JP2015152836A - 共焦点光スキャナ - Google Patents

Abstract

【課題】画像処理による偽解像やアーティファクトの影響が抑制された超解像画像を高速（リアルタイム）に得られ、構成が簡素で安価であり、光学調整が容易で環境安定性が高い共焦点光スキャナを提供する。
【解決手段】本発明の記載の共焦点光スキャナは、複数のピンホールを有する光フィルタリング手段と、光を試料上に走査する走査手段とを含む共焦点光スキャナであって、前記光フィルタリング手段は、平板状の本体、該本体の一方の主面側に配された前記ピンホール、及び、該本体の他方の主面において前記ピンホールと略同軸をなす位置に配されたマイクロレンズ、を備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、画像処理による偽解像やアーティファクトの影響が抑制された超解像画像を高速（リアルタイム）に取得できる共焦点光スキャナに関する。

以下では、共焦点光スキャナの技術分野において先行する３つの従来技術について、図面を参照して説明する。本発明者は、これらの従来技術から未解決の課題を導出し、その課題を解決する手段として有効な構成を備えた共焦点光スキャナの開発に成功した。

（Ａ）従来技術１
近年、光学系の解像限界（Ａｂｂｅの回折限界）を超える解像度で、試料画像を得る技術（以降、超解像技術と呼ぶ）が開発・実用化されている。そのような超解像技術の一例として、特許文献１に記載された手法が挙げられる。

（Ａ１）従来技術１の構成および動作
図１６は、従来の共焦点光スキャナの一構成例を示す模式図である。この図面は、特許文献１の実施形態４（図１０Ａ）に相当する。以下では、図１６を用いて構成および動作を説明する。
共焦点光スキャナ１００は、多数のマイクロレンズ１０２ａが規則的に配設されたマイクロレンズディスク１０２と、マイクロレンズ１０２ａに対向する位置に遮光マスク１０３ｂの開口部であるピンホール１０３ａが配設されたピンホールディスク１０３と、マイクロレンズディスク１０２とピンホールディスク１０３とを回転させるモーター１０４とを備えている。

光源装置１０５は、図示しないレーザー等の光源と光学系から成り、コリメートされた照明光を出射する。共焦点光スキャナ１００に入射した照明光は、マイクロレンズディスク１０２上の多数のマイクロレンズ１０２ａにより、多数の照明光ビームレット（Ｂｅａｍｌｅｔ）に分割される。分割された照明光は、ビームスプリッタ１０６を透過し、ピンホールディスク１０３上の多数のピンホール１０３ａのうち、通過したマイクロレンズ１０２ａに対向する位置にあるピンホールを通過する。尚、照明光がピンホール１０３ａを効率良く通過するよう、ピンホール１０３ａはマイクロレンズ１０２ａの焦点面に配設されている。

ピンホールディスク１０３を通過した照明光は、対物レンズ１０７により試料１０８上に集光される。試料１０８は、照明光に基づく戻り光を発する。特に蛍光試料観察の場合、試料１０８は、蛍光色素等を用いて特定の構造を染色したものであり、照明光により蛍光色素分子が励起され、照明光より長波長の蛍光を発する。

対物レンズ１０７により捉えられた戻り光は、共焦点光スキャナ１００のピンホールディスク１０３上に集光される。このとき、対物レンズ１０７の試料側焦点面からの戻り光のみが、ピンホール１０３ａを通過する。一方、焦点面以外からの戻り光は、ピンホール１０３ａ上に焦点を結ばないため、ピンホールディスク１０３の遮光マスク１０３ｂにより遮られ、大部分はピンホール１０３ａを通過できない。

ピンホール１０３ａを通過した戻り光はビームスプリッタ１０６により反射される。特に蛍光観察の場合、ビームスプリッタ１０６は照明光を透過し、照明光より波長の長い蛍光である戻り光を反射する、ショートパス特性の波長分光ビームスプリッタである。ビームスプリッタ１０６を反射した戻り光は、撮像レンズ１０９によりカメラ１１０上に結像する。

同時に、モーター１０４によりマイクロレンズディスク１０２とピンホールディスク１０３とを回転させ、試料１０８全体を照明光により走査する。これにより試料１０８の共焦点像（光学的断層像）をカメラ１１０を用いて撮像可能としている。

このとき、遮光マスク１０３ｂのピンホールパターンにより空間強度分布を変調された照明光が試料１０８に投影される。これにより、試料１０８からの戻り光は、光学系の解像限界を超える高周波成分の一部が、解像限界以下の周波数にシフトされている。更に、戻り光が遮光マスク１０３ｂのピンホールパターンを通過する構成としたことにより、シフトした帯域が元の高周波成分に復調される。従って、カメラ１１０には、光学系の解像限界を超えた高周波成分を持つ共焦点像が撮像される。但し、光学系の解像限界を超えた高周波成分は、低周波成分に比べ弱いコントラストしか持たず、画像上で十分に視認することができないため、画像処理ボード１１１及びＰＣＩ２で高周波強調処理を施し表示する。この結果、光学系の解像限界を超えた高周波成分を十分視認可能な共焦点像を得ることができる。

（Ａ２）従来技術１の課題
上述のように、光学系の解像限界を超えた高周波成分を十分視認可能な共焦点像を得るためには、カメラにより撮影された共焦点像に高周波強調処理を施す必要がある。このため、カメラで撮影された共焦点像に含まれるノイズ成分により、様々な偽解像やアーティファクト（artifact）を生じてしまう。
「自然」を観察する自然科学の分野（たとえばマイクロスコープを用いて、生物標本、細胞などを観察する分野）においては、「人工のもの（観測・解析において発生したデータの歪み、エラーなど）」が発生する場合がある。アーティファクトとは、この「人工のもの」を意味する。

また、高周波強調処理の強度や帯域といったパラメータは白明なものではなく、処理結果の画像に偽解像やアーティファクトを含まないように、パラメータを個々の画像において試行錯誤する必要がある。更には、処理の結果、視認できた高周波成分が、実際の試料の微細構造を反映したものであるのか、或いは、偽解像によるものであるのかを判別することができない。

また、高周波強調処理による解像度の向上は、撮影された画像の面内（ＸＹ面内）のみであり、画像に対し垂直な光軸方向（Ｚ軸方向）の解像度は向上しない。従って、試料の立体構造を詳細に観察することが困難である。

また、高周波強調処理には長い処理時間を要するため、リアルタイムで超解像画像を表示することが困難である。更に、高周波強調処理を行うためには高性能のＰＣと画像処理ボードが必要となり、装置構成が複雑かつ高価になるという課題もあった。

（Ｂ）従来技術２
超解像効果を有する共焦点顕微鏡の一例として、たとえば非特許文献１に記載された「Image Scanning Microscopy（ＩＳＭ)」方式が挙げられる。以下では、図１７を用いて構成および動作を説明する。

（Ｂ１）従来技術２の構成および動作
図１７は、従来の共焦点顕微鏡一構成例を示す模式図である。以下では、図１７を用いて構成および動作を説明する。
ＩＳＭ方式の共焦点顕微鏡は、従来技術１と同様の共焦点光スキャナを用いる。この共焦点光スキャナ２００は、光源装置２０５にシャッタ２０５ａを備え、また、モーター２０４とシャッタ２０５ａ及びカメラ２１０の同期制御を行う同期制御装置２１３を備える。

シャッタ２０５ａは、一回の撮影あたり数マイクロ秒の短時間のみ、光源装置２０５からの照明光をストロボ状に通過させる。この短時間の照明期間においては、モーター２０４により回転しているピンホールディスク２０３が略止まった状態と見なせる。ゆえに、カメラ２１０が照明期間と同じ短時間のみ撮影する構成をとることにより、照明光が試料２０８を走査せずに略止まった状態の共焦点像（非走査共焦点像）を得ることができる。この非走査共焦点像は、遮光マスク２０３ｂのピンホールパターン上の、多数のピンホール２０３ａの位置に対応する試料２０８の位置からの戻り光のみが撮影されるので、１枚の画像上に多数の輝点が記録されたものとなる。

同期制御装置２１３を用いてモーター２０４とシャッタ２０５ａ及びカメラ２１０の同期制御を行いながら、上記の非走査共焦点像を数百枚、撮影する。
その際、画像ごとに多数の輝点の位置が少しずつ異なり、かつ、全画像を合わせると輝点が画像全体を埋め尽くすよう、モーター２０４の回転に対するシャッタ２０５ａの開閉タイミングを一定間隔ずつ、ずれるように同期制御を行う。

このようにして得られた数百枚の非走査共焦点像に対し、次のような画像処理を施す。非走査共焦点像に記録された多数の輝点の全てについて輝点の中心座標を求め、輝点近傍のピクセルについて、中心までの距離が元の１／２となるようシフトする。言い換えれば、多数の輝点をそれぞれ１／２のサイズとなるよう縮小する画像処理を施す。最後に、輝点の縮小処理を施した数百枚の非走査共焦点像を全て足し合わせることで、超解像画像が得られる。

以下、図１８及び図１９を参照して、超解像画像が得られる理由を説明する。図１８は二次元イメージセンサー（カメラ）を用いた共焦点光学系を表した模式図である。簡単のため、照明側と撮像側を左右に分けて図示しており、点光源から試料面までが照明側、試料面から像面までが撮像側である。また、簡単のため対物レンズの倍率を１倍としているが、この仮定は議論の一般性を損なうものではない。倍率を１倍と仮定することで、試料面と像面とを上下逆の等スケールの座標で扱うことができる。

光軸上の点光源から発した照明光は、対物レンズにより試料面に焦点を結ぶ。このとき、光の回折により、試料面における照明光の強度分布は、図１８に示すように、座標０（ゼロ）を中心に一定の広がりをもつ。この光の広がりは、一般にエアリーディスク（airy disc） と呼ばれる。次に、照明光を試料に照射することにより発生する、試料面上の座標０、ｄ／２、ｄの３点から発せられた戻り光を考える。尚、この３点は照明光のエアリーディスク内にあるものとする。図１８において、像前に描かれた３つの曲線は、試料面上の座標０、ｄ／２、ｄから発せられた戻り光の、像面におけるそれぞれの強度分布曲線である。図１８に示すように、強度分布曲線は、それぞれ像面上座標０、ｄ／２、ｄにピークを有し、それぞれのピークの高さは、試料面座標０、ｄ／２、ｄにおける照明光強度に比例する。

戻り光は、像面にある二次元イメージセンサー（カメラ）によって受光される。像面上座標ｄの位置（図１８のピクセル２にあたる位置）における受光量を考える。図１８において、試料面上座標０、ｄ／２、ｄから発せられた戻り光のそれぞれの強度分布を、像面上座標ｄの位置において比較すると、試料面上座標ｄ／２からの戻り光が最も大きくなることが分かる。つまり、像面上座標ｄの位置のピクセルは、試料面上座標ｄからの戻り光ではなく、試料面上座標ｄ／２からの戻り光を最も明るく受光する。このことは、エアリーディスク内という微視的な領域において、試料面から像面へ２倍に拡大投影されていることを示している。

上記の光学的な現象は、数式を用いて次のように説明される。
戻り光が発生する試料面上の位置をｘとし、像面上の位置ｄにおける受光量をＩ（ｘ）と定義した場合、受光量Ｉ（ｘ）は、式（１）により表される。
ここで、ＰＳＦ_ｉｌｌ（ｘ）及びＰＳＦ_ｉｍｇ（ｘ）は、それぞれ照明側及び撮像側の点像分布関数である。

一般に点像分布関数ＰＳＦ（ｘ）は、第１種ベッセル関数Ｊ_１ と光学系の開口数ＮＡと波長λとを用いて、式（２）により表される。

式（１）より、Ｉ（ｘ）は、ピーク位置が距離ｄだけ異なる２つの点像分布関数の積として表されるので、Ｉ（ｘ）の概形は、図１９（横軸：座標、縦軸：光強度）に示すように、ｄ／２にピークを有する。つまり、像面上座標ｄの位置のピクセルは、試料面上座標ｄ／２からの戻り光を最も明るく受光することが、数式（１）からも示される。

以上のように、二次元イメージセンサー（カメラ）を用いた共焦点光学系においては、非走査共焦点像の個々の輝点を中心としたエアリーディスク内の領域では、試料面から像面へ２倍に拡大投影されている。このため、エアリーディスク領域内を１／２に縮小し、試料面上座標と像面上座標とを一致させる補正処理を行うことにより、光学系の解像限界を上回る高周波成分を得ることができる。何故ならば、エアリーディスク領域内を１／２に縮小する処理は、光学系の点像分布関数の幅を半分にすることに相当するためである。以上の結果として、光学系の解像限界（回折限界）の２倍の解像度を持つ超解像画像を得られる。

（Ｂ２）従来技術２の課題
上述した通り、従来技術２の手法は、一枚の超解像画像を得るために、数百枚の非走査共焦点像を撮影する必要がある。その際、一枚の超解像画像につき数十秒の撮影時間を要するため、時間分解能が低く、高速な現象を捉えることが困難であることから、リアルタイムでの超解像画像の表示が極めて難しい。

また、高速なシャッタと同期制御装置及び高性能のＰＣが必要となり、装置構成が複雑かつ高価にならざるを得ない。
また、本手法による解像度の向上は、撮影された画像の面内（ＸＹ面内）のみであり、画像に対し垂直な光軸方向（Ｚ軸方向）の解像度は向上しない。従って、試料の立体構造を詳細に観察することが困難であるという課題もあった。

（Ｃ）従来技術３
超解像効果を有する共焦点顕微鏡の他の一例として、たとえば特許文献２に記載された「Multi-Focal Structured Illumination Microscopy」方式が挙げられる。以下では、図２０を参照して構成および動作を説明する。

（Ｃ１）従来技術３の構成および動作
共焦点光スキャナ３５０は、多数のマイクロレンズが規則的に配設されたマイクロレンズアレイ３４１、３５２、３５３と、ピンホールアレイ３５１と、ガルバノミラー３４９と、ビームスプリッタ３０６と、リレーレンズ３４３、３４４、３４５と、ミラー３４６、３４７とを備えている。

ピンホールアレイ３５１は、マイクロレンズアレイ３４１の個々のマイクロレンズ３４１ａの焦点位置に光学的に対応する位置（共役な位置）に、遮光マスク３５１ｂの開口部であるピンホール３５１ａが配設されている。マイクロレンズアレイ３５２は、ピンホールアレイ３５１の個々のピンホール３５１ａと対向する位置にマイクロレンズ３５２ａが配設されている。更に、マイクロレンズアレイ３５３は、マイクロレンズアレイ３５２の個々のマイクロレンズ３５２ａと対向する位置にマイクロレンズ３５３ａが配設されている。但し、マイクロレンズ３４１ａ、３５２ａ、３５３ａは、レンズ効果を備えていれば他の光学素子（例えば、フレネルレンズ、回折光学素子など）に置き換えても構わない。

ピンホールアレイ３５１とマイクロレンズアレイ３５２との間隔は、マイクロレンズアレイ３５２の個々のマイクロレンズ３５２ａの焦点距離に等しい。従って、マイクロレンズアレイ３５２は、ピンホールアレイ３５１側から入射した光線を、マイクロレンズアレイ３５２出射後の空間において、平行光に変換する。マイクロレンズアレイ３５３の個々のマイクロレンズ３５３ａの焦点距離は、マイクロレンズ５２ａの１／２としてある。従って、マイクロレンズアレイ３５２及び３５３は、ピンホールアレイ３５１から入射した光線を、マイクロレンズアレイ３５３出射後の空間において、マイクロレンズ３５２入射前の２倍の開口数を持つ光線に変換する。

光源装置３０５は、図示しないレーザー等の光源と光学系から成り、コリメートされた照明光を出射する。照明光は、マイクロレンズアレイ３４１により、多数の照明光ビームレットに分割される。マイクロレンズアレイ３４１は、照明光ビームレットの開口数が、対物レンズ３０７の開口数を倍率で割った値に近いか、より大きくなるよう設計されていることが望ましい。

照明光は、ビームスプリッタ３０６及びリレーレンズ３４３を通過し、ガルバノミラー３４９により反射され、リレーレンズ３４４及び対物レンズ３０７を通過して、試料３０８上に集光される。このとき、ガルバノミラー３４９を変向させることで、試料３０８全体を照明光で走査する。

試料３０８は、照明光に基づく戻り光を発する。特に蛍光試料観察の場合、試料３０８は、蛍光色素等で特定の構造を染色したものであり、照明光により蛍光色素分子が励起され、照明光より長波長の蛍光を発する。

対物レンズ３０７により捉えられた戻り光は、リレーレンズ３４４を通過し、ガルバノミラー３４９で反射（デスキャン）され、リレーレンズ３４３を通過し、ビームスプリッタ３０６で反射される。特に蛍光観察の場合、ビームスプリッタ３０６は照明光を透過し、照明光より波長の長い蛍光である戻り光を反射する、ショートパス特性の波長分光ビームスプリッタである。

ビームスプリッタ３０６で反射された戻り光は、ピンホールアレイ３５１上に集光され、ピンホール３５１ａを通過する。このとき、対物レンズ３０７の試料側焦点面からの戻り光のみがピンホール３５１ａを通過する。一方、焦点面以外からの戻り光はピンホール３５１ａ上に焦点を結ばないため、ピンホールアレイ３５１の遮光マスク３５１ｂにより遮られ、大部分はピンホール３５１ａを通過できない。

ピンホール３５１ａを通過した戻り光は、マイクロレンズアレイ３５２、３５３により、マイクロレンズアレイ３５２に入射する前の２倍の開口数を持つ光線に変換される。

マイクロレンズアレイ３５３を通過した戻り光は、リレーレンズ３４５、ミラー３４６、ミラー３４７を通過して、ガルバノミラー３４９で反射（リスキャン）され、撮像レンズ３４８により、カメラ３１０上に結像する。このとき、リレーレンズ３４５及び撮像レンズ３４８の開口数は、マイクロレンズ３５２、３５３により２倍の開口数に変換後の戻り光の開口数に近いか、より大きいことが望ましい。

同時に、ガルバノミラー３４９を変向させて、試料３０８全体を照明光で走査し、更に、試料３０８からの戻り光をカメラ３１０上に走査投影することで、試料３０８の超解像共焦点像をカメラ３１０で撮像可能としている。

「従来技術２」は、図１８及び図１９を参照して上述したように、二次元イメージセンサー（カメラ）を用いた共焦点光学系においては、個々の輝点を中心としたエアリーディスク内の領域では、試料面から像面へ２倍に拡大投影されているため、エアリーディスク領域内を１／２に縮小し、試料面上座標と像面上座標を一致させる補正処理を行うことで、光学系の解像限界を上回る高周波成分を得ることができる。これに対して、「従来技術３」では、エアリーディスク領域内の１／２倍の縮小を光学的に実施している。なぜなら、マイクロレンズアレイ３５２、３５３により、対物レンズ３０７からの戻り光の開口数を２倍に変換することで、数式（２）より光学系の点像分布関数の幅が１／２になり、即ち、エアリーディスク領域内が１／２に縮小された形でカメラ３１０に投影されるためである。

また、「従来技術２」では、数百枚の非走査共焦点像を撮影し、それらを積算する必要があった。これに対して、「従来技術３」によれば、光学的にエアリーディスク領域内を１／２に縮小した状態でカメラ３１０に投影されているので、ガルバノミラー３４９を変向させて試料３０８全体を照明光で走査する間、一回の撮影のみを行えばよく、短時間で容易に光学系の解像限界（回折限界）の２倍の解像度を持つ超解像共焦点像を得ることができる。

（Ｃ２）従来技術３の課題
従来技術３を実施するためには、次の３点が安定に確保されることが重要である。
・マイクロレンズアレイ３４１を構成する個々のマイクロレンズ３４１ａの焦点位置と、ピンホールアレイ３５１の個々のピンホール３５１ａの位置とは、光学的に対応する位置関係（共役）となるよう精密に配置する必要がある。
・ピンホールアレイ３５１の個々のピンホール３５１ａは、マイクロレンズアレイ３５２の個々のマイクロレンズ３５２ａの焦点位置に精密に配置する必要がある。
・マイクロレンズアレイ３５３の個々のマイクロレンズ３５３ａは、マイクロレンズアレイ３５２の個々のマイクロレンズ３５２ａと同軸となるよう精密に配置する必要がある。

以上のように、空間的に隔てて配置された複数のマイクロ光学素子（マイクロレンズアレイ３４１、３５２、３５３及びピンホールアレイ３５１）のそれぞれを精密に配置する必要があるため、従来技術３は、精密な位置・角度調整機構が複数必要となり、構成が複雑かつ高価で、光学調整が困難である。また、従来技術３では、複数のマイクロ光学素子が空間的に隔てて配置されているため、温度等の環境変化によって、マイクロ光学素子同士の相対位置が変化し、容易に光学調整が崩れてしまい、長期間、安定して使用することができないという課題もあった。

特開２０１２−７８４０８号公報（特許第５４１２３９４号公報） 国際公開第２０１３／１２６７６２号 Schulz, O. et al. Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America,Vol.110,pp.21000-21005 (2013)

本発明は、このような従来の実情に鑑みて考案されたものであり、画像処理による偽解像やアーティファクトの影響が抑制された超解像画像を高速（リアルタイム）に得られ、構成が簡素で安価であり、光学調整が容易で環境安定性が高く、さらには、画像のＸＹ面内だけでなく、軸方向（Ｚ軸方向）にも超解像効果を有し、試料の立体構造を微細観察するのに適した共焦点光スキャナを提供することを目的とする。

本発明の請求項１に記載の共焦点光スキャナは、複数のピンホールを有する光フィルタリング手段と、光を試料上に走査する走査手段とを含む共焦点光スキャナであって、前記光フィルタリング手段は、平板状の本体、該本体の一方の主面側に配された前記ピンホール、及び、該本体の他方の主面において前記ピンホールと略同軸をなす位置に配されたマイクロレンズ、を備えることを特徴とする。
本発明の請求項２に記載の共焦点光スキャナは、請求項１において、前記光フィルタリング手段はディスク形状を成しており、前記走査手段はモーターから成り、前記マイクロレンズは凸レンズ状を成す構成を備え、前記マイクロレンズが、前記光フィルタリング手段の前記試料側に位置する主面に配されたことを特徴とする。
本発明の請求項３に記載の共焦点光スキャナは、請求項１において、前記光フィルタリング手段はディスク形状を成しており、前記走査手段はモーターから成り、前記マイクロレンズは凹レンズ状を成す構成を備え、前記マイクロレンズが、前記光フィルタリング手段の前記試料と反対側に位置する主面に配されたことを特徴とする。
本発明の請求項４に記載の共焦点光スキャナは、請求項１において、前記光フィルタリング手段はアレイ形状を成しており、前記走査手段はガルバノミラーから成り、前記マイクロレンズは凸レンズ状を成す構成を備え、前記マイクロレンズが、前記光フィルタリング手段の入射側に位置する主面に配されたことを特徴とする。
本発明の請求項５に記載の共焦点光スキャナは、請求項１において、前記光フィルタリング手段はアレイ形状を成しており、前記走査手段はガルバノミラーから成り、前記マイクロレンズは凹レンズ状を成す構成を備え、前記マイクロレンズが、前記光フィルタリング手段の出射側に位置する主面に配されたことを特徴とする。
本発明の請求項６に記載の共焦点光スキャナは、請求項１において、前記光フィルタリング手段はディスク形状の本体から構成され、前記走査手段はモーターから成り、前記マイクロレンズが、該本体の前記試料側に位置する主面に凸レンズ状を成す構成を備え、前記ピンホールが、該本体の前記試料と反対側に位置する主面に形成された凹状のミラーの中心と同軸を成すように配されていることを特徴とする。
本発明の請求項７に記載の共焦点光スキャナは、請求項１乃至６のいずれか一項において、前記光フィルタリング手段と前記走査手段に加えて、中間変倍光学系を備えることを特徴とする。
本発明の請求項８に記載の共焦点光スキャナは、請求項１乃至７のいずれか一項において、前記光フィルタリング手段は、前記試料から入射する光の開口数を、前記光フィルタリング手段に入射する前の１．２〜４倍に変換して出射することを特徴とする。

本発明の共焦点光スキャナは、複数のピンホールを有する光フィルタリング手段と、光を試料上に走査する走査手段とを含み、前記光フィルタリング手段は、平板状の本体と、該本体の一方の主面に配された前記ピンホールと、該本体の他方の主面において前記ピンホールと略同軸をなす位置に配されたマイクロレンズと、を備えている。
かかる構成によれば、マイクロレンズ付きピンホールディスクにより、対物レンズからの戻り光の開口数を変換できるので、光学系の点像分布関数の幅が小さくなり、即ち、エアリーディスク領域内が縮小された形でカメラに投影される。
これにより、本発明は、画像処理による偽解像やアーティファクトの影響が抑制された超解像画像を高速（リアルタイム）に取得できるとともに、構成が簡素で安価であり、光学調整が容易で環境安定性の高い共焦点光スキャナを提供することができる。
また、上記構成からなる共焦点光スキャナは、画像のＸＹ面内だけでなく、軸方向（Ｚ軸方向）にも超解像効果を有することから、試料の立体構造を微細観察する用途に適している。

本発明に係る共焦点光スキャナの一例（第一実施形態）を模式的に示す図。 図１において、マイクロレンズ付きピンホールディスクの一部を拡大して示す図。 本発明に係る共焦点光スキャナの他の一例（第二実施形態）を模式的に示す図。 図３において、マイクロレンズ付きピンホールディスクの一部を拡大して示す図。 本発明に係る共焦点光スキャナの他の一例（第三実施形態）を模式的に示す図。 本発明に係る共焦点光スキャナの他の一例（第四実施形態）を模式的に示す図。 本発明に係る共焦点光スキャナの他の一例（第五実施形態）を模式的に示す図。 本発明に係る共焦点光スキャナの他の一例（第六実施形態）を模式的に示す図。 図８の変形例（第六実施形態）を模式的に示す図。 図８の他の変形例（第六実施形態）を模式的に示す図。 図８の他の変形例（第六実施形態）を模式的に示す図。 図８の他の変形例（第六実施形態）を模式的に示す図。 図１０において、スキャンディスクの一部を拡大して示す図。 図１０において、スキャンディスクの一部を拡大して示す図。 図１０において、スキャンディスクの一部を拡大して示す図。 従来の共焦点光スキャナの一例（従来技術１）を模式的に示す図。 従来の共焦点光スキャナの他の一例（従来技術２）を模式的に示す図。 二次元イメージセンサー（カメラ）を用いた共焦点光学系を模式的に示す図。 図１８の共焦点光学系における点像分布関数ＰＳＦ（ｘ）を示す図。 従来の共焦点光スキャナの他の一例（従来技術３）を模式的に示す図。

以下では、本発明に係る共焦点光スキャナの一実施形態について、図面に基づいて説明する。

＜第一実施形態＞
本発明に係る共焦点光スキャナの第一実施形態について説明する。
図１は、本実施形態の共焦点光スキャナの一構成例を模式的に示す図である。
この共焦点光スキャナは、複数のピンホールを有する光フィルタリング手段と、光を試料上に走査する走査手段とを備える。

そして本実施形態の共焦点光スキャナは、光フィルタリング手段は、平板状の本体と、本体の一方の主面側に配されたピンホールと、他方の主面のピンホールと略同軸をなす位置に配されたマイクロレンズとを備える。

光フィルタリング手段はディスク形状をなしており、マイクロレンズは凸レンズ状であり、マイクロレンズが光フィルタリング手段の試料側の主面に配されている。すなわち、本実施形態の共焦点光スキャナでは、光フィルタリング手段が、一枚の平板の表裏にピンホールとマイクロレンズとを略同軸に備えている。

本実施形態の共焦点光スキャナ２０の構成と動作について、図１を参照して説明する。
共焦点光スキャナ２０は、多数のマイクロレンズ２ａが規則的に配設されたマイクロレンズディスク２と、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１（光フィルタリング手段）と、それらを回転させるモーター４（走査手段）とを備えている。

マイクロレンズ付きピンホールディスク２１は、マイクロレンズディスク２の個々のマイクロレンズ２ａに対向する位置に、遮光マスク２１ｂの開口部であるピンホール２１ａが配設される。更に、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１は、主面に配された個々のピンホール２１ａと、その主面と反対側に位置する裏面に配されたマイクロレンズ２１ｃとは、略同軸を成すように設けられている。なお、ピンホール２１ａの中心軸とマイクロレンズ２１ｃの中心軸とのズレ量は、１００μｍ以下であることが望ましい。但し、マイクロレンズ２ａ及びマイクロレンズ２１ｃは、レンズ効果があれば何れの光学素子でもよく、例えば、フレネルレンズや回折光学素子でも良い。

ここで、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１は、試料から入射する光の開口数を、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１に入射する前の１．２〜４倍に変換して出射する。
なお、以下の説明では、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１が、試料から入射する光の開口数を、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１に入射する前の２倍に変換して出射する場合を例に挙げて説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

図２を参照して、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１の機能を詳細に説明する。図２は、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１上の一組のピンホール２１ａとマイクロレンズ２１ｃとを拡大して示した詳細図である。
図２の下方から入射する光線（太い実線）を考えると、この光線は、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１に入射する以前の空間では、開口数（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ａｐｅｒｔｕｒｅ，ＮＡ）がｓｉｎ（θ）で表される収束光線である。即ち、この光線は、光軸に対しθの傾きを持つ。この光線はマイクロレンズ２１ｃで屈折されることにより、開口数がｎ×ｓｉｎ（η）の光線に変換される。即ち、光軸に対しηの傾きを持つ。但し、ｎはマイクロレンズ付きピンホールディスク２１の基材の屈折率である。ここで、マイクロレンズ２１ｃの曲率半径ｒは、この光線がピンホール２１ａを出射した後の空間において、開口数がｓｉｎ（２θ）で表される発散光線、即ち、光軸に対し２θの傾きを持つ光線となるように決める。

これを満たすマイクロレンズ２１ｃの曲率半径ｒは、以下のように求めることが出来る。マイクロレンズ付きピンホールディスク２１の基材の厚さをｔ、マイクロレンズ２１ｃの中心角の半角をφと定義すると、マイクロレンズ２１ｃにおける屈折の法則より、式（３）に示す関係が成り立つ。

また、ピンホール２１ａ側の面における屈折の法則より、式（４）に示す関係が成り立つ。

さらに、マイクロレンズ２１ｃ側の面において、光線から光軸までの距離に関しては、式（５）に示す関係が成り立つ。

式（３）〜（５）より、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１の基材の屈折率ｎと厚さｔと光線の入射角θとが与えられれば、上記の条件を満たすマイクロレンズ２１ｃの曲率半径ｒを一意に求めることができる。例えば、ｎ＝１．５，ｔ＝３．０ｍｍ，θ＝０．０１５ｒａｄとした場合、曲率半径ｒは２．０ｍｍとなる。

尚、対物レンズ７からマイクロレンズ２１ｃへと入射する戻り光の開口数は、対物レンズ７の開口数を倍率で割った値であり、その値は一般に０．０１〜０．０５ｒａｄの範囲であるから、ｓｉｎ（θ）≒θの近似が成り立つ。つまり、空気中における開口数ｓｉｎ（θ）と、光軸に対する角度θとは略等しい。従って、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１は、マイクロレンズ２１ｃ側から入射した光線を、ピンホール２１ａ出射後の空間において、入射前の２倍の開口数を持つ光線に変換する機能を有すると言える。逆に、ピンホール２１ａ側から入射した光線を、マイクロレンズ２１ｃ出射後の空間において、入射前の１／２倍の開口数を持つ光線に変換する機能を有すると言える。以上がマイクロレンズ付きピンホールディスク２１の機能の詳細説明である。

再び、図１を参照して説明する。
光源装置５は、不図示のレーザー等の光源と光学系から成り、コリメートされた照明光を出射する。共焦点光スキャナ２０に入射した照明光は、マイクロレンズディスク２上の多数のマイクロレンズ２ａにより、多数の照明光ビームレットに分割される。分割された光は、ビームスプリッタ６を透過し、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１上の多数のピンホール２１ａのうち、通過したマイクロレンズ２ａに対向する位置にあるピンホールを通過する。尚、照明光がピンホール２１ａを効率良く通過するように、ピンホール２１ａは、マイクロレンズ２ａの焦点面に配設されている。更に、照明光はマイクロレンズ２１ｃを通過する。その際、上述のようにマイクロレンズ２１ｃによって、照明光の、個々のビームレットの開口数が１／２に変換される。ここで、変換後のビームレットの開口数は、対物レンズ７の開口数を倍率で割った値に近いか、より大きいことが望ましい。

マイクロレンズ付きピンホールディスク２１を通過した照明光は、対物レンズ７により試料８上に集光される。試料８は、照明光に基づく戻り光を発する。特に蛍光試料観察の場合、試料８は蛍光色素等で特定の構造を染色したものであり、照明光により蛍光色素分子が励起され、照明光より長波長の蛍光を発する。

対物レンズ７により捉えられた戻り光は、共焦点光スキャナ２０のマイクロレンズ付きピンホールディスク２１上に集光され、マイクロレンズ２１ｃにより２倍の開口数に変換され、ピンホール２１ａを通過する。このとき、対物レンズ７の試料側焦点面からの戻り光のみがピンホール２１ａを通過する。一方、焦点面以外からの戻り光はピンホール２１ａ上に焦点を結ばないため、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１の遮光マスク２１ｂにより遮られ、大部分はピンホール２１ａを通過できない。

ピンホール２１ａを通過した戻り光は、ビームスプリッタ６により反射される。特に蛍光観察の場合、ビームスプリッタ６は、照明光を透過し、照明光より波長の長い蛍光である戻り光を反射する、ショートパス特性の波長分光ビームスプリッタである。ビームスプリッタ６を反射した戻り光は、撮像レンズ９によりカメラ１０上に結像する。このとき、撮像レンズ９の開口数は、マイクロレンズ２１ｃにより２倍の開口数に変換され、カメラ１０に結像する際の戻り光の開口数に近いか、より大きいことが望ましい。

同時に、モーター４によりマイクロレンズディスク２とマイクロレンズ付きピンホールディスク２１とを回転させ、試料８全体を照明光で走査する。これにより試料８の超解像共焦点像をカメラ１０で撮像可能としている。

「従来技術２」において図１８及び図１９を参照して説明したように、二次元イメージセンサー（カメラ）を用いた共焦点光学系においては、個々の輝点を中心としたエアリーディスク内の領域では、試料面から像面へ２倍に拡大投影されている。このため、エアリーディスク領域内を１／２に縮小し、試料面上座標と像面上座標を一致させる補正処理を行うことで、光学系の解像限界を上回る高周波成分を得ることができる。

これに対し、本実施形態では、エアリーディスク領域内の１／２倍の縮小を光学的に実施している。なぜなら、マイクロレンズ付きピンホールディスク２１により、対物レンズ７からの戻り光の開口数を２倍に変換することで、数式（２）より、光学系の点像分布関数の幅が１／２になり、即ち、エアリーディスク領域内が１／２に縮小された形でカメラ１０に投影されるからである。

さらに、「従来技術２」においては、数百枚の非走査共焦点像を撮影し、それらを積算する必要があったが、本実施形態によれば、光学的にエアリーディスク領域内を１／２に縮小した状態でカメラ１０に投影されているので、モーター４を回転させて試料８全体を照明光で走査する間、一回の撮影のみを行えばよい。これにより、非常に短時間で容易に、光学系の解像限界（回折限界）の２倍の解像度を持つ超解像共焦点像を得られる。

また、「従来技術１」においては、撮影された画像に高周波強調処理を施す必要があったが、本実施形態によれば、カメラ１０で撮影された画像そのものが、光学系の解像限界（回折限界）の２倍の解像度を持つ超解像共焦点像であり、撮影された画像に高周波強調処理を施す必要が無い。このため、カメラで撮影された共焦点像に含まれるノイズ成分による、様々な偽解像やアーティファクトを生じる危険性が無い。従って、高周波強調処理の強度や帯域といったパラメータを試行錯誤する必要が無く、偽解像に惑わされる危険性も無い。

また、本実施形態では、光学的に対物レンズ７からの戻り光がカメラ１０に投影されるときの開口数を２倍に変換にしているため、撮影された画像の面内（ＸＹ面内）のみならず、画像に対し垂直な光軸方向（Ｚ軸方向）も解像度が向上する。なぜなら、光軸方向の点像分布関数は、以下に示す式（６）で表され、光軸方向の点像分布関数の幅は開口数の２乗に反比例するためである。従って、本発明は、試料の立体構造を詳細に観察するのに好適である。

また、本実施形態におけるマイクロレンズ付きピンホールディスク２１は、一枚の基板上にピンホール２１ａとマイクロレンズ２１ｃとを形成してあるため、ピンホール２１ａとマイクロレンズ２１ｃ間の機械的な調整が不要であり、機械的安定性や、温度等の環境変化に対する安定性が非常に良いという優れた特徴をも有する。また、共焦点光スキャナ１は、マイクロレンズディスク２とマイクロレンズ付きピンホールディスク２１とをモーター４の同軸上に固定した構造であり、機械的安定性や、温度等の環境安定性、調整性が優れている。

また、本実施形態は、従来の共焦点光スキャナにおけるピンホールディスクをマイクロレンズ付きピンホールディスク２１に置き換えたのみであり、装置構成が容易かつ安価である。

＜第二実施形態＞
つぎに、本発明に係る共焦点光スキャナの第二実施形態について説明する。
図３は、本実施形態の共焦点光スキャナの一構成例を模式的に示す図である。
なお、本実施形態においては、上述した第一実施形態と異なる部分について主に説明し、第一実施形態とほぼ同様の部分については、同じ符号を付するとともに、その詳細な説明を省略する。

本実施形態の共焦点光スキャナにおいて、走査手段はモーターであり、光フィルタリング手段はディスク形状をなしており、マイクロレンズは凹レンズ状であり、マイクロレンズが光フィルタリング手段の試料と反対側の主面に配されている。

第二実施形態の共焦点光スキャナ３０の構成と動作について、図３を参照して説明する。
共焦点光スキャナ３０は、多数のマイクロレンズ２ａが規則的に配設されたマイクロレンズディスク２と、マイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１（光フィルタリング手段）と、それらを回転させるモーター４（走査手段）とを備えている。マイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１は、マイクロレンズディスク２の個々のマイクロレンズ２ａに対向する位置にマイクロ凹レンズ３１ｃが配設され、更に、個々のマイクロ凹レンズ３１ｃの裏面に遮光マスク３１ｂの開口部であるピンホール３１ａが配設されている。但し、マイクロレンズ２ａ及びマイクロ凹レンズ３１ｃは、レンズ効果があれば何れの光学素子でもよく、例えば、フレネルレンズや回折光学素子でも良い。

ここで図４を参照して、マイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１の機能を詳細に説明する。図４は、マイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１上の一組のピンホール３１ａとマイクロ凹レンズ３１ｃとを拡大して示した詳細図である。
図４の下方から入射する光線（太い実線）を考えると、この光線はマイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１に入射する以前の空間では、開口数がｓｉｎ（θ）で表される収束光線である。即ち、この光線は、光軸に対しθの傾きを持つ。この光線はピンホール３１ａへの入射面で屈折されることにより、開口数がｎ×ｓｉｎ（η）の光線に変換される。即ち、光軸に対しηの傾きを持つ。但し、ｎはマイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１の基材の屈折率である。ここで、マイクロ凹レンズ３１ｃの曲率半径ｒは、この光線がマイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１の反対側のマイクロ凹レンズ３１ｃを出射した後の空間において、開口数がｓｉｎ（２θ）で表される発散光線、即ち、光軸に対し２θの傾きを持つ光線となるように決める。

これを満たすマイクロ凹レンズ３１ｃの曲率半径ｒは、以下のように求めることが出来る。

マイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１の基材の厚さをｔ、マイクロ凹レンズ３１ｃの中心角の半角をφとすると、マイクロ凹レンズ３１ｃにおける屈折の法則より、式（７）に示す関係が成り立つ。

また、遮光マスク３１ｂ側の面における屈折の法則より、式（８）に示す関係が成り立つ。

さらに、マイクロ凹レンズ３１ｃ側の面において、光線から光軸までの距離に関しては、式（９）に示す関係が成り立つ。

式（７）〜（９）より、マイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１の基材の屈折率ｎと厚さｔと光線の入射角θとが与えられれば、上記の条件を満たすマイクロ凹レンズ３１ｃの曲率半径ｒを一意に求めることができる。例えば、ｎ＝１．５，ｔ＝３．０ｍｍ，θ＝０．０１５ｒａｄとした場合、曲率半径ｒは１．０ｍｍとなる。

以上より、マイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１は、ピンホール３１ａ側から入射した光線を、マイクロ凹レンズ３１ｃ出射後の空間において、入射前の２倍の開口数を持つ光線に変換する機能を有すると言える。逆に、マイクロ凹レンズ３１ｃ側から入射した光線を、ピンホール３１ａ出射後の空間において、入射前の１／２倍の開口数を持つ光線に変換する機能を有すると言える。以上がマイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１の機能の詳細説明である。

再び、図３を参照して、説明する。
光源装置５は、不図示のレーザー等の光源と光学系から成り、コリメートされた照明光を出射する。共焦点光スキャナ３０に入射した照明光は、マイクロレンズディスク２上の多数のマイクロレンズ２ａにより、多数の照明光ビームレットに分割される。分割された照明光は、ビームスプリッタ６を透過し、マイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１上の多数のマイクロ凹レンズ３１ｃのうち、通過したマイクロレンズ２ａに対向する位置にあるマイクロ凹レンズを通過する。その際、上述のようにマイクロ凹レンズ３１ｃによって、個々のビームレットの開口数が１／２に変換される。ここで、変換後のビームレットの開口数は、対物レンズ７の開口数を倍率で割った値に近いか、より大きいことが望ましい。更に、照明光はピンホール３１ａを通過する。尚、照明光がピンホール３１ａを効率良く通過するよう、ピンホール３１ａはマイクロレンズ２ａの焦点面に配設されている。

マイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１を通過した照明光は、対物レンズ７により試料８上に集光される。試料８は、照明光に基づく戻り光を発する。特に蛍光試料観察の場合、試料８は蛍光色素等で特定の構造を染色したものであり、照明光により蛍光色素分子が励起され、照明光より長波長の蛍光を発する。

対物レンズ７により捉えられた戻り光は、共焦点光スキャナ３０のマイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１上に集光され、ピンホール３１ａを通過し、マイクロ凹レンズ３１ｃにより２倍の開口数に変換される。このとき、対物レンズ７の試料側焦点面からの戻り光のみがピンホール３１ａを通過する。一方、焦点面以外からの戻り光はピンホール３１ａ上に焦点を結ばないため、マイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１の遮光マスク３１ｂにより遮られ、大部分はピンホール３１ａを通過できない。

マイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１を通過した戻り光は、ビームスプリッタ６により反射される。特に蛍光観察の場合、ビームスプリッタ６は、照明光を透過し、照明光より波長の長い蛍光である戻り光を反射する、ショートパス特性の波長分光ビームスプリッタである。ビームスプリッタ６を反射した戻り光は、撮像レンズ９によりカメラ１０上に結像する。このとき、撮像レンズ９の開口数は、マイクロ凹レンズ３１ｃにより２倍の開口数に変換され、カメラ１０に結像する際の戻り光の開口数に近いか、より大きいことが望ましい。

同時に、モーター４によりマイクロレンズディスク２とマイクロ凹レンズ付きピンホールディスク３１とを回転させ、試料８全体を照明光で走査する。これにより試料８の超解像共焦点像をカメラ１０で撮像可能としている。

このように、本実施形態の共焦点光スキャナにおいても、マイクロレンズ付きピンホールディスクにより、対物レンズ７からの戻り光の開口数を２倍に変換することで、光学系の点像分布関数の幅が１／２になり、即ち、エアリーディスク領域内が１／２に縮小された形でカメラに投影される。

これにより本実施形態の共焦点光スキャナでは、画像処理による偽解像やアーティファクトの無い超解像画像を高速（リアルタイム）に得られ、構成が容易で安価であり、光学調整が容易で環境安定性の高いものとなる。
このような共焦点光スキャナは、画像のＸＹ面内だけでなく、軸方向（Ｚ軸方向）にも超解像効果を有し、試料の立体構造を微細観察するのに適している。

＜第三実施形態＞
つぎに、本発明に係る共焦点光スキャナの第三実施形態について説明する。
図５は、本実施形態の共焦点光スキャナの一構成例を模式的に示す図である。
なお、本実施形態においては、上述した実施形態と異なる部分について主に説明し、上述した実施形態とほぼ同様の部分については、同じ符号を付するとともに、その詳細な説明を省略する。

本実施形態の共焦点光スキャナにおいて、走査手段はガルバノミラーであり、光フィルタリング手段はアレイ形状をなしており、マイクロレンズは凸レンズ状であり、マイクロレンズが光フィルタリング手段の入射側の主面に配されている。
第三実施形態の共焦点光スキャナ４０の構成と動作について、図５を参照して説明する。
共焦点光スキャナ４０は、多数のマイクロレンズ４１ａが規則的に配設されたマイクロレンズアレイ４１と、マイクロレンズ付きピンホールアレイ４２（光フィルタリング手段）と、ガルバノミラー４９（走査手段）と、ビームスプリッタ６と、リレーレンズ４３・４４・４５と、ミラー４６・４７とを備えている。マイクロレンズ付きピンホールアレイ４２は、マイクロレンズアレイ４１の、個々のマイクロレンズ４１ａの焦点位置に光学的に対応する位置（共役な位置）に、遮光マスク４２ｂの開口部であるピンホール４２ａが配設され、更に、個々のピンホール４２ａの裏面にマイクロレンズ４２ｃが配設されている。但し、マイクロレンズ４１ａ及びマイクロレンズ４２ｃはレンズ効果があれば何れの光学素子でもよく、例えば、フレネルレンズや回折光学素子でも良い。

マイクロレンズ付きピンホールアレイ４２は、マイクロレンズ４２ｃ側から入射した光線を、ピンホール４２ａ出射後の空間において、入射前の２倍の開口数を持つ光線に変換する。なお、本実施形態におけるマイクロレンズ付きピンホールアレイ４２は、照明光を走査する機能は無く、試料からの戻り光をフィルタリングするだけの機能となっている。

光源装置５は、不図示のレーザー等の光源と光学系から成り、コリメートされた照明光を出射する。照明光はマイクロレンズアレイ４１により、多数の照明光ビームレットに分割される。マイクロレンズアレイ４１は、照明光ビームレットの開口数が、対物レンズ７の開口数を倍率で割った値に近いか、より大きくなるよう設計されていることが望ましい。

照明光はビームスプリッタ６及びリレーレンズ４３を通過し、ガルバノミラー４９により反射され、リレーレンズ４４及び対物レンズ７を通過して、試料８上に集光される。このとき、ガルバノミラー４９を変向させることで、試料８全体を照明光で走査することができる。

試料８は照明光に基づく戻り光を発する。特に蛍光試料観察の場合、試料８は蛍光色素等で特定の構造を染色したものであり、照明光により蛍光色素分子が励起され、照明光より長波長の蛍光を発する。

対物レンズ７により捉えられた戻り光は、リレーレンズ４４を通過し、ガルバノミラー４９で反射（デスキャン）され、リレーレンズ４３を通過し、ビームスプリッタ６で反射される。特に蛍光観察の場合、ビームスプリッタ６は照明光を透過し、照明光より波長の長い蛍光である戻り光を反射する、ショートパス特性の波長分光ビームスプリッタである。

ビームスプリッタ６で反射された戻り光は、マイクロレンズ付きピンホールアレイ４ ２上に集光され、マイクロレンズ４２ｃにより２倍の開口数に変換され、ピンホール４２ａを通過する。このとき、対物レンズ７の試料側焦点面からの戻り光のみがピンホール４２ａを通過する。一方、焦点面以外からの戻り光はピンホール４２ａ上に焦点を結ばないため、マイクロレンズ付きピンホールアレイ４２の遮光マスク４２ｂにより遮られ、大部分はピンホール４２ａを通過できない。

マイクロレンズ付きピンホールアレイ４２を通過した戻り光は、リレーレンズ４５・ミラー４６・ミラー４７を通過して、ガルバノミラー４９で反射（リスキャン）され、撮像レンズ４８により、カメラ１０上に結像する。このとき、リレーレンズ４５及び撮像レンズ４８の開口数は、マイクロレンズ４２ｃにより２倍の開口数に変換後の戻り光の開口数に近いか、より大きいことが望ましい。

尚、マイクロレンズ付きピンホールアレイ４２は、ビームスプリッタ６側にピンホール４２ａを設け、リレーレンズ４５側に凹レンズであるマイクロレンズ４２ｃを設けた設計としても良い。

本構成によれば、マイクロレンズ付きピンホールアレイ４２を通過した戻り光の開口数は、元の開口数の２倍に変換されているので、エアリーディスク領域内の分布を光学的に１／２の範囲に縮小してカメラ１０に投影される。従って、光学系の解像限界（回折限界）の２倍の解像度を持つ超解像共焦点像を得られる。

また、本構成によれば、マイクロレンズ付きピンホールアレイ４２を戻り光のみが通過し、照明光は通過しないので、マイクロレンズ付きピンホールアレイ４２によって照明光の開口数が１／２に変換されることが無い。従って、マイクロレンズ４１ａの開口数を、対物レンズ７の開口数を倍率で割った値に近いか、より大きい値にするという設計条件を容易に満たせるという優れた効果を有する。
また、本実施形態におけるマイクロレンズ付きピンホールアレイ４２は、一枚の基板上にピンホール４２ａとマイクロレンズ４２ｃとを形成してあるため、ピンホール４２ａとマイクロレンズ４２ｃ間の機械的な調整が不要であり、機械的安定性や、温度等の環境変化に対する安定性、調整性が非常に良いという優れた特徴をも有する。

なお、本実施形態では、マイクロレンズが凸レンズ状である場合を例に挙げて説明したが、これに限定されず、マイクロレンズが凹レンズ状であってもよい。この場合、マイクロレンズが光フィルタリング手段の出射側の主面に配されている。

＜第四実施形態＞
つぎに、本発明に係る共焦点光スキャナの第四実施形態について説明する。
図６は、本実施形態の共焦点光スキャナの一構成例を模式的に示す図である。
なお、本実施形態においては、上述した実施形態と異なる部分について主に説明し、上述した実施形態とほぼ同様の部分については、同じ符号を付するとともに、その詳細な説明を省略する。

図６に示すように、本実施形態の共焦点光スキャナ６０は、第一実施形態の共焦点光スキャナ２０からマイクロレンズディスク２を除いた構成となっている。
本実施形態の共焦点光スキャナにおいても、マイクロレンズ付きピンホールディスクにより、対物レンズ７からの戻り光の開口数を２倍に変換することで、光学系の点像分布関数の幅が１／２になり、即ち、エアリーディスク領域内が１／２に縮小された形でカメラに投影される。
これにより本実施形態の共焦点光スキャナでは、画像処理による偽解像やアーティファクトの無い超解像画像を高速（リアルタイム）に得られ、構成が容易で安価であり、光学調整が容易で環境安定性の高いものとなる。
このような共焦点光スキャナは、画像のＸＹ面内だけでなく、軸方向（Ｚ軸方向）にも超解像効果を有し、試料の立体構造を微細観察するのに適している。
特に、本実施形態の構成によれば、マイクロレンズディスクを用いないので、構成が容易で安価である。

＜第五実施形態＞
つぎに、本発明に係る共焦点光スキャナの第五実施形態について説明する。
図７は、本実施形態の共焦点光スキャナの一構成例を模式的に示す図である。
なお、本実施形態においては、上述した実施形態と異なる部分について主に説明し、上述した実施形態とほぼ同様の部分については、同じ符号を付するとともに、その詳細な説明を省略する。

本実施形態の共焦点光スキャナは、光フィルタリング手段と、走査手段とともに、中間変倍光学系を備える。

本実施形態の共焦点光スキャナ７０の構成と動作について、図７を参照して説明する。
共焦点光スキャナ７０は、第一実施形態の構成に加え、中間変倍光学系７１を備える。中間変倍光学系７１はレンズ７１ａ及びレンズ７１ｂを備え、両者の焦点距離の比は２：１であり、倍率２倍の光学系となっている。但し、中間変倍光学系７１の倍率や光学系構成はこれに限るものではなく、例えば、倍率可変のズーム光学系であっても良い。

中間変倍光学系７１は、レンズ７１ａ側から入射した光線の開口数を、レンズ７１ｂ側から出射後の空間において２倍の開口数に変換する。逆に、レンズ７１ｂ側から入射した光線の開口数を、レンズ７１ａ側から出射後の空間において１／２倍の開口数に変換する。

従って、マイクロレンズ２ａを出射後の照明光は、マイクロレンズ２１ｃにより開口数が１／２に変換されるが、次に中間変倍光学系７１により開口数を２倍に変換されて対物レンズ７へ入射するので、照明光の開口数の変換倍率は、トータルとしては１倍となる。

ところで、マイクロレンズ２ａの開口数について、対物レンズ７に入射するときの照明光の開口数が、対物レンズ７の開口数を倍率で割った値に近いか、より大きいことが望ましいという設計条件がある。本構成によれば、マイクロレンズ２ａの開口数と対物レンズ７へ入射するときの照明光の開口数とが等しくなるので、マイクロレンズ２ａの開口数を中間変倍光学系７１が無い場合の１／２の開口数としても、この設計条件を満たすことが出来る。一般にマイクロレンズは開口数が小さい方が、安価に製作できるので望ましい。

次に対物レンズ７から出射した戻り光について考えると、中間変倍光学系７１により開口数を１／２に変換され、次にマイクロレンズ２１ｃにより開口数を２倍に変換されるので、戻り光の開口数の変換倍率はトータルとしては１倍となる。

ところで、撮像レンズ９の開口数について、撮像レンズ９の開口数は、マイクロレンズ２１ｃにより開口数を２倍に変換されカメラ１０に結像する際の、戻り光の開口数に近いか、より大きいことが望ましいという設計条件がある。本構成によれば、対物レンズ７を出射した戻り光の開口数と、撮像レンズ９での戻り光の開口数とが等しくなるので、撮像レンズ９の開口数を中間変倍光学系７１が無い場合の１／２の開口数としても、この設計条件を満たすことが出来る。一般に撮像レンズは開口数の小さい方が、安価に製作できるので望ましい。

尚、中間変倍光学系７１の倍率は２倍に限るものではなく、例えば３倍とした場合には、マイクロレンズ２ａや撮像レンズ９の開口数を更に小さくしても前述の設計条件を満たすことが出来る。但し、観察視野の大きさは中間変倍光学系７１の倍率に反比例するので、これらの条件を考慮して中間変倍光学系の倍率を決定することが望ましい。

本構成によれば、マイクロレンズ２ａや撮像レンズ９の開口数を小さくでき、安価な共焦点光スキャナを提供できる。

＜第六実施形態＞
つぎに、本発明に係る共焦点光スキャナの第六実施形態について説明する。
図８〜図１５は、本実施形態の共焦点光スキャナの一構成例を模式的に示す図である。
なお、本実施形態においては、上述した実施形態と異なる部分について主に説明し、上述した実施形態とほぼ同様の部分については、同じ符号を付するとともに、その詳細な説明を省略する。

本実施形態の共焦点光スキャナにおいて、走査手段はモーターであり、光フィルタリング手段はディスク形状の本体から構成されており、本体の試料側の主面には凸レンズ状であるマイクロレンズを備えており、ピンホールは本体の試料と反対側の主面に形成された凹状のマイクロミラーの中心に配されている。すなわち、第六実施形態は、マイクロミラーとして機能する反射膜にピンホールが形成されている。

本実施形態の共焦点光スキャナ構成と動作について、図８〜図１５を参照して説明する。
共焦点光スキャナ８０は、コーナーキューブ８１とビームスプリッタ６とレンズ８２とスキャンディスク８３とモーター４とを備えている。スキャンディスク８３は、図１３に詳細を示すように、コーナーキューブ８１側の面に、多数のマイクロ凹ミラー８３ｂを規則的に配設してあり、個々のマイクロ凹ミラー８３ｂの中心には、光を透過する微小開口であるピンホール８３ａが形成されている。また、個々のマイクロ凹ミラー８３ｂの裏側にはマイクロレンズ８３ｃが形成されている。但し、マイクロレンズ８３ｃはレンズ効果があれば何れの光学素子でもよく、例えば、フレネルレンズや回折光学素子でも良い。スキャンディスク８３はモーター４の回転軸に固定されている。

スキャンディスク８３の機能について、図１３〜図１５を参照して詳細に説明する。図１３に詳細を示すように、マイクロ凹ミラー８３ｂはレンズ８２側から入射した平行光線を、反射し収束光線に変換する凹面鏡である。但し、ピンホール８３ａに入射した光は反射せずに透過する。また、図１４に詳細を示すように、レンズ８２側からピンホール８３ａに集光されスキャンディスク８３に入射した光線を、マイクロレンズ８３ｃ出射後の空間において、入射前の１／２倍の開口数を持つ光線に変換する。逆に、図１５に詳細を示すように、マイクロレンズ８３ｃは、対物レンズ７側からスキャンディスク８３に入射した光線を、ピンホール８３ａ出射後の空間において、入射前の２倍の開口数を持つ光線に変換する。

光源装置５は、不図示のレーザー等の光源を備え、光ファイバ等によりコーナーキューブ８１に照明光を入射する。コーナーキューブ８１を出射した照明光は、ビームスプリッタ６を通過し、レンズ８２により平行光になり、スキャンディスク８３のマイクロ凹ミラー８３ｂに入射する（図９）。照明光はマイクロ凹ミラー８３ｂにより、多数の照明光ビームレットに分割され反射される。マイクロ凹ミラー８３ｂで反射した照明光は、レンズ８２及びビームスプリッタ６を通過し、コーナーキューブ８１へと入射する（図１０）。

照明光はコーナーキューブ８１内部で反射してから、コーナーキューブ８１を出射し、ビームスプリッタ６及びレンズ８２を通過し、スキャンディスク８３のピンホール８３ａに集光される。ピンホール８３ａからスキャンディスク８３に入射した照明光は、マイクロレンズ８３ｃによって開口数を１／２に変換されてスキャンディスク８３を出射し、対物レンズ７によって試料８上に集光される（図１１）。ここで、マイクロ凹ミラー８３ｂは、照明光がピンホール８３ａに焦点を結び、かつ、マイクロレンズ８３ｃを出射後の照明光の開口数が対物レンズ７の開口数を倍率で割った値に近いか、より大きくなるよう構成されている。

試料８は、照明光に基づく戻り光を発する。特に蛍光試料観察の場合、試料８は蛍光色素等で特定の構造を染色したものであり、照明光により蛍光色素分子が励起され、照明光より長波長の蛍光を発する。

対物レンズ７により捉えられた戻り光は、スキャンディスク８３上に集光され、マイクロレンズ８３ｃにより２倍の開口数に変換されて、ピンホール８３ａを出射する。このとき、対物レンズ７の試料側焦点面からの戻り光のみがピンホール８３ａを通過する。一方、焦点面以外からの戻り光はピンホール８３ａ上に焦点を結ばないため、大部分はピンホール８３ａを通過できない。
ピンホール８３ａを通過した戻り光は、レンズ８２を通過し、ビームスプリッタ６で反射される。

特に蛍光観察の場合、ビームスプリッタ６は、照明光を透過し、照明光より波長の長い蛍光である戻り光を反射する、ショートパス特性の波長分光ビームスプリッタである。ビームスプリッタ６で反射された戻り光は、撮像レンズ９によりカメラ１０上に結像する（図１２）。ここで、レンズ８２及び結像レンズ９の開口数は、ピンホール８３ａを出射後の戻り光の開口数に近いか、より大きいことが望ましい。

同時に、モーター４によりスキャンディスク８３を回転させ、試料８を照明光で走査する。これにより試料８の超解像共焦点像をカメラ１０で撮像可能としている。

本構成によれば、スキャンディスク８３のピンホール８３ａを出射した戻り光の開口数は、マイクロレンズ８３ｃに入射する前の戻り光の、開口数の２倍に変換されているので、エアリーディスク領域内の分布を光学的に１／２の範囲に縮小してカメラ１０に投影される。従って、光学系の解像限界（回折限界）の２倍の解像度を持つ超解像共焦点像を得られる。

また、本構成によれば、１枚のスキャンディスク８３上に、ピンホール８３ａとマイクロ凹ミラー８３ｂとマイクロレンズ８３ｃとを形成しているため、ピンホール８３ａとマイクロ凹ミラー８３ｂとマイクロレンズ８３ｃとの間の機械的な調整が不要であり、機械的安定性や、温度等の環境変化に対する安定性が非常に良いという優れた特徴を有する。

以上、説明してきたような、本発明の第一〜第六の実施形態にかかる共焦点光スキャナによれば、マイクロレンズ付きピンホールディスクにより、対物レンズからの戻り光の開口数を例えば２倍に変換することで、光学系の点像分布関数の幅が１／２になり、即ち、エアリーディスク領域内が１／２に縮小された形でカメラに投影される。
これにより本発明では、画像処理による偽解像やアーティファクトの無い超解像画像を高速（リアルタイム）に得られ、構成が容易で安価であり、光学調整が容易で環境安定性の高い共焦点光スキャナを提供することができる。
このような共焦点光スキャナは、画像のＸＹ面内だけでなく、軸方向（Ｚ軸方向）にも超解像効果を有し、試料の立体構造を微細観察するのに適している。

以上、本発明の共焦点光スキャナについて説明してきたが、本発明はこれに限定されるものではなく、発明の趣旨を逸脱しない範囲で、適宜変更が可能である。
上述した全ての実施形態に係る共焦点光スキャナは、反射型共焦点観察や一光子蛍光共焦点観察のみならず、多光子蛍光観察にも適用することができる。実施形態に係る共焦点光スキャナを用いることにより、超解像多光子蛍光像を撮影可能である。

本発明は、共焦点光スキャナに広く適用可能である。

２０，３０，４０，７０，８０ 共焦点光スキャナ、２ マイクロレンズディスク、２ａ マイクロレンズ、２１ マイクロレンズ付きピンホールディスク（光フィルタリング手段）、２１ａ ピンホール、２１ｂ 遮光マスク、２１ｃ マイクロレンズ、４ モーター（走査手段）。

Claims (8)

1. 複数のピンホールを有する光フィルタリング手段と、光を試料上に走査する走査手段とを含む共焦点光スキャナであって、
   前記光フィルタリング手段は、平板状の本体、該本体の一方の主面側に配された前記ピンホール、及び、該本体の他方の主面において前記ピンホールと略同軸をなす位置に配されたマイクロレンズ、を備えることを特徴とする共焦点光スキャナ。
2. 前記光フィルタリング手段はディスク形状を成しており、前記走査手段はモーターから成り、前記マイクロレンズは凸レンズ状を成す構成を備え、
   前記マイクロレンズが、前記光フィルタリング手段の前記試料側に位置する主面に配されたことを特徴とする請求項１に記載の共焦点光スキャナ。
3. 前記光フィルタリング手段はディスク形状を成しており、前記走査手段はモーターから成り、前記マイクロレンズは凹レンズ状を成す構成を備え、
   前記マイクロレンズが、前記光フィルタリング手段の前記試料と反対側に位置する主面に配されたことを特徴とする請求項１に記載の共焦点光スキャナ。
4. 前記光フィルタリング手段はアレイ形状を成しており、前記走査手段はガルバノミラーから成り、前記マイクロレンズは凸レンズ状を成す構成を備え、
   前記マイクロレンズが、前記光フィルタリング手段の入射側に位置する主面に配されたことを特徴とする請求項１に記載の共焦点光スキャナ。
5. 前記光フィルタリング手段はアレイ形状を成しており、前記走査手段はガルバノミラーから成り、前記マイクロレンズは凹レンズ状を成す構成を備え、
   前記マイクロレンズが、前記光フィルタリング手段の出射側に位置する主面に配されたことを特徴とする請求項１に記載の共焦点光スキャナ。
6. 前記光フィルタリング手段はディスク形状の本体から構成され、前記走査手段はモーターから成り、前記マイクロレンズが、該本体の前記試料側に位置する主面に凸レンズ状を成す構成を備え、
   前記ピンホールが、該本体の前記試料と反対側に位置する主面に形成された凹状のミラーの中心と同軸を成すように配されていることを特徴とする請求項１に記載の共焦点光スキャナ。
7. 前記光フィルタリング手段と前記走査手段に加えて、中間変倍光学系を備えることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の共焦点光スキャナ。
8. 前記光フィルタリング手段は、前記試料から入射する光の開口数を、前記光フィルタリング手段に入射する前の１．２〜４倍に変換して出射することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の共焦点光スキャナ。

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