JP2014523735A - 人工多能性幹細胞の選別方法 - Google Patents

人工多能性幹細胞の選別方法 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明の課題は、臨床応用に適した安全な人工多能性幹細胞（iPS細胞）を効率よく選択すること、つまり、分化抵抗性を示さない細胞株を選別する手段を提供することにある。
【解決手段】本発明は、分化抵抗性を示すiPS細胞株に特異的に発現するlincRNAまたはmRNAとして同定されたマーカーを用いて分化抵抗性を示すiPS細胞を選別する方法、およびこれらのマーカーを提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、人工多能性幹細胞の選別方法に関する。より詳細には、本発明は、人工多能性幹細胞においてlarge intergenic non-coding RNA（lincRNA）またはmRNAの発現を確認することにより、分化抵抗性を示さない人工多能性幹細胞の選別方法に関する。
近年、マウスおよびヒトの人工多能性幹細胞（iPS細胞）が相次いで樹立された。Yamanakaらは、マウス由来の線維芽細胞に、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子を導入し強制発現させることによって、iPS細胞を誘導した（特許文献1；非特許文献1）。その後、c-Myc遺伝子を除いた3因子によってもiPS細胞を作製できることが明らかとなった（非特許文献2)。さらに、Yamanakaらは、ヒトの皮膚由来線維芽細胞にマウスと同様の4遺伝子を導入することにより、iPS細胞を樹立することに成功した（特許文献1；非特許文献3）。一方、Thomsonらのグループは、Klf4とc-Mycの代わりにNanogとLin28を使用してヒトiPS細胞を作製した（特許文献2;非特許文献4)。iPS細胞は、胚を破壊するなど生命倫理問題を解決し、尚且つ多能性を維持させた状態で、増殖させることが可能であることから、再生医療用の移植材料として期待されている。
一方、樹立されたiPS細胞は、特定の組織細胞へと分化誘導を行ったとしても、その一部に十分に分化していない増殖能を持った未分化な細胞を含有する場合がある（非特許文献5)。このような場合、移植後に腫瘍を発生する恐れがあることから、樹立したiPS細胞株の中から、分化誘導に対して抵抗性を示す細胞を含有しないiPS細胞株を選別する方法が望まれている。
WO 2007/069666 A1 WO 2008/118820 A2
Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006) Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008) Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007) Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007) Miura K. et al., Nat Biotechnol., 27: 743-745 (2009)
本発明の目的は、臨床応用に適した安全な人工多能性幹細胞（iPS細胞）を効率よく選択することである。つまり、分化抵抗性を示さない細胞株を選別する手段を提供することである。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、分化抵抗性を示すiPS細胞株と分化抵抗性を示さないiPS細胞株を用いて、分化抵抗性を示すiPS細胞株において特異的に発現するRNAまたは分化抵抗性を示さないiPS細胞株において特異的に発現するRNAを調べた。すると特定のゲノム領域にコードされたlarge intergenic non-coding RNA（lincRNA）またはmRNAが、分化抵抗性を示すiPS細胞株または分化抵抗性を示さないiPS細胞株で特異的に発現していることが確認された。
以上の結果から、本発明者らは、特定のゲノム領域にコードされたlarge intergenic non-coding RNA（lincRNA）またはmRNAを指標（マーカー)として用いることで、分化抵抗性を示すiPS細胞を選別できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の[１]〜[９]の発明を包含する。
[１] 下記の工程：
(i) Ａ群および/またはＢ群から選択される少なくとも一つのlarge intergenic non-coding RNA（lincRNA）またはmRNAの発現を測定する工程；および
(ii) Ａ群から選択されるlincRNAまたはmRNAを発現するヒト人工多能性幹細胞株、あるいは、Ｂ群から選択されるlincRNAまたはmRNAを発現しないヒト人工多能性幹細胞株を選択する工程；
を含む、分化抵抗性を示さないヒト人工多能性幹細胞株を選別する方法であって、
Ａ群は、
(A1) lincRNA:chr1:852245-854050 reverse strand,
(A2) GPR177,
(A3) VTCN1,
(A4) lincRNA:chr1:142803013-142804254 reverse strand,
(A5) APOA2,
(A6) WNT6,
(A7) EPAS1,
(A8) COL3A1,
(A9) SLC40A1,
(A10) S100P,
(A11) HOPX,
(A12) GUCY1A3,
(A13) CDH10,
(A14) HAPLN1,
(A15) PITX1,
(A16) HAND1,
(A17) CGA,
(A18) AQP1,
(A19) DLX6,
(A20) DLX5,
(A21) SOX17,
(A22) FLJ45983,
(A23) PLCE1,
(A24) H19,
(A25) lincRNA:chr11:2016408-2017024 reverse strand,
(A26) lincRNA:chr11:2017517-2017651 forward strand,
(A27) IGF2,
(A28) P2RY6,
(A29) SLN,
(A30) NNMT,
(A31) APOA1,
(A32) ERP27,
(A33) LUM,
(A34) CCDC92,
(A35) CDX2,
(A36) FLJ41170,
(A37) MEG3,
(A38) lincRNA:chr14:101292469-101299626 forward strand,
(A39) lincRNA:chr14:101295637-101302637 forward strand,
(A40) lincRNA:chr14:101296681-101298460 forward strand,
(A41) lincRNA:chr14:101298129-101300147 forward strand,
(A42) lincRNA:chr14:101324825-101327247 forward strand,
(A43) MEG8,
(A44) lincRNA:chr14:101365673-101366049 forward strand,
(A45) lincRNA:chr14:101396955-101397357 forward strand,
(A46) lincRNA:chr14:101430757-101433381 forward strand,
(A47) lincRNA:chr14:101434059-101436282 forward strand,
(A48) lincRNA:chr14:101472355-101473369 forward strand,
(A49) DIO3,
(A50) MEIS2,
(A51) PRTG,
(A52) C17orf51,
(A53) lincRNA:chr17:21434064-21435857 reverse strand,
(A54) lincRNA:chr17:21435180-21454915 reverse strand,
(A55) lincRNA:chr17:21435959-21436405 reverse strand,
(A56) CCR7,
(A57) KRT23,
(A58) GREB1L,
(A59) GATA6,
(A60) TTR,
(A61) UCA1,
(A62) FLRT3,
(A63) lincRNA:chrX:73040495-73047819 reverse strand,
(A64) VGLL1,
(A65) RPS4Y1,
(A66) DDX3Y, および
(A67) RPS4Y2
から成り、
Ｂ群は、
(B1) DMRTB1,
(B2) lincRNA:chr1:73430887-73446112 reverse strand,
(B3) lincRNA:chr1:73444697-73444997 reverse strand,
(B4) C4orf51,
(B5) PCDHA1,
(B6) lincRNA:chr6:95250854-95263604 reverse strand,
(B7) lincRNA:chr6:14280358-14285376 reverse strand,
(B8) lincRNA:chr6:14283301-14285685 reverse strand,
(B9) C7orf57,
(B10) lincRNA:chr7:124873114-124899839 reverse strand,
(B11) lincRNA:chr8:129599518-129624118 reverse strand,
(B12) OC90,
(B13) lincRNA:chr8:133071643-133092468 reverse strand,
(B14) lincRNA:chr8:133073732-133075753 reverse strand,
(B15) HHLA1,
(B16) incRNA:chr8:133076031-133093351 reverse strand,
(B17) lincRNA:chr8:133090096-133097869 reverse strand,
(B18) lincRNA:chr8:138387843-138421643 reverse strand,
(B19) lincRNA:chr8:138418343-138425831 reverse strand,
(B20) NDUFA4L2,
(B21) lincRNA:chr13:54698462-54707001 reverse strand,
(B22) ABHD12B,
(B23) lincRNA:chr18:54721302-54731677 reverse strand,
(B24) ZNF208,
(B25) ZNF257,
(B26) ZNF676,
(B27) ZNF541,
(B28) TBX1,
(B29) CXorf61, および
(B30) DB090170 TESTI4 Homo sapiens cDNA clone TESTI4038997 5', mRNA sequence [DB090170]から成るものである、上記方法。
[２] Ａ群から選択されるlincRNAまたはmRNAが、
(A20) DLX5,
(A50) MEIS2,
(A53) lincRNA:chr17:21434064-21435857 reverse strand, および
(A58) GREB1Lから成る群より選択される、[１]に記載の方法。
[３] Ｂ群から選択されるlincRNAまたはmRNAが、
(B4) C4orf51,
(B9) C7orf57,
(B10) lincRNA:chr7:124873114-124899839 reverse strand,
(B12) OC90,
(B13) lincRNA:chr8:133071643-133092468 reverse strand,
(B14) lincRNA:chr8:133073732-133075753 reverse strand,
(B15) HHLA1,
(B16) lincRNA:chr8:133076031-133093351 reverse strand,
(B17) lincRNA:chr8:133090096-133097869 reverse strand,
(B22) ABHD12B,
(B23) lincRNA:chr18:54721302-54731677 reverse strand,
(B27) ZNF541,
(B28) TBX1,
(B29) CXorf61, および
(B30) DB090170 TESTI4 Homo sapiens cDNA clone TESTI4038997 5', mRNA sequence [DB090170]から成る群より選択される、[１]に記載の方法。
[４] Ｂ群から選択されるlincRNAまたはmRNAが、
(B4) C4orf51,
(B15) HHLA1, および
(B22) ABHD12Bから成る群より選択される、 [１]に記載の方法。
[５] 下記の工程：
(i) (B4) C4orf51、(B15) HHLA1、 および(B22) ABHD12Bから成る群より選択される少なくとも一つの遺伝子内に位置するLTR領域またはその近傍のDNA−メチル化状態を測定する工程；および
(ii) LTR7領域がDNA−メチル化状態にあるヒト人工多能性幹細胞株を選択する工程；
を含む、分化抵抗性を示さないヒト人工多能性幹細胞株を選別する方法。
[６] 前記Ａ群または前記Ｂ群に示す少なくとも１つのmRNAまたはLincRNAの塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドまたはそれに相補的なポリヌクレオチドを含む、分化抵抗性を示さないヒト人工多能性幹細胞株選別用試薬。
[７] 前記Ａ群または前記Ｂ群に示す少なくとも１つのmRNAまたはLincRNAの塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをプローブとして固定化したマイクロアレイである、[６]に記載の試薬。
[８] 前記Ａ群または前記Ｂ群に示す少なくとも１つのmRNAまたはLincRNAにコードされるタンパク質を認識する抗体を含む、分化抵抗性を示さないヒト人工多能性幹細胞株選別用試薬。
[９] 前記[６]〜[８]のいずれかに記載の試薬を含む、分化抵抗性を示さないヒト人工多能性幹細胞株選別用キット。
本願は、2011年7月25日に出願された米国出願No. 61/511,156号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
本発明によれば、分化抵抗性を示さないヒトiPS細胞を効率よく選別できる。従って、本発明は、iPS細胞の再生医療への応用において極めて有用である。
図１は、分化抵抗性を示す細胞株(「differentiation resistance」と表記）：FB-RV3F-4、CB-RV4F-2、DP-EP6F-1、FB-RV3F-4 sub2、CB-RV4F-2 sub2およびDP-EP6F-1、ならびに分化抵抗性を示さない細胞株(「normal」と表記）：H1、FB-RV4F-2、FB-RV3F-1、FB-RV3F-4 sub6、CB-RV4F-2 sub1およびDP-EP6F-1 sub5におけるHHLA1、 ABHD12B およびC4orf51の発現量の定量PCRによる測定結果を示す。 図２は、C4orf51、HHLA1 およびABHD12B内のLTR領域の位置を示す模式図である。 図３は、分化抵抗性を示す６細胞株（「differentiation resistance」と表記）：FB-RV3F-4、CB-RV4F-2、DP-EP6F-1、FB-RV3F-4 sub2、CB-RV4F-2 sub2 およびDP-EP6F-1、ならびに分化抵抗性を示さない６細胞株(「normal」と表記）：H1、FB-RV4F-2、 FB-RV3F-1、FB-RV3F-4 sub6、CB-RV4F-2 sub1 およびDP-EP6F-1 sub5のC4orf51、HHLA1、またはABHD12Bに位置するLTR7領域のCG ジヌクレオチドの平均メチル化状態をバイサルファイト（Bisulfite)法により測定した結果を示す。
１．ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）の選別方法
本発明のヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）を選別する方法は、下記の表１（Ａ群)または表２（Ｂ群)に示す少なくとも一つのlincRNAまたはmRNAを、分化抵抗性を示さないiPS細胞株を選別するためのマーカーとして使用する。
Figure 2014523735
Figure 2014523735
Figure 2014523735
Figure 2014523735
Figure 2014523735
本発明において、「lincRNA」とは、ゲノムから転写されたRNAであって、遺伝子をコードしない長鎖の一本鎖RNAを意味する。lincRNAは、染色体の番号、GenBankのデータベースに記載された塩基番号で示されたゲノム領域および転写の方向によって表記され、例えば、"chr1:852245-854050 reverse strand"の場合、1番染色体のGenBankのデータベースの852245から854050に相補的な配列に一致する一本鎖RNAを意味する。
本発明において、「mRNA」とはスプライシングを受ける前の前駆体であってもよく、スプライシングを受けた成熟mRNAであってもよい。また、成熟mRNAの配列は表１または表２に記載されたGenBankのAccession番号に対応する配列を有するmRNAに限定されず、選択的スプライシングによって作られるアイソフォームも含まれる。本発明ではまた、該mRNAに由来するポリヌクレオチド（例えば、cDNA）または該RNAがコードするタンパク質もマーカーとして利用され得る。
また、本発明において、「iPS細胞」は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞をいう（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。
本発明において、マーカーとして認識され得るlincRNAまたはmRNAは、当該lincRNAまたはmRNAの塩基配列の全長配列からなるポリヌクレオチドもしくはその相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよく、また、それらの断片であってもよい。ポリヌクレオチド断片の場合、当該lincRNAまたはmRNAの配列中の連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドを有していることが好ましい。少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドとして、具体的には、少なくとも18塩基、少なくとも19塩基、少なくとも20塩基、少なくとも30塩基、少なくとも40塩基、少なくとも50塩基、少なくとも60塩基、少なくとも70塩基、または少なくとも100塩基の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本発明では、上述したマーカーの発現の程度を測定することによって分化抵抗性を示さないiPS細胞株を検出することができ、これによって該iPS細胞株を選別することができる。より詳細には、表１に記載されたＡ群のマーカーを発現するiPS細胞株を、分化抵抗性を示さない細胞株として選別する、または表２に記載されたＢ群のマーカーを発現しないiPS細胞株を、分化抵抗性を示さない細胞株として選別することができる。
ここで、マーカーを発現するとは、任意の測定方法によりマーカーが検出されることを意味し、より好ましくは、得られた検出値を対照の検出値と比較して同等もしくはより高い検出値であることを意味する。同様に、マーカーを発現しないとは、任意の測定方法によりマーカーが検出されないことを意味し、より好ましくは、得られた検出値を対照の検出値と比較して同等もしくはより低い検出値であることを意味する。より詳細には、Ａ群のマーカーを用いる場合、対照としてのES細胞株または分化抵抗性を示さないことが既知であるiPS細胞株と比較して検出値が同程度である場合、または分化抵抗性を示すことが既知であるiPS細胞株と比較して検出値が高い場合においてＡ群のマーカーを発現することを意味する。一方、Ｂ群のマーカーを用いる場合、対照としてのES細胞株または分化抵抗性を示さないことが既知であるiPS細胞株と比較して検出値が同程度である場合、または分化抵抗性を示すことが既知であるiPS細胞株と比較して検出値が低い場合においてＢ群のマーカーを発現しないことを意味する。ここで、検出値が高いとは、例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍または５倍以上高いことが例示され、より好ましくは５倍以上であり、検出値が低いとは、例えば、２／３、１／２、１／３、１／４または１／５以下であることが例示され、より好ましくは１／５以下である。
本発明において、マーカーの測定方法として、特に限定されないが、ノーザンブロット法、in situハイブリダイゼーション法、RNaseプロテクションアッセイ、マイクロアレイ法、PCR法、リアルタイムPCR法、ウェスタンブロット法およびフローサイトメトリーなどが例示される。
ノーザンブロット法などハイブリダイゼーションを利用した測定方法の場合、プローブとして前記マーカーの塩基配列の全長配列またはその部分配列に相補的なポリヌクレオチドを用いることができる。ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、対象の配列に対して、A:T（U）およびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、このような相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列に対して完全な相補配列である場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press,San Diego CA）に教示されるように、プローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、よりストリンジェントなハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度の洗浄条件、さらにストリンジェントなハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」程度の洗浄条件で洗浄しても正鎖と相補鎖とがハイブリダイズ状態を維持する条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。プローブのサイズは、少なくとも15塩基、少なくとも18塩基、少なくとも19塩基、少なくとも20塩基、少なくとも30塩基、少なくとも40塩基、少なくとも50塩基、少なくとも60塩基、少なくとも70塩基、少なくとも100塩基、または全長の連続した塩基長である。該プローブは、放射性同位元素（32P、33Pなど）、蛍光物質（フルオレサミン、ローダミン、テキサスレッド、ダンシル、それらの誘導体など）、化学発光物質、または酵素などで標識されていてもよい。
また、上記プローブとなるポリ(オリゴ)ヌクレオチドは、固相担体（基板）に固定化されたマイクロアレイの形態で提供されることが好ましい。マイクロアレイの固相担体としては、例えば、ガラス基板、シリコン基板、メンブレン、ビーズなどが挙げられ、その材質、大きさ、形状は特に限定されない。マイクロアレイの形成方法は特に限定されず、当業者が利用可能ないかなる方法を用いてもよく、例えば、固相担体表面で直接プローブを合成する方法（オン・チップ法）、又は予め調製したプローブを固相担体表面に結合する方法などがある。固相担体表面で直接プローブを合成する場合には、光照射で選択的に除去される保護基を用い、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術及び固相合成技術を組み合わせて所定の微少なマトリックス領域でのオリゴヌクレオチドの選択的な合成を行う方法が一般的である。一方、予めプローブを調製して固相担体表面に結合する方法では、プローブ核酸の種類や固相担体の種類に応じて、スポッタ装置によりポリ陽イオン化合物やアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤などで表面処理した固相担体の表面に点着する方法、反応活性基を導入したプローブを合成し、予め反応性基を形成させるように表面処理した固相担体表面に該プローブを点着して該プローブを固相担体表面に共有結合により結合固定させる方法などが利用できる。
他の態様として、前記マーカーを特異的に認識し増幅する場合、該マーカーの塩基配列または該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることができる。プライマーは、前記マーカーの各塩基配列に基に、例えばprimer 3（http://primer3.sourceforge.net/）またはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計し、合成・精製することにより調製することができる。プライマーの設計は、センス鎖（5'末端側）とアンチセンス鎖（3'末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。プライマーのサイズは、前記マーカーの増幅及び検出が可能である限り特に限定されないが、少なくとも15塩基長以上、好ましくは15〜50塩基長、より好ましくは20〜35塩基長である。プライマーは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるDNA自動合成装置を利用して合成することが可能である。また、増幅産物の検出を容易にするために、該プライマーには上記と同様の標識物質をつけてもよい。
さらなる他の態様として、前記マーカーをタンパク質として認識する場合、抗体を用いることができる。
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、表１または表２に記載のmRNAがコードするタンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよいし、あるいは、キメラ抗体（例えば、ヒト/マウスキメラ抗体）、ヒト化抗体、ヒト抗体などであってもよいし、あるいは、これらの抗体のフラグメント（例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、Fv、scFvなど）であってもよいし、あるいは、該タンパク質のアミノ酸配列のうち、連続する少なくとも8アミノ酸、たとえば10〜20アミノ酸、からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も包含する。
前記抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987) Publish.John Wiley and Sons.Section 11.12-11.13）。
具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した表１または表２に記載のmRNAがコードするタンパク質、あるいはその部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、上述の免疫された非ヒト動物から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から例えばHAT選択と標的ポリペプチドとの親和性アッセイによって得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987) Publish.John Wiley and Sons.Section 11.4-11.11）。このように得られた抗体は、蛍光物質（フルオレサミン、ローダミン、テキサスレッド、ダンシル、それらの誘導体など）、化学発光物質、または酵素などで標識されていてもよい。
また、抗体の作製に使用されるタンパク質は、Genebankのデータベースより遺伝子の配列情報に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning,T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983),DNA Cloning,DM.Glover,IRL PRESS(1985)）などに準じて行うことができる。具体的には遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって実施することができる。
さらに、本発明においては、イントロンおよびエクソンを含む候補遺伝子本体（gene body）に位置するLTR領域またはその近傍のDNA−メチル化状態を測定することによって、分化抵抗性を示さないiPS細胞を選別する方法を実施することもできる。ここで、LTRは、レトロウイルス由来のリピート配列を意味する。例えば、LTR サブファミリーとして、LTR1、LTR1B、LTR5、LTR7、LTR8、LTR16A1、LTR16A1、LTR16C、LTR26、LTR26E、MER48、およびMLT2CBなどが知られている。本発明において好ましいLTR サブファミリーは、ヒト内在性レトロウイルス (HERV)-H ファミリーのLTR7である。LTR7は、全ヒトゲノムの遺伝子本体（gene body）の658 遺伝子座に位置している。LTR7の配列は、配列番号１に示される。本発明において、LTR7の当該配列は、その鎖と少なくとも90％、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、または 99% の配列同一性を有する配列を含む。
候補遺伝子の例は表２に挙げたＢ群のマーカーである。そのような遺伝子の好ましい例は、C4orf51、HHLA1、およびABHD12Bの群から選択される。C4orf51、HHLA1、および ABHD12B内のLTR領域の例は、配列番号2、3、4、5、6および7に示される。
DNA-メチル化状態を測定する方法の例は、バイサルファイトを用いて非メチル化シトシンを加水分解することを包含する。具体的には、バイサルファイト処理、PCR、およびそれに続いて配列決定を行うことを含む方法、メチル化−特異的オリゴヌクレオチド(MSO)マイクロアレイ、またはバイサルファイト処理前の配列とバイサルファイト処理後の配列との違いを認識するPCRプライマーを用い、PCR産物の有無に基づいてメチル化DNAの有無を決定することを含むメチル化−特異的PCRを用いることを含む方法などがある。これらの方法のほか、DNAメチル化−特異的抗体を用いる染色体免疫沈降によってDNA-メチル化領域内のDNA配列を抽出し、PCRを行い、そして配列決定をすることによって特異的領域からDNA−メチル化領域が検出できる。
分化抵抗性を示さないiPS細胞を選別する際には、候補遺伝子本体（gene body）に位置する上記LTR内のDNA−メチル化状態がDNA−メチル化状態にある対象iPS細胞を、分化抵抗性を示さないiPS細胞として選択する。ここで、「DNA−メチル化状態」という語は、例えば、対象領域内に検出されたメチル化CpGが、検出された全CpGの50%, 60%, 70%、80%、90%以上、好ましくは100%である状態をいう。
任意に選択した一つの細胞内のメチル化CpGの割合（パーセンテージ）を検出する方法の一例には、配列決定がある。ここで、その割合（パーセンテージ）は、PCR産物を複数回、例えば2回以上、好ましくは5回以上、より好ましくは10回以上クローン化した鋳型を繰り返し配列決定し、そして、配列決定したクローンの数とDNAメチル化が検出されたクローンの数とを比較することによって算出できる。パイロシークエンス（pyrosequencing）法を用いるとき、その割合はシトシンまたはチミンの量を測定することによって直接に決定することもできる（シトシンの量はメチル化DNAの量を意味し、チミンの量は非メチル化DNAの量を意味する）。
前記マーカーを用いて分化抵抗性を示さないiPS細胞を選別するにあたり、選別の対象となるiPS細胞は、既に確立された方法に従い、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製すればよい。
初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNA、またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、Glis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9に記載の組み合わせが例示される。
上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA SmartpoolTM (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの遺伝子の5'または3’末端にLoxP配列を有してもよい。
また、RNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよく、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いてもよい（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
iPS細胞誘導のための培養液としては、例えば、10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが含まれる。
培養法の例としては、たとえば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30〜約45日又はそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25〜約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立してもよい（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。
本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
２．ヒト人工多能性幹細胞株選別用試薬およびキット
本発明はまた、ヒト人工多能性幹細胞株選別用試薬を提供する。本発明の選別用試薬は前述のマーカーを認識するためのプローブ、プライマーまたは抗体の少なくとも１種を含む。上記当該試薬は他の試薬や装置と組み合わせてキット化することもできる。本発明のキットは、RNAの抽出用試薬、遺伝子抽出用試薬または染色体抽出試薬などを含んでもよい。また、本発明のキットは、分化抵抗性を示す細胞株と分化抵抗性を示さない株の判別分析手段、例えば、判別分析の手順を記載した書面や説明書、判別分析の手順をコンピューターに実行させるためのプログラム、当該プログラムリスト、当該プログラムを記録した、コンピューターに読み取り可能な記録媒体（例えば、フレキシブルディスク、光ディスク、CD-ROM、CD-R、及びCD-RWなど）、判別分析を実行する装置又はシステム（コンピューターなど）を含んでもよい。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
1．細胞
ヒトES細胞として、KhES1、KhES3（Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345:926-32, 2006）およびH9（Thomson，J.A.，et al.，Science 282：1145-1147，1998）を用いた。
ヒトiPS細胞は、次の方法で作製された９ファミリー、39クローンを用いた。
(i) 6因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc、LIN28およびp53shRNA）をエピソーマルベクター(Okita K,et al. Nat Methods. 8:409-12, 2011)を用いて、臍帯血から抽出したCD34陽性細胞(WO2010/131747)へ導入することで４つのCB-EP6Fクローンを作製した。
(ii) 4因子（OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYC）をレトロウィルスを用いて、臍帯血から抽出したCD34陽性細胞へ導入することで３つのCB-RV4Fクローンを作製した(WO2010/131747)。
(iii) 4因子（OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYC）をセンダイウィルス(Seki T, et al. Cell Stem Cell. 7:11-4, 2010)を用いて臍帯血から抽出したCD34陽性細胞(WO2010/131747)へ導入することで５つのCB-SV4Fクローンを作製した。
(iv) 6因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc、LIN28およびp53shRNA）をエピソーマルベクターを用いて、歯髄幹細胞へ導入することで２つのDP-EP6Fクローンを作製した(Okita K,et al. Nat Methods. 8:409-12, 2011)。
(v) 6因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc、LIN28およびp53shRNA）をエピソーマルベクターを用いて、線維芽細胞へ導入することで３つのFB-EP6Fクローンを作製した(Okita K,et al. Nat Methods. 8:409-12, 2011)。
(vi) ３因子（OCT3/4、SOX2およびKLF4）をレトロウィルスを用いて、線維芽細胞へ導入することで4つのFB-RV3Fクローンを作製した(Okita K,et al. Nat Methods. 8:409-12, 2011)。
(vii) 4因子（OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYC）をレトロウィルスを用いて、線維芽細胞へ導入することで11個のFB-RV4Fクローンを作製した(Okita K,et al. Nat Methods. 8:409-12, 2011)。
(viii) 6因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc、LIN28およびp53shRNA）をエピソーマルベクターを用いて、末梢血単核球（PBMC）に含有するT細胞(Seki T, et al. Cell Stem Cell. 7:11-4, 2010)へ導入することで４つのPM-EP6Fクローンを作製した(Okita K,et al. Nat Methods. 8:409-12, 2011)。
(ix) 4因子（OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYC）をセンダイウィルスを用いて、末梢血単核球（PBMC）に含有するT細胞へ導入することで４つのPM-SV4Fクローンを作製した(Seki T, et al. Cell Stem Cell. 7:11-4, 2010)。
2. 分化抵抗性の確認
ES細胞およびiPS細胞の分化抵抗性を確認するため、次の工程を含む改変SFEBq法を用いて神経系細胞へ分化誘導した。
(1）ES細胞またはiPS細胞の培養液へ10μMのY27632（WAKO）を添加し3時間静置した。
(2) CTK溶液（collagenase-trypsine-KSR)溶液によってフィーダー細胞を除去し、Accumax(Innovate cell technologies)で処理し、single cellへ遊離させ、96well plate (Lipidure-coat U96w, NOF Corporation)に9,000 cells/150uL/wellで播種した。
(3）10μM Y-27632、2μM Dorsomorphin（Sigma）、10μM SB431542（Sigma）、5%KSR（Invitrogen）、MEM-Non essential amino acid solution（Invitrogen）、L-glutamine（Invitrogen）、2-Mercaptoethanol（Invitrogen）を含有したDMEM/F12 （Invitrogen）中で培養し、３または４日おきにY-27632、DorsomorphinおよびSB431542を含まない培地に半量ずつ交換し14日間培養した。続いて、得られた神経系細胞を分離し、37%ホルマリンで固定後、Alexa Fluor 488 Mouse anti-Oct3/4（BD Pharmingen）で染色後、フローサイトメーターを用いて分析したところ、CB-RV4F-2、DP-EP6F-1、FB-RV3F-3、FB-RV3F-4、FB-RV4F-5およびFB-RV4F-11において、分化誘導後にも関わらずOct3/4陽性細胞が5％以上含有していた。これらのiPS細胞は分化抵抗性を示す株として用いた。これらの結果を表３に示す。
Figure 2014523735
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Figure 2014523735
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3. 分化抵抗性マーカーの同定
分化抵抗性を示すiPS細胞5株（CB-RV4F-2、DP-EP6F-1、FB-RV3F-3、FB-RV3F-4およびFB-RV4F-5）と、ES細胞を含む分化抵抗性を示さないiPS細胞27株からRNAを採取し、マイクロアレイ（Human GE G3 8x60k、Agilent）を用いてRNAの発現を測定した。分化抵抗性を示す細胞株と比べて分化抵抗性を示さない細胞株において5倍以上高い発現を示すマーカー群を表４に示す。同様に、分化抵抗性を示す細胞株と比べて分化抵抗性を示さない細胞株において5倍以上低い発現を示すマーカー群を表５に示す。ここで、t検定によりP値が0.05以下であったマーカーは、表４より4個（DLX5、MEIS2、lincRNA:chr17:21434064-21435857 reverse strand、GREB1L）および表５より12個（C4orf51、C7orf57、lincRNA:chr7:124873114-124899839 reverse strand、OC90、lincRNA:chr8:133071643-133092468 reverse strand、lincRNA:chr8:133076031-133093351 reverse strand、ABHD12B、lincRNA:chr18:54721302-54731677 reverse strand、ZNF541、TBX1、CXorf61、DB090170 TESTI4 Homo sapiens cDNA clone TESTI4038997 5', mRNA sequence [DB090170]）確認された。
Figure 2014523735
Figure 2014523735
Figure 2014523735
Figure 2014523735
Figure 2014523735
Figure 2014523735
(実施例２)
(1) 細胞
上述した分化抵抗性を示す４つのiPS細胞株（CB-RV4F-2、DP-EP6F-1、FB-RV3F-4およびFB-RV4F-5）を播種し、得られたコロニーをピックアップすることで、CB-RV4F-2より15個のサブクローン、DP-EP6F-1より15個のサブクローン、FB-RV3F-4より10個のサブクローンおよびFB-RV4F-5より11個のサブクローンが得られた。
(2) 分化抵抗性の確認
ES細胞およびiPS細胞の分化抵抗性を確認するため、上述した改変SFEBq法を用いて神経系細胞へ分化誘導した後、フローサイトメーターを用いてTRA-1-60陽性細胞の含有率を調べた。すると、CB-RV4F-2の15個中12個のサブクローンでは、神経系細胞へ分化誘導した後TRA-1-60陽性細胞を１％以上含有していた（表６）。同様に、DP-EP6F-1では15個中12個（表７）、FB-RV3F-4では10個中8個（表８）およびFB-RV4F-5では11個中3個（表９）のサブクローンにおいて1%以上のTRA-1-60陽性細胞を含有していた。これら1%以上のTRA-1-60陽性細胞を含有していた35個のサブクローンを分化抵抗性を示すiPS細胞株として選別した。
Figure 2014523735
Figure 2014523735
Figure 2014523735
Figure 2014523735
分化抵抗性マーカーの同定
上記の方法で選別された分化抵抗性を示す35個のサブクローンおよび分化抵抗性を示さない16個のサブクローンから抽出したRNAより、マイクロアレイを用いて各RNAの発現量を調べたところ、分化抵抗性を示すサブクローンにおいて表１０に示すlincRNAおよびmRNAが有意に高く発現していた。
Figure 2014523735
（実施例３）
分化抵抗性を示す細胞株用マーカーとして表５（実施例１）および表１０（実施例２）に含まれるC4orf51、HHLA1 およびABHD12Bの分化抵抗性を示す６クローンおよび分化抵抗性を示さない６クローンにおけるRNA発現を定量PCR法にて測定した（図１）。これらのマーカー遺伝子は前記結果と同様に分化抵抗性を示すクローンで発現していることが確認された。さらに、これらの遺伝子がその遺伝子本体（gene body）内にLTR7領域を有することが知られていた（図２）。その結果、LTR7 領域またはその近傍のCpG ジヌクレオチド中のメチル化シトシンの割合（パーセンテージ）を、パイロシーケンス（Pyrosequencing）法にて測定した（図３）。簡単に説明すると、パイロシーケンス（Pyrosequencing）法をPyromark Assay Design Software 2.0 (Qiagen)で設計したプライマーを用いて行った。プライマー配列およびLTR7領域内のCpG ジヌクレオチドを表１１および表１２に示す。PCRを25ng bisulfite-converted DNA、1X Pyromark PCR Master Mix (Qiagen)、1X Coral Load Concentrate (Qiagen)、ならびに0.3μM フォワードプライマー（forward primer）および5’ ビオチニル化リバースプライマー（reverse primer）を含む25μLの反応混合物中で実施した。PCR条件は、１サイクル95℃30秒、50℃30秒、および72℃30秒を45サイクルとした。PCR産物はストレプトアビジンセファロースビーズ(Amersham Biosciences)に結合させた後、精製し、洗浄し、変性させ、再び洗浄した。その後、0.3 μM/L のpyrosequencing プライマーを精製PCR 産物にアニールさせたPyrosequencing 反応はPSQ HS 96 Pyrosequencing System内で行った。メチル化度は、メチル化シトシンをメチル化シトシンおよび非メチル化シトシンの合計で除したパーセンテージで表わした(5mCのパーセンテージ)。PCR pyrosequencing assayを有効化するために、各CpGジヌクレオチド位を３回アッセイし、それらの平均を最終分析に用いた。その結果、C4orf51、HHLA1およびABHD12B遺伝子本体（gene body）に位置するLTR7領域またはその近傍のCpG ジヌクレオチド位のメチル化状態が顕著に高レベルであった。
Figure 2014523735
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Figure 2014523735
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「下線を引いたCG 配列」についてDNA-メチル化状態を分析した。
上記結果から、分化抵抗性を示すクローンをC4orf51、HHLA1およびABHD12Bの発現の認識によって分類することができる。同様に、分化抵抗性を示すクローンをC4orf51、HHLA1およびABHD12B遺伝子本体（gene body）に位置するLTR7領域またはその近傍におけるDNA−メチル化状態の認識によって分類することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
本願発明は、再生医療材料の製造分野において利用できる。
[１] 下記の工程：
(i) Ａ群および/またはＢ群から選択される少なくとも一つのlarge intergenic non-coding RNA（lincRNA）またはmRNAの発現を測定する工程；および
(ii) Ａ群から選択されるlincRNAまたはmRNAを発現するヒト人工多能性幹細胞株、あるいは、Ｂ群から選択されるlincRNAまたはmRNAを発現しないヒト人工多能性幹細胞株を選択する工程；
を含む、分化抵抗性を示さないヒト人工多能性幹細胞株を選別する方法であって、
Ａ群は、
(A1) lincRNA:chr1:852245-854050 reverse strand,
(A2) GPR177,
(A3) VTCN1,
(A4) lincRNA:chr1:142803013-142804254 reverse strand,
(A5) APOA2,
(A6) WNT6,
(A7) EPAS1,
(A8) COL3A1,
(A9) SLC40A1,
(A10) S100P,
(A11) HOPX,
(A12) GUCY1A3,
(A13) CDH10,
(A14) HAPLN1,
(A15) PITX1,
(A16) HAND1,
(A17) CGA,
(A18) AQP1,
(A19) DLX6,
(A20) DLX5,
(A21) SOX17,
(A22) FLJ45983,
(A23) PLCE1,
(A24) H19,
(A25) lincRNA:chr11:2016408-2017024 reverse strand,
(A26) lincRNA:chr11:2017517-2017651 forward strand,
(A27) IGF2,
(A28) P2RY6,
(A29) SLN,
(A30) NNMT,
(A31) APOA1,
(A32) ERP27,
(A33) LUM,
(A34) CCDC92,
(A35) CDX2,
(A36) FLJ41170,
(A37) MEG3,
(A38) lincRNA:chr14:101292469-101299626 forward strand,
(A39) lincRNA:chr14:101295637-101302637 forward strand,
(A40) lincRNA:chr14:101296681-101298460 forward strand,
(A41) lincRNA:chr14:101298129-101300147 forward strand,
(A42) lincRNA:chr14:101324825-101327247 forward strand,
(A43) MEG8,
(A44) lincRNA:chr14:101365673-101366049 forward strand,
(A45) lincRNA:chr14:101396955-101397357 forward strand,
(A46) lincRNA:chr14:101430757-101433381 forward strand,
(A47) lincRNA:chr14:101434059-101436282 forward strand,
(A48) lincRNA:chr14:101472355-101473369 forward strand,
(A49) DIO3,
(A50) MEIS2,
(A51) PRTG,
(A52) C17orf51,
(A53) lincRNA:chr17:21434064-21435857 reverse strand,
(A54) lincRNA:chr17:21435180-21454915 reverse strand,
(A55) lincRNA:chr17:21435959-21436405 reverse strand,
(A56) CCR7,
(A57) KRT23,
(A58) GREB1L,
(A59) GATA6,
(A60) TTR,
(A61) UCA1,
(A62) FLRT3,
(A63) lincRNA:chrX:73040495-73047819 reverse strand,
(A64) VGLL1,
(A65) RPS4Y1,
(A66) DDX3Y, および
(A67) RPS4Y2
から成り、
Ｂ群は、
(B1) DMRTB1,
(B2) lincRNA:chr1:73430887-73446112 reverse strand,
(B3) lincRNA:chr1:73444697-73444997 reverse strand,
(B4) C4orf51,
(B5) PCDHA1,
(B6) lincRNA:chr6:95250854-95263604 reverse strand,
(B7) lincRNA:chr6:14280358-14285376 reverse strand,
(B8) lincRNA:chr6:14283301-14285685 reverse strand,
(B9) C7orf57,
(B10) lincRNA:chr7:124873114-124899839 reverse strand,
(B11) lincRNA:chr8:129599518-129624118 reverse strand,
(B12) OC90,
(B13) lincRNA:chr8:133071643-133092468 reverse strand,
(B14) lincRNA:chr8:133073732-133075753 reverse strand,
(B15) HHLA1,
(B16) lincRNA:chr8:133076031-133093351 reverse strand,
(B17) lincRNA:chr8:133090096-133097869 reverse strand,
(B18) lincRNA:chr8:138387843-138421643 reverse strand,
(B19) lincRNA:chr8:138418343-138425831 reverse strand,
(B20) NDUFA4L2,
(B21) lincRNA:chr13:54698462-54707001 reverse strand,
(B22) ABHD12B,
(B23) lincRNA:chr18:54721302-54731677 reverse strand,
(B24) ZNF208,
(B25) ZNF257,
(B26) ZNF676,
(B27) ZNF541,
(B28) TBX1,
(B29) CXorf61, および
(B30) DB090170 TESTI4 Homo sapiens cDNA clone TESTI4038997 5', mRNA sequence [DB090170]から成るものである、上記方法。
さらに、本発明においては、イントロンおよびエクソンを含む候補遺伝子本体（gene body）に位置するLTR領域またはその近傍のDNA−メチル化状態を測定することによって、分化抵抗性を示さないiPS細胞を選別する方法を実施することもできる。ここで、LTRは、レトロウイルス由来のリピート配列を意味する。例えば、LTR サブファミリーとして、LTR1、LTR1B、LTR5、LTR7、LTR8、LTR16A1、LTR16C、LTR26、LTR26E、MER48、およびMLT2CBなどが知られている。本発明において好ましいLTR サブファミリーは、ヒト内在性レトロウイルス (HERV)-H ファミリーのLTR7である。LTR7は、全ヒトゲノムの遺伝子本体（gene body）の658 遺伝子座に位置している。LTR7の配列は、配列番号１に示される。本発明において、LTR7の当該配列は、その鎖と少なくとも90％、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、または 99% の配列同一性を有する配列を含む。

Claims (9)

  1. 下記の工程：
    (i) Ａ群および/またはＢ群から選択される少なくとも一つのlarge intergenic non-coding RNA（lincRNA）またはmRNAの発現を測定する工程；および
    (ii) Ａ群から選択されるlincRNAまたはmRNAを発現するヒト人工多能性幹細胞株、あるいは、Ｂ群から選択されるlincRNAまたはmRNAを発現しないヒト人工多能性幹細胞株を選択する工程；
    を含む、分化抵抗性を示さないヒト人工多能性幹細胞株を選別する方法であって、
    Ａ群は、
    (A1) lincRNA:chr1:852245-854050 reverse strand,
    (A2) GPR177,
    (A3) VTCN1,
    (A4) lincRNA:chr1:142803013-142804254 reverse strand,
    (A5) APOA2,
    (A6) WNT6,
    (A7) EPAS1,
    (A8) COL3A1,
    (A9) SLC40A1,
    (A10) S100P,
    (A11) HOPX,
    (A12) GUCY1A3,
    (A13) CDH10,
    (A14) HAPLN1,
    (A15) PITX1,
    (A16) HAND1,
    (A17) CGA,
    (A18) AQP1,
    (A19) DLX6,
    (A20) DLX5,
    (A21) SOX17,
    (A22) FLJ45983,
    (A23) PLCE1,
    (A24) H19,
    (A25) lincRNA:chr11:2016408-2017024 reverse strand,
    (A26) lincRNA:chr11:2017517-2017651 forward strand,
    (A27) IGF2,
    (A28) P2RY6,
    (A29) SLN,
    (A30) NNMT,
    (A31) APOA1,
    (A32) ERP27,
    (A33) LUM,
    (A34) CCDC92,
    (A35) CDX2,
    (A36) FLJ41170,
    (A37) MEG3,
    (A38) lincRNA:chr14:101292469-101299626 forward strand,
    (A39) lincRNA:chr14:101295637-101302637 forward strand,
    (A40) lincRNA:chr14:101296681-101298460 forward strand,
    (A41) lincRNA:chr14:101298129-101300147 forward strand,
    (A42) lincRNA:chr14:101324825-101327247 forward strand,
    (A43) MEG8,
    (A44) lincRNA:chr14:101365673-101366049 forward strand,
    (A45) lincRNA:chr14:101396955-101397357 forward strand,
    (A46) lincRNA:chr14:101430757-101433381 forward strand,
    (A47) lincRNA:chr14:101434059-101436282 forward strand,
    (A48) lincRNA:chr14:101472355-101473369 forward strand,
    (A49) DIO3,
    (A50) MEIS2,
    (A51) PRTG,
    (A52) C17orf51,
    (A53) lincRNA:chr17:21434064-21435857 reverse strand,
    (A54) lincRNA:chr17:21435180-21454915 reverse strand,
    (A55) lincRNA:chr17:21435959-21436405 reverse strand,
    (A56) CCR7,
    (A57) KRT23,
    (A58) GREB1L,
    (A59) GATA6,
    (A60) TTR,
    (A61) UCA1,
    (A62) FLRT3,
    (A63) lincRNA:chrX:73040495-73047819 reverse strand,
    (A64) VGLL1,
    (A65) RPS4Y1,
    (A66) DDX3Y, および
    (A67) RPS4Y2
    から成り、
    Ｂ群は、
    (B1) DMRTB1,
    (B2) lincRNA:chr1:73430887-73446112 reverse strand,
    (B3) lincRNA:chr1:73444697-73444997 reverse strand,
    (B4) C4orf51,
    (B5) PCDHA1,
    (B6) lincRNA:chr6:95250854-95263604 reverse strand,
    (B7) lincRNA:chr6:14280358-14285376 reverse strand,
    (B8) lincRNA:chr6:14283301-14285685 reverse strand,
    (B9) C7orf57,
    (B10) lincRNA:chr7:124873114-124899839 reverse strand,
    (B11) lincRNA:chr8:129599518-129624118 reverse strand,
    (B12) OC90,
    (B13) lincRNA:chr8:133071643-133092468 reverse strand,
    (B14) lincRNA:chr8:133073732-133075753 reverse strand,
    (B15) HHLA1,
    (B16) incRNA:chr8:133076031-133093351 reverse strand,
    (B17) lincRNA:chr8:133090096-133097869 reverse strand,
    (B18) lincRNA:chr8:138387843-138421643 reverse strand,
    (B19) lincRNA:chr8:138418343-138425831 reverse strand,
    (B20) NDUFA4L2,
    (B21) lincRNA:chr13:54698462-54707001 reverse strand,
    (B22) ABHD12B,
    (B23) lincRNA:chr18:54721302-54731677 reverse strand,
    (B24) ZNF208,
    (B25) ZNF257,
    (B26) ZNF676,
    (B27) ZNF541,
    (B28) TBX1,
    (B29) CXorf61, および
    (B30) DB090170 TESTI4 Homo sapiens cDNA clone TESTI4038997 5', mRNA sequence [DB090170]から成るものである、上記方法。
  2. Ａ群から選択されるlincRNAまたはmRNAが、
    (A20) DLX5,
    (A50) MEIS2,
    (A53) lincRNA:chr17:21434064-21435857 reverse strand, および
    (A58) GREB1Lから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
  3. Ｂ群から選択されるlincRNAまたはmRNAが、
    (B4) C4orf51,
    (B9) C7orf57,
    (B10) lincRNA:chr7:124873114-124899839 reverse strand,
    (B12) OC90,
    (B13) lincRNA:chr8:133071643-133092468 reverse strand,
    (B14) lincRNA:chr8:133073732-133075753 reverse strand,
    (B15) HHLA1,
    (B16) lincRNA:chr8:133076031-133093351 reverse strand,
    (B17) lincRNA:chr8:133090096-133097869 reverse strand,
    (B22) ABHD12B,
    (B23) lincRNA:chr18:54721302-54731677 reverse strand,
    (B27) ZNF541,
    (B28) TBX1,
    (B29) CXorf61, および
    (B30) DB090170 TESTI4 Homo sapiens cDNA clone TESTI4038997 5', mRNA sequence [DB090170]から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
  4. Ｂ群から選択されるlincRNAまたはmRNAが、
    (B4) C4orf51,
    (B15) HHLA1, および
    (B22) ABHD12Bから成る群より選択される、 請求項１に記載の方法。
  5. 下記の工程：
    (i) (B4) C4orf51, (B15) HHLA1, および(B22) ABHD12Bからより選択される少なくとも一つの遺伝子内に位置するLTR領域またはその近傍のDNA−メチル化状態を測定する工程；および
    (ii) LTR7領域がDNA−メチル化状態にあるヒト人工多能性幹細胞株を選択する工程；
    を含む、分化抵抗性を示さないヒト人工多能性幹細胞株を選別する方法。
  6. 前記Ａ群または前記Ｂ群に示す少なくとも１つのmRNAまたはLincRNAの塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドまたはそれに相補的なポリヌクレオチドを含む、分化抵抗性を示さないヒト人工多能性幹細胞株選別用試薬。
  7. 前記Ａ群または前記Ｂ群に示す少なくとも１つのmRNAまたはLincRNAの塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをプローブとして固定化したマイクロアレイである、請求項６に記載の試薬。
  8. 前記Ａ群または前記Ｂ群に示す少なくとも１つのmRNAまたはLincRNAにコードされるタンパク質を認識する抗体を含む、分化抵抗性を示さないヒト人工多能性幹細胞株選別用試薬。
  9. 請求項６〜８のいずれかに記載の試薬を含む、分化抵抗性を示さないヒト人工多能性幹細胞株選別用キット。
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