JP6021021B2 - 多発性嚢胞腎の検査方法および治療剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
多発性嚢胞腎の原因遺伝子は特定されているにも関わらず、現在、有効な治療法は確立されていない。
[1] 被験者が多発性嚢胞腎を発症しているまたは発症するリスクを有しているか否かを検査する方法であって、以下の工程:
(a)被験者由来の試料において、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD 、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の発現量を測定する工程;および
(b)NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の前記発現量が、対照試料における発現量より低い場合、該被験者が多発性嚢胞腎を発症している、または発症するリスクを有している、と決定する工程、あるいは、ACAT2、INSIG1、SCDもしくはそれら3つの遺伝子の前記発現量が、該対照試料における発現量より高い場合、被験者が多発性嚢胞腎を発症している、または発症するリスクを有している、と決定する工程、
を含む方法。
[2] 前記試料が血液、血清、血漿、細胞抽出液、尿、リンパ液、組織液、腹水、髄液、およびその他の体液、あるいは組織または細胞からなる群より選択される少なくとも1種である、[1]に記載の方法。
[3] 前記試料が、被験者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導した血管内皮細胞であり、工程(a)における遺伝子がNTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1およびSCDから成る群より選択される遺伝子である、[1]に記載の方法。
[4] 前記試料が、被験者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導した血管周皮細胞であり、工程(a)における遺伝子がHSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択される遺伝子である、[1]に記載の方法。
[5] 前記遺伝子の発現量を測定する工程が、前記試料中の前記遺伝子のmRNA、cRNAもしくはcDNA量または前記遺伝子によってコードされるタンパク質の量を測定する工程である、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 被験者が多発性嚢胞腎の合併症を発症しているまたは発症するリスクを有しているか否かを検査する方法であって、以下の工程:
(a)多発性嚢胞腎である被験者由来の試料から、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の発現量を測定する工程;および
(b)NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の前記発現量が、対照試料における発現量より低い場合、当該被験者が多発性嚢胞腎の合併症を発症している、または発症するリスクを有している、と決定する工程、あるいは、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の前記発現量が、該対照試料における発現量より高い場合、被験者が多発性嚢胞腎の合併症を発症している、または発症するリスクを有している、と決定する工程、
を含む方法。
[7] 前記合併症が脳動脈瘤である、[6]に記載の方法。
[8] 前記試料が、血液、血清、血漿、細胞抽出液、尿、リンパ液、組織液、腹水、髄液、およびその他の体液、あるいは組織または細胞からなる群より選択される少なくとも1種である、[6]または[7]に記載の方法。
[9] 前記試料が、被験者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞であり、工程(a)における遺伝子がNTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子である、[6] または[7]に記載の方法。
[10] 前記試料が、被験者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞であり、工程(a)における遺伝子がHSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子である、[6] または[7]に記載の方法。
[11] 前記遺伝子の発現量を測定する工程が、前記遺伝子のmRNA、cRNAもしくはcDNA量または前記遺伝子によってコードされるタンパク質の量を測定する工程である、[6]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[12] NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび/またはそれに相補的なポリヌクレオチド、ならびに/あるいは、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する(1もしくは複数の)抗体もしくはそのフラグメント、を含む、多発性嚢胞腎または多発性嚢胞腎の合併症を検査するための疾患マーカー。
[13] 前記合併症が脳動脈瘤である、[12]に記載の疾患マーカー。
[14] BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび/またはそれに相補的なポリヌクレオチド、ならびに/あるいは、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1もしくは2以上から全部の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する(1もしくは複数の)抗体もしくはそのフラグメント、を含む、[13]に記載の疾患マーカー。
[15] NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび/またはそれに相補的なポリヌクレオチド、ならびに/あるいは、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1もしくは2以上から全部の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する(1もしくは複数の)抗体もしくはそのフラグメント、を含む、多発性嚢胞腎または多発性嚢胞腎の合併症の検査用キット。
[16] 前記合併症が脳動脈瘤である、[15]に記載のキット。
[17] BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび/またはそれに相補的なポリヌクレオチド、ならびに/あるいは、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1もしくは2以上から全部の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する(1もしくは複数の)抗体もしくはそのフラグメント、を含む、[16]に記載のキット。
[18] 以下の工程:
(a)候補物質を、多発性嚢胞腎患者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞と接触させる工程、
(b)NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1およびSCDから成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の発現量もしくは転写活性を測定する工程、および
(c)候補物質と接触させなかった場合と比較して、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1および BST1から成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の前記発現量もしくは転写活性が増加した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎の治療剤または予防剤として選別する工程、あるいは、ACAT2、INSIG1、SCDから成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の前記発現量もしくは転写活性が減少した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎の治療剤または予防剤として選別する工程、
を含む、多発性嚢胞腎の治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
[19] 以下の工程:
(a)候補物質を、多発性嚢胞腎患者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞と接触させる工程、
(b)HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の発現量もしくは転写活性を測定する工程、および
(c)候補物質と接触させなかった場合と比較して、前記発現量もしくは転写活性が増加した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎の治療剤または予防剤として選別する工程、
を含む、多発性嚢胞腎の治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
[20] 前記遺伝子の発現量を測定する工程が、遺伝子のmRNA、cRNAもしくはcDNA量を測定する工程である、[18]および[19]に記載のスクリーニング方法。
[21] 以下の工程:
(a)候補物質を、多発性嚢胞腎合併症患者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞と接触させる工程、
(b)NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の発現量もしくは転写活性を測定する工程、および
(c)候補物質と接触させなかった場合と比較して、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1およびBST1から成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の前記発現量もしくは転写活性が増加した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎合併症の治療剤または予防剤として選別する工程、あるいは、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の前記発現量もしくは転写活性が減少した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎合併症の治療剤または予防剤として選別する工程、
を含む、多発性嚢胞腎の合併症の治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
[22] 以下の工程:
(a)候補物質を、多発性嚢胞腎合併症患者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞と接触させる工程、
(b)HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、 MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の発現量または転写活性を測定する工程、および
(c)候補物質と接触させなかった場合と比較して、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の前記発現量もしくは転写活性が増加した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎合併症の治療剤または予防剤として選別する工程、あるいは、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の前記発現量もしくは転写活性が減少した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎合併症の治療剤または予防剤として選別する工程、
を含む、多発性嚢胞腎の合併症の治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
[23] 前記合併症が脳動脈瘤である、[21]および[22]に記載のスクリーニング方法。
[24] 前記遺伝子の発現量を測定する工程が、遺伝子のmRNA、cRNAもしくはcDNA量を測定する工程である、[21]および[22]に記載のスクリーニング方法。
[25] ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAE遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの核酸またはその転写産物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAもしくはshRNAの薬学的有効量を含む、多発性嚢胞腎または多発性嚢胞腎の合併症の治療または予防のための組成物。
[26] 前記合併症が脳動脈瘤である、[25]に記載の組成物。
[27] BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAE遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの核酸またはその転写産物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAもしくはshRNAの薬学的有効量を含む、[26]に記載の組成物。
[28] 健常者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞と比較して、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1およびBST1の発現量が低く、かつ、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2の発現量が高い、ならびに、多発性嚢胞腎患者のうち脳動脈瘤併発患者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られたものであることを特徴とする血管内皮細胞。
[29] BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2の発現量が高い、ならびに、多発性嚢胞腎患者のうち脳動脈瘤併発患者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られたものであることを特徴とする血管内皮細胞。
[30] 健常者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞と比較して、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1の発現が低く、かつ、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEの発現量が高い、ならびに、多発性嚢胞腎患者のうち脳動脈瘤併発患者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られたものであることを特徴とする血管周皮細胞。
[31] MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEの発現量が高い、ならびに、多発性嚢胞腎患者のうち脳動脈瘤併発患者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られたものであることを特徴とする血管周皮細胞。
本発明は、対照試料と比較して、表1に記載の少なくとも1種の遺伝子の発現上昇(増加)および/または下降(減少)の有無やその程度を測定(定性および/または定量的測定)することによって多発性嚢胞腎または多発性嚢胞腎の合併症を発症していることまたは発症するリスクを有していることを特異的に検出することができ、これによって該疾患の検査を正確に行うことができるという知見に基づく。
本発明の疾患マーカーをプライマーとして用いる場合、好ましいプライマーセットを表2に例示する。
(a)被験者由来の試料から、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD 、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の発現量を測定する工程;および
(b)NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の前記発現量が、対照試料における発現量より低い場合、該被験者が多発性嚢胞腎を発症している、または発症するリスクを有している、と決定する工程、あるいは、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の前記発現量が、該対照試料における発現量より高い場合、被験者が多発性嚢胞腎を発症している、または発症するリスクを有している、と決定する工程、
を含む。
本発明はまた、多発性嚢胞腎または多発性嚢胞腎の合併症の疾患マーカーとして表1に記載の遺伝子の発現産物(タンパク質)を特異的に認識することのできる抗体を提供する。
本発明は、多発性嚢胞腎の検査方法として、次の(a-1)および(b-1)の工程を含む方法を提供する:
(a-1)被験者由来の試料から、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子または該遺伝子によってコードされるタンパク質の発現量を測定する工程、および
(b-1)NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の前記発現量が、健常者由来の対照試料における発現量より低い場合、該被験者が多発性嚢胞腎を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程、あるいは、ACAT2、INSIG1、SCDから成る群より選択される1以上もしくは全部の前記発現量が、健常者由来の対照試料における発現量より高い場合、被験者が多発性嚢胞腎を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程。
(a-2)多発性嚢胞腎である被験者由来の試料において、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1もしくは2以上から全部の遺伝子の発現量を測定する工程、および
(b-2)NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択される1以上もしくは全部の前記発現量が、健常者由来の対照試料における発現量より低い場合、該被験者が多発性嚢胞腎の合併症を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程、あるいは、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の前記発現量が、健常者由来の対照試料における発現量より高い場合、被験者が合併症を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程。
(a-3)多発性嚢胞腎である被験者由来の試料において、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の発現量を測定する工程、および
(b-3)BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の前記発現量が、健常者由来の対照試料における発現量より高い場合、被験者が脳動脈瘤を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程。
(a-4)被験者の体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞において、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の発現量または該遺伝子によってコードされるタンパク質の発現量を測定する工程、および
(b-4)NTNG1、POSTN、TNC、KAL1およびBST1から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の前記発現量が、健常人由来の対照試料における発現量より低い場合、該被験者が多発性嚢胞腎を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程、あるいは、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択される1以上もしくは全部の前記発現量が、健常人由来の対照試料における発現量より高い場合、被験者が多発性嚢胞腎を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程。
(a-5)被験者の単離された体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞において、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の発現量または該遺伝子によってコードされるタンパク質の発現量を測定する工程、および
(b-5)HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の前記発現量が、健常者の体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞(対照試料)における発現量より低い場合、該被験者が多発性嚢胞腎を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程、あるいは、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の前記発現量が、健常人由来の対照試料における発現量より高い場合、被験者が多発性嚢胞腎を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程。
(a-6)多発性嚢胞腎である被験者の体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞において、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の発現量または該遺伝子によってコードされるタンパク質の発現量を測定する工程、および
(b-6)NTNG1、POSTN、TNC、KAL1およびBST1から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の前記発現量が、健常者の体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞(対照試料)における発現量より低い場合、該被験者が多発性嚢胞腎の合併症を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程、もしくは、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択される1以上もしくは全部の前記発現量が、該対照試料における発現量より高い場合、被験者が多発性嚢胞腎の合併症を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程。
(a-7)多発性嚢胞腎を発症する被験者の体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞において、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の発現量または該遺伝子によってコードされるタンパク質の発現量を測定する工程、および
(b-7)BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択される1以上もしくは全部の前記発現量が、該対照試料における発現量より高い場合、被験者が脳動脈瘤を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程。
(a-8)多発性嚢胞腎である被験者の体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞において、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の発現量または該遺伝子によってコードされるタンパク質の発現量を測定する工程、および
(b-8)HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の前記発現量が、健常者の体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞(対照試料)における発現量より低い場合、該被験者が多発性嚢胞腎の合併症を発症していると決定する工程、あるいは、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の前記発現量が、該対照試料における発現量より高い場合、被験者が多発性嚢胞腎の合併症を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程。
(a-9)多発性嚢胞腎である被験者の体細胞由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞において、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の発現量または該遺伝子によってコードされるタンパク質の発現量を測定する工程、および
(b-9)MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の前記発現量が、該対照試料における発現量より高い場合、被験者が脳動脈瘤を発症している、または発症するリスクを有していると決定する工程。
測定対象物としてmRNAまたはそれから調製されるポリヌクレオチド(例えば、cDNA、cRNAなど)を利用する場合、上記工程(i)および(ii)として下記の工程を用いることができる。
(i)被験者の試料から調製されたmRNAまたは該mRNAから転写された相補的ポリヌクレオチドと前述の疾患マーカーとを結合させる工程、
(ii)該疾患マーカーに結合した生体試料由来のRNAまたは該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチド(cDNA)を、上記疾患マーカーの存在量を指標として測定する工程。
本発明で用いるiPS細胞は、ある特定の核初期化物質(「リプログラミング物質」ともいう。)を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することまたは薬剤によって当該核初期化物質の内在性のmRNAおよびタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676、K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872、J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920、M. Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106、国際公開WO 2007/069666、国際公開WO 2010/068955など)。核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, Esrrb、EsrrgまたはGlis1が例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも1つ、2つもしくは3つ含む組み合わせであり、好ましくは3つもしくは4つを含む組み合わせである。
プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。
前述のようにして得られたiPS細胞から、血管内皮細胞を製造するため、次の工程:
(1)コーティング処理された培養皿上で霊長類ES/iPS細胞用培地を用いて接着培養する工程、
(2)培地へ各種添加剤を加えて培養する工程、
(3)無血清培地へ増殖因子を加えて培養する工程、
(4)VEGFR2陽性、TRA1陰性およびVE-cadherin陽性の細胞を分離する工程、および
(5)コーティング処理された培養皿上で血管内皮細胞用増殖培地を用いて接着培養する工程、
を含む分化誘導方法を用いることができる。
血管周皮細胞を製造するため、上述の血管内皮細胞の作製工程(1)から(3)と同様の工程およびその後の(4’)および(5’)の工程:
(1)コーティング処理された培養皿上で霊長類ES/iPS細胞用培地を用いて接着培養する工程、
(2)培地へ各種添加剤を加えて培養する工程、
(3)無血清培地へ増殖因子を加えて培養する工程、
(4’)VEGFR2陽性、TRA1陰性およびVE-cadherin陰性の細胞を分離する工程、および
(5’)コーティング処理された培養皿上で増殖因子を含有する培地を用いて接着培養する工程、
を含む分化誘導方法を用いることができる。
本発明は、多発性嚢胞腎または多発性嚢胞腎合併症の治療または予防に有用な薬剤である候補薬剤のスクリーニング方法を提供する。表1に記載の遺伝子の発現量を指標として用いるスクリーニング方法を通じて該治療剤または予防剤が同定され得る。表1(上記)に記載の遺伝子の発現量は、上述の疾患マーカーを利用して測定することが可能である。
(A-1)候補物質を、多発性嚢胞腎患者由来のiPS細胞から分化誘導した体細胞と接触させる工程、
(B-1)NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の発現量もしくは転写活性を測定する工程、および
(C-1)候補物質と接触させなかった場合と比較して、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が増加した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎の治療剤または予防剤として選別する工程、あるいは、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が減少した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎の治療剤または予防剤として選別する工程。
ここで、iPS細胞から分化誘導により得られる体細胞として、尿細管細胞、集合管細胞、胆管細胞、肝細胞、膵管細胞、膵臓細胞、腸管細胞、生殖細胞、血管内皮細胞または血管周皮細胞が例示され、好ましくは、血管内皮細胞または血管周皮細胞である。iPS細胞からの、尿細管細胞、集合管細胞、胆管細胞、肝細胞、膵管細胞、膵臓細胞、腸管細胞、生殖細胞、血管内皮細胞または血管周皮細胞の製造方法は、特に限定されないが、胚様体もしくは形成したテラトーマから適宜抽出することで得ることができる(例えば、特開2006-239169)。肝細胞は、特に限定されないが、WO2006/082890、特開2010-75631またはHay DC, et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 105, 12301-6 2008に記載の方法で作製することができる。同様に、膵臓細胞は、WO2007/103282に記載の方法を用いて作製することができる。iPS細胞ならびに血管内皮細胞または血管周皮細胞は、前述の方法により製造することができる。
(A-2)候補物質を、多発性嚢胞腎患者由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞と接触させる工程、
(B-2)NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択された遺伝子の発現量もしくは転写活性を測定する工程、および
(C-2)候補物質と接触させなかった場合と比較して、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1およびBST1から成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が増加した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎の治療剤または予防剤として選別する工程、あるいは、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が減少した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎の治療剤または予防剤として選別する工程。
(A-3)候補物質を、多発性嚢胞腎患者由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞と接触させる工程、
(B-3)HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の発現量もしくは転写活性を測定する工程、および
(C-3)候補物質と接触させなかった場合と比較して、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が増加した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎の治療剤または予防剤として選別する工程、あるいは、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が減少した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎の治療剤または予防剤として選別する工程。
(A-4)候補物質を、多発性嚢胞腎の合併症患者由来のiPS細胞から分化誘導により得られた体細胞と接触させる工程、
(B-4)NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の発現量もしくは転写活性を測定する工程、および
(C-4)候補物質と接触させなかった場合と比較して、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が増加した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎の合併症の治療剤または予防剤と決定して選別する工程、あるいは、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が減少した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎の合併症の治療剤または予防剤として選別する工程。
(A-5)候補物質を、多発性嚢胞腎の合併症患者由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞と接触させる工程、
(B-5)NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の発現量もしくは転写活性を測定する工程、および
(C-5)候補物質と接触させなかった場合と比較して、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1およびBST1から成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が増加した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎に併発する合併症の治療剤または予防剤と決定して選別する工程、あるいは、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が減少した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎に併発する合併症の治療剤または予防剤として選別する工程。
(A-6)候補物質を、多発性嚢胞腎の合併症患者由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞と接触させる工程、
(B-6)BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の発現量もしくは転写活性を測定する工程、および
(C-6)候補物質と接触させなかった場合と比較して、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2から成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が減少した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎に併発する脳動脈瘤の治療剤または予防剤として選別する工程。
(A-7)候補物質を、多発性嚢胞腎の合併症患者由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞と接触させる工程;
(B-7)HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の発現量もしくは転写活性を測定する工程、および
(C-7)候補物質と接触させなかった場合と比較して、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1から成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が増加した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎に併発する合併症の治療剤または予防剤として選別する工程、あるいは、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が減少した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎に併発する合併症の治療剤または予防剤として選別する工程。
(A-8)候補物質を、多発性嚢胞腎の合併症患者由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞と接触させる工程、
(B-8) MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択された1以上もしくは全部の遺伝子の発現量もしくは転写活性を測定する工程、および
(C-8)候補物質と接触させなかった場合と比較して、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択された1以上もしくは全部の前記発現量もしくは転写活性が減少した場合、前記候補物質を、多発性嚢胞腎に併発する合併症の治療剤または予防剤として選別する工程。
(A-9)多発性嚢胞腎患者由来のiPS細胞から分化誘導により得られた体細胞と候補物質を接触させる工程であって、当該体細胞が、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEより選択される一つ又は複数の遺伝子の転写調節領域により制御されるレポーター遺伝子を含む工程、
(B-9)当該レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
(C-9)遺伝子がNTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、HSD3B1、KRT7、USP40および/またはSULT1E1である場合、当該レポーター遺伝子の発現量又は活性レベルを、候補物質の非存在下での発現量と比較して増加させる、またはACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1および/またはSIAEである場合、該レポーター遺伝子の発現量を、候補物質の非存在下で検出される発現量と比較して減少させる候補物質を選択する工程。
(A-10)多発性嚢胞腎患者由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞と候補物質を接触させる工程であって、当該血管内皮細胞が、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2より選択される一つ又は複数の遺伝子の転写調節領域により制御されるレポーター遺伝子を含む工程、
(B-10)該レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
(C-10)遺伝子がNTNG1、POSTN、TNC、KAL1および/またはBST1である場合、該レポーター遺伝子の発現量又は活性レベルを、候補物質の非存在下での発現量と比較して増加させる、またはACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1および/またはTFPI2である場合、該レポーター遺伝子の発現量を、候補物質の非存在下で検出される発現量と比較して減少させる候補物質を選択する工程。
(A-11)多発性嚢胞腎患者のiPS細胞から分化誘導した血管周皮細胞と候補物質を接触させる工程であって、当該血管周皮細胞が、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1および/またはSIAEより選択される一つ又は複数の遺伝子の転写調節領域により制御されるレポーター遺伝子を含む工程、
(B-11)該レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
(C-11)遺伝子がHSD3B1、KRT7、USP40および/またはSULT1E1である場合は、該レポーター遺伝子の発現量又は活性レベルを、候補物質の非存在下での発現量と比較して増加させる候補物質を選択する工程、またはMMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1および/またはSIAEである場合、該レポーター遺伝子の発現量を、候補物質の非存在下で検出される発現量と比較して減少させる候補物質を選択する工程。
(A-12)多発性嚢胞腎の合併症患者由来のiPS細胞から分化誘導した体細胞と候補物質を接触させる工程であって、当該体細胞が、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEより選択される一つ又は複数の遺伝子の転写調節領域により制御されるレポーター遺伝子を含む工程、
(B-12)該レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
(C-12)遺伝子がNTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、HSD3B1、KRT7、USP40および/またはSULT1E1である場合は、該レポーター遺伝子の発現量又は活性レベルを、候補物質の非存在下での発現量と比較して増加させる、またはACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1および/またはSIAEである場合は、該レポーター遺伝子の発現量を、候補物質の非存在下で検出される発現量と比較して減少させる候補物質を選択する工程。
(A-13)多発性嚢胞腎の合併症患者由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞と候補物質を接触させる工程であって、該内皮細胞が、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2より選択される一つ又は複数の遺伝子の転写調節領域により制御されるレポーター遺伝子を含む工程、
(B-13)該レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
(C-13)遺伝子がNTNG1、POSTN、TNC、KAL1および/またはBST1である場合は、該レポーター遺伝子の発現量又は活性レベルを、候補物質の非存在下での発現量と比較して増加させる、またはACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1および/またはTFPI2である場合は、該レポーター遺伝子の発現量を、候補物質の非存在下で検出される発現量と比較して減少させる候補物質を選択する工程。
(A-14)脳動脈瘤を併発する多発性嚢胞腎患者由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管内皮細胞と候補物質を接触させる工程であって、該内皮細胞が、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1およびTFPI2より選択される一つ又は複数の遺伝子の転写調節領域により制御されるレポーター遺伝子を含む工程、
(B-14)該レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
(C-14)遺伝子がBMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、および/またはTFPI2である場合は、該レポーター遺伝子の発現量を、候補物質の非存在下で検出される発現量と比較して減少させる候補物質を選択する工程。
(A-15)多発性嚢胞腎の合併症患者由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞と候補物質を接触させる工程であって、当該血管周皮細胞が、HSD3B1、KRT7、USP40、SULT1E1、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEより選択される一つ又は複数の遺伝子の転写調節領域により制御されるレポーター遺伝子を含む工程、
(B-15)該レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
(C-15)遺伝子がHSD3B1、KRT7、USP40および/またはSULT1E1である場合は、該レポーター遺伝子の発現量又は活性レベルを、候補物質の非存在下での発現量と比較して増加させる候補物質を選択する工程、またはMMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1および/またはSIAEである場合は、該レポーター遺伝子の発現量を、候補物質の非存在下で検出される発現量と比較して減少させる候補物質を選択する工程。
(A-16)脳動脈瘤を併発する多発性嚢胞腎患者由来のiPS細胞から分化誘導により得られた血管周皮細胞と候補物質を接触させる工程であって、該周皮細胞が、MMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEより選択される一つ又は複数の遺伝子の転写調節領域により制御されるレポーター遺伝子を含む工程、
(B-16)該レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
(C-16)遺伝子がMMP1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1および/またはSIAEである場合は、該レポーター遺伝子の発現量を、候補物質の非存在下で検出される発現量と比較して減少させる候補物質を選択する工程。
本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドには、ACAT2、INSIG1、SCD、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、MMP1、TFPI2 HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1またはSIAEの塩基配列内の部位にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号:11、13、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93または94の塩基配列の少なくとも15連続ヌクレオチド(たとえば20〜200連続ヌクレオチド)からなる塩基配列に相補的な塩基配列を有する。上記の少なくとも15連続ヌクレオチドにおいて開始コドンを含む上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、さらにより好ましい。
(1)ACAT2(配列番号:45)、INSIG1(配列番号:11)、SCD(配列番号:13)、BMP6(配列番号:47)、CD274(配列番号:49)、CTGF(配列番号:51)、E2F7(配列番号:53)、EDN1(配列番号:55)、FAM43A(配列番号:57)、FRMD3(配列番号:59)、MMP10(配列番号:61)、MYEOV(配列番号:63)、NR2F1(配列番号:65)、NRCAM(配列番号:67)、PCSK1(配列番号:69)、PLXNA2(配列番号:71)、SLC30A3(配列番号:73)、SNAI1(配列番号:75)、SPOCD1(配列番号:77)、MMP1(配列番号:79)、TFPI2(配列番号:81)、HMGA2(配列番号:83)、KRTAP4-7(配列番号:85)、KRTAP4-8(配列番号:87)、KRTAP4-9(配列番号:89)、MYPN(配列番号:91)、RPPH1(配列番号:93)またはSIAE(配列番号:94)のAUG開始コドンを出発点として、その下流部をAAジヌクレオチド配列についてスキャンする。有用なsiRNAもしくはshRNA標的部位として各AAの出現する部位及び3'側に隣接する19塩基を候補配列とする。Tuschl, et al. (1999) Genes Dev 13: 3191-7に従うと、5'側及び3'側の非翻訳領域(UTR)並びに開始コドン付近の領域(75塩基内)に対するsiRNAもしくはshRNAの設計は、UTR結合タンパク質及び/又は翻訳開始複合体が、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合と干渉するため推奨されていない。
このように選択されたsiRNAの標的部位から成るセンス鎖は、対応するアンチセンス鎖とハイブリダイゼーションにより二重鎖RNAを形成し得る。他の態様として、該センス鎖とそれに対応するアンチセンス鎖とをループ配列を介して成る一本鎖RNA、すなわちshRNA、においては、ヘアピンループ構造を形成し得る。このような二重鎖RNAは、10塩基につき1塩基(もしくは1塩基未満)の不一致(ミスマッチ)を含んでも良い。好ましくは、二重鎖複合体の鎖は完全に相補的であり、不一致を含まない。上述のセンス鎖の核酸の一つ又は複数を含むベクター及びそのベクターを含む細胞もまた、本発明に包含される。
<iPS細胞株の樹立>
<線維芽細胞>
4名の脳動脈瘤合併多発性嚢胞腎患者および3名の脳動脈瘤合併なしの多発性嚢胞腎患者から同意のもとに生検した皮膚を培養して樹立した線維芽細胞を、それぞれPK-ane線維芽細胞およびPK-free線維芽細胞と命名し、本実施例に用いた。一方、3名の多発性嚢胞腎および脳動脈瘤を発症していない健常人の線維芽細胞株をnonPK線維芽細胞と命名し、本実施例に用いた。
Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycに対するヒトcDNAを、Takahashi, K. et al., Cell, 131(5), 861, 2007に記載の方法に従って、レトロウイルスを用いて前記線維芽細胞へ導入した。同様に、Oct3/4、Sox2およびKlf4に対するヒトcDNAを、Nakagawa, M. et al., Nat Biotechnol 26 (1), 101, 2008に記載の方法に従って、レトロウイルスを用いて前記線維芽細胞へ導入した。遺伝子導入後、線維芽細胞をSNLフィーダー細胞上に移し、翌日に4 ng/mlのbFGF(Wako)を添加した霊長類ES細胞用培養液へ培地を交換した。出現したコロニーをピックアップして、各線維芽細胞につき1つのiPS細胞株を選択した。選択したPK-ane線維芽細胞由来iPS細胞株をPK-ane-iPS1、PK-ane-iPS2、PK-ane-iPS3およびPK-ane-iPS4と命名し、PK-free線維芽細胞由来iPS細胞株をPK-free-iPS1、PK-free-iPS2およびPK-free-iPS3と命名し、ならびにnonPK線維芽細胞由来iPS細胞株をnonPK-iPS1、nonPK-iPS2およびnonPK-iPS3と命名した。ここで、PK-ane-iPS1、PK-ane-iPS2、PK-ane-iPS4、PK-free-iPS2、PK-free-iPS3、nonPK-iPS2およびnonPK-iPS3は、4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Myc)の導入により作製され、PK-ane-iPS3、PK-free-iPS1およびnonPK-iPS1は、3因子(Oct3/4、Sox2およびKlf4)の導入により作製された。
<血管内皮細胞への分化誘導>
上記のように作製した各iPS細胞株コロニーを適度なサイズに分離し、I型コラーゲンコーティングディッシュ(Becton Dickinson)上に散布し、霊長類ES/iPS細胞用培地(ReproCELL)で1日間培養しディッシュ面に接着させた。2日目にGSK-3α/β インヒビター(Sigma)、N2サプリメント、B27サプリメント(Invitrogen)を添加しさらに3日間培養した。そして、培地をヒト造血幹細胞用無血清培地(Invitrogen)に変更し、50ng/ml VEGF(Peprotec Inc)を添加しさらに5日間培養した後、細胞を解離し、VEGFR2陽性、TRA1陰性およびVE-カドヘリン陽性細胞をFACSにより分離した。続いて、分離した細胞をIV型コラーゲンコーティングディッシュ(Becton Dickinson)に散布し血管内皮細胞用増殖培地(Lonza)中で培養し、VE-カドヘリン、CD31、CD34、eNOSなどの血管内皮細胞マーカーを発現し敷石状の外観を持つ血管内皮細胞シートを構築した段階で血管内皮細胞(EC)として回収した。各iPS細胞株から作製したEC細胞を各々PK-ane-iPS1-EC、PK-ane-iPS2-EC、PK-ane-iPS3-EC、PK-ane-iPS4-EC、PK-free-iPS1-EC、PK-free-iPS2-EC、PK-free-iPS3-EC、nonPK-iPS1-EC、nonPK-iPS2-ECおよびnonPK-iPS3-ECと命名した。
<血管周皮細胞への分化誘導>
上記のように作製した各iPS細胞株コロニーを適度なサイズに分離し、I型コラーゲンコーティングディッシュ(Becton Dickinson)上に散布し、霊長類ES/iPS細胞用培地(ReproCELL)で1日間培養しディッシュ面に接着させた。2日目にGSK-3α/β インヒビター(Sigma)、N2サプリメント、B27サプリメント(invitrogen)を添加しさらに3日間培養した。そして、培地をヒト造血幹細胞用無血清培地(invitrogen)に変更しさらに5日間培養した後、細胞を解離し、VEGFR2陽性、TRA1陰性およびVE-カドヘリン陰性細胞をFACSにより分離した。続いて、分離した細胞をIV型コラーゲンコーティングディッシュ(Becton Dickinson)に散布しさらに2% FCSおよび20ng/ml PDGF-BB(Peprotech Inc)を含有するMEM中で培養し、α平滑筋アクチン、カルポニン等の血管周皮細胞マーカーを発現し紡錐形を呈する血管周皮細胞(MC)に分化誘導し回収した。各iPS細胞株から作製したMC細胞を各々PK-ane-iPS1-MC、PK-ane-iPS2-MC、PK-ane-iPS3-MC、PK-ane-iPS4- MC、PK-free-iPS1-MC、PK-free-iPS2- MC、PK-free-iPS3- MC、nonPK-iPS1-MC、nonPK-iPS2-MCおよびnonPK-iPS3-MCと命名した。
<各遺伝子発現確認>
実施例2で得られたPK-ane-iPS1-EC、PK-ane-iPS2-EC、PK-ane-iPS3-EC、nonPK-iPS1-EC、nonPK-iPS2-ECおよびnonPK-iPS3-ECにおける、NTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1、INSIG1、SCDおよびACAT2の発現量を表2に記載のプライマーを用いてRT-PCRにより測定し、PK-iPS細胞由来のECの各遺伝子の発現量をnonPK-iPS細胞由来のECと比較したところ、PK-ane-iPS細胞由来のECにおいてNTNG1、POSTN、TNC、KAL1、BST1の発現量が低いこと、ならびにINSIG1、SCDおよびACAT2の発現量が高いことを確認した(図1)。同様に、実施例3で得られたPK-ane-iPS1-MC、PK-ane-iPS2-MC、PK-ane-iPS3-MC、nonPK-iPS1-MC、nonPK-iPS2-MCおよびnonPK-iPS3-MCにおける、HSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1の発現量を表2に記載のプライマーを用いてRT-PCRにより測定し、PK-iPS細胞由来のMCの各遺伝子の発現量をnonPK-iPS細胞由来のMCと比較したところ、PK-iPS細胞由来のMC においてHSD3B1、KRT7、USP40およびSULT1E1の発現量が低いことを確認した(図2)。
Claims (4)
- 多発性嚢胞腎を有する被験者が合併症として脳動脈瘤を発症しているまたは発症するリスクを有しているか否かをin vitroで検査支援する方法であって、以下の工程:
(a)多発性嚢胞腎を有する被験者から単離された試料において、MMP1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の発現量を測定する工程;
および
(b)MMP1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子の前記発現量が、非合併患者由来の対照試料における発現量より高い場合、該被験者が多発性嚢胞腎の合併症として脳動脈瘤を発症している、または発症するリスクを有している、と決定する工程、
を含む方法。 - 前記試料が、血液、血清、血漿、血管内皮細胞、血管周皮細胞、及びこれらの細胞を含む組織からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子の発現量を測定する工程が、前記遺伝子のmRNA、cRNAもしくはcDNA量または前記遺伝子によってコードされるタンパク質の量を測定する工程である、請求項1または2に記載の方法。
- MMP1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子のオープンリーディングフレームの塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび/またはそれに相補的なポリヌクレオチド、ならびに/あるいは、MMP1、BMP6、CD274、CTGF、E2F7、EDN1、FAM43A、FRMD3、MMP10、MYEOV、NR2F1、NRCAM、PCSK1、PLXNA2、SLC30A3、SNAI1、SPOCD1、TFPI2、HMGA2、KRTAP4-7、KRTAP4-8、KRTAP4-9、MYPN、RPPH1およびSIAEから成る群より選択される1以上もしくは全部の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体もしくはそのフラグメント、を含む、多発性嚢胞腎を有する被験者においてその合併症として脳動脈瘤を発症しているまたは発症するリスクを有しているか否かを検査するためのキット。
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