WO2018074498A1 - リムルス属由来の組換え蛋白質及びこれをコードするdna - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
Definitions
- the present invention relates to a recombinant protein derived from the genus Limulus, DNA encoding the same, and methods for using them.
- the horseshoe crab is said to be a “living fossil”, and there are only 4 species of 2 genera on the earth.
- the genus includes only the genus “Limulus” that lives only on the east coast of the North American continent, and the genus “Tachypleus” that lives only in the southeastern region of Asia.
- the organism belonging to the genus Limulus is only one species of Limulus polyphemus, and the organisms belonging to the genus Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas, Tachypleus roticadi roticad rotica Noscorpius rotundicauda (also called Carcinoscorpius rotundicauda)).
- amebocyte lysate amoebocyte lysate
- amebocyte lysate is widely used for quality control of pharmaceuticals as a reagent for detecting endotoxin with high sensitivity.
- This reagent is called “lysate reagent”.
- this reagent is sometimes called “Limulus reagent” or “LAL (Limulus amoebocyte lysate) reagent”.
- LAL Lith Generational reagent
- Even a reagent using an Amobosite lysate belonging to the genus Takipreus is conventionally called “Limulus reagent” or “LAL reagent”.
- lysate reagents Limulus reagents, LAL reagents
- lysate reagents used by pharmaceutical manufacturers in Japan, the US and Europe are derived from Limulus Polyphems.
- Limulus polyphemus has been severely limited in capture due to fear of extinction, but there are reports that solids are still decreasing.
- Patent Documents 1 to 8 In order to protect horseshoe crabs, there is a concept of artificially producing a protein in amebocyte lysate by recombinant technology and preparing a reagent.
- products such as PyroGene (trademark) (Lonza), EndoZyme (trademark) (Hyglos), and PyroSmart (trademark) (Seikagaku Corporation) are commercially available using recombinant proteins.
- Non-patent Document 1 A complete gene sequence and amino acid sequence derived from Rotundicauda (Carcinoscorpius rotundicauda) are reported (Non-patent Document 2).
- An object of the present invention is to provide all full-length recombinant proteins involved in the coagulation mechanism of Limulus polyphemus, cDNA encoding them, and uses thereof.
- the present inventor succeeded in obtaining a full-length cDNA encoding all protein factors involved in the coagulation mechanism of Limulus polyphemus, which has not been successful for many years, and expressing all of the recombinant proteins. Has been found to be usable for various purposes, and the present invention has been completed.
- a recombinant first protein such as a recombinant protein that is any of the following: (A) A recombinant protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4. (B) A recombinant protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and having factor C activity. (C) A recombinant protein encoded by DNA containing a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and having factor C activity.
- a recombinant second protein such as a recombinant protein that is any of the following: (A) A recombinant protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 8, 10, or 12. (B) A recombinant protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 8, 10, or 12, and having factor B activity.
- D A recombinant protein encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, 7, 9, or 11 and having factor B activity.
- a recombinant third protein such as a recombinant protein that is any of the following: (A) A recombinant protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, or 22.
- a recombinant protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, or 22 and having proclotting enzyme activity.
- C It is encoded by DNA containing a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21 and has a proclotting enzyme activity Recombinant protein.
- D is encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a complementary sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21, and has proclotting enzyme activity Recombinant protein.
- [1-1] Use of a recombinant first protein for activating a protein having factor B activity (for example, a second protein such as the following protein).
- a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 8, 10, or 12.
- B A protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 8, 10, or 12, and having factor B activity.
- C A protein encoded by a DNA comprising a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, 7, 9, or 11 and having factor B activity.
- (C) It is encoded by DNA containing a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21 and has a proclotting enzyme activity protein.
- (D) is encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a complementary sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21, and has proclotting enzyme activity protein.
- [2-1-1] The use according to [2-1], wherein the third protein is a recombinant third protein.
- [3-1] Use of a recombinant third protein to cleave a substrate.
- [3-1-1] The use according to [3-1], wherein the substrate is a synthetic substrate.
- [1-2] A method for detecting endotoxin in a sample, comprising a step of bringing a recombinant first protein into contact with the sample. [1-2-1] The method according to [1-2], further comprising a step of contacting the recombinant first protein that has contacted the specimen with a protein having factor B activity, such as a second protein. [1-2-1-1] The method according to [1-2-1], wherein the second protein is a recombinant second protein. [1-2-2] A step of contacting a protein having a factor B activity that has been brought into contact with the “recombinant first protein in contact with the specimen” with a protein having a proclotting enzyme activity such as a third protein [1-2-1] Or the method described in [1-2-1-1].
- the method further comprises a step of contacting a protein having proclotting enzyme activity in contact with “a protein having factor B activity in contact with a recombinant first protein in contact with a specimen” with a detection substrate [1-2-2 ] Or the method described in [1-2-2-1].
- An endotoxin detection agent comprising a recombinant first protein.
- the agent according to [1-3] further comprising a protein having factor B activity such as a second protein.
- the agent according to [1-3-1] wherein the second protein is a recombinant second protein.
- [1-3-2] The agent according to [1-3-1] or [1-3-1-1], further comprising a protein having a proclotting enzyme activity such as a third protein.
- [1-3-2-1] The agent according to [1-3-2], wherein the third protein is a recombinant third protein.
- Any of the following cDNAs (hereinafter also referred to as “first cDNA”).
- a cDNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
- (B) A cDNA encoding a protein comprising a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and having factor C activity.
- [1-4-1] A DNA construct comprising the first cDNA.
- [1-4-2] A cell that is transformed with the DNA construct according to [1-4-1] and expresses the recombinant first protein.
- [1-4-3] A method for producing a recombinant first protein, which comprises the step of culturing the cell.
- Any of the following cDNAs (hereinafter also referred to as “second cDNA”).
- a cDNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, 7, 9, or 11.
- B A cDNA comprising a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, 7, 9, or 11 and encoding a protein having factor B activity.
- C cDNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, 7, 9, or 11 and encodes a protein having factor B activity.
- E cDNA comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 8, 10, or 12, and encoding a protein having factor B activity.
- [2-4-1] A DNA construct comprising a second cDNA.
- [2-4-2] A cell that is transformed with the DNA construct according to [2-4-1] and expresses a recombinant second protein.
- [2-4-3] [2-4-2] A method for producing a recombinant second protein, comprising the step of culturing the cell according to the above.
- Any of the following cDNAs hereinafter also referred to as “third cDNA”).
- (B) encodes a protein comprising a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21 and having proclotting enzyme activity cDNA.
- (C) encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a complementary sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21 and has proclotting enzyme activity cDNA.
- [3-4-2] A method for producing a recombinant third protein, comprising the step of culturing the cell according to [3-4-2].
- [1-5] A method for producing an endotoxin detection agent comprising the step of artificially expressing a protein using the first cDNA.
- [1-5-1] The production method according to [1-5], further comprising the step of artificially expressing a protein using the second cDNA.
- [1-5-2] The production method according to [1-5-1], further comprising the step of artificially expressing a protein using the third cDNA.
- Recombinant 1st protein and its manufacturing method (1) Recombinant 1st protein A recombinant 1st protein is a recombinant protein which has C factor activity.
- the first recombinant protein is any one of the following recombinant proteins.
- a recombinant protein comprising the amino acid sequence of a protein having Limulus polyphemus factor C activity.
- II A recombinant protein which is a variant of the above (I) and has factor C activity.
- amino acid sequence of the protein having Limulus polyphemus C factor activity examples include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
- the recombinant first protein may be any of the following recombinant proteins.
- A A recombinant protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
- B A recombinant protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and having factor C activity.
- C A recombinant protein encoded by DNA containing a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and having factor C activity.
- D A recombinant protein encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and having factor C activity.
- the function is a function that becomes active in the presence of endotoxin and changes a protein having factor B activity such as a second protein described later to an active form (referred to as “factor C activity” in this application document).
- the recombinant first protein may exhibit factor C activity at least in combination with a second protein such as a recombinant second protein.
- the target recombinant protein is a protein having factor B activity (non-active type) such as a second protein (non-active type, hereinafter referred to as “inactive type”), Confirmed by detecting the progress of cascade reaction in the presence of endotoxin when combined with a protein (non-active type) having a proclotting enzyme activity such as a third protein (non-active type) and a detection substrate. it can.
- “Cascade reaction” means that endotoxin activates a protein having factor C activity (inactive type), and a protein having C factor activity (active type) activates a protein having factor B activity (inactive type). And a series of reactions in which a protein having a proclotting enzyme activity (inactive form) is activated by a protein having a factor B activity (active form). The progress of the cascade reaction can be detected by cleaving the detection substrate.
- the most preferred is the recombinant protein of (I) such as the recombinant protein of (A), but may be a variant thereof as long as it has factor C activity.
- the variant is a substitution of one or several amino acids at one or several positions in the amino acid sequence of the recombinant first protein as described above (for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4).
- a recombinant protein comprising an amino acid sequence containing a deletion, insertion, and / or addition, and having factor C activity.
- the “one or several” may be, for example, 1 to 20, 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3.
- the substitution, deletion, insertion, and / or addition of one or several amino acids described above are conservative mutations in which the function of the protein is normally maintained.
- a typical conservative mutation is a conservative substitution.
- Conservative substitution means, for example, when a substitution site is an aromatic amino acid, between Phe, Trp, and Tyr, and when a substitution site is a hydrophobic amino acid, between Leu, Ile, and Val, a polar amino acid Is an amino acid having a hydroxyl group between Gln and Asn, in the case of a basic amino acid, between Lys, Arg, and His, and in the case of an acidic amino acid, between Asp and Glu. In some cases, it is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
- substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Substitution from Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, substitution from Met to Ile, Leu, Val or Phe, substitution from Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala Substitution, substitution from Trp to Phe or Tyr, substitution
- the variant is, for example, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 96% of the amino acid sequence of the recombinant first protein as described above (for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4). %, 97% or more, 98% or more, 99% or more of an amino acid sequence having identity and a recombinant protein having factor C activity.
- the variant is, for example, 80% or more, 90% or more with respect to the base sequence encoding the amino acid sequence of the recombinant first protein as described above (for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3), It may be a recombinant protein encoded by DNA containing a base sequence having 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity and having factor C activity.
- the variant is, for example, under stringent conditions with DNA comprising a complementary sequence of the base sequence encoding the amino acid sequence of the recombinant first protein as described above (for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3). It may be a recombinant protein encoded by hybridizing DNA and having factor C activity.
- Stringent conditions refers to normal hybridization operations described in T. Maniatis et al., Molecular ⁇ Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, and so-called specific hybrids are formed. , Refers to conditions under which non-specific hybrids are not formed.
- the “stringent condition” refers to a sodium salt concentration of 15 to 750 mM, preferably 50 to 750 mM, more preferably 300 to 750 mM, and a temperature of 25 to 70 ° C., preferably 50 to 70 ° C.
- the conditions are preferably 55 to 65 ° C. and the formamide concentration is 0 to 50%, preferably 20 to 50%, more preferably 35 to 45%.
- the conditions for washing the filter after hybridization are usually that the sodium salt concentration is 15 to 600 mM, preferably 50 to 600 mM, more preferably 300 to 600 mM, and the temperature is 50 to 70 ° C., preferably The temperature is 55 to 70 ° C, more preferably 60 to 65 ° C.
- variants (B) to (D) are preferred as variants.
- “95% or more” in (B) and (C) is preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and more preferably 99% or more.
- the recombinant first protein may be added with any peptide such as His tag, V tag, etc. as long as it has factor C activity.
- “recombinant protein” refers to a protein obtained by artificially introducing and expressing a gene encoding a protein into a host cell other than horseshoe crab. Therefore, the protein itself obtained from natural horseshoe crab does not correspond to the “recombinant protein” in the present application document.
- a recombinant first protein can be produced by artificially introducing a first cDNA described later into a host cell other than horseshoe crab and expressing the protein from this cDNA.
- the present invention also provides a method for producing such a recombinant first protein.
- a DNA construct (such as a vector) in which the DNA is artificially incorporated may be used.
- An example of such an artificial DNA construct is a DNA construct in which the first cDNA is incorporated. Such an artificial DNA construct will be described later.
- Host cells other than horseshoe crab are not particularly limited as long as the protein can be expressed functionally from the first cDNA.
- Examples of host cells other than horseshoe crab include mammalian cells and insect cells. Mammals include rodents and primates. Examples of rodents include Chinese hamsters, hamsters, mice, rats, and guinea pigs.
- Examples of Chinese hamster cells include a Chinese hamster ovary-derived cell line (CHO).
- Examples of CHO include CHO DG44, CHO S, and CHO K1. Although it does not restrict
- Examples of human cells include a human embryonic kidney cell-derived cell line (HEK). HEK includes HEK293.
- “Functionally expressed” means that the expressed recombinant first protein exhibits factor C activity. Showing factor C activity can be confirmed by the method described in Examples below. Whether or not the expressed protein includes the target amino acid sequence such as any one of the structures (A) to (D) is determined by analyzing the amino acid sequence of the expressed protein and analyzing the target amino acid sequence. It can confirm by comparing with.
- the method for artificially introducing the first cDNA into the host cell is not particularly limited as long as the cDNA is in a state that can be expressed in the host cell.
- the recombinant first protein can be expressed by growing a host cell into which the first cDNA has been artificially introduced.
- the transformed host cell can be grown, for example, by culturing the cell.
- the culture conditions at that time are not particularly limited as long as the cells can grow and proliferate, and the conditions usually used for culturing the cells can be appropriately modified as necessary.
- a medium usually used for culturing mammalian cells can be used.
- RPMI1640 medium Sigma
- DMEM medium Sigma
- ExpiCHO TM Expression Medium Thermo Fisher Scientific
- the culture can be performed, for example, by stationary culture or suspension culture at 36 ° C. to 38 ° C. with 5% to 8% CO 2 supplied. You may use the kit only for protein expression.
- the expressed recombinant first protein can be recovered as a solution fraction containing the protein and used for various applications described later.
- the solution fraction containing the recombinant first protein can be, for example, a culture solution, a culture supernatant, a cell disruption extract, or a mixture thereof.
- the recombinant first protein may be used after being purified to a desired degree, or may be used as it is without being purified.
- Purification can be performed by a known method used for protein purification. Such methods include ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxyapatite chromatography and the like.
- the present invention enables the first artificial and functional expression of the recombinant first protein.
- the recombinant first protein produced in this way can be used, for example, for uses described later.
- Recombinant second protein and its production method Recombinant second protein is a recombinant protein having factor B activity.
- the recombinant second protein is specifically a recombinant protein that is any of the following.
- a recombinant protein comprising the amino acid sequence of a protein having Limulus polyphemus factor B activity.
- II A recombinant protein which is a variant of the above (I) and has factor B activity.
- amino acid sequence of the protein having factor B activity of Limulus polyphemus examples include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 6, 8, 10, or 12. Moreover, as a base sequence which codes such an amino acid sequence, the base sequence represented by sequence number 5, 7, 9, or 11 is mentioned.
- the recombinant second protein may be any of the following recombinant proteins.
- A A recombinant protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 8, 10, or 12.
- B A recombinant protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 8, 10, or 12, and having factor B activity.
- C A recombinant protein encoded by DNA containing a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, 7, 9, or 11 and having factor B activity.
- D A recombinant protein encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, 7, 9, or 11 and having factor B activity.
- the function of this protein is activated by a protein having C factor activity (active form) such as the activated first protein, and the protein having proclotting enzyme activity such as the third protein described below is activated.
- This is a function to be changed (referred to as “factor B activity” in the present application document).
- the recombinant second protein may exhibit factor B activity in a combination of at least a first protein such as a recombinant first protein and a third protein such as a recombinant third protein.
- Having a factor B activity means that the target recombinant protein is a proclotting enzyme such as a protein having C factor activity (active type) such as the first protein (active type) or a third protein (inactive type). This can be confirmed by detecting the progress of the cascade reaction when the active protein (non-active type) and the detection substrate are combined.
- This system may further contain an endotoxin for changing a protein having C factor activity (inactive form) to an active form.
- ⁇ 1> can be applied mutatis mutandis. That is, for example, in the above ⁇ 1>, “SEQ ID NO: 1 or 3” is “SEQ ID NO: 5, 7, 9, or 11”, and “SEQ ID NO: 2 or 4” is “SEQ ID NO: 6, 8, 10, or 12”. “(Recombinant) first protein” may be read as “(recombinant) second protein”, “first cDNA” as “second cDNA”, “C factor” as “factor B”, etc.
- Recombinant third protein and production method thereof The recombinant third protein is a recombinant protein having proclotting enzyme activity.
- the recombinant third protein is any one of the following recombinant proteins.
- a recombinant protein comprising an amino acid sequence of a protein having a proclotting enzyme activity of Limulus polyphemus.
- a recombinant protein which is a variant of the above (I) and has proclotting enzyme activity.
- amino acid sequence of the protein having proclotting enzyme activity of Limulus polyphemus examples include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, or 22. Moreover, as a base sequence which codes such an amino acid sequence, the base sequence represented by sequence number 13, 15, 17, 19, or 21 is mentioned.
- the recombinant third protein may be any of the following recombinant proteins.
- A A recombinant protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, or 22.
- B A recombinant protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, or 22 and having proclotting enzyme activity.
- C It is encoded by DNA containing a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21 and has a proclotting enzyme activity Recombinant protein.
- D is encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a complementary sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21, and has proclotting enzyme activity Recombinant protein.
- the function of this protein is activated by a protein having a factor B activity (active form), such as the activated second protein, and cleaves a substrate (protein or peptide) described later (in the present application document, “Pro Clotting enzyme activity ”).
- the recombinant third protein may exhibit proclotting enzyme activity at least in combination with a second protein such as a recombinant second protein.
- proclotting enzyme activity means that when the target recombinant protein is combined with a protein (active type) having a factor B activity such as the second protein (active type) and a detection substrate, a cascade reaction occurs. This can be confirmed by detecting the progress.
- This system may further include a protein having C factor activity (active form) for changing a protein having factor B activity (inactive form) to an active form. Further, this system may further contain an endotoxin for changing a protein having C factor activity (inactive type) to an active type.
- ⁇ 1> can be applied mutatis mutandis. That is, for example, in the above ⁇ 1>, “SEQ ID NO: 1 or 3” is replaced with “SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21”, and “SEQ ID NO: 2 or 4” is replaced with “SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20”. Or 22 ”,“ (recombinant) first protein ”as“ (recombinant) third protein ”,“ first cDNA ”as“ third cDNA ”,“ factor C ”as“ proclotting enzyme ”, etc. Just do it.
- Recombinant first protein can be used to activate a protein having factor B activity, such as a second protein.
- the present invention includes a method for activating a protein having factor B activity, comprising the step of bringing the recombinant first protein into contact with a protein having factor B activity.
- the second protein is an example of a protein having factor B activity.
- the second protein is one of the following proteins.
- a protein comprising the amino acid sequence of a protein having Limulus polyphemus factor B activity.
- a protein having the factor B activity which is a variant of the above (I).
- the second protein may be any of the following proteins.
- a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 8, 10, or 12.
- B A protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 8, 10, or 12, and having factor B activity.
- C A protein encoded by a DNA comprising a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, 7, 9, or 11 and having factor B activity.
- D A protein encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, 7, 9, or 11 and having factor B activity.
- Examples of the protein having factor B activity also include the following proteins.
- (III) A protein comprising the amino acid sequence of a protein having factor B activity of horseshoe crabs other than Limulus polyphemus.
- (IV) A protein which is a variant of the above (III) and has factor B activity.
- ⁇ Description of ⁇ 2> can be applied to the description of the protein having factor B activity.
- the present invention revealed for the first time that the protein (A) of the recombinant first protein retains the factor C activity.
- the protein (A) having such a function and its variant are applied to the activation of a protein having factor B activity.
- the protein having factor B activity used here may be one obtained from a natural product or one produced artificially (for example, a recombinant second protein) as long as it has the structure and function described above. According to the present invention, it becomes possible for the first time to artificially and functionally express a recombinant second protein, and the second protein can be stably produced with a certain quality without obtaining it from natural Limulus polyphemus. Therefore, the protein having factor B activity is preferably a recombinant second protein.
- Activation of a protein having factor B activity using a recombinant first protein is performed by bringing a recombinant first protein (active type) molecule into contact with a protein having B factor activity (inactive type). Can do.
- the recombinant first protein (non-active form) and a protein having factor B activity (non-active form) may be contacted in the presence of endotoxin.
- the conditions at the time of contact are such that the recombinant first protein (active form) exhibits the factor C activity and can activate the protein having factor B activity (in the presence of endotoxin, the endotoxin is further recombined).
- the conditions are not particularly limited as long as the first protein can be activated.
- reaction conditions in a known lysate reagent can be employed.
- the activation of the protein having factor B activity can be confirmed by the method described in the examples below.
- Recombinant second protein can be used to activate a protein having proclotting enzyme activity such as a third protein.
- the present invention includes a method for activating a protein having proclotting enzyme activity, comprising the step of bringing a recombinant second protein into contact with a protein having proclotting enzyme activity.
- proteins having proclotting enzyme activity examples include the third protein.
- the third protein is one of the following proteins.
- the third protein may be any of the following proteins.
- a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, or 22.
- B A protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, or 22 and having proclotting enzyme activity.
- C It is encoded by DNA containing a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21 and has a proclotting enzyme activity protein.
- D is encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a complementary sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21, and has proclotting enzyme activity protein.
- Examples of the protein having proclotting enzyme activity include the following proteins.
- (III) A protein comprising the amino acid sequence of a protein having proclotting enzyme activity of horseshoe crab other than Limulus polyphemus.
- (IV) A protein having a proclotting enzyme activity, which is a variant of the above (III).
- ⁇ Description of ⁇ 3> can be applied mutatis mutandis to the description of the protein having proclotting enzyme activity.
- the protein having proclotting enzyme activity used here may be a protein obtained from a natural product or an artificially produced protein (for example, a recombinant third protein) as long as it has the structure and function described above.
- Activation of a protein having a proclotting enzyme activity using a recombinant second protein brings a recombinant second protein (active type) molecule into contact with a protein having a proclotting enzyme activity (inactive type). Can be done.
- the recombinant second protein (non-active form) and the protein having proclotting enzyme activity in the presence of the protein having the factor C activity (active form) may be contacted.
- a protein having factor C activity inactive type
- a recombinant second protein inactive type
- proclotting enzyme activity in the presence of endotoxin You may contact the protein which has (non-active type).
- the condition at the time of the contact is that the recombinant second protein (active form) can exhibit a factor B activity and activate a protein having a proclotting enzyme activity (the presence of a protein having a factor C activity (active form))
- a protein having C factor activity active form
- a protein having C factor activity active form
- reaction conditions in a known lysate reagent can be employed.
- the activation of the third protein can be confirmed by the method described in Examples below.
- the first protein is an example of a protein having factor C activity.
- the first protein is one of the following proteins.
- a protein comprising an amino acid sequence of a protein having Limulus polyphemus factor C activity.
- a protein which is a variant of the above (I) and has factor C activity.
- the first protein may be any of the following proteins.
- a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
- B A protein comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and having factor C activity.
- C A protein encoded by a DNA containing a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and having factor C activity.
- D A protein encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a complementary sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and having factor C activity.
- Examples of the protein having factor C activity include the following proteins.
- (III) A protein comprising the amino acid sequence of a protein having C factor activity of horseshoe crab other than Limulus polyphemus.
- (IV) A protein which is a variant of the above (III) and has factor C activity.
- the protein having C factor activity used here may be one obtained from a natural product or one produced artificially (for example, a recombinant first protein).
- Recombinant Third Protein Recombinant third protein can be used to cleave a substrate.
- the present invention encompasses a method for cleaving a substrate, comprising the step of contacting a recombinant third protein with the substrate.
- This substrate can also be used as the aforementioned “detection substrate”, and may be a naturally occurring substrate or a synthetic substrate.
- a substrate is not particularly limited as long as it is cleaved by a proclotting enzyme activity possessed by a protein (active form) having a proclotting enzyme activity such as a third protein (active form).
- proteins such as coagulogen, general formula XYZ (where X- is a protective group covalently bonded to Y, Y is a peptide residue) , -Z is a signal substance amide-bonded to Y).
- Protecting group X is not particularly limited, and a known protecting group for peptides can be used. Examples of such a protecting group include a t-butoxycarbonyl group and a benzoyl group.
- the peptide residue Y is not particularly limited, and examples thereof include Leu-Gly-Arg (LGR) and Ile-Glu-Gly-Arg (IEGR) (SEQ ID NO: 23).
- the signal substance Z is not particularly limited, and examples thereof include a dye and a fluorescent dye that are detected under visible light.
- a dye examples include pNA (paranitroaniline), MCA (7-methoxycoumarin-4-acetic acid), DNP (2,4-dinitroaniline), and dansyl (dansyl) dye.
- Boc-Leu-Gly-Arg-pNA (t-butoxycarbonyl-leucyl-glycyl-arginyl-paranitroaniline. Boc-LGR-pNA) is preferable.
- the fact that the substrate is cleaved by the proclotting enzyme activity can be detected, for example, by detecting “gelation” when coagulogen is used as the substrate. Gelation can be detected by, for example, visually detecting that the fluidity has decreased.
- the substrate was cleaved by the proclotting enzyme activity.
- the signal Z was released by cleaving the amide bond between YZ. Since signals such as color development and fluorescence are emitted, it can be detected by detecting this signal. Signal detection may be performed by a method corresponding to the type of the signal. For example, the pNA signal can be detected by absorbance (405 nm).
- the cleavage of the substrate using the recombinant third protein can be performed by bringing the recombinant third protein (active type) molecule into contact with the substrate molecule.
- the recombinant third protein (inactive form) and the substrate may be contacted in the presence of a protein having factor B activity (active form).
- the protein having the factor B activity (active form) in order to change the protein having the factor B activity to the active form, the protein having the factor B activity (active form), the recombinant third protein in the presence of the protein having the factor C activity (active form). (Inactive type) and a substrate may be contacted.
- a protein having C factor activity in the presence of endotoxin inactive form
- a protein having B factor activity inactive form
- recombinant third A protein non-active type
- the conditions at the time of contact are such that the recombinant third protein (active form) exhibits proclotting enzyme activity and can cleave the substrate (in the presence of a protein having factor B activity (active form)). Furthermore, the condition that the protein having the factor B activity (active type) can activate the recombinant third protein by exhibiting the factor B activity, and in the presence of the protein having the factor C activity (active type), Furthermore, a condition that allows a protein having C factor activity (active form) to activate the second protein by demonstrating C factor activity, and when it is performed in the presence of endotoxin, endotoxin can activate a protein having C factor activity. As long as it is (condition), it will not specifically limit. For example, reaction conditions in a known lysate reagent can be employed.
- the endotoxin detection method of the present invention is a method for detecting endotoxin in a sample, comprising the step of bringing a recombinant first protein into contact with the sample.
- the method may further include a step of bringing the recombinant first protein that has contacted the specimen into contact with a protein having factor B activity, such as a second protein.
- a protein having factor B activity such as a second protein.
- the protein having factor B activity may be a recombinant second protein.
- the method further includes a step of bringing a protein having factor B activity in contact with the “recombinant first protein in contact with the specimen” with a protein having proclotting enzyme activity such as a third protein.
- a protein having proclotting enzyme activity such as a third protein.
- the protein having the proclotting enzyme activity may be a recombinant third protein.
- the detection of endotoxin in the specimen can be performed by detecting the activation of the recombinant first protein that has contacted the specimen.
- the activation of the recombinant first protein can be confirmed by the method described in Examples below.
- the activation of the recombinant first protein can also be directly detected using a substrate (detection substrate). That is, the activation of the recombinant first protein can be directly detected by using a detection substrate that is cleaved by the activated factor C activity of the recombinant first protein and emits a signal. Therefore, this method may further include a step of bringing the “recombinant first protein in contact with the specimen” into contact with the detection substrate.
- the step of contacting with a protein having factor B activity it can be carried out by detecting the activation of the protein having factor B activity by the method described in ⁇ 4> above.
- the activation of a protein having factor B activity can also be detected directly using a substrate (detection substrate). That is, the activation of a protein having factor B activity can be directly detected by using a substrate that is cleaved by the factor B activity of a protein having activated factor B activity as a detection substrate. . Therefore, this method may further include a step of bringing the detection protein into contact with the “protein having factor B activity in contact with the recombinant first protein”.
- this method may further include a step of bringing a “protein having proclotting enzyme activity in contact with a protein having factor B activity” into contact with a substrate (detection substrate).
- detection substrate capable of detecting the activation of a protein having proclotting enzyme activity include those exemplified in the above ⁇ 6>.
- steps may be performed sequentially or simultaneously.
- a specimen, a recombinant first protein (non-active type), a protein having factor B activity (non-active type), and a protein having proclotting enzyme activity (non-active type) The detection substrate may be contacted simultaneously in the same system.
- the contact between the recombinant first protein and the sample is not particularly limited as long as the endotoxin in the sample is a condition that can activate the recombinant first protein.
- a reaction condition in a known lysate reagent can be employed.
- the pH of the reaction solution may be 5 to 10, preferably 7 to 8.5.
- the reaction temperature may be 10 ° C. to 80 ° C., preferably 20 ° C. to 50 ° C., more preferably 30 ° C. to 40 ° C.
- An example of the reaction temperature is 37 ° C.
- the reaction time is not particularly limited, and may be set as appropriate according to various conditions. The reaction time may be, for example, 5 minutes to 2 hours, preferably 15 minutes to 90 minutes, more preferably 30 minutes to 40 minutes.
- the specimen is not particularly limited as long as it is a sample that requires endotoxin detection.
- the specimen include medical water, pharmaceuticals, infusions, blood products, medical devices, medical instruments, cosmetics, foods and drinks, environmental samples, biological components, natural proteins, recombinant proteins, nucleic acids, and carbohydrates.
- the specimen can be used for detection of endotoxin by mixing itself, dispersing or dissolving the extract itself or an extract or washing solution in the reaction system.
- the detection of endotoxin may be qualitative detection or quantitative detection.
- quantitative detection for example, when using multiple standards with different endotoxin levels (concentrations), the detection level according to the amount (concentration) and the type of substrate (for example, using coagulogen as the substrate)
- the degree of “gelation” or the degree of signal when a synthetic substrate is used is correlated in advance using, for example, a calibration curve or a relational expression, and the detection level when using an actual specimen From this, the endotoxin amount (concentration) can be converted.
- the endotoxin detection agent of the present invention is an endotoxin detection agent containing a recombinant first protein.
- the detection agent may further contain a protein having factor B activity such as a second protein.
- the protein having factor B activity may be a recombinant second protein.
- the detection agent may further contain a protein having a proclotting enzyme activity such as a third protein.
- the protein having the proclotting enzyme activity may be a recombinant third protein.
- proteins may be present in, for example, a culture solution, a culture supernatant, a cell disruption extract, or a mixture thereof as described in ⁇ 1> to ⁇ 3> above. These proteins may be used after being purified to a desired degree, or may be used as they are without being purified. For example, when these proteins are contained in the culture supernatant, they may be used with their medium components included.
- the amounts of the recombinant first protein, the protein having factor B activity, and the protein having proclotting enzyme activity in this detection agent can be appropriately set according to the activity of each protein.
- As the final concentration of each protein in the reaction solution 15 to 30 ⁇ g / mL can be exemplified.
- the detection agent may further contain a substrate (detection substrate).
- This detection agent can be produced by including these substances as constituent components.
- this detection agent may further contain additives such as excipients, stabilizers, and buffers.
- the shape of this detection agent is not specifically limited, It can formulate in arbitrary forms, such as a solid form (for example, freeze-dried form) and a liquid form.
- these substances may be collectively stored as a constituent component in an integral container, or may be stored in a separate container.
- the detection agent may further contain a lysis buffer, an endotoxin standard, a reaction container (eg, a tube or a microplate), and the like.
- This detection agent also includes the form of a kit.
- This detection agent can be used, for example, by the method described in ⁇ 7> above.
- First cDNA and its use (1) First cDNA
- the first cDNA is one of the following cDNAs.
- a cDNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
- B A cDNA encoding a protein comprising a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and having factor C activity.
- C cDNA that hybridizes with a DNA consisting of a complementary sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions and encodes a protein having factor C activity.
- D cDNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
- E cDNA comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and encoding a protein having factor C activity.
- This cDNA was obtained for the first time in the world by the method disclosed in the Examples of the present specification, and its full-length sequence structure and the function of the protein encoded thereby were revealed for the first time. Its function is “factor C activity”.
- the cDNA of (A) is most preferable, but may be a variant thereof as long as the protein encoded thereby has factor C activity.
- variants (B) to (E) are preferred as variants.
- “95% or more” in (B), (C), and (E) is preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and more preferably 99% or more.
- the first cDNA may be an arbitrary codon substituted with an equivalent codon.
- a cDNA obtained by substituting an arbitrary codon in the cDNA of (A) with an equivalent codon is included in (D).
- the first cDNA can be produced by a known DNA synthesis technique or genetic engineering technique using this sequence information.
- the first cDNA was obtained for the first time by the method described in the examples described later. However, as long as the base sequence is disclosed in the present invention, it can also be produced by a method other than the method described in the examples.
- the present invention provides a DNA construct containing the first cDNA.
- An example of such an artificial DNA construct is a vector.
- the vector plasmids, viruses, and other known vectors can be appropriately selected according to the purpose of amplification, maintenance, introduction, library preparation, cloning, protein translation (protein expression), and the like.
- the present invention also provides a cell containing the first cDNA.
- Such cells may be, for example, cells that are transformed with such a DNA construct and express the recombinant first protein.
- the present invention also provides a method for producing a recombinant first protein, comprising the step of culturing such cells.
- Second cDNA is one of the following cDNAs.
- A A cDNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, 7, 9, or 11.
- B A cDNA comprising a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, 7, 9, or 11 and encoding a protein having factor B activity.
- C cDNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, 7, 9, or 11 and encodes a protein having factor B activity.
- D cDNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 8, 10, or 12.
- E cDNA comprising an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 8, 10, or 12, and encoding a protein having factor B activity.
- ⁇ 9> (1) can be applied mutatis mutandis. That is, for example, the “factor C” in ⁇ 9> (1) may be read as “factor B”, the “first cDNA” as “second cDNA”, and the like.
- the present invention provides a DNA construct containing the second cDNA.
- the present invention also provides a cell containing a second cDNA, such as a cell transformed with such a DNA construct and expressing a recombinant second protein.
- the present invention also provides a method for producing a recombinant second protein comprising the step of culturing such cells.
- Third cDNA is a third cDNA that is one of the following.
- A cDNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21.
- B encodes a protein comprising a base sequence having 95% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21 and having proclotting enzyme activity cDNA.
- C encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a complementary sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, or 21 and has proclotting enzyme activity cDNA.
- ⁇ 9> (1) can be applied mutatis mutandis. That is, for example, the “factor C” in ⁇ 9> (1) may be read as “proclotting enzyme”, “first cDNA” as “third cDNA”, and the like.
- the present invention provides a DNA construct containing the third cDNA.
- the present invention also provides a cell containing a third cDNA such as a cell transformed with such a DNA construct to express a recombinant third protein.
- the present invention also provides a method for producing a recombinant third protein comprising the step of culturing such cells.
- the present invention also provides a method for producing an endotoxin detection agent, comprising the step of artificially expressing a protein using the first cDNA.
- This method may further include the step of artificially expressing the protein using the second cDNA. Further, the method may further include the step of artificially expressing the protein using the third cDNA.
- a method for artificially expressing a protein using these cDNAs is not particularly limited.
- the method described in ⁇ 9> (2), ⁇ 10> (2), ⁇ 11> (2) is used. be able to.
- the recombinant first protein is expressed by artificially expressing it using the first cDNA.
- the recombinant second protein is expressed by artificially expressing the second cDNA
- the recombinant third protein is expressed by artificially expressing the third cDNA.
- the expressed protein can be in a form present in, for example, a culture solution, a culture supernatant, a cell disruption extract, or a mixture thereof.
- These proteins may be used after being purified to a desired degree, or may be used as they are without being purified. For example, when these proteins are contained in the culture supernatant, they may be used with their medium components included.
- the method for producing an endotoxin detection agent of the present invention includes a method for producing a kit.
- one or both of the second protein (recombinant second protein, etc.) and the third protein (recombinant third protein, etc.) are derived from horseshoe crab other than Limulus polyphemus. May be replaced respectively. The same applies to the second cDNA and the third cDNA.
- Examples of the horseshoe crab other than Limulus polyphemus include organisms belonging to the genus Tachypleus such as Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas, and Tachypleus rotundicauda.
- the B protein derived from horseshoe crab (Tachypleus tridenttus, etc.) other than Limulus polyphemus is replaced with the third protein (recombinant third protein).
- a proclotting enzyme such as a recombinant proclotting enzyme
- a factor B gene such as a cDNA
- each of these proclotting enzyme genes may be used.
- proteins and genes may contain amino acid sequences or base sequences actually found in horseshoe crabs other than Limulus polyphemus, or may be variants thereof.
- the description of variants in ⁇ 1> to ⁇ 11> can be applied mutatis mutandis.
- these proteins and genes may or may not be derived from the same horseshoe crab other than Limulus polyphemus.
- the method for producing the endotoxin detection agent of the present invention includes the first cDNA, the second cDNA, and the third cDNA (for the second cDNA and the third cDNA, either or both of them are limulus, Each of these genes may be artificially introduced into a host cell other than the horseshoe crab (may be replaced with a gene derived from horseshoe crab other than polyphemus). An embodiment is also included in which each of these expressed recombinant proteins is included as a constituent, as described in ⁇ 8> above.
- primers were synthesized in order to attempt cloning of a protein having factor B activity and a protein having proclotting enzyme activity.
- SK15-FB-S ATCGATAAGCTTGATCACATGCAAGGAAAAGTTCT
- SEQ ID NO: 32 SK15-FB-As: CTGCAGGAATTCGATCACTGTTTAAACAAACTGAA
- SEQ ID NO: 33 SK15-PCE-S: ATCGATAAGCTTGATAGACCAGAGTGGTCTTTCTG
- SEQ ID NO: 34 SK15-As: CTGCAGGAATTCGAT (SEQ ID NO: 26)
- RNA was prepared using the PureLink (registered trademark) RNA Mini Kit and PureLink (registered trademark) DNase kit (Thermo Fisher Scientific). The attached instructions were followed. Cells were disrupted by adding TRIzol solution to 2.23 g of Limulus polyphemus blood cell pool. Thereafter, chloroform was added thereto and centrifuged to obtain an aqueous layer. After adding ethanol to the obtained aqueous layer, the nucleic acid component was bound to the silica membrane by passing it through a silica membrane cartridge attached to the kit. DNase I attached to the kit was added to the silica membrane to decompose the DNA, the cartridge was washed, and then an elution buffer was added to recover total RNA (1.3 mg).
- cDNA (first cDNA) of a protein having C factor activity of Limulus polyphemus (3-1)
- First step SK15-d20 (SEQ ID NO: 24) using the total RNA recovered in (2) as a template
- a reverse transcription reaction was performed using as a primer to obtain cDNA.
- This primer is designed to selectively bind to the poly A sequence of mRNA, and further has an additional sequence that can be used for polymerase chain reaction (PCR) on the outside thereof.
- PCR polymerase chain reaction
- SuperScript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) was used as a reverse transcriptase, and the reaction conditions were in accordance with the attached instructions.
- the lane “1” is a size marker
- the lane “2” is a PCR product.
- the triangle mark is the part where LpFC1 is expected to exist.
- the target DNA (LpFC1) was surprisingly amplified (FIG. 1B).
- This LpFC1 was cut out from the gel and extracted and purified.
- a partial DNA fragment possibly encoding a protein having Limulus polyphemus factor C activity was successfully obtained.
- the lane “1” is a size marker
- the lane “2” is a PCR product.
- the triangle mark is the position of LpFC1.
- DNA amplification was performed by colony PCR on candidate colonies.
- M13-20 Primer was used as a sense primer
- M13 Reverse Primer was used as an antisense primer
- Tks Gflex DNA polymerase (Takara Bio) was used as a polymerase.
- the obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the sequence was confirmed by sequence PCR using DNA (LpFC1) cut out from the gel, extracted and purified as a template. This revealed the DNA sequence of LpFC1.
- LpFC2 After high-temperature treatment (95 ° C., 2 minutes) in the presence of RNase A, LpFC2 was subjected to ethanol precipitation. Subsequently, as a result of treatment with T4 RNA ligase (New England Biolabs), concatemerized DNA (LpFC3) in which LpFC2 was continuously bound was obtained. As a result, a partial fragment of DNA (LpFC3) possibly encoding an amino acid sequence containing a part of a protein having Limulus polyphemus factor C activity was obtained.
- LpFC4 LFC-1st-S (SEQ ID NO: 28) as a sense primer
- LFC-1st-As SEQ ID NO: 29
- Tks Gflex DNA polymerase Takara Bio
- the target DNA (LpFC4) was hardly detected, and nonspecific DNA amplification was detected (FIG. 2A). Therefore, we decided to try the following steps.
- the lane “1” is a size marker
- the lane “2” is a PCR product.
- the triangle mark is the position of LpFC4.
- the target DNA (LpFC4) was surprisingly amplified and detected at a very high concentration (FIG. 2B).
- This LpFC4 was cut out from the gel and extracted and purified.
- a partial fragment (LpFC4) of DNA that may encode an amino acid sequence containing a portion of a protein having Limulus polyphemus C factor activity was successfully obtained.
- the lane “1” is a size marker
- the lane “2” is a PCR product.
- the triangular mark is the part where LpFC4 is expected to exist.
- LpFC4 As a template, the sequence of LpFC4 was analyzed by sequence PCR. This revealed the DNA sequence on the 5 'side of the target protein.
- the PCR product was purified by phenol chloroform extraction and ethanol precipitation, and then treated with EcoRI enzyme and XhoI enzyme.
- the restriction enzyme-treated product was subjected to agarose gel electrophoresis and cut out from the gel, and DNA was extracted and purified to obtain the target DNA (LpFC5).
- LpFC5 was mixed with an expression vector pCA7 (Takeda et al., 2005, JJvirol 79: 14346-14354) treated with EcoRI enzyme and XhoI enzyme, and ligation reaction was performed using Ligation Mix (Takara Bio).
- the reaction product was transformed into E.coli DH5 ⁇ competent cell and spread on an LB medium plate containing ampicillin. After selecting by colony PCR from the obtained colonies, it was inoculated into ampicillin-containing LB medium.
- the full-length sequence of cDNA (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3) encoding a protein that may have Limulus polyphemus factor C activity and the full-length sequence of amino acids of the protein (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4) )
- SEQ ID NOs: 1 and 3 (SEQ ID NOs: 2 and 4) are in a variant relationship and are considered to be based on polymorphism between individuals. The expression and activity analysis of this protein will be described later.
- cDNA (second cDNA) of the protein having the factor B activity of Limulus polyphemus Using the cDNA obtained in (3-1) as a template, SK15-FB-S (SEQ ID NO: 32), anti-sense primer PCR was performed using SK15-FB-As (SEQ ID NO: 33) as the sense primer and Tks Gflex DNA polymerase (Takara Bio) as the polymerase.
- the amplified fragment was cloned by the same procedure as in the above (3-4), and each of the obtained 4 clones was analyzed for the nucleotide sequence.
- a full-length sequence of cDNA (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11) encoding a protein that may have Limulus polyphemus factor B activity, and a full-length sequence of amino acids of the protein (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12) were elucidated.
- SEQ ID NOs: 5, 7, 9 and 11 SEQ ID NOs: 6, 8, 10 and 12 are in a variant relationship and are thought to be based on polymorphisms between individuals. The expression and activity analysis of this protein will be described later.
- cDNA (third cDNA) of a protein having proclotting enzyme activity of Limulus polyphemus Using the cDNA obtained in (3-1) as a template and SK15-PCE-S (SEQ ID NO: 34) as a sense primer PCR was performed using SK15-As (SEQ ID NO: 26) as an antisense primer and Tks Gflex DNA polymerase (Takara Bio) as a polymerase.
- the amplified fragment was cloned by the same procedure as described in (3-4) above, and the nucleotide sequence of each of the obtained 5 clones was analyzed.
- the full-length sequence of cDNA (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21) encoding a protein that may have the proclotting enzyme activity of Limulus polyphemus, and its The full-length amino acid sequence of the protein (SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22) was elucidated.
- SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, and 21 (SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, and 22) are in a variant relationship and are thought to be based on polymorphisms between individuals. The expression and activity analysis of this protein will be described later.
- the cDNA (SEQ ID NO: 13) obtained in (5) above was ligated to a protein expression vector pCA7 in mammalian cells to obtain an expression plasmid.
- the cDNA (SEQ ID NO: 5) obtained in the above (4) was ligated to a protein expression vector pCA7 according to the literature (Kobayashi et al., 2015, J Biol Chem, 290: 19379-19386) to obtain an expression plasmid.
- Using these expression plasmids and the expression plasmid obtained in the above (3-7) (incorporating the cDNA of SEQ ID NO: 1) and ExpiCHO TM Expression System (Thermo Fisher Scientific), A recombinant protein was obtained.
- Limulus polyphemus has a protein that may have factor C activity (SEQ ID NO: 2), a protein that may have factor B activity (SEQ ID NO: 6), and a proclotting enzyme activity.
- a protein SEQ ID NO: 14 was successfully expressed and obtained for the first time. The activity analysis of these proteins will be described later.
- a protein having factor C activity is activated by endotoxin
- a protein having factor B activity is activated by the activated protein having factor C activity.
- a protein having proclotting enzyme activity is activated by the activated protein having factor B activity
- the synthetic substrate Boc-LGR-pNA is cleaved by the activated protein having proclotting enzyme activity, whereby pNA Is liberated.
- the release of pNA was detected by measuring the change in absorbance (A405 nm). As a result, when the three types of recombinant proteins were prepared, the synthetic substrate was cleaved (FIG. 3). In FIG.
- FC is the protein expressed from the cDNA obtained in (3-7)
- FB is the protein expressed from the cDNA obtained in (4)
- PCE is the cDNA obtained in (5).
- FC is the protein expressed from the cDNA obtained in (3-7)
- FB is the protein expressed from the cDNA obtained in (4)
- PCE is the cDNA obtained in (5).
- the expressed protein having the possibility of having the factor C activity, the protein having the possibility of having the factor B activity, and the protein having the possibility of having the proclotting enzyme activity are respectively represented by the factor C activity and the factor B. It has been shown for the first time that it has activity and proclotting enzyme activity, and a cascade reaction occurs upon contact with endotoxin. It was also shown for the first time that endotoxin can be detected using these recombinant proteins.
- LFC was obtained as a culture supernatant fraction by expressing the cDNA of SEQ ID NO: 1 in the same manner as in (6) above.
- TFC uses the Tachypleus tridentatus factor C gene (SEQ ID NO: 1 of WO2014 / 092079). It was expressed in the same manner as in (6) above by the method described in (2), and obtained as a culture supernatant fraction.
- pCI-neo Promega
- the LFC and TFC subjected to the test were subjected to Western blot using a factor C specific monoclonal antibody (2C12; Yoshiki Miura, et al., J. Biochem. 112: 476-481 (1992)).
- a factor C specific monoclonal antibody (2C12; Yoshiki Miura, et al., J. Biochem. 112: 476-481 (1992)
- LFC was 18036
- TFC was 24516. That is, the relative amount of recombinant factor C (TFC / LFC) in equal volume samples was 1.4.
- each recombinant C factor in a cascade reaction system (a system containing factor C, factor B, and proclotting enzyme) were compared.
- Both factor B and proclotting enzyme were recombinant proteins derived from the genus Tachypreus.
- the former is the Takipreus tridentus factor B gene (SEQ ID NO: 5 of WO2014 / 092079), the latter is the proclotting enzyme gene of the same organism (SEQ ID NO: 7).
- Example 2 Preparation of Recombinant Factor B and Recombinant Proclotting Enzyme) and using as a culture supernatant fraction.
- recombinant factor C LFC or TFC
- TFB recombinant factor B
- TPCE recombinant proclotting enzyme
- the present invention it is possible to provide all full-length recombinant proteins involved in the coagulation mechanism of Limulus polyphemus, cDNA encoding them, and uses thereof.
- the present invention is particularly useful for detecting endotoxins.
- SEQ ID NO: 1 nucleotide sequence of the first cDNA
- SEQ ID NO: 2 amino acid sequence of the first protein
- SEQ ID NO: 3 nucleotide sequence of the first cDNA-variant 1
- SEQ ID NO: 4 amino acid sequence of the first protein-variant 1
- SEQ ID NO: 5 second cDNA
- SEQ ID NO: 6 amino acid sequence of the second protein
- SEQ ID NO: 7 base sequence of the second cDNA-variant 1
- SEQ ID NO: 8 amino acid sequence of the second protein-variant 1
- SEQ ID NO: 9 base sequence of the second cDNA-variant 2
- 10 amino acid sequence of the second protein-variant 2
- 11 base sequence of the second cDNA-variant 3
- SEQ ID NO: 12 amino acid sequence of the second protein-variant 3
- SEQ ID NO: 13 base sequence of the third cDNA
- SEQ ID NO: 14 Amino acid sequence of the third protein SEQ ID NO:
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Abstract
リムルス・ポリフェムスの凝固メカニズムに関与するすべての完全長の組換え蛋白質、これらをコードするcDNA、これらの用途を提供する。配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質、配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質、配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質、それらのバリアント、それらをコードするcDNA、それらの利用。
Description
本発明は、リムルス属由来の組換え蛋白質、これをコードするDNA及びこれらの利用法に関する。
カブトガニは「生きた化石」と言われており、地球上に2属4種しか存在しない。属としては、北米大陸東海岸のみに生息する「リムルス(Limulus)属」と、アジア東南海域のみに生息する「タキプレウス(Tachypleus)属」のみである。
一つの生物群が遠く離れた地域に分かれて分布することを不連続分布といい、カブトガニのように地球上の2つの地域に分かれた生物は大変珍しい。
リムルス属に属する生物はリムルス・ポリフェムス(Limulus polyphemus)の1種のみであり、タキプレウス属に属する生物はタキプレウス・トリデンタツス(Tachypleus tridentatus)、タキプレウス・ギガス(Tachypleus gigas)、タキプレウス・ロツンディカウダ(Tachypleus rotundicauda。カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ(Carcinoscorpius rotundicauda)とも言われる)の3種のみである。
この生物の血中に存在するアメボサイト(amoebocyte)の抽出物(アメボサイト・ライセート。amoebocyte lysate)がエンドトキシンに接触すると、凝固することが知られている。この性質を利用して、アメボサイト・ライセートはエンドトキシンを高感度に検出する試薬として医薬品の品質管理等に広く使用されている。
この試薬は「ライセート試薬」と呼ばれている。またエンドトキシンによって凝固が生じる性質は、最初にリムルス・ポリフェムスで発見されたことから、この試薬は「リムルス試薬」や「LAL(Limulus amoebocyte lysate)試薬」と呼ばれることもある。タキプレウス属のアメボサイト・ライセートを用いた試薬であっても、慣習上「リムルス試薬」や「LAL試薬」と呼ばれている。
現在、日米欧の医薬品メーカーが使用しているライセート試薬(リムルス試薬、LAL試薬)は、リムルス・ポリフェムスを原料としている。リムルス・ポリフェムスは絶滅の懸念から捕獲数が厳しく制限されているが、依然固体数が減少しているとの報告もある。
カブトガニを保護するため、アメボサイト・ライセート中の蛋白質を組換え技術で人工的に製造し、試薬を作製する思想がある(特許文献1~8)。そして実際に、組換え蛋白質を利用して、PyroGene(商標)(Lonza)、EndoZyme(商標)(Hyglos)、PyroSmart(商標)(生化学工業)といった製品が上市されている。
しかし、これらはいずれもタキプレウス属の生物に由来する組換え蛋白質を用いたものであり、ライセート試薬として広く普及しているリムルス・ポリフェムスに由来する組換え蛋白質を用いた試薬は報告されていない。
その理由は、リムルス・ポリフェムスでは、エンドトキシンによって凝固が生じるメカニズムに関与する蛋白質及びその遺伝子が、構造的にも機能的にも完全には同定されていないからである。
タキプレウス属では、例えば、凝固メカニズムに関与する1つの蛋白質であるC因子については、1991年にタキプレウス・トリデンタツス由来の完全な遺伝子配列及びアミノ酸配列が(非特許文献1)、1995年にはタキプレウス・ロツンディカウダ(カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ)由来の完全な遺伝子配列及びアミノ酸配列が(非特許文献2)それぞれ報告されている。
しかし、リムルス・ポリフェムスでは、前記タキプレウス属における報告から20年以上経過してもなお、これらの蛋白質及び遺伝子の構造及び機能の両面における完全な同定には成功していない。カブトガニの属や種の相違による生体分子の種々の相違や多様性等に起因して、一般的な手法ではこれらの蛋白質及び遺伝子の全長配列構造の正確な決定、発現、および機能解明ができなかったからである。
現に、次世代シーケンサーを使った無脊椎動物ゲノムプロジェクトの一環として、リムルス・ポリフェムスの遺伝子の網羅的な解析が行われているが(http://genome.wustl.edu/genomes/detail/limulus-polyphemus/)、リムルス・ポリフェムスの凝固メカニズムに関与する全ての蛋白質及び遺伝子の全長配列の解明には至っていない。この事実も、リムルス・ポリフェムスにおけるこれらの蛋白質及び遺伝子の全長配列構造の正確な決定の困難性を裏付けている。
Muta T et al., Journal of Biological Chemistry, 266, 6554-6561 (1991)
Ding JL et al., Molecular Marine Biology and Biotechnology, 4(1), 90-103 (1995)
本発明は、リムルス・ポリフェムスの凝固メカニズムに関与するすべての完全長の組換え蛋白質、これらをコードするcDNA、これらの用途を提供することを課題とする。
本発明者は、長年誰も成功しなかったリムルス・ポリフェムスの凝固メカニズムに関与するすべての蛋白質因子をコードする完全長のcDNAの取得、及びそのすべての組換え蛋白質の発現に成功し、更にこれらが各種用途に利用できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
[1]
以下のいずれかである組換え蛋白質等の組換え第1蛋白質。
(A)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
[2]
以下のいずれかである組換え蛋白質等の組換え第2蛋白質。
(A)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
[3]
以下のいずれかである組換え蛋白質等の組換え第3蛋白質。
(A)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
[1-1]
B因子活性を有する蛋白質(例えば以下の蛋白質等の第2蛋白質)を活性化するための、組換え第1蛋白質の使用。
(A)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(D)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
[1-1-1]
第2蛋白質が、組換え第2蛋白質である、[1-1]記載の使用。
[2-1]
プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質(例えば以下の蛋白質等の第3蛋白質)を活性化するための、組換え第2蛋白質の使用。
(A)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(D)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
[2-1-1]
第3蛋白質が、組換え第3蛋白質である、[2-1]記載の使用。
[3-1]
基質を切断するための、組換え第3蛋白質の使用。
[3-1-1]
基質が、合成基質である、[3-1]記載の使用。
[1-2]
組換え第1蛋白質を検体と接触させるステップを含む、検体中のエンドトキシンの検出方法。
[1-2-1]
検体と接触した組換え第1蛋白質を、第2蛋白質等のB因子活性を有する蛋白質と接触させるステップを更に含む、[1-2]記載の方法。
[1-2-1-1]
第2蛋白質が、組換え第2蛋白質である、[1-2-1]記載の方法。
[1-2-2]
「検体と接触した組換え第1蛋白質」と接触したB因子活性を有する蛋白質を、第3蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質と接触させるステップを更に含む、[1-2-1]又は[1-2-1-1]記載の方法。
[1-2-2-1]
第3蛋白質が、組換え第3蛋白質である、[1-2-2]記載の方法。
[1-2-3]
「検体と接触した組換え第1蛋白質と接触したB因子活性を有する蛋白質」と接触したプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を、検出用基質と接触させるステップを更に含む、[1-2-2]又は[1-2-2-1]記載の方法。
[1-3]
組換え第1蛋白質を含む、エンドトキシン検出剤。
[1-3-1]
第2蛋白質等のB因子活性を有する蛋白質を更に含む、[1-3]記載の剤。
[1-3-1-1]
第2蛋白質が、組換え第2蛋白質である、[1-3-1]記載の剤。
[1-3-2]
第3蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を更に含む、[1-3-1]又は[1-3-1-1]記載の剤。
[1-3-2-1]
第3蛋白質が、組換え第3蛋白質である、[1-3-2]記載の剤。
[1-4]
以下のいずれかであるcDNA(以下「第1cDNA」ともいう)。
(A)配列番号1または3で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
[1-4-1]
第1cDNAを含むDNA構築物。
[1-4-2]
[1-4-1]記載のDNA構築物で形質転換されて組換え第1蛋白質を発現する細胞。
[1-4-3]
[1-4-2]記載の細胞を培養するステップを含む、組換え第1蛋白質の生産方法。
[2-4]
以下のいずれかであるcDNA(以下「第2cDNA」ともいう)。
(A)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
[2-4-1]
第2cDNAを含むDNA構築物。
[2-4-2]
[2-4-1]記載のDNA構築物で形質転換されて組換え第2蛋白質を発現する細胞。
[2-4-3]
[2-4-2]記載の細胞を培養するステップを含む、組換え第2蛋白質の生産方法。
[3-4]
以下のいずれかであるcDNA(以下「第3cDNA」ともいう)。
(A)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
[3-4-1]
第3cDNAを含むDNA構築物。
[3-4-2]
[3-4-1]記載のDNA構築物で形質転換されて組換え第3蛋白質を発現する細胞。
[3-4-3]
[3-4-2]記載の細胞を培養するステップを含む、組換え第3蛋白質の生産方法。
[1-5]
第1cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを含む、エンドトキシン検出剤の製造方法。
[1-5-1]
第2cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを更に含む、[1-5]記載の製造方法。
[1-5-2]
第3cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを更に含む、[1-5-1]記載の製造方法。
[1]
以下のいずれかである組換え蛋白質等の組換え第1蛋白質。
(A)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
[2]
以下のいずれかである組換え蛋白質等の組換え第2蛋白質。
(A)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
[3]
以下のいずれかである組換え蛋白質等の組換え第3蛋白質。
(A)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
[1-1]
B因子活性を有する蛋白質(例えば以下の蛋白質等の第2蛋白質)を活性化するための、組換え第1蛋白質の使用。
(A)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(D)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
[1-1-1]
第2蛋白質が、組換え第2蛋白質である、[1-1]記載の使用。
[2-1]
プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質(例えば以下の蛋白質等の第3蛋白質)を活性化するための、組換え第2蛋白質の使用。
(A)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(D)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
[2-1-1]
第3蛋白質が、組換え第3蛋白質である、[2-1]記載の使用。
[3-1]
基質を切断するための、組換え第3蛋白質の使用。
[3-1-1]
基質が、合成基質である、[3-1]記載の使用。
[1-2]
組換え第1蛋白質を検体と接触させるステップを含む、検体中のエンドトキシンの検出方法。
[1-2-1]
検体と接触した組換え第1蛋白質を、第2蛋白質等のB因子活性を有する蛋白質と接触させるステップを更に含む、[1-2]記載の方法。
[1-2-1-1]
第2蛋白質が、組換え第2蛋白質である、[1-2-1]記載の方法。
[1-2-2]
「検体と接触した組換え第1蛋白質」と接触したB因子活性を有する蛋白質を、第3蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質と接触させるステップを更に含む、[1-2-1]又は[1-2-1-1]記載の方法。
[1-2-2-1]
第3蛋白質が、組換え第3蛋白質である、[1-2-2]記載の方法。
[1-2-3]
「検体と接触した組換え第1蛋白質と接触したB因子活性を有する蛋白質」と接触したプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を、検出用基質と接触させるステップを更に含む、[1-2-2]又は[1-2-2-1]記載の方法。
[1-3]
組換え第1蛋白質を含む、エンドトキシン検出剤。
[1-3-1]
第2蛋白質等のB因子活性を有する蛋白質を更に含む、[1-3]記載の剤。
[1-3-1-1]
第2蛋白質が、組換え第2蛋白質である、[1-3-1]記載の剤。
[1-3-2]
第3蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を更に含む、[1-3-1]又は[1-3-1-1]記載の剤。
[1-3-2-1]
第3蛋白質が、組換え第3蛋白質である、[1-3-2]記載の剤。
[1-4]
以下のいずれかであるcDNA(以下「第1cDNA」ともいう)。
(A)配列番号1または3で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
[1-4-1]
第1cDNAを含むDNA構築物。
[1-4-2]
[1-4-1]記載のDNA構築物で形質転換されて組換え第1蛋白質を発現する細胞。
[1-4-3]
[1-4-2]記載の細胞を培養するステップを含む、組換え第1蛋白質の生産方法。
[2-4]
以下のいずれかであるcDNA(以下「第2cDNA」ともいう)。
(A)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
[2-4-1]
第2cDNAを含むDNA構築物。
[2-4-2]
[2-4-1]記載のDNA構築物で形質転換されて組換え第2蛋白質を発現する細胞。
[2-4-3]
[2-4-2]記載の細胞を培養するステップを含む、組換え第2蛋白質の生産方法。
[3-4]
以下のいずれかであるcDNA(以下「第3cDNA」ともいう)。
(A)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
[3-4-1]
第3cDNAを含むDNA構築物。
[3-4-2]
[3-4-1]記載のDNA構築物で形質転換されて組換え第3蛋白質を発現する細胞。
[3-4-3]
[3-4-2]記載の細胞を培養するステップを含む、組換え第3蛋白質の生産方法。
[1-5]
第1cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを含む、エンドトキシン検出剤の製造方法。
[1-5-1]
第2cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを更に含む、[1-5]記載の製造方法。
[1-5-2]
第3cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを更に含む、[1-5-1]記載の製造方法。
<1>組換え第1蛋白質及びその製法
(1)組換え第1蛋白質
組換え第1蛋白質は、C因子活性を有する組換え蛋白質である。
(1)組換え第1蛋白質
組換え第1蛋白質は、C因子活性を有する組換え蛋白質である。
組換え第1蛋白質は、具体的には、以下のいずれかである組換え蛋白質である。
(I)リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(I)リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、C因子活性を有する組換え蛋白質。
リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列としては、配列番号2または4で表されるアミノ酸配列が挙げられる。また、そのようなアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号1または3で表される塩基配列が挙げられる。
組換え第1蛋白質は、より具体的には、以下のいずれかである組換え蛋白質であってよい。
(A)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(A)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
なお、「アミノ酸配列を含む」または「塩基配列を含む」という表現は、当該「アミノ酸配列からなる」場合または当該「塩基配列からなる」場合も包含する。
この蛋白質は、本明細書の実施例に開示された方法により世界で初めて取得され、その全長の配列構造及び機能が初めて明らかにされたものである。その機能は、エンドトキシンの存在下で活性型となり、後述する第2蛋白質等のB因子活性を有する蛋白質を活性型に変化させる機能(本出願書類において「C因子活性」という)である。組換え第1蛋白質は、少なくとも組換え第2蛋白質等の第2蛋白質との組み合わせにおいて、C因子活性を示すものであってよい。
C因子活性を有することは、対象となる組換え蛋白質を、第2蛋白質(活性型になっていないもの。以下「非活性型」という)等のB因子活性を有する蛋白質(非活性型)、第3蛋白質(非活性型)等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質(非活性型)、及び検出用基質と組み合わせた際に、エンドトキシンの存在下でのカスケード反応の進行を検出することにより確認できる。
「カスケード反応」とは、エンドトキシンによりC因子活性を有する蛋白質(非活性型)が活性化され、C因子活性を有する蛋白質(活性型)によりB因子活性を有する蛋白質(非活性型)が活性化され、B因子活性を有する蛋白質(活性型)によりプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質(非活性型)が活性化される一連の反応をいう。カスケード反応の進行は、検出用基質の切断によって検出できる。
組換え第1蛋白質のうち、最も好ましいのは前記(A)の組換え蛋白質等の前記(I)の組換え蛋白質であるが、C因子活性を有する限り、それらのバリアントであってもよい。
バリアントは、例えば、上記のような組換え第1蛋白質のアミノ酸配列(例えば配列番号2または4で表されるアミノ酸配列)において、1若しくは数個の位置での、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質であってよい。前記「1若しくは数個」とは、例えば、1~20個、1~10個、1~5個、または1~3個であってよい。上記の1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加は、蛋白質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、例えば、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
また、バリアントは、例えば、上記のような組換え第1蛋白質のアミノ酸配列(例えば配列番号2または4で表されるアミノ酸配列)に対して、80%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質であってもよい。
また、バリアントは、例えば、上記のような組換え第1蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列(例えば配列番号1または3で表される塩基配列)に対して、80%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質であってもよい。
また、バリアントは、例えば、上記のような組換え第1蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列(例えば配列番号1または3で表される塩基配列)の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、T. Maniatisら編、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratoryなどに記載の通常のハイブリダイゼーション操作で、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」とは、具体的には、ナトリウム塩濃度が15~750mM、好ましくは50~750mM、より好ましくは300~750mM、温度が25~70℃、好ましくは50~70℃、より好ましくは55~65℃、ホルムアミド濃度が0~50%、好ましくは20~50%、より好ましくは35~45%での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が15~600mM、好ましくは50~600mM、より好ましくは300~600mM、温度が50~70℃、好ましくは55~70℃、より好ましくは60~65℃である。
バリアントとして具体的には、前記(B)~(D)の組換え蛋白質が好ましい。前記(B)及び(C)における「95%以上」は、好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上である。
また、組換え第1蛋白質は、C因子活性を有する限り、Hisタグ、Vタグ等の任意のペプチド等が付加されていてもよい。
また、本出願書類において「組換え蛋白質」とは、蛋白質をコードする遺伝子を人工的にカブトガニ以外の宿主細胞に導入し、発現させることにより得られた蛋白質をいう。したがって、天然のカブトガニから取得された蛋白質そのものは、本出願書類における「組換え蛋白質」には該当しない。
(2)組換え第1蛋白質の製法
組換え第1蛋白質は、その完全なアミノ酸配列が本発明によって初めて開示されたので、例えば、この配列をコードするDNAを用いて、遺伝子工学的手法により製造することができる。組換え第1蛋白質を遺伝子工学的手法により製造する方法は特に制限されず、例えば、蛋白質を遺伝子工学的手法により製造する通常の方法を採用できる。組換え第1蛋白質は、例えば、異種発現系や無細胞蛋白質合成系を利用して製造することができる。
組換え第1蛋白質は、その完全なアミノ酸配列が本発明によって初めて開示されたので、例えば、この配列をコードするDNAを用いて、遺伝子工学的手法により製造することができる。組換え第1蛋白質を遺伝子工学的手法により製造する方法は特に制限されず、例えば、蛋白質を遺伝子工学的手法により製造する通常の方法を採用できる。組換え第1蛋白質は、例えば、異種発現系や無細胞蛋白質合成系を利用して製造することができる。
例えば、後述する第1cDNAを人工的にカブトガニ以外の宿主細胞に導入し、このcDNAから蛋白質を発現させることによって組換え第1蛋白質を製造することができる。本発明は、このような組換え第1蛋白質の製造方法をも提供する。
宿主細胞に人工的にDNAを導入する際、当該DNAが人工的に組み込まれたDNA構築物(ベクターなど)を用いてもよい。このような人工のDNA構築物としては、例えば第1cDNAが組み込まれたDNA構築物が例示できる。このような人工のDNA構築物については後述する。
カブトガニ以外の宿主細胞は、第1cDNAから蛋白質を機能的に(functionally)発現させることができる限りにおいて特に限定されない。カブトガニ以外の宿主細胞としては、例えば、哺乳類細胞や昆虫細胞が挙げられる。哺乳類としては、げっ歯類や霊長類が挙げられる。げっ歯類としては、チャイニーズハムスター、ハムスター、マウス、ラット、モルモットが挙げられる。チャイニーズハムスターの細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株(CHO)が挙げられる。CHOとしては、CHO DG44、CHO SやCHO K1が挙げられる。霊長類としては、特に制限されないが、ヒト、サル、チンパンジーが挙げられる。ヒトの細胞としては、ヒト胎児腎細胞由来細胞株(HEK)が挙げられる。HEKとしては、HEK293が挙げられる。
「機能的に発現する」とは、発現された組換え第1蛋白質が、C因子活性を示すことをいう。C因子活性を示すことは、後述の実施例に記載の方法により確認することができる。また、発現された蛋白質が前記(A)~(D)のいずれかの構造等の目的のアミノ酸配列を含むか否かは、発現された蛋白質のアミノ酸配列を分析し、これを目的のアミノ酸配列と比較することにより確認することができる。
第1cDNAを人工的に宿主細胞に導入する手法も、当該cDNAが宿主細胞内で発現可能に保持される状態となる限りにおいて特に制限されない。第1cDNAが人工的に導入された宿主細胞を生育させることで、組換え第1蛋白質を発現させることができる。
形質転換された宿主細胞の生育は、例えば当該細胞を培養することにより行うことができる。その際の培養条件も、当該細胞が生育や増殖できる限り特に限定されず、当該細胞の培養に通常用いられる条件を、必要により適宜修正して用いることができる。例えば、宿主細胞が哺乳類細胞の場合には、哺乳類細胞の培養に通常用いられる培地を用いることができる。このような培地として、例えばRPMI1640培地(Sigma社)、DMEM培地(Sigma社)やExpiCHOTM Expression Medium(Thermo Fisher Scientific)などを用いることができる。培養は、例えば、36℃~38℃で、5%~8%CO2供給下で、静置培養あるいは浮遊培養などにより行うことができる。蛋白質発現専用のキットを用いてもよい。
発現した組換え第1蛋白質は、これを含有する溶液画分として回収して、後述する各種用途に利用できる。
組換え第1蛋白質を含有する溶液画分は、例えば、培養液、培養上清、細胞破砕抽出物、またはそれらの混合物等でありうる。組換え第1蛋白質は、所望の程度に精製して用いてもよく、精製せずそのまま用いてもよい。
精製は、蛋白質の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等が挙げられる。
本発明により、組換え第1蛋白質の人工的、かつ機能的な発現が初めて可能になった。このようにして製造された組換え第1蛋白質は、例えば後述する用途に使用することができる。
<2>組換え第2蛋白質及びその製法
組換え第2蛋白質は、B因子活性を有する組換え蛋白質である。
組換え第2蛋白質は、B因子活性を有する組換え蛋白質である。
組換え第2蛋白質は、具体的には、以下のいずれかである組換え蛋白質である。
(I)リムルス・ポリフェムスのB因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(I)リムルス・ポリフェムスのB因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、B因子活性を有する組換え蛋白質。
リムルス・ポリフェムスのB因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列としては、配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列が挙げられる。また、そのようなアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列が挙げられる。
組換え第2蛋白質は、より具体的には、以下のいずれかである組換え蛋白質であってよい。
(A)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(A)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
この蛋白質の機能は、活性型となった第1蛋白質等のC因子活性を有する蛋白質(活性型)によって活性型となり、後述する第3蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を活性型に変化させる機能(本出願書類において「B因子活性」という)である。組換え第2蛋白質は、少なくとも組換え第1蛋白質等の第1蛋白質及び組換え第3蛋白質等の第3蛋白質との組み合わせにおいて、B因子活性を示すものであってよい。
B因子活性を有することは、対象となる組換え蛋白質を、第1蛋白質(活性型)等のC因子活性を有する蛋白質(活性型)、第3蛋白質(非活性型)等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質(非活性型)、及び検出用基質を組み合わせた際に、カスケード反応の進行を検出することにより確認できる。この系には、C因子活性を有する蛋白質(非活性型)を活性型に変化させるためのエンドトキシンがさらに存在していてもよい。
その他の説明は、前記<1>の説明を準用できる。すなわち、例えば、前記<1>における「配列番号1または3」を「配列番号5、7、9、または11」、「配列番号2または4」を「配列番号6、8、10、または12」、「(組換え)第1蛋白質」を「(組換え)第2蛋白質」、「第1cDNA」を「第2cDNA」、「C因子」を「B因子」などとそれぞれ読み替えればよい。
<3>組換え第3蛋白質及びその製法
組換え第3蛋白質は、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質である。
組換え第3蛋白質は、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質である。
組換え第3蛋白質は、具体的には、以下のいずれかである組換え蛋白質である。
(I)リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(I)リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列としては、配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列が挙げられる。また、そのようなアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列が挙げられる。
組換え第3蛋白質は、より具体的には、以下のいずれかである組換え蛋白質であってよい。
(A)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(A)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
この蛋白質の機能は、活性型となった第2蛋白質等のB因子活性を有する蛋白質(活性型)によって活性型となり、後述する基質(蛋白質またはペプチド)を切断する機能(本出願書類において「プロクロッティングエンザイム活性」という)である。組換え第3蛋白質は、少なくとも組換え第2蛋白質等の第2蛋白質との組み合わせにおいて、プロクロッティングエンザイム活性を示すものであってよい。
プロクロッティングエンザイム活性を有することは、対象となる組換え蛋白質を、第2蛋白質(活性型)等のB因子活性を有する蛋白質(活性型)及び検出用基質と組み合わせた際に、カスケード反応の進行を検出することにより確認できる。この系には、B因子活性を有する蛋白質(非活性型)を活性型に変化させるためのC因子活性を有する蛋白質(活性型)がさらに存在していてもよい。また、この系には、C因子活性を有する蛋白質(非活性型)を活性型に変化させるためのエンドトキシンがさらに存在していてもよい。
その他の説明は、前記<1>の説明を準用できる。すなわち、例えば、前記<1>における「配列番号1または3」を「配列番号13、15、17、19、または21」、「配列番号2または4」を「配列番号14、16、18、20、または22」、「(組換え)第1蛋白質」を「(組換え)第3蛋白質」、「第1cDNA」を「第3cDNA」、「C因子」を「プロクロッティングエンザイム」などとそれぞれ読み替えればよい。
<4>組換え第1蛋白質の使用
組換え第1蛋白質は、第2蛋白質等のB因子活性を有する蛋白質を活性化するために使用することができる。換言すれば、本発明は、組換え第1蛋白質をB因子活性を有する蛋白質と接触させるステップを含む、B因子活性を有する蛋白質の活性化方法を包含する。
組換え第1蛋白質は、第2蛋白質等のB因子活性を有する蛋白質を活性化するために使用することができる。換言すれば、本発明は、組換え第1蛋白質をB因子活性を有する蛋白質と接触させるステップを含む、B因子活性を有する蛋白質の活性化方法を包含する。
B因子活性を有する蛋白質としては、第2蛋白質が挙げられる。
第2蛋白質は、具体的には、以下のいずれかである蛋白質である。
(I)リムルス・ポリフェムスのB因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、B因子活性を有する蛋白質。
(I)リムルス・ポリフェムスのB因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、B因子活性を有する蛋白質。
第2蛋白質は、より具体的には、以下のいずれかである蛋白質であってよい。
(A)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(D)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(A)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(D)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
また、B因子活性を有する蛋白質としては、以下の蛋白質も挙げられる。
(III)リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニのB因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(IV)前記(III)のバリアントであって、B因子活性を有する蛋白質。
(III)リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニのB因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(IV)前記(III)のバリアントであって、B因子活性を有する蛋白質。
B因子活性を有する蛋白質の説明は、前記<2>の説明を準用できる。
本発明により、組換え第1蛋白質の(A)の蛋白質がC因子活性を保持していることが初めて明らかにされた。このような機能をもつ(A)の蛋白質及びそのバリアントを、B因子活性を有する蛋白質の活性化に応用したものである。
ここで用いるB因子活性を有する蛋白質は、上記の構造及び機能を有する限り、天然物から取得したものでも、人工的に製造されたもの(例えば、組換え第2蛋白質)でもよい。本発明により、組換え第2蛋白質の人工的かつ機能的な発現が初めて可能になり、第2蛋白質を天然のリムルス・ポリフェムスから取得することなく一定の品質で安定的に製造することができるようになったことから、B因子活性を有する蛋白質は、組換え第2蛋白質であることが好ましい。
組換え第1蛋白質を用いたB因子活性を有する蛋白質の活性化は、組換え第1蛋白質(活性型)分子とB因子活性を有する蛋白質(非活性型)分子とを接触させることにより行うことができる。なお、組換え第1蛋白質を活性型に変化させるために、エンドトキシン存在下で組換え第1蛋白質(非活性型)とB因子活性を有する蛋白質(非活性型)とを接触させてもよい。
この接触時の条件は、組換え第1蛋白質(活性型)がC因子活性を発揮してB因子活性を有する蛋白質を活性化できる条件(エンドトキシン存在下で行う場合には、さらにエンドトキシンが組換え第1蛋白質を活性化できる条件)である限りにおいて特に限定されない。例えば、公知のライセート試薬における反応条件を採用することができる。
B因子活性を有する蛋白質が活性化されたことは、後述の実施例に記載の方法で確認することができる。
<5>組換え第2蛋白質の使用
組換え第2蛋白質は、第3蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を活性化するために使用することができる。換言すれば、本発明は、組換え第2蛋白質をプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質と接触させるステップを含む、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の活性化方法を包含する。
組換え第2蛋白質は、第3蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を活性化するために使用することができる。換言すれば、本発明は、組換え第2蛋白質をプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質と接触させるステップを含む、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の活性化方法を包含する。
プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質としては、第3蛋白質が挙げられる。
第3蛋白質は、具体的には、以下のいずれかである蛋白質である。
(I)リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(I)リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
第3蛋白質は、より具体的には、以下のいずれかである蛋白質であってよい。
(A)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(D)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(A)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(D)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
また、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質としては、以下の蛋白質も挙げられる。
(III)リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(IV)前記(III)のバリアントであって、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(III)リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(IV)前記(III)のバリアントであって、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の説明は、前記<3>の説明を準用できる。
ここで用いるプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質は、上記の構造及び機能を有する限り、天然物から取得したものでも、人工的に製造されたもの(例えば、組換え第3蛋白質)でもよい。
組換え第2蛋白質を用いたプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の活性化は、組換え第2蛋白質(活性型)分子とプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質(非活性型)分子とを接触させることにより行うことができる。なお、組換え第2蛋白質を活性型に変化させるために、C因子活性を有する蛋白質(活性型)の存在下で、組換え第2蛋白質(非活性型)とプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質(非活性型)とを接触させてもよい。さらに、このC因子活性を有する蛋白質を活性化するために、エンドトキシン存在下でC因子活性を有する蛋白質(非活性型)、組換え第2蛋白質(非活性型)、及びプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質(非活性型)を接触させてもよい。
この接触時の条件は、組換え第2蛋白質(活性型)がB因子活性を発揮してプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を活性化できる条件(C因子活性を有する蛋白質(活性型)の存在下で行う場合には、さらにC因子活性を有する蛋白質(活性型)がC因子活性を発揮して組換え第2蛋白質を活性化できる条件。エンドトキシン存在下で行う場合には、さらにエンドトキシンがC因子活性を有する蛋白質を活性化できる条件)である限りにおいて特に限定されない。例えば、公知のライセート試薬における反応条件を採用することができる。
第3蛋白質が活性化されたことは、後述の実施例に記載の方法により確認することができる。
C因子活性を有する蛋白質としては、第1蛋白質が挙げられる。
第1蛋白質は、具体的には、以下のいずれかである蛋白質である。
(I)リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、C因子活性を有する蛋白質。
(I)リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、C因子活性を有する蛋白質。
第1蛋白質は、より具体的には、以下のいずれかである蛋白質であってよい。
(A)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する蛋白質。
(D)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する蛋白質。
(A)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する蛋白質。
(D)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する蛋白質。
また、C因子活性を有する蛋白質としては、以下の蛋白質も挙げられる。
(III)リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニのC因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(IV)前記(III)のバリアントであって、C因子活性を有する蛋白質。
(III)リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニのC因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(IV)前記(III)のバリアントであって、C因子活性を有する蛋白質。
C因子活性を有する蛋白質の説明は、前記<1>の説明を準用できる。
ここで用いるC因子活性を有する蛋白質は、上記の構造及び機能を有する限り、天然物から取得したものでも、人工的に製造されたもの(例えば、組換え第1蛋白質)でもよい。
その他の説明は、前記<4>の説明を準用できる。
<6>組換え第3蛋白質の使用
組換え第3蛋白質は、基質を切断するために使用することができる。換言すれば、本発明は、組換え第3蛋白質を基質と接触させるステップを含む、基質の切断方法を包含する。
組換え第3蛋白質は、基質を切断するために使用することができる。換言すれば、本発明は、組換え第3蛋白質を基質と接触させるステップを含む、基質の切断方法を包含する。
この基質は、前記の「検出用基質」としても用いることができ、天然由来の基質であっても、合成基質であってもよい。このような基質は、第3蛋白質(活性型)等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質(活性型)が有するプロクロッティングエンザイム活性によって切断されるものであれば特に限定されない。
プロクロッティングエンザイム活性によって切断されるものとしては、例えば、コアギュローゲンなどの蛋白質や、一般式X-Y-Z(式中、X-はYと共有結合した保護基、Yはペプチド残基、-ZはYとアミド結合したシグナル物質である)で表される合成基質が挙げられる。
保護基Xは特に限定されず、ペプチドの公知の保護基を用いることができる。そのような保護基としては、例えば、t-ブトキシカルボニル基やベンゾイル基が挙げられる。
ペプチド残基Yも特に限定されず、例えば、Leu-Gly-Arg(LGR)やIle-Glu-Gly-Arg(IEGR)(配列番号23)が挙げられる。
シグナル物質Zも特に限定されず、例えば、可視光下で検出される色素や蛍光色素が挙げられる。このような色素としては、例えば、pNA(パラニトロアニリン)、MCA(7-メトキシクマリン-4-酢酸)、DNP(2,4-ジニトロアニリン)、Dansyl(ダンシル)系色素が挙げられる。
これらのなかでも、Boc-Leu-Gly-Arg-pNA(t-ブトキシカルボニル-ロイシル-グリシル-アルギニル-パラニトロアニリン。Boc-LGR-pNA)が好ましい。
基質がプロクロッティングエンザイム活性によって切断されたことは、例えば、基質としてコアギュローゲンを用いた場合には、「ゲル化」を検知することにより検出することができる。ゲル化は、例えば、流動性が低下したことを目視などで検知することにより検出することができる。
また、基質がプロクロッティングエンザイム活性によって切断されたことは、例えば、前記のような合成基質を用いた場合には、Y-Z間のアミド結合が切断されることによりシグナルZが遊離して発色や蛍光などのシグナルを発するので、このシグナルを検知することにより検出することができる。シグナルの検知は、そのシグナルの種類に応じた手法により行えばよい。例えば、pNAのシグナルは、吸光度(405nm)によって検知することができる。
組換え第3蛋白質を用いた基質の切断は、組換え第3蛋白質(活性型)分子と基質分子とを接触させることにより行うことができる。なお、組換え第3蛋白質を活性型に変化させるために、B因子活性を有する蛋白質(活性型)の存在下で、組換え第3蛋白質(非活性型)と基質とを接触させてもよい。さらに、このB因子活性を有する蛋白質を活性型に変化させるために、C因子活性を有する蛋白質(活性型)の存在下で、B因子活性を有する蛋白質(非活性型)、組換え第3蛋白質(非活性型)、及び基質を接触させてもよい。さらに、このC因子活性を有する蛋白質を活性型に変化させるために、エンドトキシン存在下でC因子活性を有する蛋白質(非活性型)、B因子活性を有する蛋白質(非活性型)、組換え第3蛋白質(非活性型)、及び基質を接触させてもよい。
この接触時の条件は、組換え第3蛋白質(活性型)がプロクロッティングエンザイム活性を発揮して基質を切断できる条件(B因子活性を有する蛋白質(活性型)の存在下で行う場合には、さらにB因子活性を有する蛋白質(活性型)がB因子活性を発揮して組換え第3蛋白質を活性化できる条件。C因子活性を有する蛋白質(活性型)の存在下で行う場合には、さらにC因子活性を有する蛋白質(活性型)がC因子活性を発揮して第2蛋白質を活性化できる条件。エンドトキシン存在下で行う場合には、さらにエンドトキシンがC因子活性を有する蛋白質を活性化できる条件)である限りにおいて特に限定されない。例えば、公知のライセート試薬における反応条件を採用することができる。
その他の説明は、前記<4>の説明を準用できる。
<7>エンドトキシンの検出方法
本発明のエンドトキシンンの検出方法は、組換え第1蛋白質を検体と接触させるステップを含む、検体中のエンドトキシンの検出方法である。
本発明のエンドトキシンンの検出方法は、組換え第1蛋白質を検体と接触させるステップを含む、検体中のエンドトキシンの検出方法である。
この方法は、検体と接触した組換え第1蛋白質を、第2蛋白質等のB因子活性を有する蛋白質と接触させるステップを更に含んでいてよい。このB因子活性を有する蛋白質は、組換え第2蛋白質であってよい。
また、この方法は、「検体と接触した組換え第1蛋白質」と接触したB因子活性を有する蛋白質を、第3蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質と接触させるステップを更に含んでいてよい。このプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質は、組換え第3蛋白質であってよい。
検体中のエンドトキシンの検出は、検体と接触した組換え第1蛋白質の活性化を検知することにより行うことができる。組換え第1蛋白質が活性化されたことは、後述の実施例に記載の方法により確認することができる。また、組換え第1蛋白質の活性化は、基質(検出用基質)を利用して直接検知することもできる。すなわち、検出用基質として、活性化された組換え第1蛋白質のC因子活性により切断されシグナルを発するものを利用することにより、組換え第1蛋白質の活性化を直接検知することができる。よって、この方法は、「検体と接触した組換え第1蛋白質」と検出用基質を接触させるステップを更に含んでいてもよい。
更にB因子活性を有する蛋白質と接触させるステップを含む場合には、前記<4>に記載の方法でB因子活性を有する蛋白質の活性化を検知することにより行うことができる。また、B因子活性を有する蛋白質の活性化は、基質(検出用基質)を利用して直接検知することもできる。すなわち、検出用基質として、活性化されたB因子活性を有する蛋白質のB因子活性により切断されシグナルを発するものを利用することにより、B因子活性を有する蛋白質の活性化を直接検知することができる。よって、この方法は、「組換え第1蛋白質と接触したB因子活性を有する蛋白質」と検出用基質を接触させるステップを更に含んでいてもよい。
更にプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質と接触させるステップを含む場合には、前記<5>に記載の方法でプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の活性化(前記<6>に記載の方法による基質の切断)を検知することにより行うことができる。よって、この方法は、「B因子活性を有する蛋白質と接触したプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質」と基質(検出用基質)を接触させるステップを更に含んでいてもよい。プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の活性化を検知できる検出用基質としては、前記<6>に例示したものが挙げられる。
これらのステップは、順次行ってもよく、同時に行ってもよい。例えば、これらのステップを同時に行う場合には、検体、組換え第1蛋白質(非活性型)、B因子活性を有する蛋白質(非活性型)、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質(非活性型)、検出用基質を同時に同じ系のなかで接触させてもよい。
これらの接触の条件は、前記<4>~<6>に記載した条件と同様である。例えば、組換え第1蛋白質と検体との接触は、検体中のエンドトキシンが組換え第1蛋白質を活性化できる条件である限りにおいて特に限定されない。接触の条件は、例えば公知のライセート試薬における反応条件を採用することができる。例えば、反応液のpHとしては、pH5~10、好ましくは7~8.5を採用できる。反応温度としては、10℃~80℃、好ましくは20℃~50℃、さらに好ましくは30℃~40℃を採用することができる。反応温度としては、例えば、37℃が例示される。反応時間も特に限定されず、諸条件に応じて適宜設定すればよい。反応時間は、例えば、5分~2時間、好ましくは15分~90分、より好ましくは30分~40分であってよい。
検体も、エンドトキシンの検出が必要な試料である限りにおいて特に限定されない。検体としては、例えば、医療用水、医薬品、輸液、血液製剤、医療機器、医療器具、化粧品、飲食品、環境試料、生体成分、天然の蛋白質、組換え蛋白質、核酸、糖質が挙げられる。検体は、それ自体を、あるいはその抽出物や洗浄液を反応系に混合、分散、又は溶解し、エンドトキシンの検出に供することができる。
エンドトキシンの検出は、定性的な検出でも、定量的な検出でもよい。定量的な検出は、例えば、エンドトキシン量(濃度)が異なる複数の標準品を用いて、その量(濃度)と、基質の種類に応じた検出レベル(例えば、基質としてコアギュローゲンを用いた場合には「ゲル化」の程度、合成基質を用いた場合にはシグナルの程度)との関係を、例えば検量線や関係式を用いて予め関連付けておき、実際の検体を用いた場合の検出レベルから、エンドトキシン量(濃度)を換算することにより行うことができる。
<8>エンドトキシン検出剤
本発明のエンドトキシン検出剤は、組換え第1蛋白質を含む、エンドトキシン検出剤である。
本発明のエンドトキシン検出剤は、組換え第1蛋白質を含む、エンドトキシン検出剤である。
この検出剤は、第2蛋白質等のB因子活性を有する蛋白質を更に含んでいてよい。このB因子活性を有する蛋白質は、組換え第2蛋白質であってよい。
この検出剤は、第3蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を更に含んでいてよい。このプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質は、組換え第3蛋白質であってよい。
これらの蛋白質は、前記<1>~<3>に説明したとおり、例えば、培養液、培養上清、細胞破砕抽出物、またはそれらの混合物等の中に存在する形態でありうる。これらの蛋白質は、所望の程度に精製して用いてもよく、精製せずそのまま用いてもよい。例えば、これらの蛋白質が培養上清中に含有されている場合には、その培地成分を含んだまま用いてもよい。
この検出剤中の組換え第1蛋白質、B因子活性を有する蛋白質、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の各量は、各蛋白質の活性等に応じ適宜設定できるが、例えば、検体と混合した状態の反応液中の各蛋白質の終濃度として、15~30μg/mLを例示することができる。
この検出剤は、更に基質(検出用基質)を含んでいてよい。
この検出剤は、これらの物を構成成分として含ませることにより製造することができる。この検出剤は、それ以外に賦形剤、安定化剤、緩衝剤などの添加剤を更に含んでいてもよい。また、この検出剤の形状も特に限定されず、固体状(例えば凍結乾燥形態)、液体状等の任意の形態で製剤化できる。
この検出剤では、これらの物が、まとめて一体の容器内に構成成分として収められていてもよく、別体の容器内に収められていてもよい。
また、この検出剤は、溶解用の緩衝液、エンドトキシン標準品、反応用容器(例えば、チューブやマイクロプレート)などを更に含んでいてもよい。この検出剤は、キットの形態をも包含する。
この検出剤は、例えば前記<7>に説明した方法で使用することができる。
<9>第1cDNA及びその利用
(1)第1cDNA
第1cDNAは、以下のいずれかであるcDNAである。
(A)配列番号1または3で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(1)第1cDNA
第1cDNAは、以下のいずれかであるcDNAである。
(A)配列番号1または3で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
このcDNAは、本明細書の実施例に開示された方法によって世界で初めて取得され、その全長の配列構造及びこれによってコードされる蛋白質の機能が初めて明らかにされたものである。その機能は「C因子活性」である。
第1cDNAのうち、最も好ましいのは前記(A)のcDNAであるが、これによってコードされる蛋白質がC因子活性を有する限り、それらのバリアントであってもよい。
バリアントとして具体的には、前記(B)~(E)のcDNAが好ましい。前記(B)、(C)、及び(E)における「95%以上」は、好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上である。
また、「ストリンジェントな条件」の意義及びその他の説明は、前記<1>の説明を準用できる。
また、第1cDNAは、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、前記(A)のcDNAにおいて任意のコドンをそれと等価のコドンに置換してなるcDNAは、前記(D)に包含される。
第1cDNAは、その完全な塩基配列が本発明によって開示されたので、この配列情報を用いて、公知のDNA合成手法ないし遺伝子工学的手法により製造することができる。第1cDNAは、後述の実施例に記載の方法によって初めて取得されたものであるが、その塩基配列が本発明で開示された以上、実施例記載の方法以外の方法によっても製造することができる。
(2)第1cDNAを含むDNA構築物、形質転換細胞、これを用いた組換え第1蛋白質の生産方法
本発明は、第1cDNAを含むDNA構築物を提供する。このような人工のDNA構築物としては、例えば、ベクターを例示することができる。ベクターとしては、組換えDNAの増幅、維持、導入、ライブラリー作製、クローニング、蛋白質翻訳(蛋白質発現)などの目的に応じて、プラスミド、ウイルス、その他の公知のベクターを適宜選択することができる。このようなベクター等に第1cDNAを導入することにより、第1cDNAを含むDNA構築物を製造することができる。
本発明は、第1cDNAを含むDNA構築物を提供する。このような人工のDNA構築物としては、例えば、ベクターを例示することができる。ベクターとしては、組換えDNAの増幅、維持、導入、ライブラリー作製、クローニング、蛋白質翻訳(蛋白質発現)などの目的に応じて、プラスミド、ウイルス、その他の公知のベクターを適宜選択することができる。このようなベクター等に第1cDNAを導入することにより、第1cDNAを含むDNA構築物を製造することができる。
また、本発明は、第1cDNAを含む細胞を提供する。このような細胞は、例えば、このようなDNA構築物で形質転換されて組換え第1蛋白質を発現する細胞であってよい。また、本発明は、このような細胞を培養するステップを含む、組換え第1蛋白質の生産方法を提供する。
DNA構築物で細胞(宿主細胞)を形質転換する方法、これを培養して組換え第1蛋白質を生産する方法は、前記<1>(2)における説明を準用できる。
<10>第2cDNA
(1)第2cDNA
第2cDNAは、以下のいずれかであるcDNAである。
(A)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(1)第2cDNA
第2cDNAは、以下のいずれかであるcDNAである。
(A)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
その他の説明は、前記の<9>(1)の説明を準用できる。すなわち、例えば、前記<9>(1)の「C因子」を「B因子」、「第1cDNA」を「第2cDNA」などとそれぞれ読み替えればよい。
(2)第2cDNAを含むDNA構築物、形質転換細胞、これを用いた組換え第2蛋白質の生産方法
本発明は、第2cDNAを含むDNA構築物を提供する。また本発明は、このようなDNA構築物で形質転換されて組換え第2蛋白質を発現する細胞等の第2cDNAを含む細胞を提供する。また本発明は、このような細胞を培養するステップを含む、組換え第2蛋白質の生産方法を提供する。
本発明は、第2cDNAを含むDNA構築物を提供する。また本発明は、このようなDNA構築物で形質転換されて組換え第2蛋白質を発現する細胞等の第2cDNAを含む細胞を提供する。また本発明は、このような細胞を培養するステップを含む、組換え第2蛋白質の生産方法を提供する。
その他の説明は、前記<9>(2)の説明を準用できる。
<11>第3cDNA
(1)第3cDNA
第3cDNAは、以下のいずれかである第3cDNAである。
(A)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(1)第3cDNA
第3cDNAは、以下のいずれかである第3cDNAである。
(A)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
その他の説明は、前記の<9>(1)の説明を準用できる。すなわち、例えば、前記<9>(1)の「C因子」を「プロクロッティングエンザイム」、「第1cDNA」を「第3cDNA」などとそれぞれ読み替えればよい。
(2)第3cDNAを含むDNA構築物、形質転換細胞、これを用いた組換え第3蛋白質の生産方法
本発明は、第3cDNAを含むDNA構築物を提供する。また本発明は、このようなDNA構築物で形質転換されて組換え第3蛋白質を発現する細胞等の第3cDNAを含む細胞を提供する。また本発明は、このような細胞を培養するステップを含む、組換え第3蛋白質の生産方法を提供する。
本発明は、第3cDNAを含むDNA構築物を提供する。また本発明は、このようなDNA構築物で形質転換されて組換え第3蛋白質を発現する細胞等の第3cDNAを含む細胞を提供する。また本発明は、このような細胞を培養するステップを含む、組換え第3蛋白質の生産方法を提供する。
その他の説明は、前記<9>(2)の説明を準用できる。
<12>エンドトキシン検出剤の製造方法
本発明は、第1cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを含む、エンドトキシン検出剤の製造方法も提供する。
本発明は、第1cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを含む、エンドトキシン検出剤の製造方法も提供する。
この方法は、第2cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを更に含んでいてよい。また、第3cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを更に含んでいてよい。
これらのcDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させる方法も特に限定されないが、例えば、前記<9>(2)、<10>(2)、<11>(2)に記載された方法を用いることができる。
このような方法で、第1cDNAを用いて人工的に発現させることにより組換え第1蛋白質が発現される。同様に、更に第2cDNAを用いて人工的に発現させることで組換え第2蛋白質が、第3cDNAを用いて人工的に発現させることで組換え第3蛋白質がそれぞれ発現される。
発現された蛋白質は、前記<1>~<3>に説明したとおり、例えば、培養液、培養上清、細胞破砕抽出物、またはそれらの混合物等の中に存在する形態でありうる。これらの蛋白質は、所望の程度に精製して用いてもよく、精製せずそのまま用いてもよい。例えば、これらの蛋白質が培養上清中に含有されている場合には、その培地成分を含んだまま用いてもよい。
その他の説明は、前記<8>の説明を準用できる。したがって、本発明のエンドトキシン検出剤の製造方法は、キットの製造方法をも包含する。
なお、本発明では、第2蛋白質(組換え第2蛋白質など)及び第3蛋白質(組換え第3蛋白質など)のいずれか一方又は双方を、リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニに由来するこれらの対応物にそれぞれ置き換えてもよい。第2cDNA及び第3cDNAについても同様である。リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニとしては、タキプレウス・トリデンタツス(Tachypleus tridentatus)、タキプレウス・ギガス(Tachypleus gigas)、タキプレウス・ロツンディカウダ(Tachypleus rotundicauda)等のタキプレウス属に属する生物が挙げられる。
すなわち、第2蛋白質(組換え第2蛋白質など)に代えてリムルス・ポリフェムス以外のカブトガニ(タキプレウス・トリデンタツスなど)由来のB因子(組換えB因子など)を、第3蛋白質(組換え第3蛋白質など)に代えて同生物由来のプロクロッティングエンザイム(組換えプロクロッティングエンザイムなど)を、第2cDNAに代えて同生物由来のB因子遺伝子(cDNAなど)を、第3cDNAに代えて同生物由来のプロクロッティングエンザイム遺伝子(cDNAなど)をそれぞれ用いてもよい。
これらの蛋白質や遺伝子は、いずれも、リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニに実際に見出されるアミノ酸配列又は塩基配列を含むものであってもよいし、それらのバリアントであってもよい。バリアントについては、前記<1>~<11>におけるバリアントの説明を準用できる。また、これらの蛋白質や遺伝子は、リムルス・ポリフェムス以外の同一のカブトガニに由来するものであってもよく、そうでなくてもよい。
そして、前記の説明からも明らかなとおり、本発明のエンドトキシン検出剤の製造方法には、第1cDNA、第2cDNA、及び第3cDNA(第2cDNA及び第3cDNAについては、そのいずれか一方又は双方をリムルス・ポリフェムス以外のカブトガニ(タキプレウス・トリデンタツスなど)由来の遺伝子に置き換えてもよい)のそれぞれを人工的にカブトガニ以外の宿主細胞に導入し、これら各々のcDNAから各々の組換え蛋白質(計3種類)を発現させ、次いで、前記<8>のとおり、これらの発現された各々の組換え蛋白質を構成成分として含ませる態様も包含される。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の例示であり、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
(1)プライマーの合成
リムルス・ポリフェムスにおけるC因子活性を有する蛋白質のクローニングを試みるため、下記の各プライマーを合成した。
リムルス・ポリフェムスにおけるC因子活性を有する蛋白質のクローニングを試みるため、下記の各プライマーを合成した。
<C因子活性を有する蛋白質のクローニングに用いたプライマー>
SK15-dT20: CTGCAGGAATTCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(配列番号24)
SK15-FC-S: ATCGATAAGCTTGATGATCTGGGCTTGTGTGATGA(配列番号25)
SK15-As: CTGCAGGAATTCGAT(配列番号26)
LFC-5race: CTACACCAAGTTCCA(配列番号27)
LFC-1st-S: GTAAACCATGTGACAAACTGGAGGC(配列番号28)
LFC-1st-As: AATAAGGCCTCCATCGATAGAAGTA(配列番号29)
LFC-EcoRI-kozak-S: GGGGAATTCAAGCTTGCCACCATGGTACTAGCGTCGTTC(配列番号30)
LFC-XhoI-stop-As: GGGCTCGAGTCAAATGAACTGCCGAATCCACGATA(配列番号31)
SK15-dT20: CTGCAGGAATTCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(配列番号24)
SK15-FC-S: ATCGATAAGCTTGATGATCTGGGCTTGTGTGATGA(配列番号25)
SK15-As: CTGCAGGAATTCGAT(配列番号26)
LFC-5race: CTACACCAAGTTCCA(配列番号27)
LFC-1st-S: GTAAACCATGTGACAAACTGGAGGC(配列番号28)
LFC-1st-As: AATAAGGCCTCCATCGATAGAAGTA(配列番号29)
LFC-EcoRI-kozak-S: GGGGAATTCAAGCTTGCCACCATGGTACTAGCGTCGTTC(配列番号30)
LFC-XhoI-stop-As: GGGCTCGAGTCAAATGAACTGCCGAATCCACGATA(配列番号31)
また、B因子活性を有する蛋白質及びプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の各クローニングを試みるため、下記の各プライマーを合成した。
<B因子活性を有する蛋白質及びプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のクローニングに用いたプライマー>
SK15-FB-S: ATCGATAAGCTTGATCACATGCAAGGAAAAGTTCT(配列番号32)
SK15-FB-As: CTGCAGGAATTCGATCACTGTTTAAACAAACTGAA(配列番号33)
SK15-PCE-S: ATCGATAAGCTTGATAGACCAGAGTGGTCTTTCTG(配列番号34)
SK15-As: CTGCAGGAATTCGAT(配列番号26)
SK15-FB-S: ATCGATAAGCTTGATCACATGCAAGGAAAAGTTCT(配列番号32)
SK15-FB-As: CTGCAGGAATTCGATCACTGTTTAAACAAACTGAA(配列番号33)
SK15-PCE-S: ATCGATAAGCTTGATAGACCAGAGTGGTCTTTCTG(配列番号34)
SK15-As: CTGCAGGAATTCGAT(配列番号26)
(2)リムルス・ポリフェムスの血球細胞からのトータルRNAの調製
トータルRNAの調製は、PureLink(登録商標) RNA Mini KitとPureLink(登録商標) DNase kit (Thermo Fisher Scientific)を使用し、基本的操作は添付の説明書に従った。リムルス・ポリフェムスの血球細胞プール2.23gにTRIzol溶液を添加して細胞を破砕した。その後、これにクロロホルムを添加して遠心分離し、水層を得た。得られた水層にエタノールを添加した後、これをキットに添付のシリカ膜カートリッジに通すことで、核酸成分をシリカ膜に結合させた。このシリカ膜にキット添付のDNase Iを加えてDNAを分解し、カートリッジを洗浄後、溶出バッファーを添加して、トータルRNA(1.3mg)を回収した。
トータルRNAの調製は、PureLink(登録商標) RNA Mini KitとPureLink(登録商標) DNase kit (Thermo Fisher Scientific)を使用し、基本的操作は添付の説明書に従った。リムルス・ポリフェムスの血球細胞プール2.23gにTRIzol溶液を添加して細胞を破砕した。その後、これにクロロホルムを添加して遠心分離し、水層を得た。得られた水層にエタノールを添加した後、これをキットに添付のシリカ膜カートリッジに通すことで、核酸成分をシリカ膜に結合させた。このシリカ膜にキット添付のDNase Iを加えてDNAを分解し、カートリッジを洗浄後、溶出バッファーを添加して、トータルRNA(1.3mg)を回収した。
(3)リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質のcDNA(第1cDNA)の取得
(3-1)第1ステップ
前記(2)で回収したトータルRNAを鋳型として、SK15-d20(配列番号24)をプライマーとして用いた逆転写反応を行い、cDNAを得た。本プライマーはmRNAのポリA配列に選択的に結合するように設計され、更にその外側にポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PCR)に利用可能な付加配列を有している。本反応では逆転写酵素としてSuperScript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) を用い、反応条件は添付の説明書に従った。
(3-1)第1ステップ
前記(2)で回収したトータルRNAを鋳型として、SK15-d20(配列番号24)をプライマーとして用いた逆転写反応を行い、cDNAを得た。本プライマーはmRNAのポリA配列に選択的に結合するように設計され、更にその外側にポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PCR)に利用可能な付加配列を有している。本反応では逆転写酵素としてSuperScript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) を用い、反応条件は添付の説明書に従った。
(3-2)第2ステップ
得られたcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてSK15-FC-S(配列番号25)、アンチセンスプライマーとしてSK15-As(配列番号26)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。
得られたcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてSK15-FC-S(配列番号25)、アンチセンスプライマーとしてSK15-As(配列番号26)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。
PCR産物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、目的としたDNA(LpFC1)はほとんど検知できず、非特異的なDNA増幅が検知された(図1A)。そこで、以下のステップを試すこととした。なお、図1A中の「1」のレーンはサイズマーカー、「2」のレーンがPCR産物である。また三角印はLpFC1の存在が予想される部分である。
(3-3)第3ステップ
LpFC1の存在が予想された部分をゲルから切り出して、DNAを抽出、精製した。これを鋳型として、センスプライマーとしてSK15-FC-S(配列番号25)、アンチセンスプライマーとしてSK15-As(配列番号26)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。
LpFC1の存在が予想された部分をゲルから切り出して、DNAを抽出、精製した。これを鋳型として、センスプライマーとしてSK15-FC-S(配列番号25)、アンチセンスプライマーとしてSK15-As(配列番号26)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。
PCR産物をアガロースゲル電気泳動した結果、驚くべきことに目的としたDNA(LpFC1)が著しく増幅していた(図1B)。このLpFC1をゲルから切り出して抽出、精製した。これにより、リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質をコードしている可能性があるDNAの部分断片(LpFC1)の取得に成功した。なお、図1B中の「1」のレーンはサイズマーカー、「2」のレーンがPCR産物である。また、三角印はLpFC1の位置である。
(3-4)第4ステップ
LpFC1をEcoRV酵素処理したpBluescript II SK (+) と混合し、In-Fusion HD Enzyme premix(タカラバイオ)を用いて組換え反応によりベクターへの導入を行った。反応物をE. coli DH5α competent cellに形質転換し、X-Gal、IPTGを含むアンピシリンLB培地プレートに塗布して、ブルーホワイトスクリーニングによるコロニーの選定を行った。
LpFC1をEcoRV酵素処理したpBluescript II SK (+) と混合し、In-Fusion HD Enzyme premix(タカラバイオ)を用いて組換え反応によりベクターへの導入を行った。反応物をE. coli DH5α competent cellに形質転換し、X-Gal、IPTGを含むアンピシリンLB培地プレートに塗布して、ブルーホワイトスクリーニングによるコロニーの選定を行った。
その後、候補のコロニーに対するコロニーPCRでDNA増幅を行った。この際、センスプライマーとしてM13-20 Primer、アンチセンスプライマーとしてM13 Reverse Primer、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いた。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動後、ゲルから切り出して抽出、精製したDNA(LpFC1)を鋳型として、シークエンスPCRにより配列を確認した。これにより、LpFC1のDNA配列が判明した。
(3-5)第5ステップ
LpFC1の配列情報を参考に作製した合成DNA LFC-5race(配列番号27)の5’末端を、ATP存在下でT4 Polynucleotide Kinase(タカラバイオ)によりリン酸化した。前記のトータルRNAを鋳型とし、得られたリン酸化プライマーと逆転写酵素SuperScript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) を用いた逆転写反応により、目的とするDNA(LpFC2)を得た。これにより、リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質の一部分を含むアミノ酸配列をコードしている可能性があるDNAの部分断片(LpFC2)を得た。
LpFC1の配列情報を参考に作製した合成DNA LFC-5race(配列番号27)の5’末端を、ATP存在下でT4 Polynucleotide Kinase(タカラバイオ)によりリン酸化した。前記のトータルRNAを鋳型とし、得られたリン酸化プライマーと逆転写酵素SuperScript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) を用いた逆転写反応により、目的とするDNA(LpFC2)を得た。これにより、リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質の一部分を含むアミノ酸配列をコードしている可能性があるDNAの部分断片(LpFC2)を得た。
LpFC2をRNase A存在下で高温処理(95℃、2分間)したのち、エタノール沈殿を行った。その後、T4 RNA Ligase(New England Biolabs)で処理した結果、LpFC2が連続的に結合したコンカテマー化DNA(LpFC3)が得られた。これにより、リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質の一部分を含むアミノ酸配列をコードしている可能性があるDNAの部分断片(LpFC3)を得た。
LpFC3を鋳型に、センスプライマーとしてLFC-1st-S(配列番号28)、アンチセンスプライマーとしてLFC-1st-As(配列番号29)、Tks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いたPCRを行い、目的とするDNA(LpFC4)を増幅した。
PCR産物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、目的としたDNA(LpFC4)はほとんど検知できず、非特異的なDNA増幅が検知された(図2A)。そこで、以下のステップを試すこととした。なお、図2A中の「1」のレーンはサイズマーカー、「2」のレーンがPCR産物である。また、三角印はLpFC4の位置である。
(3-6)第6ステップ
LpFC4の存在が予想される部分をゲルから切り出して、DNAを抽出、精製した。これを鋳型として、センスプライマーとしてLFC-1st-S(配列番号28)、アンチセンスプライマーとしてLFC-1st-As(配列番号29)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。
LpFC4の存在が予想される部分をゲルから切り出して、DNAを抽出、精製した。これを鋳型として、センスプライマーとしてLFC-1st-S(配列番号28)、アンチセンスプライマーとしてLFC-1st-As(配列番号29)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。
PCR産物をアガロースゲル電気泳動した結果、驚くべきことに目的としたDNA(LpFC4)が著しく増幅し、非常に高濃度で検出された(図2B)。このLpFC4をゲルから切り出して抽出、精製した。これにより、リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質の一部分を含むアミノ酸配列をコードしている可能性があるDNAの部分断片(LpFC4)の取得に成功した。なお、図2B中の「1」のレーンはサイズマーカー、「2」のレーンがPCR産物である。また、三角印はLpFC4の存在が予想される部分である。
LpFC4を鋳型とし、シークエンスPCRによりLpFC4の配列を解析した。これにより、目的蛋白質の5’側のDNA配列が判明した。
(3-7)第7ステップ
前記(3-1)で得たcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてLFC-EcoRI-kozak-S(配列番号30)、アンチセンスプライマーとしてLFC-XhoI-stop-As(配列番号31)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。
前記(3-1)で得たcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてLFC-EcoRI-kozak-S(配列番号30)、アンチセンスプライマーとしてLFC-XhoI-stop-As(配列番号31)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。
PCR産物をフェノールクロロフォルム抽出、エタノール沈殿によって精製後、EcoRI酵素とXhoI酵素で処理した。制限酵素処理産物をアガロースゲル電気泳動してゲルから切り出し、DNAを抽出、精製して目的DNA(LpFC5)を得た。
LpFC5をEcoRI酵素とXhoI酵素で処理した発現ベクターpCA7(Takeda et al., 2005, J virol 79:14346-14354)と混合し、Ligation Mix(タカラバイオ)を用いてライゲーション反応を行った。反応物をE. coli DH5α competent cellに形質転換し、アンピシリン含有LB培地プレートに塗布した。得られたコロニーからコロニーPCRによる選定を行った後、アンピシリン含有LB培地に植菌した。
培養後、NucleoSpin(登録商標) Plasmid Easy Pure(マッハライ・ナーゲル)によるプラスミド精製を行った。得られた2種のクローンのプラスミドを鋳型とし、シークエンスPCRにより各々の塩基配列を解析した。
これにより、リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する可能性がある蛋白質をコードするcDNAの全長配列(配列番号1、配列番号3)と、その蛋白質のアミノ酸の全長配列(配列番号2、配列番号4)の解明に初めて成功した。配列番号1と3(配列番号2と4)はバリアントの関係にあり、個体間の多型に基づくと考えられる。この蛋白質の発現及び活性解析については後述する。
(4)リムルス・ポリフェムスのB因子活性を有する蛋白質のcDNA(第2cDNA)の取得
前記(3-1)で得たcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてSK15-FB-S(配列番号32)、アンチセンスプライマーとしてSK15-FB-As(配列番号33)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。増幅した断片を前記(3-4)と同じ手順でクローニングし、得られた4種のクローンについて各々の塩基配列を解析した。
前記(3-1)で得たcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてSK15-FB-S(配列番号32)、アンチセンスプライマーとしてSK15-FB-As(配列番号33)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。増幅した断片を前記(3-4)と同じ手順でクローニングし、得られた4種のクローンについて各々の塩基配列を解析した。
これにより、リムルス・ポリフェムスのB因子活性を有する可能性がある蛋白質をコードするcDNAの全長配列(配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11)と、その蛋白質のアミノ酸の全長配列(配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12)を解明した。配列番号5、7、9および11(配列番号6、8、10および12)はバリアントの関係にあり、個体間の多型に基づくと考えられる。この蛋白質の発現及び活性解析については後述する。
(5)リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のcDNA(第3cDNA)の取得
前記(3-1)で得たcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてSK15-PCE-S(配列番号34)、アンチセンスプライマーとしてSK15-As(配列番号26)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。増幅した断片を前記(3-4)と同じ手順でクローニングし、得られた5種のクローンについて各々の塩基配列を解析した。
前記(3-1)で得たcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてSK15-PCE-S(配列番号34)、アンチセンスプライマーとしてSK15-As(配列番号26)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。増幅した断片を前記(3-4)と同じ手順でクローニングし、得られた5種のクローンについて各々の塩基配列を解析した。
これにより、リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する可能性がある蛋白質をコードするcDNAの全長配列(配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21)と、その蛋白質のアミノ酸の全長配列(配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22)を解明した。配列番号13、15、17、19および21(配列番号14、16、18、20および22)はバリアントの関係にあり、個体間の多型に基づくと考えられる。この蛋白質の発現及び活性解析については後述する。
(6)組換え蛋白質の発現
前記(5)で得たcDNA(配列番号13)を、哺乳類細胞での蛋白質発現用ベクターpCA7につなぎ、発現プラスミドを得た。前記(4)で得たcDNA(配列番号5)は、文献(Kobayashi et al., 2015, J Biol Chem, 290:19379-19386)に従い、蛋白質発現用ベクターpCA7につなぎ、発現プラスミドを得た。これらの発現プラスミドおよび前記(3-7)で得られた発現プラスミド(配列番号1のcDNAが組み込まれたもの)と、ExpiCHOTM Expression System(Thermo Fisher Scientific)を使い、培養上清画分として各々の組換え蛋白質を得た。
前記(5)で得たcDNA(配列番号13)を、哺乳類細胞での蛋白質発現用ベクターpCA7につなぎ、発現プラスミドを得た。前記(4)で得たcDNA(配列番号5)は、文献(Kobayashi et al., 2015, J Biol Chem, 290:19379-19386)に従い、蛋白質発現用ベクターpCA7につなぎ、発現プラスミドを得た。これらの発現プラスミドおよび前記(3-7)で得られた発現プラスミド(配列番号1のcDNAが組み込まれたもの)と、ExpiCHOTM Expression System(Thermo Fisher Scientific)を使い、培養上清画分として各々の組換え蛋白質を得た。
細胞への発現プラスミドのトランスフェクションと組換え蛋白質の回収は、添付の説明書に従った。
これにより、リムルス・ポリフェムスの、C因子活性を有する可能性がある蛋白質(配列番号2)、B因子活性を有する可能性がある蛋白質(配列番号6)、プロクロッティングエンザイム活性を有する可能性がある蛋白質(配列番号14)の発現及び取得に初めて成功した。これら蛋白質の活性解析については後述する。
(7)活性測定
50mMトリス緩衝液(pH8.0)、合成基質(Boc-LGR-pNA)の存在下で、前記(6)で得た3種類の組換え蛋白質の種々の組合せについて、米国薬局方標準エンドトキシン(USP-RSE。生化学工業株式会社)(0EU/mL、0.05EU/mL。EUはエンドトキシン単位)を検体として、エンドトキシンに依存した3種の組換え蛋白質の活性化を調べた。この反応は37℃で30分間行った。
50mMトリス緩衝液(pH8.0)、合成基質(Boc-LGR-pNA)の存在下で、前記(6)で得た3種類の組換え蛋白質の種々の組合せについて、米国薬局方標準エンドトキシン(USP-RSE。生化学工業株式会社)(0EU/mL、0.05EU/mL。EUはエンドトキシン単位)を検体として、エンドトキシンに依存した3種の組換え蛋白質の活性化を調べた。この反応は37℃で30分間行った。
このアッセイ系でカスケード反応が進行すれば、エンドトキシンによりC因子活性を有する蛋白質が活性化され、この活性化されたC因子活性を有する蛋白質によりB因子活性を有する蛋白質が活性化され、この活性化されたB因子活性を有する蛋白質によりプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質が活性化され、この活性化されたプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質により合成基質Boc-LGR-pNAが切断され、これによりpNAが遊離する。pNAの遊離は、吸光度(A405nm)の変化を測定することで検知した。その結果、3種の組換え蛋白質が揃った場合に合成基質の切断がみられた(図3)。なお、図3中、FCは前記(3-7)で得たcDNAから発現させた蛋白質、FBは前記(4)で得たcDNAから発現させた蛋白質、PCEは前記(5)で得たcDNAから発現させた蛋白質である。エンドトキシン検体と混合した状態の反応液(100μL)中の蛋白質終濃度は、FCが22.8μg/mL、FBが20.0μg/mL、PCEが23.5μg/mLであった。各アッセイはN=3で行い、標準偏差をエラーバーとして図中に併記した。
このことから、発現されたC因子活性を有する可能性がある蛋白質、B因子活性を有する可能性がある蛋白質、プロクロッティングエンザイム活性を有する可能性がある蛋白質は、それぞれC因子活性、B因子活性、プロクロッティングエンザイム活性を有し、エンドトキシンと接触することによってカスケード反応が生じることが初めて示された。またこれらの組換え蛋白質を利用して、エンドトキシンを検出できることが初めて示された。
更に、この条件下でエンドトキシンの濃度依存性を調べ、検量線を作成したところ、0.001 から0.1 EU/mLの濃度範囲で良好な直線性を示した(図4)。各エンドトキシン濃度におけるアッセイはN=3で行い、標準偏差をエラーバーとして図中に併記した。
以上の結果から、前記の3種類の各組換え蛋白質を用いることで、エンドトキシンの定量的な高感度かつ高精度での検出も可能であることが初めて示された。
(8)タキプレウス属由来の組換えC因子との活性比較
リムルス・ポリフェムス由来の組換えC因子(以下「LFC」)と、タキプレウス属由来の組換えC因子(以下「TFC」)との活性を比較した。
リムルス・ポリフェムス由来の組換えC因子(以下「LFC」)と、タキプレウス属由来の組換えC因子(以下「TFC」)との活性を比較した。
LFCは、配列番号1のcDNAを前記(6)と同様に発現させ、培養上清画分として得た。TFCは、タキプレウス・トリデンタツスのC因子遺伝子(WO2014/092079の配列番号1)を同文献の実施例1.(2)に記載の方法によって前記(6)と同様に発現させ、培養上清画分として得た。ここでは、蛋白質発現用ベクターとして、いずれもpCI-neo(Promega)を用いた。
試験に付するLFCとTFCについて、C因子特異的なモノクローナル抗体(2C12;Yoshiki Miura, et al., J. Biochem. 112: 476-481 (1992))を用いたウェスタンブロットを行った。等しい容量のサンプル(各3μL)をアプライしてバンドの強度を光学的に測定した結果、LFCは18036、TFCは24516であった。すなわち、等容量のサンプル中の組換えC因子の相対量(TFC/LFC)は1.4であった。
次に、カスケード反応系(C因子、B因子、及びプロクロッティングエンザイムを含有する系)における各組換えC因子の活性を比較した。B因子及びプロクロッティングエンザイムは、いずれもタキプレウス属由来の組換え蛋白質を用いた。前者は、タキプレウス・トリデンタツスのB因子遺伝子(WO2014/092079の配列番号5)を、後者は同生物のプロクロッティングエンザイム遺伝子(同文献の配列番号7)を、それぞれ同文献に記載の方法(実施例 2.組換えファクターBと組換えプロクロッティングエンザイムの調製)で発現させ、培養上清画分として得たものを用いた。
組換えC因子(LFC又はTFC)の各サンプル(いずれも同容量)、並びに前記のタキプレウス・トリデンタツス由来の組換えB因子(TFB)及び同由来の組換えプロクロッティングエンザイム(TPCE)を用いて、前記(7)に記載の方法で活性を測定した。用いる組換えC因子以外の条件は同一とした。
各カスケード反応系における、0EU/mL(ブランク)及び0.05EU/mLの各エンドトキシン濃度における吸光度の変化(mAbs/min)は、LFCの系で0.53及び14.27、TFCの系で0.51、9.15であった。すなわちこの系において、LFCはTFCの約1.6倍(前記の蛋白量の相違を考慮すれば約2.2倍)の活性を示した。
日本国特許出願第2016-204729号(出願日:2016年10月18日)の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
本発明によれば、リムルス・ポリフェムスの凝固メカニズムに関与するすべての完全長の組換え蛋白質、これらをコードするcDNA、これらの用途を提供できる。本発明は、特に、エンドトキシンの検出に有用である。
〔配列表の説明〕
配列番号1:第1cDNAの塩基配列
配列番号2:第1蛋白質のアミノ酸配列
配列番号3:第1cDNA-バリアント1の塩基配列
配列番号4:第1蛋白質-バリアント1のアミノ酸配列
配列番号5:第2cDNAの塩基配列
配列番号6:第2蛋白質のアミノ酸配列
配列番号7:第2cDNA-バリアント1の塩基配列
配列番号8:第2蛋白質-バリアント1のアミノ酸配列
配列番号9:第2cDNA-バリアント2の塩基配列
配列番号10:第2蛋白質-バリアント2のアミノ酸配列
配列番号11:第2cDNA-バリアント3の塩基配列
配列番号12:第2蛋白質-バリアント3のアミノ酸配列
配列番号13:第3cDNAの塩基配列
配列番号14:第3蛋白質のアミノ酸配列
配列番号15:第3cDNA-バリアント1の塩基配列
配列番号16:第3蛋白質-バリアント1のアミノ酸配列
配列番号17:第3cDNA-バリアント2の塩基配列
配列番号18:第3蛋白質-バリアント2のアミノ酸配列
配列番号19:第3cDNA-バリアント3の塩基配列
配列番号20:第3蛋白質-バリアント3のアミノ酸配列
配列番号21:第3cDNA-バリアント4の塩基配列
配列番号22:第3蛋白質-バリアント4のアミノ酸配列
配列番号23:合成基質ペプチドIEGR
配列番号24~34:プライマー
配列番号1:第1cDNAの塩基配列
配列番号2:第1蛋白質のアミノ酸配列
配列番号3:第1cDNA-バリアント1の塩基配列
配列番号4:第1蛋白質-バリアント1のアミノ酸配列
配列番号5:第2cDNAの塩基配列
配列番号6:第2蛋白質のアミノ酸配列
配列番号7:第2cDNA-バリアント1の塩基配列
配列番号8:第2蛋白質-バリアント1のアミノ酸配列
配列番号9:第2cDNA-バリアント2の塩基配列
配列番号10:第2蛋白質-バリアント2のアミノ酸配列
配列番号11:第2cDNA-バリアント3の塩基配列
配列番号12:第2蛋白質-バリアント3のアミノ酸配列
配列番号13:第3cDNAの塩基配列
配列番号14:第3蛋白質のアミノ酸配列
配列番号15:第3cDNA-バリアント1の塩基配列
配列番号16:第3蛋白質-バリアント1のアミノ酸配列
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配列番号19:第3cDNA-バリアント3の塩基配列
配列番号20:第3蛋白質-バリアント3のアミノ酸配列
配列番号21:第3cDNA-バリアント4の塩基配列
配列番号22:第3蛋白質-バリアント4のアミノ酸配列
配列番号23:合成基質ペプチドIEGR
配列番号24~34:プライマー
Claims (4)
- 以下のいずれかである組換え蛋白質。
(A)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。 - 以下の蛋白質を活性化するための、請求項1に記載の組換え蛋白質の使用。
(A)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(D)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。 - 請求項1に記載の組換え蛋白質を検体と接触させるステップを含む、検体中のエンドトキシンの検出方法。
- 請求項1に記載の組換え蛋白質を含む、エンドトキシン検出剤。
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