選択マーカーを持っ
ているなら、いくつかの発現構築物を維持することができる（Wirtzら、1999）
。発現のレベルは、選択された宿主および構築物に依存して有意に変化し、エピ
ソームのプラスミドはもっとも低い規模であるが、それにも関わらず組み換えタ
ンパク質を細胞の全タンパク質の１％まで産生できる（LeBowitzら、1990）。

【００２６】その結果は明らかに、選択された病原性の種は異種のタンパク質を発現し分泌
できることを示している。したがって、この能力は一つの系統に限定されたもの
ではなく、むしろこの種のグループ全体の特徴であると理解される。当業者はこ
れらの種の他の系統のものもまた異種のタンパク質の発現に使えることを認識す
るだろう。たくさんの系統は公的に入手可能である。たとえば、レイシュマニア
タレントラエパロット（Leishamania tarentolae Parrot）ATCC番号30143お
よびクリシジアファスシキュラタレゲール（Crithidia fasciculata Leger
）ATCC番号12857がある。

【００２７】当業者は、本明細書に記載した宿主種の成功した形質転換は、特に例示したベ
クター、プロモーター、および選択マーカーの使用に限定されるものではないこ
とを認識するだろう。それらの技術もまた、本発明の宿主細胞と関連した有用な
ものとして、含まれる。

【００２８】「有用な」という言葉は、組み換えクローンを選択するために用いる、ヒグロ
マイシンとの組み合わせのヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HYG）
遺伝子、G418との組み合わせのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（NEO
）遺伝子、フレオマイシンとの組み合わせのストレプトアロテイクスヒンドゥ
スタヌス（Streptoalloteichts hindustanus）BLE遺伝子（BLE）、およびノル
セオスリシンとの組み合わせのストレプトスリシンアセチルトランスフェラーゼ
をコードする（SAT）遺伝子を含む技術を含むがこれらに限定されない。さらに
、カルモジュリン、ジヒドロフォレートレダクターゼ−チミジレートシンタ
ーゼ、およびシステインプロテイナーゼ遺伝子のような、宿主の活発に転写さ
れる遺伝子の５’および３’遺伝子間の領域を含むが限定しない。

【００２９】本発明は、核酸が所望のタンパク質をコードし、活発に転写されるキネトプラ
スチダエ（Kinetoplastidae）遺伝子の５’および３’UTRを側面に接しており、
効率のよいトランススプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含み、およ
び適切ならば選択マーカーを含んでいる、非病原性キネトプラスチダエ（Kineto
plastidae）、特に前述の望ましい種に形質転換可能なベクターも提供する。

【００３０】ベクターシステムは、宿主細胞内に形質転換される全DNAをともに含む、単一
ベクターまたはプラスミドあるいは二つまたはそれ以上のベクターまたはプラス
ミドのシステムであってよい。ベクターまたはプラスミドは直線上または閉環上
の分子であってよい。

【００３１】本発明の望ましい態様によると、ベクターシステムは直線化プラスミド核酸お
よび活発に転写される宿主の遺伝子の断片を側面に接した耐性マーカー遺伝子と
機能可能に連結した、活発に転写される宿主のタンパク質の遺伝子間領域を側面
に接した、関心のあるタンパク質をコードする異種の核酸を望ましくは含む。そ
のような遺伝子は、小サブユニットリボソームRNA遺伝子、大サブユニットリボ
ソームRNA遺伝子、αまたはβ−チューブリン遺伝子、カルモジュリン遺伝子、
あるいはgp63遺伝子などを含むがこれらに限定されない。その構築物は小サブユ
ニットリボソームRNA遺伝子クラスター、大サブユニットリボソームRNA遺伝子ク
ラスター、アルファまたはベータ−チューブリン遺伝子クラスターのような活発
に転写されるクラスター中に相同組み換え、および適切な抗生物質による選択に
よって統合される。

【００３２】本発明の別の望ましい態様によると、ベクターシステムは直線化プラスミド核
酸およびrRNA遺伝子クラスターの転写されないスペーサーからのDNAのフラグメ
ントを側面に接した耐性マーカー遺伝子と機能可能に連結した、活発に転写され
る宿主のタンパク質の遺伝子間領域を側面に接した、関心のあるタンパク質をコ
ードする異種の核酸を望ましくは含む。関心のあるタンパク質をコードする遺伝
子はリボソームRNA遺伝子プロモーターおよび、いくつかの場合においては、Tet
またはLacリプレッサー応答因子を含むがそれらに限定されない制御因子の後に
置かれる。その構築物はrRNA遺伝子領域の転写されないスペーサー中に相同組み
換え、および適切な抗生物質による選択によって統合される。

【００３３】本発明の別の望ましい体系によると、ベクターシステムはエピソーム的に有効
な環状プラスミド核酸および耐性マーカーが機能可能に連結した活発に転写され
る宿主タンパク質の遺伝子間領域に側面を接した関心のあるタンパク質をコード
する異種の遺伝子をのぞましくは含む。その構築物は、抗生物質選択の圧力の下
で生物体の中にエピソーム的に維持され、転写産物はランダム開始および疑似（
runaround）転写によって生じる。

【００３４】本発明の別の望ましい体系によると、ベクターシステムはエピソームとして得
られる環状プラスミド核酸および耐性マーカーが機能可能に連結した、活発に転
写される宿主タンパク質の遺伝子間領域を側面に接する、関心のあるタンパク質
をコードする異種の核酸を望ましくは含む。関心のある遺伝子をコードする核酸
は、リボソーマルプロモーターおよびその制御因子か、あるいはT7、T3などを含
むがそれらに限定されない外来のRNAポリメラーゼのプロモーターかのいずれか
が前に置かれる。構築物は、抗生物質選択の圧力化でエピソーム的に生物体の中
に維持され、リボソームRNA遺伝子プロモーターである場合RNAポリメラーゼＩに
よって転写物が生成する。他のプロモーター（T7、T3など）の場合は、転写はゲ
ノム中に統合した外来のポリメラーゼによって行われる。

【００３５】本発明の別の望ましい態様によると、宿主細胞は３つのベクターで形質転換さ
れ、一つは活発に発現される宿主のタンパク質の遺伝子間の領域に、耐性マーカ
ー遺伝子が機能可能に連結され、そして活発に転写される宿主の遺伝子セグメン
トを側面に接した、外来のRNAポリメラーゼの遺伝子（例えば、T7またはT3ポリ
メラーゼ）を含む。この構築物は相同組み換えにより、宿主の活発に転写される
遺伝子クラスター中に統合される。

【００３６】別のプラスミドは、活発に発現する宿主のタンパク質の遺伝子間の領域にTet
リプレッサーをコードする異種のDNAを含み、その前にプロモーター、望ましく
はT3あるいは減衰させたT7プロモーターを含む。この修飾Tetリプレッサー遺伝
子は抗生物質耐性マーカー遺伝子に機能可能に結合し、そして構築物全体は活発
に転写される宿主の遺伝子のセグメントを側面に接する。この構築物は相同組み
換えによって宿主の活発に転写される遺伝子クラスターに統合される。

【００３７】三番目のベクターは、関心のあるタンパク質が発現するための異種のDNAを含
み、活発に発現する宿主のタンパク質の遺伝子間の領域を側面に接し、そして望
ましくはT3あるいはT7特異的なプロモーターを先に示した所望するタンパク質の
遺伝子の５’末端に有する、エピソームとして可能なプラスミドを含む。このプ
ロモーターには、転写のテトラサイクリン依存的な対照標準を許容するためのTE
Tリプレッサー認識配列が付加的に供給される。得られた構築物は抗生物質耐性
マーカー遺伝子に機能可能に連結し、エピソーム的に維持されるあるいは構造体
全体の側面に接する適切なターゲット配列とともに供給され、そして転写されな
いrRNA遺伝子スペーサーのような宿主ゲノムの転写的に静的な部分に統合される
。

【００３８】本発明の宿主細胞種は、任意の原核生物あるいは真核生物の異種の関心あるタ
ンパク質の発現に用いることができ、望ましくは真核生物のタンパク質を発現す
るために用いる。たとえば、この新規の発現および送達システムは、カタラーゼ
、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ
、セルラーゼキシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エ
ステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼおよびその他のタンパク質分解酵素、ア
ミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナ
ーゼおよびその他のペクチン分解酵素、アミラーゼグルコアミラーゼ、α−ガ
ラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダ
ーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、
リボヌクレアーゼ、キチナーゼ、およびデオキシリボヌクレアーゼのような酵素
を発現するのに用いることができる。当業者は、「酵素」とは天然型の酵素だけ
ではなく、アミノ酸置換、欠損、付加、あるいは活性促進、熱安定性、pH耐性な
どを向上させる修飾によって修飾された酵素を含むことを理解するだろう。

【００３９】本発明の宿主細胞は、宿主細胞にとって天然型であるタンパク質の組み換え生
産に用いてもよい。そのような使用の例として、非病原性キネトプラスチダエ（
Kinetoplastidae）型の天然のタンパク質をそのタンパク質の発現を促進するた
めに異なるプロモーターの制御下に置くこと、関心のある天然のタンパク質の細
胞外への輸送をシグナル配列を用いて促進すること、あるいは対象の宿主細胞が
標準的に生産しているタンパク質のコピー数を増加させることを含むが、それら
に限定されない。したがって、本発明はまた、そのような発現が宿主細胞に非天
然型である遺伝子の因子の使用、あるいは宿主細胞では通常観察されない挙動で
機能するように操作された天然型の因子の使用を含む発現である限り、そのよう
な同種のタンパク質の組み換え生産も含む。

【００４０】発現したタンパク質を得るための細胞の破壊の必要性を避けるために、そして
細胞による発現した産物の分解可能性の程度を最小にするため、産物は細胞から
分泌されることが望ましい。望ましい態様では、関心のある遺伝子は、発現した
産物を細胞の分泌経路に導くことができるシグナルあるいはリーダーペプチドの
ような前領域のDNA配列に融合される。その前領域はどんな生物体の分泌タンパ
ク質の遺伝子に由来してもよく、あるいは望ましくは選ばれた種のまたは選ばれ
たタンパク質の天然型の前領域である。それは哺乳類のインターフェロン−ガン
マの分泌シグナル配列、レイシュマニアメキシカーナ（Leishmania mexicana
）由来の分泌性アシッドホスファターゼの分泌シグナル配列、レイシュマニア
ドノバニ（Leishmania donovani）由来の溶解性アシッドホスファターゼの分泌
シグナル配列、L.タレントラエ（L. tarentolae）の9P63遺伝子の分泌シグナル
配列、あるいは他の分泌タンパク質の分泌シグナルを含むがこれに限定されない
。

【００４１】本発明は、開示したベクターおよびベクターシステムによって得ることができ
る安定に形質転換された細胞系列をも提供する。本発明のさらなる特徴をさらに以下に詳細に記述する。

【００４２】以下の実施例は本発明をより詳細を説明するものであるが、本発明は実施例で
述べる産物や態様と同じものに制限されるわけではない。

【００４３】

【実施例】

実施例１レイシュマニアタレントラエ（Leishmania tarentolae）によ
る前癌Miz-1の発現前癌Miz-1遺伝子のpIRベクターへのクローニング： pIRベクター（Hubel A.およびBeverley、1999）｛Wirtz、Lealら、1999 ID:
267｝は、・複製のためのColE1オリジンおよび大腸菌（E. Coli）中での増殖と選択のため
のアンピシリン耐性遺伝子（Amp）、・所望するタンパク質遺伝子のmRNAのトランススプライシングおよびポリアデニ
ル化シグナルを伴う、レイシュマニア（Leishmania）のcys2（システインプロ
テイナーゼ）およびLPG1（グリコシルトランスフェラーゼ）の遺伝子間領域に側
面を接した、遺伝子カセット挿入のためのBgl IIサイト、・レイシュマニア（Leishmania）のLPG1およびDHFR-TS（ジヒドロフォレートレ
ダクターゼ−チミジレートシンターゼ）遺伝子の遺伝子間領域を側面に接した
、レイシュマニア（Leishmania）に抗生物質ノルセオスリシン（nourseothricin
）耐性を与える、トランスポゾンTn7由来のストレプトスリシンアセチルトラ
ンスフェラーゼ（sat）遺伝子、・sat耐性マーカーに連結された発現シグナルを一括し、そしてssu-ボックスの
間のDNAを、相同組み換えに続く組み換えpIRベクターの制限酵素SmiIによる切断
により、レイシュマニアタレントラエ（Leishmania tarentolae）のゲノム中
に統合することを可能にする、レイシュマニア（Leishmania）の小リボソームサ
ブユニットRNA（ssu）のためのおよそ１kb（５'と３'の部分）の遺伝子の二つの
セグメント、を含む。

【００４４】 Miz-1をコードする配列（gene bankアクセス番号 Y09723）は、標準的な手法
によってMiz-1タンパク質のN'末端に余分のヘキサヒスチジンタグの遺伝子情報
が与えられているプラスミド原料（pFH50）からPCRにより増幅した。以下のプラ
イマーは、2.6 kbのPCR断片の両末端に制限酵素Bcl Iの認識配列を導入するため
に用いた：・F2460 miz-1フォーワードプライマー： CTG CAG TGA TCA GTC GCC ACC ATG CG
G GGT TCT CAT CAT CAT C（配列番号１、開始コドンは下線で示した）および、・F2461 miz-1リバースプライマー： CTG CAG TGA TCA AGA TCT TCA CTC GGC AG
G CGG GGG AC（配列番号２、終止コドンは下線で示した）。

【００４５】 miz-1遺伝子をベクターpIRに挿入するために、標準的な分子クローニング技術
を適用した。PCR断片の末端ははじめにBcl Iで切断し、そしてそのPCR産物はBgl
IIで直線化したベクターpIRに連結した。連結反応混合物による大腸菌（E.coli
）TG1の形質転換に続いて、正しい方向付けでmiz-1が挿入された組み換えpIRを
含むクローン（pIRmiz1）は、pIRのBgl IIサイトの上流にアニーリングするプラ
イマーF2718（pIR-Bgl II-フォーワード）CTG CAC CGT GGT CGA CTG C（配列番
号３）およびプライマーF2461（miz-1リバース、先述した）を用いてコロニー−
PCRにより同定した。プラスミドDNAは陽性のクローンから抽出し、pIRmiz1の正
しい構造と配列を制限解析および配列解析によって確認した。大スケールのプラ
スミド調製はプラスミドマキシキット（Plasmid Maxi Kit）（Qiagen）によ
り行った。

【００４６】レイシュマニアタレントラエ（Leishmania tarentolae）のpIRmiz1による形
質転換： ssu−クラスター中へのmiz-1遺伝子の染色体統合では、約１０μｇのpIRmiz1
を制限酵素SmiIで切断し、0.5 μg/μlに再懸濁し、エレクトロポレーションに
よりレイシュマニアタレントラエ（Leishmania tarentolae）細胞に導入した
。

【００４７】エレクトロポレーションはマルチポレーター（Multiporator）（Eppendorf社
）を用いて発売元のプロトコルに従って行った。形質転換ごとに1.0 mlの増殖中
のL.タレントラエ（L. tarentolae）のBHI肉汁および５μg/mlヘミン中の培養液
（ＯＤ₆₀₀ = 1.0）を遠心分離（１分間、５０００ｘｇ）により回収し、ハイポ
オスモラリック（hypoosmolaric）緩衝液（HOP）（Eppendorfカタログ番号4308
070 501）中で一度洗浄し、1.0 mlのHOP中に再懸濁した。形質転換ごとに0.4 ml
のこの細胞懸濁液を用いた。細胞は氷上に１０分間保ち、DNAを加えて、キュベ
ット中でd = 2 mmで1000 Vおよび160μsec.でエレクトロポレーションを行った
。パルスに続いて細胞は氷上で10分間保ち、5μg/mlヘミンを含む10 ml BHI中に
再懸濁し、26℃でインキュベートした。100μg/mlノウルセオスリシン（nourseo
thricin）による選択を20時間後に行い、形質転換された系列が限界希釈法によ
り選択した。形質転換Ｌ．タレントラエ（L. tarentolae）：：pIRmiz1細胞の期
待した染色体構造（異種のmiz-1遺伝子の発現ユニットがssuクラスターに統合さ
れたもの）は、３つの特異的なプライマー対を用いてこれらの細胞のゲノムDNA
のPCR診断によって確認した。一つ目のプライマー対は、組み換え領域の内側（p
IRのsat遺伝子）とアニーリングするsatフォーワードプライマーF2999（CCT AGT
ATG AAG ATT TCG GTG ATC）（配列番号４）および組み換え領域の外側（pIR上
にはない3' ssu遺伝子領域）とアニーリングするssuリバースプライマーF3002（
CTG CAG GTT CAC CTA CAG CTA C）（配列番号５）からなり、天然型対照標準に
は現れない特徴的な2.3 kbpフラグメントが生じる。他の二つのプライマー対は
、pIRmiz1の統合されたセグメントに特異的で、特異的な2.6 kbp miz-1 PCRフラ
グメントを生じる、先述したF2460 miz-1フォーワードプライマーおよびF2461 m
iz-1リバースプライマーを含む。三番目のプライマー対は、先述したF2460 miz-
1フォーワードプライマーおよびF3000 satリバースプライマー（GGC TAG TTA GG
C GTC ATC CTG A）(配列番号６)であり、satおよびmiz-1遺伝子を包含する特徴
的な4 kbpのPCRフラグメントを生じる。

【００４８】ヌクレオチドレベルで統合した構築物を確認するために、miz-1遺伝子とそれ
に連なる領域を、形質転換L.タレントラエ（L. tarentolae）：：pIRmiz1細胞の
ゲノムDNAから、先述したF2718 pIR-Bgl II-forw.およびpIRmiz1のBgl IIサイ
トと側面を接するF2719 pIR-Bgl II-rev.（GGC CGA TTC ATT AAT GCA GGA C）（
配列番号７）のプライマー対を用いてPCR増幅した。3 kbpのPCR産物は配列解析
し、予想したヌクレオチド配列と一致することを見いだした。

【００４９】レイシュマニアタレントラエ（Leishmania tarentolae）の培養 L. タレントラエ（L. tarentolae）は５μg/mlのヘミンを添加したBHI肉汁（D
ifco）中で培養した。細胞は24穴プレートを用いて静置培養するか、２リットル
フラスコを用いて活発に混合する培養によって培養した。振盪速度は50 rpmある
いはそれ以下に設定した。培養物の扱いは（Alfonzoら、1998）およびその参考
文献に記されている標準的な方法に従って行った。

【００５０】 Miz-1タンパク質の同定：形質転換L. タレントラエ（L. tarentolae）：：pIRmiz1細胞は５μg/mlのヘ
ミンを含む10 mlのBHI肉汁に植え付け、26℃でインキュベートした。２mlの増殖
中の培養液をOD₆₀₀が1.0を示したところで遠心分離（１分間、10000x gで）によ
って回収し、ペレット状の細胞を200 μlのラエムリ（Laemmli）サンプル緩衝液
中で溶菌し、10 μlのサンプルを用いてタンパク質電気泳動を10% SDS-PAGE上で
標準的な手順に従って行った。Miz-1タンパク質は、Miz-1のＮ末端に導入したヘ
キサヒスチジンタグに対するモノクローナル抗体（Qiagenカタログ番号34610）
および精製Miz-1に対して作製したウサギポリクローナル抗体を用いて、ウエス
タンブロッティングによって同定した。

【００５１】結果は図 3Aに示す。mizを発現しているL. タレントラエ（L. tarentolae）細
胞について、列Tは全溶菌液、列Ｐは１％トリトンX-100不溶画分を、および列Ｓ
は１％トリトンX-100可溶画分を示す。列Ｍは分子量マーカーを、列Cは対照標準
細胞の溶菌液を示す。

【００５２】実施例２エピソームプラスミドからのヒトサイトカインエリスロポエチン
（Epo）の例レイシュマニアタレントラエ（Leishmania tarentolae）T7 RNA-ポリメラー
ゼ（T7 RNAP）株の構築。

【００５３】 T7 RNAポリメラーゼを含むベクターpT724は、pLEW13プラスミド（Misslitz A.
ら、；TobinおよびWirth、1992；Wirtzら、1999）からSV40ウイルスの核局在シ
グナルに融合されたT7 RNAP遺伝子をBgl IIおよびBamH Iサイトで切り取り、pIR
-SATベクターのBgl II サイト中に標準的な分子生物学的手法を用いてサブクロ
ーニングして構築した。オープンリーディングフレームの完全性は配列解析によ
って確かめた。レイシュマニアタレントラエ（Leishmania tarentolae）を、
得られたベクターを用いて実施例１で記述したように形質転換し、薬物耐性クロ
ーンを選択した。T7 RNAPタンパク質の存在は、形質転換した細胞の全溶菌液か
ら、T7 RNAPに対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングに
よって同定した。

【００５４】 pIR-SATの構築およびT7 RNAP誘導ヒトエリスロポエチンの発現用いたpIR発現ベクターは実施例１で記述したが、ストレプトスリシンアセチ
ルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、ヒグロマイシンホスホトランス
フェラーゼに置き換え、およびT7プロモータをSSU領域の５'に導入した。シグナ
ル配列を含むヒトエリスロポエチン前駆物質の完全長をコードする配列（EMBL
アクセス番号；X02158）をプラスミド源（pcDNA3.1/GS-epo, Invitrogen）より
、プライマーの両末端に制限酵素BamH Iの配列を含むプライマーを用いて、標準
的な手法によりPCRにより増幅した。Epo遺伝子をベクターpIR-Hyg中のBgl IIサ
イト中に挿入するためには、標準的な分子クローニング技術を用いた。陽性クロ
ーンの同定は、上に述べたように行った。得られたプラスミドは、DNAがエピソ
ーム性に保持されることを確実にするために、直線化処理は行わなかったことを
除いては実施例１に記述したように、レイシュマニアタレントラエ（Leishman
ia tarentolae）T7 RNAP株にエレクトロポレーションした。陽性クローンは実施
例１に記述したように選択したが、但し選択には５０μg/mlのヒグロマイシンを
使用した。耐性クローンを選択し、50μg/mlヒグロマイシンを含むBHI培地中に
分散し、細胞並びに培養上清も特異的なポリクローナル抗体を用いてウエスタン
ブロッティングによって解析した。その結果は図３Bに示す。列Tは培地の上清
がポリクローナル抗体と明確に反応するタンパク質を含むことを示す。上清中に
回収されたタンパク質はゆっくりと泳動した。この挙動はEpoに典型的な転写後
グリコシル化によるものであり、ヌロミダーゼ（nuromidase）による脱グリコシ
ル化によってより小さい種が現れた結果により確認した。列M（図３Ｂ）は分子
量マーカーを示し、列Cは対照標準細胞の溶菌液を示す。

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【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）におけるエピソームベ
クターからのタンパク質発現を示す。キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）種における異種遺伝子発現のための
エピソームプラスミドベクターの概略の表示。そのプラスミドは原核生物の複製
オリジンと原核生物の耐性マーカー遺伝子（Amp）を含む。関心のある遺伝子は
宿主の遺伝子間の領域および真核生物の選択マーカー遺伝子（Hyg）に側面を接
している。転写はランダムに開始し、ランダムな長さの転写物を生じる。

【図２】キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）におけるRNAポリメラーゼ
に媒介されるタンパク質発現を示す。ファージのポリメラーゼに基づき、そしてTet応答因子に制御されるキネトプ
ラスチダエ（Kinetoplastidae）における異種遺伝子発現の概略の表示。T7 RNA
ポリメラーゼおよびTetリプレッサー遺伝子は活発に転写される座、望ましくは
、強く転写される遺伝子クラスターの中に統合される。関心のある遺伝子は、T7
プロモーターおよびTet応答因子の制御下で、ゲノムの転写的に静止している領
域に統合される。関心のある遺伝子の転写は培地へのテトラサイクリンの添加に
より開始する。トランススプライシング、ポリアデニル化、および成熟mRNAの関
心のあるタンパク質への翻訳がつづく。

【図３】前癌（proto-oncogen）Miz-1（A）およびヒトエリスロポエチン（
B）を発現したレイシュマニアタレントラエ（Leishmania tarentolae）細胞の
ウエスタンブロットを示す。前癌（proto-oncogen）Miz-1を発現したレイシュマニアタレントラエ（Leis
hmania tarentolae）細胞のウエスタンブロット（A）。pIR-miz構築物によって
形質転換された細胞は、抗生物質耐性によって選択され、100 mg/Lのノウルセオ
スリシン（nourseothricin）を含むBHI肉汁中に分散した。細胞は遠心分離によ
って回収し、ラエムリ（Laemmli）バッファー中で直接煮沸するか、あるいは最
初にトリトンX-100で可溶および不溶画分に分離した。その溶菌液は10% SDS-PAG
Eで分離し、ニトロ−セルロースに転写し、組み換えMizをポリクローナル抗miz-
1抗体によって調べた。列T（図 3A）は、mizを発現しているL.タレントラエ（L. tarentolae）細胞の
全溶菌液を示す。列Ｐ（図3A）は、mizを発現しているL.タレントラエ（L. tarentolae）細胞の
１%トリトンX-100不溶画分を示す。列Ｓ（図 3A）は、mizを発現しているL.タレントラエ（L. tarentolae）細胞
の１%トリトンX-100可溶画分を示す。列Ｍは、分子量マーカー、列Ｃは対照標準細胞の溶菌液を示す。ヒトエリスロポエチンを発現したレイシュマニアタレントラエ（Leishmani
a tarentolae）細胞の培養上清のウエスタンブロット（B）。エリスロポエチン
の発現のために、200マイクロリットルの培養上清を10%TCA（Tri-Chlor-Acetic
acid:トリクロロ酢酸）により沈殿させ、15% SDS-PAGE上で分離し、ニトロ−セ
ルロース上に転写して組み換えエリスロポエチンをポリクローナル抗エリスロポ
エチン抗体で調べた。列T（図 3B）は、ヒトEpo.を発現しているＬ．タレントラエ（L. tarentolae
）の培養上清の異なる量を示す。列Ｍは分子量マーカーを、列Ｃは対照標準細胞の溶菌液を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA20 BA07 CA02 DA20 EA04 FA02 FA10 HA01 4B050 CC03 EE10 4B065 AA86 AB01 BA02 CA27

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】非病原性キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）型の宿主
およびプロモーターに機能可能であるように連結した異種のタンパク質をコード
する核酸配列を含む発現および送達システム。
【請求項２】非病原性キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）型宿主が
レイシュマニアタレントラエ（Leishmania tarentolae）、クリシジアファ
スシキュラタ（Crithidia fasciculata）、ワルラセイナインコンスタンス（W
allaceina inconstans）、レプトモナスコルロス（Leptomonas collos）、レ
プトモナス（Leptomonas）sp. Cfm、レプトモナス（Leptomonas）sp. Nfm、また
はレプトモナスセイモウリ（Leptomonas seymouri）からなるグループから選
択される、請求項１に記載の発現および送達システム。
【請求項３】異種の核酸配列が、活発に転写されるキネトプラスチダエ（
Kinetoplastidae）遺伝子の５’および３’ＵＴＲを側面に接した、請求項１ま
たは請求項２に記載の発現および送達システム。
【請求項４】異種の核酸配列が、活発に転写されるキネトプラスチダエ（
Kinetoplastidae）遺伝子の、効果的な分泌、トランススプライシング、および
ポリアデニル化のためのシグナル配列を側面に有する、請求項１から３のいずれ
か一項に記載の発現および送達システム。
【請求項５】異種の核酸配列が、線状または環状のベクターあるいはプラ
スミドに組み込まれた、請求項１から４のいずれか一項に記載の発現および送達
システム。
【請求項６】二つないしはそれ以上のベクターあるいはプラスミドが組み
込まれた、請求項１から５のいずれか一項に記載の発現および送達システム。
【請求項７】異種のタンパク質が、カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノール
オキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナー
ゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、
プロテアーゼおよびそのほかの蛋白質分解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキ
シペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン分解
酵素、アミラーゼグルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラ
ーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼお
よびデオキシリボヌクレアーゼからなるグループから選択された酵素である、請
求項１から６のいずれか一項に記載の発現および送達システム。
【請求項８】非病原性キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）型宿主ま
たは組み込まれたベクターもしくはプラスミドが選択可能なマーカー遺伝子を含
む、請求項１から７のいずれか一項に記載の発現および送達システム。
【請求項９】マーカー遺伝子が、ヒグロマイシンと共同したヒグロマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＹＧ）、Ｇ４１８と共同したネオマイ
シンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）、フレオマイシンと共同した
ストレプトアロテイクスヒンドゥスタヌス（Streptoalloteichus hindustanus
）ＢＬＥ遺伝子（ＢＬＥ）の産物およびナーセオスリシン（nourseothricin）と
共同したストレプトスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子
（ＳＡＴ）からなるグループから選択される、請求項８に記載の発現および送達
システム。
【請求項１０】プロモーターが活発に転写されるキネトプラスチダエ（Ki
netoplastidae）遺伝子プロモーターあるいは強力に転写を開始する異種のプロ
モーターである、請求項１から９のいずれか一項に記載の発現および送達システ
ム。
【請求項１１】異種の核酸の転写が、組み込まれそして発現されたリプレ
ッサー遺伝子に関連するリプレッサー応答因子によって制御される、請求項１か
ら１０のいずれか一項に記載の発現および送達システム。
【請求項１２】少なくとも１コピーの異種の核酸が、キネトプラスチダエ
（Kinetoplastidae）宿主細胞の活発に転写される遺伝子クラスター内に位置す
る、請求項１から１１のいずれか一項に記載の発現および送達システム。
【請求項１３】活発に転写される遺伝子クラスターがrRNA遺伝子クラスタ
ーである、請求項１２に記載の発現および送達システム。
【請求項１４】異種の核酸がエピソーム的に転写されるプラスミド中に位
置する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の発現および送達システム。
【請求項１５】前にプロモーターが置かれ、活発に転写されるキネトプラ
スチダエ（Kinetoplastidae）遺伝子の５’および３’ＵＴＲを側面に接した異
種の核酸を含むベクターまたはプラスミド。
【請求項１６】活発に転写されるキネトプラスチダエ（Kinetoplastidae
）遺伝子の効果的な分泌、トランススプライシングおよび／またはポリアデニル
化のためのシグナル配列を含む、請求項１５に記載のベクターまたはプラスミド
。
【請求項１７】選択マーカー遺伝子を含む、請求項１５または１６に記載
のベクターまたはプラスミド。
【請求項１８】異種の核酸で安定に形質転換された、請求項１または２に
記載の非病原性キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）細胞系列。
【請求項１９】請求項１５から１７のいずれかに記載の異種の核酸を含む
ベクターまたはプラスミドで安定に形質転換された、請求項１または２に記載の
非病原性キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）細胞系列。
【請求項２０】ａ）選択可能なマーカーの遺伝子をコードするＤＮＡ配列
および、ｂ）活発に転写される遺伝子の中に機能可能であるように連結および統合された
関心のあるタンパク質をコードする異種のＤＮＡ配列、を含む、安定に形質転換された非病原性キネトプラチダエ（Kinetoplastidae）
細胞系列を、異種遺伝子の構成的な発現のための選択培地上で培養することを含
む、請求項１または２に記載のキネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）宿主細
胞で異種のタンパク質を産生する方法。
【請求項２１】ａ）選択可能なマーカー遺伝子をコードするＤＮＡ配列お
よび、ｂ）エピソーム的に維持されるプラスミドＤＮＡ中に、活性なプロモーターとと
もに機能可能であるように連結および統合された関心のあるタンパク質をコード
する異種のＤＮＡ配列、を含む、安定に形質転換された非病原性キネトプラチダエ（Kinetoplastidae）
細胞系列を、異種遺伝子の構成的な発現のために選択培地上で培養することを含
む、請求項１または２に記載のキネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）宿主細
胞で異種のタンパク質を産生する方法。
【請求項２２】ａ）活発に転写される遺伝子クラスターに統合された、異
種のＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列および、ｂ）活発に転写される遺伝子クラスターに統合された、選択可能なマーカーをコ
ードするＤＮＡ配列および、ｃ）活発に転写される遺伝子クラスターに統合された、転写リプレッサー遺伝子
をコードするＤＮＡ配列および、ｄ）異種のＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびリプレッサー応答因子を前に
おく、所望のタンパク質をコードする異種のＤＮＡ配列、を含む、安定に形質転換された非病原性キネトプラチダエ（Kinetoplastidaeｅ
）細胞系列を、選択可能なマーカーとともに培養し、異種のリプレッサーの阻害
剤によって異種遺伝子の発現を誘導することを含む、請求項１または２に記載の
キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）宿主細胞で異種のタンパク質を産生す
る方法。
【請求項２３】異種のＲＮＡポリメラーゼがＴ７またはＴ３ＲＮＡポリ
メラーゼである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】リプレッサーが異種のＴｅｔまたはＬａｃリプレッサーで
ある、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】異種のタンパク質の発現のための、請求項１に記載の発現
および／または送達システムの使用。
【請求項２６】非病原性キネトプラスチダエ（Kinetoplastidae）型宿主
によるトランスフェクションによる植物細胞および動物細胞への異種タンパク質
の送達のための、請求項１に記載の発現および／または送達システムの使用。
【請求項２７】異種の真核生物のタンパク質の発現および／または送達の
ための、請求項１に記載の発現および／または送達システムの使用。