JP2014523252A - 免疫調節のための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、免疫疾患の処置のための方法および試薬に関する。特に、本発明は、β鎖を欠くＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）のアイソフォームならびにそれに由来する断片およびペプチドに関し、および免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主病および過敏性疾患などの免疫疾患の処置のためのこれらのポリペプチドの使用に関する。さらに、本発明はまた、免疫疾患の処置のためのＨ因子の使用に関する。加えて、本発明は、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、そのペプチドおよび断片、ならびにＨ因子を用いて得られる寛容原性樹状細胞、ならびに前記細胞の治療的使用に関する。

Description

本発明は、免疫学の分野に関し、より詳しくは、樹状細胞において免疫寛容誘導状態を誘導することができ、β鎖を欠く補体Ｃ４ＢＰのアイソフォームおよびＨ因子に基づく組成物、ならびに免疫系の望ましくない活性化を特徴とする疾患の予防および／または治療のためのその使用に関する。
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫系の専門的ＡＰＣである。ＤＣは、その未熟な状態では、食作用または飲作用の手段によって細胞外抗原を取り込み、エンドソームおよびファゴソームなどのエンドサイトーシスコンパートメントでこれらの抗原を処理してペプチドとし、そこでペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する。これらの分子はまた、外因性タンパク質に由来するペプチドをＭＨＣクラスＩ提示経路に負荷するユニークな能力も有し、このプロセスは「交差提示」と呼ばれる。適当な分化シグナル（微生物産物など）が与えられれば、未熟ＤＣは、ナイーブＴ細胞とメモリーＴ細胞の両方を活性化する能力を備えた免疫原性ＤＣへと発達することができる。他方で、未熟ＤＣは寛容原性表現型へも分化することができ、この表現型は末梢性免疫寛容の維持に重要な役割を果たすと考えられる(Steinman, Ann. Rev. Immunol. 2003, 21: 685-711; Morelli, Immunol Rev 2003: 125-146)。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで寛容原性ＤＣを生成するための多くのプロトコールが記載されている(Xiao et al., J. lmmunother. 2006 (29) 465-471)。最もよく特徴付けられている方法では、薬理学的メディエーター（例えば、ビタミンＤ３類似体、グルココルチコイド、エストロゲンを含む免疫抑制剤）、サイトカインおよび増殖因子（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ）またはＴ細胞共刺激分子（例えば、ＣＤ８６およびＣＤ４０）の発現を抑制するか、またはＴ細胞阻害分子（例えば、ＣＴＬＡ−４およびインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）の発現を増強するための遺伝子工学が利用される。
ビタミンＤの活性化形態である１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）は、カルシウムおよび骨代謝におけるその中枢的機能に加えて多くの細胞種の増殖および分化に対する重要な作用ならびに顕著な免疫調節特性を有するセコステロイドホルモンである(van Etten et al., J Steroid Biochem and MoI Biol 2005 (97) 93-101)。１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の生物学的作用はビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）（ビタミンＤ応答性遺伝子内の特定のＤＮＡ配列エレメントであるビタミンＤ応答性エレメントと結合し、最終的には、それらのＲＮＡポリメラーゼＩＩを介する転写速度に影響を及ぼすアゴニストにより活性化される転写因子として機能する核ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバー）により媒介される。ＡＰＣ、特にＤＣは、ＶＤＲを発現し、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるＶＤＲアゴニストの重要な標的である。ＩＬ−１０は、主として、活性化されたリンパ球、単球およびマクロファージにより産生される。ＩＬ−１０は２つのサブユニット、すなわち、リガンド結合ＩＬ−１０Ｒ１とシグナル伝達ＩＬ−１０Ｒ２から構成される受容体と結合する。ＩＬ−１０は、ＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激分子の発現、ＩＬ−１２および炎症性サイトカインの分泌、ならびにいくつかのＡＰＣのＴ細胞刺激機能をダウンレギュレートする(Moore et al., Ann Rev Immunol 2001 (19)683-785)。
アンチセンスオリゴヌクレオチドに使用によるＴ細胞共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の阻害など、ＤＣの遺伝子操作は、寛容原性ＤＣの生成に効果的であることが分かった(Machen et al., J.Immunol. 2004, 173: 4331-4341)。このようなＤＣは、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−αレベルの低減をもたらし、非肥満糖尿病マウスにおける糖尿病を予防した。
これまでに自己免疫疾患に関してＵＳ ＦＤＡが承認した療法の大部分は、免疫炎症活性の全身的阻害に集中していた。非特異的免疫抑制は自己反応性免疫細胞機能の阻害に部分的には効果があるが、免疫応答を抑制するために使用される薬物には多くの副作用があり、継続的療法は長期宿主生存に貢献しない。従って、免疫系の感染排除能を維持しつつ、自己反応性免疫細胞機能の有害な作用の特異的遮断を可能とする自己抗原特異的処置を開発することが望ましい。よって、抗原特異的免疫寛容を効果的に誘導することができる、適切に備えられたＤＣを生成する方法に対する強い需要がある。
さらに、ｅｘ ｖｉｖｏで生成された、適当な免疫寛容誘導機能を有するＤＣは、アレルギーの処置における、また、移植免疫寛容の誘導のための治療用ワクチンとして実行され得る。自己免疫疾患に対する免疫療法の場合と同様に、有害な免疫応答の効果的な抑制には、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両Ｔ細胞の免疫寛容誘導が含まれる。従って、ｅｘ ｖｉｖｏで生成される寛容原性ＤＣは自己免疫疾患、アレルギーを治療する場合、および移植片拒絶を予防する場合と同様の特徴を有するべきであると予想することができる。
しかしながら、異なる寛容原性表現型を有し、かつ、寛容原決定基の発現を示す寛容原性樹状細胞を生産する新規かつ代替の方法は、常に当技術分野における研究の繰り返し発生する課題である。
本発明は、免疫疾患の予防および／または治療に使用するためのβ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームに関する。本発明はまた、Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインまたはその機能的に等価な変異体を含んでなるポリペプチド（ただし、前記ポリペプチドは全長Ｃ４ＢＰ α鎖を含まず、かつ、前記ポリペプチドは、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の領域を含まない）、配列番号２、３、４および５からなる群から選択される配列を有するペプチドまたはその機能的に等価な変異体、前記ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクターに関する。
別の面において、本発明は、本発明によるポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターを含んでなる医薬組成物に関する。
別の面において、本発明は、免疫疾患の予防および／または治療に使用するための、
（ｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体、
（ｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター
からなる群から選択される材料の組成物に関する。
別の面において、本発明は、寛容原性樹状細胞集団の作成方法に関し、その方法は、
（ｉ）樹状前駆細胞集団を未熟樹状細胞集団の形成に十分な条件下でインキュベートする工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた未熟樹状細胞集団を成熟樹状細胞の形成に十分な条件下でインキュベートする工程
を含んでなり、工程（ｉ）および／または（ｉｉ）は、
（ａ）β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、
（ｂ）本発明によるポリペプチド、
（ｃ）本発明によるペプチド、
（ｄ）本発明によるポリヌクレオチド、
（ｅ）本発明によるベクター、
（ｆ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体、
（ｇ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド、および
（ｈ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター
からなる群から選択される材料の組成物の存在下で行われる。
さらに別の面では、本発明は、本発明による方法により得られる寛容原性樹状細胞、 本発明の寛容原性樹状細胞集団を含んでなる医薬組成物、ならびに免疫疾患の予防および／または治療のための本発明の寛容原性樹状細胞集団の使用に関する。
β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームはヒトＭｏ−ＤＣの活性化表現型をダウンレギュレートする Ｃ４ＢＰ α７β０および組換えα６β０（α７β１はそうではない）は、ヒトＭｏ−ＤＣ由来の重要な表面マーカーのアップレギュレーションを阻害する。ヒトＭｏ−ＤＣは、それらの分化および成熟過程を通して、示された濃度のＣ４ＢＰアイソフォームとともにインキュベートした。ＤＣ成熟はＬＰＳ処理により達成された（詳しくは、材料およ方法を参照）。次に、細胞を回収し、洗浄し、フローサイトメトリーにより、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１ａおよびＨＬＡ−ＤＲの細胞表面発現を分析した。柱は、陽性細胞（Ａ）およびＭＦＩ（Ｂ）のパーセンテージを種々の表面マーカーに関して表す。ｉＤＣは、非処理の未熟ＤＣ；ｍＤＣは、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ。示されている結果は、８回の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである（＊はｍＤＣに対してｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊はｐ＜０．００１）。 Ｃ４ＢＰ処理はヒトＭｏ−ＤＣの生存率に影響を及ぼさない Ｃ４ＢＰ α７β０またはＣ４ＢＰ α７β１処理（２μｇ／ｍｌ）により得、ＬＰＳで成熟させたＭｏ−ＤＣの生存率を、材料および方法に記載されているように、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＤＤ染色ならびにフローサイトメトリー分析により評価した。参照として、本発明者らは免疫抑制剤ビタミンＤ３（カルシトリオール、Ｃａｌｃｉｇｅｘ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓ．Ａ．；２．４μＭ）で処理したＭｏ−ＤＣを含めた。ｉＤＣは、非処理の未熟ＤＣ；ｍＤＣは、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ。示されている結果は、８回の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである。 β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームに曝されたヒトＭｏ−ＤＣはＣＣＲ７ならびにＤＣ成熟マーカーＩＤＯおよびＢＩＣ−１の発現が低い （Ａ）Ｃ４ＢＰ処理かつＬＰＳ成熟Ｍｏ−ＤＣの遺伝子発現プロフィール。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術を用いたＲＴ−ｑＰＣＲによるＣＣＲ７、ＩＤＯ、およびＢＩＣ−１遺伝子発現の比較定量。示されている結果は、６回（ＣＣＲ７）、４回（ＩＤＯ）、および３回（ＢＩＣ−１）の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである。（Ｂ）フローサイトメトリーによるＣ４ＢＰ処理かつＬＰＳ成熟Ｍｏ−ＤＣに対するＣＣＲ７表面発現分析（ＭＦＩ）。示されている結果は、３回の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである。ｉＤＣは、非処理の未熟ＤＣ；ｍＤＣは、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ（＊はｍＤＣに対してｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１）。 β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームはＬＰＳ成熟ヒトＭｏ−ＤＣによる炎症性サイトカインの放出を阻害する ２μｇ／ｍｌの種々のＣ４ＢＰアイソフォームで処理したＭｏ−ＤＣをＬＰＳで成熟させ、各上清中のＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの濃度を分析した。示されている結果は、２反復で実施した３回の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである。ｉＤＣは、非処理の未熟ＤＣ；ｍＤＣは、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ（＊はｍＤＣに対してｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊はｐ＜０．００１）。 β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームはヒトＭｏ−ＤＣの形態を改変する ２μｇ／ｍｌの主要なＣ４ＢＰアイソフォーム（α７β０またはα７β１）で処理し、ＬＰＳで成熟させたＭｏ−ＤＣの表面形態をＳＥＭにより調べ、非処理の未熟ＤＣ（ｉＤＣ）およびＬＰＳ成熟ＤＣ（ｍＤＣ）の両方から得られたものと比較した。Ｃ４ＢＰ α７β０で処理されたＤＣに長い樹状突起が存在しないことが、より密接に未熟ＤＣ表現型に似ていることを注記しておく。 β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームはヒトＭｏ−ＤＣの走化性を変化させる ＬＰＳ成熟後の非処理Ｍｏ−ＤＣおよびＣ４ＢＰ処理Ｍｏ−ＤＣの、ケモカインＣＣＬ２１へと向かう移動を、トランスウェルアッセイで評価した。２時間のインキュベーション後に下方のＣＣＬ２１含有チャンバーへと移動したＤＣの、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ（ｍＤＣ）で得られた移動値（１００％）に対するパーセンテージを示す。ＣＣＬ２１を含まない下方チャンバーへのＤＣの自然移動も評価した。結果は、２反復で実施した４回の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである（＊はｍＤＣに対してｐ＜０．０５）。 β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームに曝されたヒトＭｏ−ＤＣは同種異系Ｔ細胞の増殖を阻害する 非処理（ｍＤＣ）、Ｃ４ＢＰ処理（α７β０もしくはα７β１、２μｇ／ｍｌ）またはＶｉｔＤ３処理（カルシトリオール、Ｃａｌｃｉｇｅｘ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓ．Ａ．；２．４μＭ）を行い、かつ、ＬＰＳで成熟させたＭｏ−ＤＣを、同種異系の精製ＣＤ３＋Ｔ細胞（１０５／ウェル）とともに１：４０（ｎ＝１０）、１：８０および１：１６０（両方ともｎ＝４）ＤＣ：Ｔ細胞比で５日間、３反復で培養した。［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を培養の最後の１６時間に加え、組み込みをβ−プレートカウンターにより測定した（＊はｍＤＣに対してｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊はｐ＜０．００１）。ｉＤＣは、非処理の未熟ＤＣ。 Ｃ４ＢＰＡのＣＣＰ６ドメインはヒトＭｏ−ＤＣに対するＣ４ＢＰの「免疫寛容誘導」活性に必要である ヒトＭｏ−ＤＣを、それらの分化および成熟過程を通して、示された濃度のＣ４ＢＰ α鎖ＣＣＰ欠失突然変異体（ΔＣＣＰ１〜ΔＣＣＰ８；総て２μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした（Ａ）。ＤＣ成熟はＬＰＳ処理（５μｇ／ｍｌ）により達成された。次に、細胞を回収し、洗浄し、ＣＤ１４、ＣＤ８３、ＣＤ１ａおよびＨＬＡ−ＤＲの細胞表面発現をフローサイトメトリーにより分析した。柱は、陽性細胞（Ｂ）、およびＭＦＩ（Ｃ）のパーセンテージを種々の表面マーカーに関して表す。ｉＤＣは、非処理の未熟ＤＣ；ｍＤＣは、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ。示されている結果は、８回の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである（＊はｍＤＣに対するｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊はｐ＜０．００１）。 ＣＣＰ６に基づくペプチドＰＳ６−０４はヒトＭｏ−ＤＣの成熟表現型を妨げる （Ａ）ＣＣＰ６アミノ酸配列および使用した４つのＣＣＰ６に基づくペプチドの直線的表示。（Ｂ）ヒトＭｏ−ＤＣを、それらの分化および成熟過程を通して、ＰＳ６−０１、ＰＳ６−０２、ＰＳ６−０３、またはＰＳ６−０４ペプチド（総て１００μＭ）とともにインキュベートした。ＤＣ成熟はＬＰＳ処理（５μｇ／ｍｌ）により達成された。次に、細胞を回収し、洗浄し、特異的ＤＣ成熟マーカーＣＤ８３である細胞表面発現をフローサイトメトリーにより分析した。柱は、陽性細胞のパーセンテージ（％）と蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を表す。ｉＤＣは、非処理の未熟ＤＣ；ｍＤＣは、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ。示されている結果は、３回の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである（＊はｍＤＣに対するｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊はｐ＜０．００１）。ｎ．ｄ．は、測定せずを表す。 Ｈ因子はヒトＭｏ−ＤＣの活性化表現型をダウンレギュレートする Ｈ因子は、ヒトＭｏ−ＤＣ由来の重要な表面マーカーのアップレギュレーションを阻害する。ヒトＭｏ−ＤＣを、それらの分化および成熟過程を通して、示された濃度のＨ因子とともにインキュベートした。ＤＣは成熟ＬＰＳ処理により達成された（詳しくは、材料およ方法を参照）。次に、細胞を回収し、洗浄し、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１ａおよびＨＬＡ−ＤＲの細胞表面発現をフローサイトメトリーにより分析した。柱は、陽性細胞（Ａ）およびＭＦＩ（Ｂ）のパーセンテージを種々の表面マーカーに関して表す。ｉＤＣは、非処理の未熟ＤＣ；ｍＤＣは、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ。示されている結果は、５回の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである（＊はｍＤＣに対するｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊はｐ＜０．００１）。 Ｈ因子はヒトＭｏ−ＤＣの生存率に影響を及ぼさない Ｈ因子処理（５μｇ／ｍｌ）により得、ＬＰＳで成熟させたＭｏ−ＤＣの生存率を、材料および方法に記載されているように、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＤＤ染色、ならびにフローサイトメトリー分析により評価した。参照として、本発明者らは免疫抑制剤ビタミンＤ３（カルシトリオール、Ｃａｌｃｉｇｅｘ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓ．Ａ．；２．４μＭ）で処理したＭｏ−ＤＣを含めた。ｉＤＣは、非処理の未熟ＤＣ；ｍＤＣは、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ。示されている結果は、８回の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである。 Ｈ因子に曝されたヒトＭｏ−ＤＣはＣＣＲ７ならびにＤＣ成熟マーカーＩＤＯ、ＢＩＣ−１およびＳＯＤ２の発現が低い （Ａ）Ｈ因子処理（５μｇ／ｍｌ）かつＬＰＳ成熟Ｍｏ−ＤＣの遺伝子発現プロフィール。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術を用いたＲＴ−ｑＰＣＲによるＣＣＲ７、ＩＤＯ、ＢＩＣ−１、およびＳＯＤ２遺伝子発現の比較定量。示されている結果は、４回の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである。（Ｂ）フローサイトメトリーによるＨ因子処理かつＬＰＳ成熟Ｍｏ−ＤＣに対するＣＣＲ７表面発現分析（ＭＦＩ）。示されている結果は、３回の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである。ｉＤＣは、非処理の未熟ＤＣ；ｍＤＣは、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ（＊はｍＤＣに対してｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊はｐ＜０．００１）。 Ｈ因子はＬＰＳ成熟ヒトＭｏ−ＤＣによる炎症性サイトカインの放出を阻害する ５μｇ／ｍｌの種々のＣ４ＢＰアイソフォームで処理したＭｏ−ＤＣをＬＰＳで成熟させ、各上清中のＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの濃度を分析した。示されている結果は、２反復で実施した４回の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである。ｉＤＣは、非処理の未熟ＤＣ；ｍＤＣは、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ（＊はｍＤＣに対してｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊はｐ＜０．００１）。 Ｈ因子はヒトＭｏ−ＤＣの形態を改変する Ｈ因子（１０μｇ／ｍｌ）で処理し、ＬＰＳで成熟させたＭｏ−ＤＣの表面形態をＳＥＭにより調べ、非処理の未熟ＤＣ（ｉＤＣ）およびＬＰＳ成熟ＤＣ（ｍＤＣ）の両方から得られたものと比較した。Ｈ因子で処理されたＤＣに長い樹状突起が存在しないことが、より密接に未熟ＤＣ表現型に似ていることを注記しておく。 Ｈ因子はｉＤＣのエンドサイトーシス能を低下させる 非処理の、またはＨ因子で処理した（２、５、および１０μｇ／ｍｌ）未熟Ｍｏ−ＤＣを、蛍光ＤＱ−ＯＶＡとともに暗所にて３７℃で１５分間インキュベートし、フローサイトメトリーにより調べ、特異的取り込みを測定した。Ｈ因子処理ｉＤＣ（ｉＤＣ）の食作用レベルは、非処理のｉＤＣよりも有意に低かった（＊はｐ＜０．０５）。結果は、３回の独立した実験からの平均ＭＦＩ＋／−ＳＤとして表す。 Ｈ因子はヒトＭｏ−ＤＣの走化性を変化させる ＬＰＳで成熟させた、非処理Ｍｏ−ＤＣおよびＨ因子処理Ｍｏ−ＤＣの、ケモカインＣＣＬ２１へ向かう移動を、トランスウェルアッセイにより評価した。２時間のインキュベーション後に下方のＣＣＬ２１含有チャンバーへと移動したＤＣの、非処理ＤＣ（ｍＤＣ）から得られた移動値（１００％）に対するパーセンテージを示す。ＣＣＬ２１を含まない下方チャンバーへのＤＣの自然移動も評価した。結果は、２反復で実施した４回の独立した実験からの平均＋／−ＳＤである（＊はｍＤＣに対してｐ＜０．０５）。 Ｈ因子に曝されたヒトＭｏ−ＤＣは同種異系Ｔ細胞の増殖を阻害する 非処理（ｍＤＣ）、５μｇ／ｍｌのＨ因子処理またはＶｉｔＤ３処理（カルシトリオール、Ｃａｌｃｉｇｅｘ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓ．Ａ．；２．４μＭ）を行い、かつ、ＬＰＳで成熟させたＭｏ−ＤＣを、同種異系の精製ＣＤ３＋Ｔ細胞（１０５／ウェル）とともに１：４０（ｎ＝８）、１：８０および１：１６０（両方ともｎ＝４）ＤＣ：Ｔ細胞比で５日間、３反復で培養した。［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を培養の最後の１６時間に加え、組み込みをβ−プレートカウンターにより測定した（＊はｍＤＣに対してｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊はｐ＜０．００１）。ｉＤＣは、非処理の未熟ＤＣ。 Ｃ４ＢＰ（β−）またはＦＨにより誘導された寛容原性ＤＣは安定な表現型を示す Ｃ４ＢＰ（β−）またはＦＨで処理し、ＬＰＳで成熟させたＤＣの安定性を、免疫調節剤（Ｃ４ＢＰ（β−）またはＦＨ）を含まない完全培地中、炎症誘発性ＴＮＦ−α（１００Ｕ／ｍｌ）＋ＩＦＮ−γ（１０００Ｕ／ｍｌ）でさらに２４時間誘導を行った後に評価した。ＤＣマーカーＣＤ８３（Ａ）およびＣＤ８６（Ｂ）の蛍光強度中央値（ＭＩＦ）を総てのＤＣ条件（ＴＮＦ−α＋ＩＦＮ−γを含むまたは含まない）について求めた。ｉＤＣは、未熟ＤＣ；ｍＤＣは、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ；Ｂ−５は、Ｃ４ＢＰ（β−）処理（５μｇ／ｍｌ）かつＬＰＳ成熟ＤＣ；ＷＴ５は、Ｃ４ＢＰ（β＋）処理（５μｇ／ｍｌ）かつＬＰＳ成熟ＤＣ；Ｒｅｃ２は、組換えＣ４ＢＰ（β−）処理（２μｇ／ｍｌ）かつＬＰＳ成熟ＤＣ；ＦＨ５は、ＦＨ処理（５μｇ／ｍｌ）かつＬＰＳ成熟ＤＣ（各群ｎ＝６）。 Ｃ４ＢＰ（β−）処理またはＦＨ処理ＤＣで刺激されたＴリンパ球によるＩＦＮ−γの産生および分泌の低下 増殖中のＴリンパ球を同種刺激培養から得た。ＩＦＮ−γの産生は、ブレフェルディンの存在下、ＰＭＡ＋イオノマイシンで５時間、細胞を再刺激した後に、細胞内染色により測定した。（Ａ）Ｃ４ＢＰ（β−）またはＦＨで処理し、ＬＰＳで成熟させたＤＣ：Ｔ培養からの全Ｔ細胞細胞内ＩＦＮ−γ産生の結果を、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ：Ｔ培養（１００％産生とする）と比較してまとめたもの。（Ｂ）自己刺激（ＣＳＦＥｌｏｗＣＤ３＋細胞）に応答したＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞のパーセンテージ。各記号は個々のサンプルを表す。ｉＤＣは、未熟ＤＣ；ｍＤＣは、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ；Ｃ４ＢＰ（β−）またはＢは、Ｃ４ＢＰ（β−）処理（５μｇ／ｍｌ）かつＬＰＳ成熟ＤＣ；ＷＴは、Ｃ４ＢＰ（β＋）処理（５μｇ／ｍｌ）かつＬＰＳ成熟ＤＣ；ＦＨは、ＦＨ処理（５μｇ／ｍｌ）かつＬＰＳ成熟ＤＣ；ＶｉｔＤは、ＶｉｔＤ処理かつＬＰＳ成熟ＤＣ。有意差を示す（ｍＤＣ／ＷＴ：ｎ＝３を除き、各群ｎ＝４）；＊はｐ＜０．０５；対応のあるｔ検定）。 Ｃ４ＢＰ（β−）またはＦＨ処理ＤＣは芽細胞Ｔ細胞からのＣＤ４＋ＣＤ２５ ｈｉ Ｃｄ１２７ ｌｏｗ ＦｏｘＰ３＋誘導を促進する 再刺激もいずれのサイトカイン補給も行わずに培養６日後、細胞サイズをＦＡＣＳにより、側方散乱（ＳＳＣ）パラメーターに対して前方散乱（ＦＳＣ）パラメーターをプロットすることによって評価した（左の列）。ＣＤ４＋、ＦｏｘＰ３＋としてのＴ細胞の表現型（中央の列）およびＣＤ１２７発現が低いか無いＣＤ２５＋（右の列）。４つの代表的な実験のうちの１つを示す。ｉＤＣは、未熟ＤＣ；ｍＤＣは、非処理のＬＰＳ成熟ＤＣ；Ｂは、Ｃ４ＢＰ（β−）処理（５μｇ／ｍｌ）かつＬＰＳ成熟ＤＣ；ＷＴは、Ｃ４ＢＰ（β＋）処理（５μｇ／ｍｌ）かつＬＰＳ成熟ＤＣ；ＦＨは、ＦＨ処理（５μｇ／ｍｌ）かつＬＰＳ成熟ＤＣ；ＶｉｔＤは、ＶｉｔＤ処理かつＬＰＳ成熟ＤＣ。
β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームの治療的使用
本発明者らは、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームが成熟刺激の存在下での樹状細胞の成熟を阻害することができ、かつ、寛容原性樹状細胞の特徴を示す樹状細胞の生成を促進することができることを見出した。本発明の実施例１〜６に示されるように、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームは、ヒトＭｏ−ＤＣの活性化マーカーおよびＬＰＳ成熟ヒトＭｏ−ＤＣによる炎症性サイトカインの放出をダウンレギュレートすることができる。さらに、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームは、樹状細胞への曝露に応答して、ヒトＭｏ−ＤＣの形態を改変し、ヒトＭｏ−ＤＣの走化性および同種異系Ｔ細胞の増殖を低下させる。
さらに、本発明の筆者らは、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームは、Ｔ細胞刺激能が低減され、かつ、炎症誘発条件下でＴｈ１の分化を妨げるだけでなく制御性Ｔ細胞生成能を有する寛容原性樹状細胞を生成することを見出した。
よって、第１の態様において、本発明は、免疫疾患の予防および／または治療において使用するためのβ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームに関する。
別の実施態様では、本発明は、免疫疾患の予防および／または治療用薬剤の製造のための、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームの使用に関する。
別の面において、本発明は、必要とする対象において免疫疾患を予防および／または治療するための方法であって、前記対象にβ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームを投与することを含んでなる方法に関する。
別の面において、本発明は、必要とする対象において寛容原性樹状細胞および／または制御性Ｔ細胞集団を増加させるための方法であって、前記対象にβ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームを投与することを含んでなる方法に関する。
別の面において、本発明は、寛容原性樹状細胞および／または制御性Ｔ細胞集団の増加において使用するための、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームに関する。
本明細書において用語「Ｃ４ＢＰ」は、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂのＩ因子依存性分解の補因子として働き、古典経路Ｃ３／Ｃ５−コンベルターゼの減衰を加速化する、主として肝臓細胞により合成される、古典経路の調節成分を意味する。Ｃ４ＢＰは、３つのアイソフォームとして血漿中を循環しており、その割合はＣ４ＢＰα（７０ｋＤａ）とＣ４ＢＰβ（４５ｋＤａ）鎖の相対的レベルに依存している。Ｃ４ＢＰの主要なアイソフォームは、７本の同一のα鎖と１本のβ鎖（α７β１）から構成されるが、炎症時には通常、α鎖のみから構成される希少なアイソフォーム（α７β０）がアップレギュレートされる。さらに、真核細胞でのα鎖の組換え発現では、６本α鎖（α６β０）を含んでなるオリゴマーが生じる。よって、本発明の方法において有用なＣ４ＢＰアイソフォームには、複数のα鎖の会合から生じ、β鎖を欠いているいずれのアイソフォームも含まれる。
当業者ならば、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームは、それらが下記に定義されるように自然界に本来存在しているので（例えば、ヒト、マウス、ラット、またはウシＣ４ＢＰ α鎖）、α鎖のみから形成されてもよく、または１以上のα鎖変異体を含んでもよいことを理解するであろう。例えば、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームは、少なくとも１本、少なくとも２本、少なくとも３本、少なくとも４本、少なくとも５本、少なくとも６本のα鎖変異体を含んでもよく（Ｃ４ＢＰアイソフォームがα６β０である場合）、または少なくとも１本、少なくとも２本、少なくとも３本、少なくとも４本、少なくとも５本、少なくとも６本もしくは少なくとも７本のα鎖変異体を含んでもよい（Ｃ４ＢＰアイソフォームがα７β０である場合）。
本明細書において用語「Ｃ４ＢＰ α鎖」は、ＰＲＰまたはプロリンリッチタンパク質としても知られ、ＮＣＢＩデータベース（２０１１年４月５日公開）で受託番号Ｐ０４００３として定義されるヒトポリペプチドの成熟プロセシング型を意味し、アミノ酸４９〜５９７を含んでなる。用語Ｃ４ＢＰ α鎖はまた、ヒトＣ４ＢＰ α鎖の相同分子種、例えば、ＮＣＢＩデータベースに受託番号Ｐ０８６０７として示されるポリペプチドの成熟型（アミノ酸５７〜４６９）に相当するマウスＣ４ＢＰ α鎖、ＮＣＢＩデータベースに受託番号Ｑ６３５１４として示されるポリペプチドの成熟型（アミノ酸１４〜５５８）に相当するラットＣ４ＢＰ α鎖、ＮＣＢＩデータベースに受託番号Ｑ２８０６５として示されるポリペプチドの成熟型（アミノ酸４９〜６１０）に相当するウシＣ４ＢＰ α鎖を意味して使用される。
Ｃ４ＢＰ α鎖は、１−３ ２−４配置でジスルフィド結合した４つのシステイン残基とほとんど不変のトリプトファン残基の周囲に形成された疎水性コアを有する６０アミノ酸残基長の８つの補体調節タンパク質ドメイン（ＣＣＰ）を含む。α鎖およびβ鎖両方のＣ末端伸張部は、それぞれ２個のシステイン残基と、分子の細胞内重合に必要な両親媒性(amphipatic)αヘリックス領域とを含む。
用語「Ｃ４ＢＰ α鎖」はまた、本発明では、１以上のアミノ酸の改変、挿入または欠失から生じ、かつ、他のＣ４ＢＰ α鎖またはその変異体とオリゴマーを形成する能力を実質的に保持している、上記で定義される天然型Ｃ４ＢＰ α鎖のいずれの変異体も意味して使用される。変異体がオリゴマーを形成することができるかどうかを判定する方法は当業者に利用可能であり、例えば、Blom et al. (J.Biol.Chem. 2001, 276: 27136-27144)により記載されているような、真核細胞（例えば、２９３細胞）で変異体α鎖を組換え発現させた後、欠失されていないＣＣＰ領域の１つに特異的な抗体を用いてアフィニティー精製することにより得られた精製Ｃ４ＢＰの、非変性条件下でのポリアクリルアミド(polyacryamide)ゲル電気泳動による分析に基づく方法が含まれる。
本発明に従って使用するためのＣ４ＢＰ α鎖変異体としは、限定されるものではないが、以下のものが含まれる。
−天然型多型変異体（すなわち、対立遺伝子）ならびに組換え的に操作または工作されたα鎖変異体。本発明に従った使用に好適な変異体Ｃ４ＢＰ α鎖としては、限定されるものではないが、上記で定義される天然型Ｃ４ＢＰ α鎖ポリペプチドと、特に、ヒト起源の天然型Ｃ４ＢＰ α鎖と、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドが含まれる。
上記で示されるアミノ酸配列に対する、Ｃ４ＢＰ α鎖変異体のアミノ酸配列の同一性パーセントは、配列比較により、当業者によって容易に決定することができる。本明細書において、２つのアミノ酸配列は、最大の一致が得られるようにアラインした場合にその２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が同じであれば、１００パーセントのアミノ酸配列同一性を有する。ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）の配列比較は、当業者に周知のコンピューターアルゴリズムを用いるものなど、いずれの方法を用いて行ってもよい。このようなアルゴリズムには、ＡｌｉｇｎまたはＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991; Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992参照）が含まれ、これらはＮＣＢＩウェブサイト（［オンライン］インターネットncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST参照）で利用可能である。デフォルトパラメーターを使用することができる。さらに、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスーツ(DNASTAR, Inc., Madison, Wis.)；ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム(Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-80 (1991))；および「ＧｅｎｅＤｏｃ」(Nicholas et al., EMBNEW News 4:14 (1991))に含まれているものなどの標準的なソフトウエアプログラムが利用可能である。最適アラインメントを決定することにより２つのアミノ酸配列を比較する他の方法も当業者により実施されている（例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997);およびBishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Ed. (Academic Press, Inc. 1998)参照）。
−ＣＣＰ６領域が保持されている限り、ＣＣＰ領域のうちの少なくとも１つを欠く欠失突然変異体（実施例７参照）、例えば、ＣＣＰ１ドメインを欠く、ＣＣＰ２ドメインを欠く、ＣＣＰ３ドメインを欠く、ＣＣＰ４ドメインを欠く、ＣＣＰ５ドメインを欠く、ＣＣＰ７ドメインを欠く、および／またはＣＣＰ８ドメインを欠く突然変異体。
−Ｃ４ＢＰ α鎖を含んでなる第１の領域と、Ｃ４ＢＰ α鎖の一部を形成しないポリペプチドを含んでなる第２の領域とを含んでなる融合タンパク質。本発明の融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）ＣＣＰ６ドメインを含んでなる領域、および（ｂ）Ｃ４ＢＰ α鎖の一部を形成しないポリペプチドを含んでなる領域を含んでなり得る。あるいは、本発明の融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）Ｃ４ＢＰ α鎖の一部を形成しないポリペプチドを含んでなる領域、および（ｂ）ＣＣＰ６ドメインを含んでなる領域を含んでなり得る。薬物動態特性を改善する融合タンパク質の例としては、限定されるものではないが、ヒトアルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、Ｆｃドメイン、ポリＧｌｕまたはポリＡｓｐ配列、フェリチンおよびトランスフェリンとの融合が含まれる。さらに、アミノ酸Ｐｒｏ、Ａｌａ、およびＳｅｒから構成される立体障害ポリペプチド配列との融合（「ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ」）またはヒドロキシエチルデンプンとの融合（ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標））は、Ｃ−ペプチドの流体力学的体積を増す簡単な方法を提供する。この付加的伸張部は嵩高のランダム構造を採り、結果として得られる融合タンパク質のサイズを著しく大きくする。好ましい実施態様では、このＣ４ＢＰ α鎖の一部を形成しないポリペプチドを含んでなる領域は、免疫グロブリンＦｃ領域である。
本明細書において、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリン鎖定常領域の、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域の、カルボキシル末端部分、またはその一部を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２以上のＣＨドメインの組合せと、免疫グロブリンヒンジ領域とを含んでなり得る。本発明の融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域は、好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、さらに好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ｓＩｇＡ、より好ましくは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４、最も好ましくは、ＩｇＧ２から選択されるアイソタイプの免疫グロブリンのＦｃまたはＦｃの一部を含んでなる、またはからなる。
本明細書において用語「免疫疾患」は、自然免疫系または適応免疫系、ならびに体液性免疫系または細胞性(cell branch)免疫系を含め、免疫系の望ましくない活性化により引き起こされるいずれの疾患も意味する。
好ましい実施形態では、免疫疾患は、免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主病および過敏性疾患からなる群から選択される。
本明細書において用語「免疫炎症性疾患」とは、免疫細胞および／またはサイトカインが疾患または障害の病態生理学に関与する、炎症性疾患および障害を意味する。免疫炎症性疾患の例としては、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、急性呼吸窮迫症候群および喘息などの病態が含まれる。免疫炎症性疾患という用語には、急性および慢性両方の炎症疾患が含まれる。用語「急性炎症性障害」は、炎症性応答を伴う症状の急性発症および比較的短期間の症状を特徴とする障害、および障害のエピソードを含むことを意図し、「慢性炎症疾患」は、炎症性応答を伴う症状の持続的存在および症状の進行期間を特徴とする障害を含むことを意図する。本発明による方法で処置可能な免疫炎症性疾患としては、限定されるものではないが、梗塞または卒中などの心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、肺線維症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、急性呼吸窮迫症候群、喘息、および癌が含まれる。また、本発明に従って処置可能な免疫炎症性疾患の範囲内に含まれるものとしては、子癇前症および子癇などの妊娠中に現れる疾患が含まれる。子癇前症は、高血圧、蛋白尿および浮腫を特徴とする妊娠関連疾患である。子癇前症は、本明細書では、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、早期流産、早産、子宮内死および子癇を含む、ある範囲の子癇前症障害を包含し、前記範囲内にあると理解され、また、そのように定義されるべきである。
本明細書において用語「敗血症」は、感染の原発部位から離れた末端器官の機能不全を特徴とする、それまでは無菌の組織における、微生物に対する全身性宿主応答を意味する。敗血症として認定するためには、感染、または感染に特徴的な臨床症候群が疑われ、または証明されなければならない（培養、染色またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による）。感染の特定のエビデンスとしては、通常は無菌の流体（例えば、尿または脳脊髄液（ＣＳＦ））中のＷＢＣ、内臓穿孔のエビデンス（腹部Ｘ線またはＣＴスキャンでの遊離ガス、急性腹膜炎の徴候）、肺炎と一致する異常な胸部Ｘ線（ＣＸＲ）（局部的混濁化を伴う）、または点状出血、紫斑病、もしくは電撃性紫斑病が含まれる。敗血症のより重大なサブセットは、重症敗血症（急性臓器不全を伴う敗血症）および敗血性ショック（難治性動脈性低血圧症を伴う敗血症）である。別法として、全身性炎症性応答症候群判定基準の２つ以上が感染のエビデンスを用いずに満たされた場合に、患者は簡単に「ＳＩＲＳ」を有すると診断することができる。ＳＩＲＳおよび急性臓器不全を有する患者は「重症ＳＩＲＳ」と呼ぶことができる。患者が敗血症と全身性低潅流の徴候（すなわち、末端臓器不全または４ｍｍｏｌ／ｄＬを超える血清乳酸のいずれか）を持てば、その患者は「重症敗血症」を有すると定義される。他の徴候としては、乏尿症および精神状態の変化が含まれる。患者が敗血症と急速輸液蘇生（一般に６リットルまたは晶質４０ｍｌ／ｋｇを超える）後の低血圧症を持てば、その患者は敗血性ショックを有すると定義される。末端臓器不全の例としては、急性肺損傷もしくは急性呼吸窮迫症候群、脳症、または肝臓に影響を及ぼす機能不全（タンパク質合成機能および代謝機能の破綻）、腎臓（乏尿症および無尿、電解質異常、容量過負荷）、および心臓（収縮期および拡張期心不全）が含まれる。
本発明による組成物で処置することができる好適な敗血症病態としては、限定されるものではないが、重症敗血症、敗血性ショックが含まれる。一実施態様において、敗血症症候群に関連する病態は、臓器不全、好ましくは、腎不全または肝不全、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、および播種性血管内凝固（ＤＩＣ）からなる群から選択される。
敗血症は、グラム陰性菌およびグラム陽性細菌からなる群から選択される１種の細菌または２種以上の細菌により誘発され得る。好ましくは(Preferrably)、グラム陰性菌は、大腸菌(Escherichia coli)、クレビシエラ(Klebsiella)種、セラチア (Serratia) 種、エンテロバクター(Enterobacter)種、プロテウス(Proteus)種、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ナイセリア(Neisseria)種、およびリステリア(Listeria)種からなる群から選択される。あるいは、グラム陽性菌は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌(Staphylococci)、腸球菌(Enterococcus)種、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、および緑色連鎖球菌(Streptococcus viridans) からなる群から選択される。一実施態様において、敗血症症候群はＬＰＳにより誘導される。さらに別の実施態様において、敗血症は、好気性細菌、真菌、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、スピロヘータ、およびウイルスからなる群から選択される１種の微生物または２種以上の微生物により誘発され得る。
用語「自己免疫疾患」、「免疫不全／調節不全に関連する疾患」または「免疫炎症性疾患」は、本明細書を通して、患者の免疫系が自己抗原（自己免疫）または外来抗原（免疫不全／調節不全または免疫炎症性疾患）から疾患を生じる病態を意味して用いられる。自己免疫は誰もに、ある程度存在する。自己免疫は通常は無害であり、おそらく脊椎動物の生命に普遍的な現象である。しかしながら、自己免疫は、自己免疫疾患として知られる広範囲のヒト疾病の原因となり得る。ヒト疾病の原因としてのこの自己免疫の概念は比較的新しく、１９５０年代および１９６０年代まで、医学的考察の主流には受け入れられていなかった。よって、自己免疫疾患は、良性自己免疫から病的自己免疫へと進行が起こる場合に定義される。この進行は、遺伝的影響と環境的誘因の両方によって決定される。このヒト疾病の実際の原因（結果や無害な付随物ではなく）としての自己免疫の概念は、ある疾患を自己免疫疾患と定義する判定基準の確立に使用することができる。本発明により処置可能な自己免疫疾患または免疫不全もしく調節不全を含むことを特徴とする疾患（免疫炎症性疾患）としては、他の多くの中でも、全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosis)（ＳＬＥ）、糖尿病（Ｉ型）、喘息、潰瘍性大腸炎、グレーブス病、関節炎（関節リウマチおよび骨関節炎を含む）、悪性貧血、および多発性硬化症が挙げられる。中でも、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、強直性脊椎炎を含む、自己免疫血液疾患；多発性筋炎および皮膚筋炎を含む、筋肉組織の自己免疫疾患；自己免疫性難聴およびメニエール症候群を含む、耳の自己免疫疾患；モーレン病、ライター症候群およびフォークト−小柳−原田病を含む、自己免疫性眼疾患；糸球体腎炎およびＩｇＡ腎症を含む、腎臓の自己免疫疾患；糖尿病（Ｉ型）；尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、紅斑性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、白斑、後天性表皮水疱症、乾癬および円形脱毛症などの天疱瘡（自己免疫性水疱症）を含む、自己免疫性皮膚疾患；自己免疫性心筋炎、チャーグ−ストラウス症候群、巨大細胞動脈炎、川崎病、結節性多発性動脈炎、高安動脈炎およびウェゲナー肉芽腫を含む血管炎を含む、心血管自己免疫疾患；アジソン病、自己免疫性上皮小体機能低下症、自己免疫性下垂体炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性***、グレーブス病、橋本甲状腺炎、１型多腺性自己免疫症候群（ＰＡＳ−Ｉ）、２型多腺性自己免疫症候群（ＰＡＳ−２）、および３型多腺性自己免疫症候群３（ＰＡＳ−３）を含む内分泌自己免疫疾患；自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、セリアック病、クローン病を含む、自己免疫性胃腸疾患；多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン−バレー症候群および慢性炎症性脱髄神経障害を含む、自己免疫性神経疾患；ならびに全身性紅斑性狼瘡、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性リンパ増殖性疾患、自己免疫性多腺性内分泌障害、ベーチェット病、グッドパスチャー病、関節炎(arthrtitis)（関節リウマチ、骨関節炎および敗血性関節炎を含む）、サルコイドーシス、硬皮症およびシェーグレン症候群および乾癬を含む、全身性自己免疫疾患といった、多くの自己免疫疾患が本発明の方法を用いて処置可能である。
本明細書において「移植拒絶」という表現は、移植された細胞、組織または臓器が移植レシピエントの身体に受け入れられない免疫病態を意味する。移植拒絶という表現には、急性および慢性両方の移植拒絶を包含する。
「急性拒絶またはＡＲ」は、移植された組織が免疫学的に外来である場合の、組織移植レシピエントの免疫系による拒絶である。急性拒絶は、レシピエントの免疫細胞による移植組織の浸潤を特徴とし、これらの免疫細胞はそれらのエフェクター機能を遂行し、移植組織を破壊する。急性拒絶の発生は急速であり、一般にヒトでは移植手術の後、数週間のうちに起こる。
「慢性移植拒絶またはＣＲ」は一般にヒトでは、急性拒絶の免疫抑制が成功していたとしても、数か月〜数年のうちに起こる。線維症は、総ての種類の臓器移植の慢性拒絶において共通の因子である。慢性拒絶は一般に、特定の臓器に特徴的な一定の範囲の具体的障害によって表すことができる。例えば、肺移植では、このような障害として気道の線維増殖性破壊（閉塞性細気管支炎）を含み；心臓移植、または弁置換などの心臓組織の移植では、このような障害として線維性アテローム性動脈硬化症を含み；腎臓移植では、このような障害として閉塞性腎症、腎硬化症、尿細管間質性腎症を含み；肝臓移植では、このような障害として胆管消失症候群を含む。慢性拒絶はまた、虚血発作、移植組織の除神経、高脂血症および免疫抑制薬に関連する高血圧症も特徴とし得る。
移植分野で知られているように、移植器官、組織または細胞は同種異系または異種の場合があり、この場合、移植片は同種異系移植片または異種移植片であり得る。対象の方法により検出または特定された移植寛容原性表現型の特徴は、それが免疫抑制療法を行わない場合に生じる表現型であるということ、すなわち、それは免疫抑制療法を受けていない宿主に存在し、従って、免疫抑制剤はその宿主に投与されていないというものである。移植片はいずれの固形臓器および皮膚移植片であってもよい。本発明に記載の方法により分析可能な臓器移植の例としては、限定されるものではないが、腎臓移植、膵臓移植、肝臓移植、心臓移植、肺移植、腸移植、腎臓後膵臓移植、および膵臓−腎臓同時移植が含まれる。
本発明による方法はまた、虚血−再潅流傷害による移植後腎機能発現遅延（ＤＧＦ）の予防および／または治療にも好適である。本明細書において用語「移植後腎機能発現遅延」は、移植後乏尿症、同種異系移植免疫原性および急性拒絶エピソードリスクの増大、ならびに長期生存の低下をもたらす急性腎不全の一形態を意味する。ＤＧＦは、ドナーに関連する様々な因子、およびレシピエントに関連する腎前性、腎性、または腎後性移植因子によって引き起こされ得る。しかしながら、移植後腎機能発現遅延の主要な原因は、虚血、および低温保存後の虚血障害を受けた腎臓における血流の再開である。
本明細書において用語「移植片対宿主病」またはＧＶＨＤは、ドナー組織中に存在するＴ細胞が宿主、またはその移植細胞もしくは組織のレシピエントを攻撃する場合に起こる病態を意味する。急性ＧＶＨＤおよび慢性ＧＶＨＤを含め、いずれのタイプのＧＶＨＤも、本発明の治療薬により処置することができる。
用語「過敏性疾患」は、対象がアレルゲンとして知られる無害な因子に異常な感受性を有する場合の病態を意味する。過敏性疾患は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型の４つのタイプに分類することができる。Ｉ型は、ＩｇＥ感作好塩基球および肥満細胞からのメディエーターの放出によって起こるアトピーまたはアナフィラキシー型とされている。ＩＩ型は、細胞溶解性または抗体依存性細胞傷害性(antibody-dependent cellular cytotoxocity)を有する補体結合抗体を含む細胞傷害型とされている。ＩＩＩ型は、可溶性抗原抗体複合体に関連する免疫複合体媒介型とされている。ＩＶ型は、抗原との接触後の感作Ｔリンパ球によるリンホカインの放出によって起こる細胞媒介型または遅延型過敏症とされている。
免疫疾患の予防および／または治療は、寛容原性樹状細胞および／または制御性Ｔ細胞集団を増加させることによって達成される。
「寛容原性樹状細胞集団を増加させる」という表現は、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームの投与が、非処置対象に比べて寛容原性樹状細胞の数の増加をもたらすことを意味すると理解される。寛容原性樹状細胞集団は、非処置対象の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％増加される。β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームの、寛容原性樹状細胞集団を増加させる能力は、例えば実施例１〜５に記載のように決定することができる。
本明細書において「制御性Ｔ細胞集団を増加させる」という表現は、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームが、非処置対象に比べて制御性Ｔ細胞の数の増加をもたらすことを意味する。制御性Ｔ細胞集団は、非処置対象の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％増加される。β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームの、制御性Ｔ細胞集団を増加させる能力は、例えば実施例１７に記載のように決定することができる。
免疫学的に活性なＣ４ＢＰ α鎖変異体およびペプチド
本発明の筆者らは、Ｃ４ＢＰ α鎖の、単離されたＣＣＰ６ドメインが樹状細胞の成熟の阻害に必要な領域であること、ならびにＣ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインに由来する特定のポリペプチドが、樹状細胞の成熟の阻害および前記細胞による寛容原性表現型の獲得の促進における、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームの効果を再現できることを確認した。
よって、別の面において、本発明は、Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチド、その機能的に等価な変異体に関し、この場合、前記ポリペプチドは全長Ｃ４ＢＰ αではない。本明細書において用語「ＣＣＰドメイン」は、Ｃ４ＢＰ α鎖に見られる補体制御ドメインの１つを意味する。ＣＣＰは、１−３ ２−４配置でジスルフィド結合した４つのシステイン残基とほとんど不変のトリプトファン残基の周囲に形成された疎水性コアとを含んでなる６０アミノ酸残基長である。ＣＣＰ６は、ＮＣＢＩデータベースに受託番号Ｐ０４００３として示される配列中に定義されるヒトＣ４ＢＰ α鎖に対してアミノ酸３６３〜４２４の間に見られる領域に相当し（配列番号１）、これは下記配列に相当する。
Figure 2014523252
好ましくは、ＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドは、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の領域を含まない。別の実施態様では、Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドは、Ｃ４ＢＰ α鎖の少なくともＣＣＰ１ドメイン、少なくともＣＣＰ２ドメイン、少なくともＣＣＰ３ドメイン、少なくともＣＣＰ４ドメイン、少なくともＣＣＰ５ドメイン、少なくともＣＣＰ７ドメインおよび／または少なくともＣＣＰ８ドメインを欠く。さらにより好ましい実施態様では、Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドは、Ｃ４ＢＰ α鎖に見られる他のいずれのＣＣＰドメインも含まない。本発明に従って使用するためのＣ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなる好適なポリペプチドには、限定されるものではないが、
−Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ５、ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ドメインを含んでなるポリペプチド、
−Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ５、ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ドメインを含んでなるが、Ｃ４ＢＰ α鎖に見られる他のいずれか１以上のＣＣＰドメインを欠く、特に、ＣＣＰ８を欠く、ポリペプチド、
−Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ５、ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ドメインを含んでなり、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の領域を含まない、ポリペプチド
が含まれる。
用語「機能的に等価な変異体」とは、Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドに関して、１以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換によりそのポリペプチドから誘導され、かつ、元のポリペプチドの機能活性を実質的に保持する配列を有するいずれのポリペプチドも意味する。本発明の範囲内に包含される好適な変異体としては、ヒトＣＣＰ６ドメインと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％またはそれより低い同一性を示すＣＣＰ６ドメインの変異体を含んでなるポリペプチドが含まれる。２つのポリペプチドの同一性を決定する好適な方法は、上記に詳細に定義されている。好ましい実施態様では、変異体は、１以上のシステイン残基のセリンによる置換を含む。本明細書において「元のポリペプチドの機能活性を実質的に保持する」という表現は、例えば本発明の実施例１〜５に示されるように決定される、樹状細胞の成熟を阻害し得るポリペプチドを意味する。よって、ポリペプチドは、βを欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、特に、α７β０またはα６β０アイソフォームの活性の少なくとも１００％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％または少なくとも５０％を示す場合に、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームと機能的に等価であると見なされる。
例えば、Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドの機能的に等価な変異体は、受容体に対する親和性の調節、循環半減期の調節、治療半減期の調節、ポリペプチドの安定性の調節、プロテアーゼによる切断の調節、用量の調節、放出もしくはバイオアベイラビリティーの調節、精製の助長、または特定の投与経路の改善もしくは変更を目的に改変することができる。同様に、Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドの変異体は、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（限定されるものではないが、ＦＬＡＧまたはポリ−Ｈｉｓを含む）または他の親和性に基づく配列（限定されるものではないが、ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなどを含む）または検出（限定されるものではないが、ＧＦＰを含む）、精製もしくは前記ポリペプチドの他の性質を改善する連結分子（限定されるものではないが、ビオチンを含む）を含んでなってもよい。
別の実施態様では、Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドの機能的に等価な変異体は、ＣＣＰ６ドメインを含んでなる第１の領域と、Ｃ４ＢＰ α鎖の一部を形成しないポリペプチドを含んでなる第２の領域とを含んでなる融合タンパク質である。本発明の融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）ＣＣＰ６ドメインを含んでなる領域、および（ｂ）Ｃ４ＢＰ α鎖の一部を形成しないポリペプチドを含んでなる領域を含んでなり得る。あるいは、本発明の融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）Ｃ４ＢＰ α鎖の一部を形成しないポリペプチドを含んでなる領域、および（ｂ）ＣＣＰ６ドメインを含んでなる領域を含んでなり得る。好ましくは、融合タンパク質の一部を形成し、かつ、ＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドは、Ｃ４ＢＰ α鎖の少なくともＣＣＰ１ドメイン、少なくともＣＣＰ２ドメイン、少なくともＣＣＰ３ドメイン、少なくともＣＣＰ４ドメイン、少なくともＣＣＰ５ドメイン、少なくともＣＣＰ７ドメインおよび／または少なくともＣＣＰ８ドメインを欠く。さらにより好ましい実施態様では、Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドは、Ｃ４ＢＰ α鎖に見られる他のいずれのＣＣＰドメインも含まない。本発明による融合タンパク質において使用するためのＣ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなる好適なポリペプチドには、限定されるものではないが、
−Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ５、ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ドメインを含んでなるポリペプチド、
−Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ５、ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ドメインを含んでなるが、Ｃ４ＢＰ α鎖に見られる他のいずれか１以上のＣＣＰドメインを欠く、特に、ＣＣＰ８を欠く、ポリペプチド
が含まれる。
好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドは、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の領域を含まない。例えば、本発明のポリペプチドは、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の一部を形成する領域を含んでなる融合タンパク質とはなり得ない。
発明者らは、１以上のシステイン残基がセリンで置換されたＣ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインの断片は、元のポリペプチドの機能活性を実質的に保持していることを見出した。具体的には、本発明の筆者らは、配列番号２、３、４および５の４つのペプチドを合成した。
さらに別の面では、本発明は、配列番号２、３、４および５からなる群から選択される配列を有するペプチドまたはその機能的に等価な変異体に関する（表Ｉ参照）。
Figure 2014523252
好ましい実施形態では、ペプチドは配列番号５である。
本明細書において用語「ペプチド」は、ペプチド結合で互いに連結された２〜４０アミノ酸前後の直鎖に関する。
本発明のペプチドの機能的に等価な変異体には、限定されるものではないが、上述のペプチドの１以上の(one of more)アミノ酸の挿入、欠失または置換により改変されたペプチド、ならびにペプチドの活性を実質的に維持するそのペプチド模倣物が含まれる。所与のポリペプチドまたはペプチドが単離されたＣＣＰ６ポリペプチド（配列番号１）の、または配列番号２〜５のポリペプチドの、機能的に等価な変異体と見なせるかどうかを決定するのに十分な方法としては、例えば、本発明の実施例８で示されるアッセイが含まれ、この場合、ペプチドは、未熟樹状細胞への分化段階に単球細胞に加えた場合、および／または成熟樹状細胞への成熟段階に未熟樹状細胞に加えた場合に、寛容原性樹状細胞生成能を示せば、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームの変異体と見なされる。変異体の、寛容原性樹状細胞の生成を促進する能力は、変異体の存在下で成熟させた樹状細胞の成熟マーカー（例えば、ＣＤ８３、ＣＤ１４および／またはＣＤ１ａ）の、樹状細胞における発現レベルを測定することによって決定することができる（本発明の実施例１および２）。よって、ペプチドは、βを欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、特に、α７β０またはα６β０の活性の少なくとも１００％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％または少なくとも５０％を示せば、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームと機能的に等価と見なすことができる。
本発明における使用に好適な、単離されたＣＣＰ６ポリペプチド（配列番号１）の、または配列番号２〜５のポリペプチドの機能的に等価な変異体には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる。
・アシル化、アミド化、エステル化誘導体などを含む、上記ペプチドのいずれかの誘導体化から生じるペプチド。
・置換（例えば、保存的アミノ酸置換）および／または挿入（例えば、小さな単一のアミノ酸の挿入、または２、３、４、５、１０、１５、２０もしくはそれを超える連続するアミノ酸を包含する挿入）および／または欠失（例えば、小さな単一のアミノ酸の欠失、または２、３、４、５、１０、１５、２０もしくはそれを超える連続するアミノ酸を包含する欠失）による、上記ペプチドのいずれかの改変から生じるペプチド。よって、特定の実施態様では、天然ペプチド配列の変異体は、（ｉ）１以上の（例えば、２、３、４、５、６、またはそれを超える）保存的アミノ酸置換、（ｉｉ）１以上の（例えば、２、３、４、５、６、またはそれを超える）アミノ酸の欠失、または（ｉｉｉ）それらの組合せによって、天然に存在する配列とは異なるものである。欠失または挿入されるアミノ酸は、連続であっても不連続であってもよい。
このような変異を作出するに当たっては、アミノ酸のハイドロパシーインデックスが考慮されるが、これは、あるアミノ酸は類似のハイドロパシーインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸で置換することができ、その結果、類似の生物活性を有するポリペプチドが得られるということが知られているからである。例えば、アミノ酸残基の相対的ハイドロパシー特性は得られるポリペプチドの二次構造および三次構造に影響を及ぼし、そして、そのポリペプチドと他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、抗体、抗原などの相互作用を規定する。上記で概説したように、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前述の様々な特徴を考慮に入れた例示的置換は当業者に周知であり、下表２に示す。
Figure 2014523252
好ましい実施態様では、ペプチドは、１以上のセリン残基をシステインで置換することにより改変される。
−上記のいずれかの配列を有するが、様々な既知の化学基または分子のいずれかを含むように改変されているペプチド。このような改変には、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ポリエチレングリコールとの共有結合（例えば、ペグ化）、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール(phosphatidylnositol)の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、水酸化、アシル化、アミド化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ユビキチン化、脂肪酸による修飾、アルギニン化などのトランスファー−ＲＮＡにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸付加などが含まれる。アミノ酸の類似体（非天然アミノ酸を含む）および置換連結を有するペプチドも含まれる。
−上記ペプチドのペプチド模倣物。「ペプチド模倣物(peptide mimetic or peptidomimetic)」とは、得られる分子が所望のポリペプチド二次（または局部的に三次）構造要素を模倣するまたはそれと似ている限り、様々なタイプまたはクラスの分子を意味する。例えば、ペプチド模倣物は、アミド結合等価体の使用および／または天然ペプチド主鎖の修飾（鎖伸張またはヘテロ原子の組み込みを含む）によりペプチドの二次構造を模倣するオリゴマーであり、その例としては、アザペプチド、オリゴカルバミン酸、オリゴ尿素、β−ペプチド、γ−ペプチド、オリゴ（フェニレンエチニレン）、ビニローグ性スルホノペプチド、ポリ−Ｎ−置換グリシン（ペプトイド）などが挙げられる。ペプチド模倣物を設計および合成するための方法は、当業者に周知である。特定の実施態様では、プロテアーゼ感受性を克服するため、二次構造を安定化させるため、および／または天然型ＣＣＰ６ペプチド類似体よりもバイオアベイラビリティーを改善するためにペプチド模倣物を使用することが企図される。特定の実施態様では、本発明のペプチド模倣物は、リバースターン模倣物、例えば、α−ターン模倣物、単環式β−ターン模倣物、二環式β−ターン模倣物、γ−ターン模倣物または単環式γ−ターン模倣物である。
本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供する。よって、別の面において、本発明は、Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドまたはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドに関し、この場合、前記ポリペプチドは全長Ｃ４ＢＰ α鎖ではなく、かつ、前記ポリペプチドは、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の領域を含まない。
本発明はまた、配列番号２、３、４および５からなる群から選択される配列を有するペプチドまたはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、任意の長さの、ポリマー形態のヌクレオチドを意味して互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体を含み得る。ヌクレオチドはいずれの三次元構造を有してもよく、既知または未知のいずれかの機能を遂行し得る。用語「ポリヌクレオチド」には、例えば、一本鎖、二本鎖および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。天然核酸分子の他、本発明の核酸分子はまた、修飾核酸分子を含んでなってもよい。本明細書において、ｍＲＮＡは、細胞内で翻訳され得るＲＮＡを意味する。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドをコードする領域の転写を調節する単一のプロモーター領域をさらに含んでなってよい（ただし、前記プロモーターは本ポリペプチドが発現される細胞内で適合すること）。本発明のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、それ自体単離された形で、または好適な宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドの増幅を可能とするベクターの一部を形成して見出すことができる。前記ポリヌクレオチドの挿入に好適なベクターは、原核生物の発現ベクター、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、Ｃｏ１Ｅ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージおよび「シャトル」ベクター（例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８）；酵母の発現ベクター、例えば、２ミクロンプラスミド、組み込みプラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドなどのタイプのベクター；昆虫細胞の発現ベクター、例えば、ｐＡＣ系のベクターおよびｐＶＬのベクター；植物の発現ベクター、例えば、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ系など；ならびに任意の市販のバキュロウイルス系を用いて昆虫細胞をトランスフェクトするのに好適なバキュロウイルスを含む真核細胞の発現ベクターに由来するベクターである。真核細胞用のベクターとしては、好ましくは、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルスに随伴するウイルス、レトロウイルス、特に、レンチウイルス）ならびに非ウイルスベクター、例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＭＣＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦＩ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐトレーサー−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびＰＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１が含まれる。
これらのベクターはまた、ベクターと接触させた後にベクターが組み込まれた細胞の同定を可能とするリポーターまたはマーカー遺伝子も含んでなってよい。本発明に関して有用なリポーター遺伝子としては、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ＧＦＰなどが含まれる。本発明に関して有用なマーカー遺伝子としては、例えば、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を付与するネオマイシン耐性遺伝子；ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；オルニチンデカルボキシラーゼ（２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）の阻害剤に対する耐性を付与するＯＤＣ遺伝子；メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子；ピューロマイシンに対する耐性を付与するピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子；ゼオシンに対する耐性を付与するｂｌｅ遺伝子；９−β−Ｄ−キシロフラノースアデニンに対する耐性を付与するアデノシンデアミナーゼ遺伝子；Ｎ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸の存在下で細胞の成長を可能とするシトシンデアミナーゼ遺伝子；アミノプテリンの存在下で細胞の成長を可能とするチミジンキナーゼ；キサンチンの存在下およびグアニンの不在下で細胞の成長を可能とするキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子；トリプトファンの代わりにインドールの存在下で細胞の成長を可能とする大腸菌のｔｒｐＢ遺伝子；細胞にヒスチジンの代わりにヒスチジノールを使用させる大腸菌のｈｉｓＤ遺伝子が含まれる。選択遺伝子はプラスミドに組み込まれるが、このプラスミドは、真核細胞における前記遺伝子の発現に好適なプロモーター（例えば、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーター）、最適化された翻訳開始部位（例えば、いわゆるコザックルールに従った部位またはＩＲＥＳ）、ポリアデニル化（例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化またはホスホグリセリン酸キナーゼ部位）、イントロン（例えば、β−グロブリン遺伝子イントロン）が含まれる。あるいは、リポーター遺伝子およびマーカー遺伝子の両方の組合せを同じベクターで同時に使用することもできる。本発明では、本発明によるポリヌクレオチドが作動可能に連結できるプロモーターおよびクローニング部位の両方を含むベクターも提供される。このようなベクターはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することができる。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を最適化するためには、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変更して、余分な、潜在的に不適当な選択的翻訳開始コドン、または転写もしくは翻訳のいずれかのレベルで発現を妨げ得るもしくは低下させ得るその他の配列を除去する必要のある場合がある。あるいは、開始コドンのすぐ５’側にコンセンサスリボソーム結合部位を挿入して発現を増強することもできる。遺伝子送達ビヒクルとしてはまた、ＤＮＡ／リポソーム複合体および標的ウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体を含む、数種の非ウイルスベクターが含まれる。標的化抗体またはそのフラグメントもまた含んでなるリポソームが本発明の方法で使用可能である。細胞への送達を高めるために、本発明の核酸またはタンパク質は、細胞表面抗原と結合する抗体またはその結合フラグメントと結合させることができる。
β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームを用いて得られる寛容原性樹状細胞の集団を生成するための方法
本発明者らは、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、Ｃ４ＢＰ α鎖の単離されたＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチド、配列番号２〜５に定義されるペプチドまたはそれらの機能的に等価な変異体、前記ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、のいずれかと接触させた樹状細胞が寛容原性表現型、すなわちを示すことを見出した。
よって、別の面において、本発明は、
（ｉ）樹状前駆細胞集団を未熟樹状細胞集団の形成に十分な条件下でインキュベートする工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた未熟樹状細胞集団を成熟樹状細胞の形成に十分な条件下でインキュベートする工程
を含んでなり、工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、
（ｂ）本発明のポリペプチド、
（ｃ）本発明のペプチド、
（ｄ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｅ）本発明のベクター
からなる群から選択される材料の組成物の存在下で行われる、寛容原性樹状細胞集団の生成方法に関する。
本明細書において用語「樹状細胞」は、リンパまたは非リンパ系組織に見られる形態的に類似した細胞種の多様な集団のいずれのメンバーも意味する。樹状細胞は「専門的」抗原提示細胞の一種であり、ＭＨＣ拘束Ｔ細胞を感作する高い能力を有する。樹状細胞は、機能により、または表現型により、特に細胞表面表現型により認識され得る。これらの細胞は、それらの特有の形態、中〜高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩ発現、およびＴ細胞、特にナイーブＴ細胞に対する抗原提示能を特徴とする（Steinman et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271;そのような細胞の記載に関しては、引用することにより本明細書の一部とされる）。本発明の方法によって影響を受けた樹状細胞は、未熟樹状細胞または成熟樹状細胞となるように選択され得る。
樹状細胞には、身体の様々な組織および器官に分布した、樹状形態を有する骨髄由来細胞の群、サイトカインを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ分化から生じる、身体の様々な器官および組織に分布した、樹状形態を有する細胞の群、または骨髄由来もしくは血液由来幹細胞および等価な細胞からの同様の群が含まれる。具体的には、樹状細胞には、例えば、リンパ系樹状細胞（Ｔｈ２または免疫寛容を誘導する細胞を含む）、骨髄樹状細胞（未熟および成熟樹状細胞を含む、一般に使用される樹状細胞）、ランゲルハンス細胞（皮膚の抗原提示細胞として重要な樹状細胞）、指状嵌入細胞（リンパ節および脾臓Ｔ細胞領域に分布し、Ｔ細胞に対する抗原提示に機能を持つと考えられる）、および濾胞性樹状細胞（Ｂ細胞に対する抗原提示細胞として重要）が含まれる。樹状細胞の細胞表面は、特徴的なベール様突起を有する特異なものであり、細胞表面マーカーＣＤ１ａ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８６＋、またはＨＬＡ−ＤＲ＋の発現を特徴とする。成熟樹状細胞は一般にＣＤ１１ｃ＋であるが、樹状細胞の前駆体には、表現型ＣＤ１１ｃ−，ＩＬ−３Ｒαｌｏｗを有するもの、およびＣＤ１１ｃ−ＩＬ−３Ｒαｈｉｇｈであるものが含まれる。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＧＭ−ＣＳＦによる処理は、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ ＤＣを優先的に拡大するが、Ｆｌｔ−３リガンドは、ＣＤ１１ｃ＋ ＩＬ−３Ｒαｌｏｗ ＤＣ、およびＣＤ１１ｃ− ＩＬ−３Ｒαｈｉｇｈ ＤＣ前駆体を拡大することが示されている。
「寛容原性樹状細胞」とは、分化刺激に曝された未熟樹状細胞から誘導される樹状細胞を意味し、この分化刺激はサイトカイン、ホルモン、ビタミン、およびそれにより樹状細胞が免疫寛容誘導能を獲得する他の生物学的因子の組合せであり得る。寛容原性樹状細胞は、低いエフェクターＴ細胞活性化能と、制御性Ｔ細胞の高い誘導および活性化能を有する。寛容原性樹状細胞は、「炎症誘発シグナルの存在下でも保持される安定な表現型を有する未熟ＤＣ」として働く成熟抵抗性細胞と見ることができる。
第１の工程において、寛容原性樹状細胞集団を得る方法は、樹状細胞前駆体集団を未熟樹状細胞集団の形成に十分な条件下でインキュベートすることを含んでなる。
本明細書において用語「樹状細胞前駆体」は、適当なサイトカイン（具体的には、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＳＣＦ（ｃ−ｋｉｔリガンド）、Ｆｌｔ−３リガンド、またはそれらの組合せ）の存在下で未熟樹状細胞に分化することができるいずれの細胞も意味し、好ましくは、４週間以内、より好ましくは２０日以内、さらにより好ましくは１８日以内、いっそうより好ましくは１６日以内に未熟樹状細胞に分化することができる細胞である。樹状前駆細胞の例としては、限定されるものではないが、骨髄樹状前駆細胞、リンパ系樹状前駆細胞および形質細胞様樹状前駆細胞が含まれる。樹状前駆細胞の様々なサブセットにより発現される表現型的表面マーカーは当技術分野で周知であり、例えば、フローサイトメトリーにより、または免疫組織化学的技術を用いて、同定目的に使用可能である。
好ましい実施態様では、樹状前駆細胞集団は、単球樹状前駆細胞集団である。本明細書において「単球樹状細胞前駆体」は、それらの表面にＧＭ−ＣＳＦ受容体を有する単球と、ＧＭ−ＣＳＦに応答性のあるその他の骨髄前駆細胞とを含んでなる。これらの細胞は、それらが属する任意の組織、特に、脾臓、骨髄、リンパ節および胸腺などのリンパ系組織から得ることができる。単球樹状細胞前駆体はまた、循環系から単離することもできる。末梢血は、容易に入手可能な単球樹状細胞前駆体の供給源である。臍帯血が単球樹状細胞前駆体のもう１つの供給源である。
単球樹状細胞前駆体は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得てもよく、このＰＢＭＣは、緩衝生理食塩水で１：１希釈した全血または白血球濃縮物（「バフィーコート」画分、ＭＳＫＣＣ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ）から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（内毒素フリー、＃１７−１４４０−０３、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）での標準的遠心分離により得ることができる。ＭｏＤＣ前駆体は、組織培養プラスチック接着型（＃３５−３００３；Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ、フランクリンレイクス、ＮＪ） ＰＢＭＣであり、完全ＲＰＭＩ １６４０および１％正常ヒト血清（ＮＨＳ）中、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００ＩＵ／ｍｌ）の存在下（記載の通り２日ごとに補給）で培養することができる(Thurner B et al., 1999, J.Immunol.Meth.; 223:1-15 and Ratzinger G. et al., 2004, J. Immunol. 173:2780-2791)。一般に、単球樹状細胞前駆体は、ＣＤ１３およびＣＤ３３などのマーカーの発現により同定することができる。骨髄樹状前駆体は、ＣＤ１４またはＣＤ１ａ経路を介して樹状細胞に分化することができる。従って、本発明の樹状前駆細胞は、ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ−樹状前駆細胞またはＣＤ１４−ＣＤ１ａ＋樹状前駆細胞であり得る。本発明の特定の実施態様では、骨髄樹状前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３３＋ＣＤ７−ＣＤ１０−表現型を特徴とし得る。好ましい実施形態では、骨髄樹状前駆細胞はＣＤ１４＋単球である。ＣＤ１４＋単球もＧＭ−ＣＳＦ受容体を発現し得る。
本発明の方法のための出発材料として使用する樹状前駆細胞は、処置する対象に対して自己であり得る。他の実施形態では、本発明の方法のための出発材料として使用する樹状細胞は、異種の樹状細胞である。例えば、移植片対宿主病を処置する場合、出発材料として使用する樹状細胞は、ドナーから得た樹状細胞である。対象は、例えば、マウス、ラット、イヌ、ニワトリ、ウマ、ヤギ、ロバ、または霊長類であり得る。最も好ましくは、対象はヒトである。
本明細書において「未熟樹状細胞集団の形成に十分な条件」という表現は、樹状前駆細胞の未熟前駆細胞への分化をもたらす条件を意味する。好適な条件としては、例えば、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍｌ）、およびＴＮＦ−ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で約３日間培養した後に、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−４（２５０Ｕ／ｍｌ）、およびＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、より好ましくは、ＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、またはＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養することを含む。
この処理は、未熟樹状細胞の生成をもたらす。「未熟樹状細胞」とは、成熟状態に比べて有意に低いＴ細胞活性化能を有する樹状細胞を意味する。具体的には、未熟樹状細胞は、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を加えて２日間培養することにより成熟が誘導された樹状細胞の１／２未満、好ましくは１／４未満の抗原提示能を持ち得る。抗原提示能は、例えば、同種異系Ｔ細胞活性化能（混合リンパ球試験（同種異系Ｔ細胞と樹状細胞をＴ細胞：樹状細胞比１：１０、または好ましくは比率を変えて共培養し、培養終了の８時間前に３Ｈ−チミジンを加え、Ｔ細胞の増殖能をＴ細胞のＤＮＡへの３Ｈ−チミジンへの組み込み量に基づいて評価する）（Gene Therapy 7; 249-254 (2000)参照）を用いて定量することができる。あるいは、抗原提示能は、ペプチドを用いて特定の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導する能力を試験することによって評価することもでき、この場合、ある特定の抗原の既知のクラスＩ拘束ペプチドを樹状細胞に加え、これらの樹状細胞を、樹状細胞を採取したドナーと同じ健常ドナーの末梢血から得たＴ細胞と共培養する（３日目以降に、２５Ｕ／ｍｌまたは好ましくは１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を加える）。Ｔ細胞は好ましくは、２１日の間に３回樹状細胞で刺激し、より好ましくは、１４日の間に２回樹状細胞で刺激する。生じたエフェクター細胞を、５１Ｃｒ標識標的細胞（ペプチド拘束クラスＩ陽性腫瘍細胞）とともに１００：１〜２．５：１（１００：１、５０：１、２５：１、２０：１、１２．５：１、１０：１、５：１，または２．５：１）の比率で、好ましくは１０：１の比率で４時間、共培養し、標的細胞から放出された５１Ｃｒを定量する（Arch Dermatol Res 292:325-332 (2000)参照)。さらに、未熟樹状細胞は好ましくは、抗原に対して食作用能を有し、より好ましくは、Ｔ細胞の活性化のための共刺激を誘導する受容体の発現が低い（例えば、上記のようにＬＰＳにより誘導された成熟ＤＣに比べて有意に低い）かまたは陰性である。
好ましい実施態様では、本方法の第１の工程は、
（ｉ）β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、
（ｉｉ）本発明によるポリペプチド、
（ｉｉｉ）本発明によるペプチド、
（ｉｖ）本発明によるポリヌクレオチド、および
（ｖ）本発明によるベクター
からなる群から選択される材料の組成物の存在下で行う。
用語「β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム」、「本発明のポリペプチド」、「本発明によるペプチド」、「本発明によるポリヌクレオチド」および「本発明によるベクター」は、上記に詳細に記載されいる。
β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームの存在下または前記分子をコードするポリヌクレオチドの存在下で行われる工程は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行うことができる。一般に、これらの方法では、未熟樹状細胞を、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームに、下端０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、５０、または１００マイクログラム／ｍｌの培地；および上端０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、５０、１００、または２００マイクログラム／ｍｌの培地の範囲内で曝すことができる。最も好ましくは、ＤＣは、１〜１０μｇ／ｍｌのＣ４ＢＰ α７β０またはα６β０アイソフォームの存在下で、最も好ましくは、２、５および１０μｇ／ｍｌで成熟させる。
第２の工程では、第１の工程に従って単離した未熟樹状細胞を、次に、前記未熟樹状細胞の寛容原性成熟樹状細胞への成熟に十分な条件下でインキュベートする。この方法により、寛容原性樹状細胞が富化された組成物が得られる。
成熟ヒト樹状細胞は、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩの発現に関して陽性の細胞である。未熟樹状細胞は、例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６からなる群から選択されるマーカーに基づいて成熟樹状細胞から識別することができる。未熟樹状細胞は、これらのマーカーに関して弱い陽性、好ましくは、陰性であるが、成熟樹状細胞は陽性である。
成熟ＤＣは抗原を取り込む能力を失い、これらの細胞は共刺激細胞表面分子の発現のアップレギュレーションを示し、様々なサイトカインを分泌する。具体的には、成熟ＤＣは、より高レベルのＭＨＣクラスＩおよびＩＩ抗原を発現し、一般にＣＤ８０＋、ＣＤ８３＋、およびＣＤ８６＋として同定されている。ＭＨＣ発現が大きいほどＤＣ表面の抗原密度が高まるとともに、共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６のアップレギュレーションが、Ｔ細胞上のＣＤ２８など、共刺激分子の相手を介したＴ細胞活性化シグナルを強化する。
本明細書において「前記未熟樹状細胞の寛容原性成熟樹状細胞への成熟に十分な条件」という表現は、未熟樹状細胞の寛容原性成熟樹状細胞への成熟を可能とする方法を意味する。成熟樹状細胞は、未熟樹状細胞を有効な量または濃度の樹状細胞成熟因子と接触させることにより作製する（すなわち、成熟させる）ことができる。樹状細胞成熟因子としては、例えば、ＢＣＧ、ＩＦＮγ、ＬＰＳ、ＴＮＦαなどを含み得る。ＢＣＧの有効量は一般に、組織培養培地１ミリリットル当たり約１０５〜１０７ｃｆｕの範囲である。ＩＦＮγの有効量は一般に、組織培養培地１ミリリットル当たり約１００〜１０００Ｕの範囲である。カルメット・ゲラン菌(Bacillus Calmette-Guerin)（ＢＣＧ）は、ウシ結核菌(M. bovis)の病原性株である。本明細書において、ＢＣＧは、ＢＣＧ全体ならびに細胞壁成分、ＢＣＧ由来のリポアラビドマンノース、および２型免疫応答の誘導に関連するその他のＢＣＧ成分を意味する。ＢＣＧは場合により、熱失活ＢＣＧ、ホルマリン処理ＢＣＧなど、失活させてもよい。
未熟ＤＣは一般に、約１時間〜約４８時間、有効量のＢＣＧおよびＩＦＮγと接触させる。未熟樹状細胞は、好適な成熟培養条件で培養および成熟させることができる。好適な組織培養培地としては、ＡＩＭ−Ｖａｎｄ ＃１７４；、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（商標）などが含まれる。組織培養培地は、細胞の成熟を促進するためにアミノ酸、ビタミン、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカイン、二価陽イオンなどを添加することができる。一般に、約５００単位／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを使用する。
好ましい実施形態では、第２の工程は、
（ｉ）β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、
（ｉｉ）本発明によるポリペプチド、
（ｉｉｉ）本発明によるペプチド、
（ｉｖ）本発明によるポリヌクレオチド、および
（ｖ）本発明によるベクター
からなる群から選択される材料の組成物の存在下で行う。
樹状細胞の成熟は、樹状細胞に関して当技術分野で公知の方法によってモニタリングすることができる。細胞表面マーカーは、フローサイトメトリー、免疫組織化学などの当技術分野でよく知られているアッセイで検出することができる。これらの細胞はまた、サイトカイン産生に関してモニタリングすることもできる（例えば、ＥＬＩＳＡ、別の免疫アッセイによるか、またはオリゴヌクレオチドアレイの使用による）。本発明の成熟ＤＣはまた、抗原取り込み能を失っており、これは当業者によく知られている取り込みアッセイにより分析することができる。
用語「成熟樹状細胞」は、Ｔ細胞などに対して、未熟状態に比べて有意に強い抗原提示能を有する樹状細胞を意味する。具体的には、成熟樹状細胞は、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を加えて２日間培養することにより成熟が誘導された樹状細胞の抗原提示能の半分またはそれより強い、好ましくは同等またはそれより強い抗原提示能を持ち得る。さらに、成熟樹状細胞は好ましくは、抗原に対する食作用能が弱いかまたは全くなく、より好ましくは、 Ｔ細胞の活性化に対して共刺激を誘導する受容体の発現が陽性である。樹状細胞の活性化とは、未熟樹状細胞から成熟樹状細胞への移行を意味し、活性化された樹状細胞は成熟樹状細胞と移行過程の樹状細胞を包含し、この場合、共刺激シグナルを誘導するＣＤ８０およびＣＤ８６の発現が活性化刺激により高められる。
寛容原性細胞集団は、細胞組成の約５０％またはそれ以上、好ましくは細胞組成の約７５％またはそれ以上を占めてよく、９０％以上であってもよい。所望の細胞は、それらの表面表現型、免疫寛容誘導能などによって同定することができる。富化した細胞集団はすぐに使用してもよいし、または液体窒素温度で凍結させて長期間保存し、解凍して再使用することもできる。これらの細胞は通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％ＦＣＳ、４０％ＲＰＭＩ １６４０培地中で保存される。寛容原性樹状細胞が富化された細胞集団は、下記のように様々なスクリーニングアッセイおよび培養で使用することができる。
ＤＣは、場合により、ＤＣマーカーに対する抗体を用いた蛍光標識細胞の選別によりさらに精製してもよい。ＤＣはまた、ＤＣに対する抗体を用いて単離してもよく、この場合、抗体は磁性ビーズに結合される。特定の実施態様では、ＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂを同時発現するＤＣがＦＡＣＳを用いて単離される。
分離された細胞は、通常回収試験管の底に血清のクッションを備えた、細胞の生存を維持する任意の適当な培地中に回収することができる。様々な培地が市販されており、細胞の性質に応じて使用することができる。培養培地は液体であっても、例えば寒天、メチルセルロースなどを含有する半固体であってもよい。細胞集団は好都合には、通常、ウシ胎児血清（約５〜１０％）、Ｌ−グルタミン、チオール、特に、２−メルカプトエタノール、および抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した、イスコブの改変ｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、イスコブ培地、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０などの適当な栄養培地に懸濁させることができる。
場合により、形態観察および免疫化学的染色などの標準的技術を用いて樹状細胞の存在を確認することができる。例えば、樹状細胞の純度は、１以上の特徴的な細胞表面マーカーに対するフルオロクロム標識抗体を用いたフローサイトメトリーにより評価することができる。
特定の実施態様では、本発明は、抗原特異的寛容原性樹状細胞を作出するための方法を提供する。抗原特異的寛容原性樹状細胞を生成するためには、樹状細胞に対して本発明の方法を施して樹状細胞の成熟を阻害し、その後または同時に、それらの樹状細胞を、免疫寛容が求められる１以上の抗原と接触させる。自己免疫疾患を処置するために抗原特異的寛容原性樹状細胞を使用する場合には、この１または複数の抗原は、自己免疫疾患の基礎にある免疫反応を引き起こす抗原である。特定の、より具体的な実施態様では、寛容原性樹状細胞（すなわち、成熟が本発明の方法により阻害された樹状細胞）を、複数の異なる抗原と接触させて抗原特異的寛容原性樹状細胞集団を作出する。他の実施形態において、例えば、移植片対宿主病を処置するために寛容原性樹状細胞を使用する場合には、寛容原性樹状細胞（すなわち、成熟が本発明の方法により阻害された樹状細胞）を移植片由来の組織（この場合、組織は抗体と複合体を形成しているかまたは抗体と結合している）と接触させて移植片の抗原に特異的な寛容原性樹状細胞の集団を作出する。
特定の実施態様では、抗原特異的寛容原性樹状細胞は、（ａ）未熟樹状細胞を、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、本発明によるポリペプチド、本発明によるペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、または本発明によるベクターと接触させること、および（ｂ）前記細胞を抗原に曝すこと（この抗原は、免疫寛容が望まれる抗原、例えば、自己抗原である）によって生成することができる。特定の実施態様では、工程（ａ）および（ｂ）は順次実施され、従って、まず工程（ａ）が実施された後に工程（ｂ）が実施される。抗原をコードするＲＮＡを細胞に導入することにより、本発明の抗原特異的寛容原性樹状細胞に、提示のための抗原を負荷することもできる（例えば米国特許第６，３８７，７０１号；同第６，６７０，１８６号；米国特許出願第１０／３６２，７１５号参照）。本発明の方法はまた、付加的利点を得るための当技術分野で公知の他の方法（例えば、米国特許第５，８３１，０６８号；米国出願第１１／２４６，３８７号参照）と組み合わせてもよい。
いくつかの実施態様では、寛容原性樹状細胞は、制御性Ｔ細胞を作出するために使用される（例えば、米国特許出願第１０／６６１，８０４号参照）。簡単に述べると、制御性Ｔ細胞はＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を含んでなる集団から作出することができる。これらのＴ細胞集団は対象から単離してもよいし、または培養してもよい。また、例えば、特定の細胞（例えば、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞またはＣＤ４＋ ＣＤ２５−Ｔ細胞）の富化集団を含んでなるように細胞表面マーカーによって選別された集団など、Ｔ細胞の亜集団を使用してもよい。次に、Ｔ細胞を本発明の寛容原性樹状細胞とともに培養またはインキュベートする。制御性Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで作出されれば、前記寛容原性樹状細胞は前記Ｔ細胞と同種異系または同系であり得る。いくつかの実施態様では、寛容原性ＤＣに抗原を負荷する（例えば、抗原でパルスするか、または抗原をコードするＲＮＡでトランスフェクトする）。このような実施態様では、寛容原性ＤＣはＴ細胞に抗原を提示し得る。制御性Ｔ細胞の作出の際には、Ｔ細胞を寛容原性ＤＣに１回または２回以上曝し、かつ／または共に培養することができる。例えば、Ｔ細胞をＤＣとともに数日または数週間培養してもよく、この混合培養中のＤＣは、必要であれば補充してもよい。いくつかの実施態様では、培養は、治療量の制御性Ｔ細胞が得られるまで続ける。得られる結果を改善するために他の培養技術および／または添加物を使用してもよく、例えば、培養培地はＩＬ−２などのサイトカインを含んでもよい。
一般に、制御性Ｔ細胞はＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−βを分泌し（例えば、Walsh et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1398-1403参照）、これらのサイトカインの分泌を確認するためのアッセイは当技術分野で公知である。いくつかの実施態様では、制御性Ｔ細胞は、混合リンパ球反応を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、９０％、９５％、または１００％阻害する。混合リンパ球反応アッセイは当技術分野で周知である。本発明の制御性Ｔ細胞は、抗原特異的であり得る。ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は一般に、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘｐ３を含む特徴的な細胞表面マーカーを発現し、細胞表面マーカーのアッセイは当技術分野で周知である。
β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームを用いて得られた本発明の寛容原性樹状細胞およびその治療的使用
別の態様において、本発明は、樹状細胞を、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、Ｃ４ＢＰ α鎖を含んでなるポリペプチド、本発明に定義されるペプチド、前記ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリペプチドを含んでなるベクターの存在下で分化させる、および／または成熟させることにより得られる本発明の寛容原性樹状細胞に関する。
本発明による寛容原性樹状細胞は、以下の特徴のうちの１以上を示すことを特徴とする。
−前記細胞がＨＬＡ−ＤＲ＋であること。用語「陽性」は、所与のマーカーに適用される場合、本発明の方法により作出された寛容原性ＤＣ上での特定の細胞表面マーカーの発現のレベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）の場合と実質的に同じであることを示す。
−前記細胞がＣＤ８０−、ＣＤ８３−、ＣＤ８６−、ＣＤ１ａ−、ＣＣＲ７−、ＩＤＯ−および／またはＢＩＣ−１−であること。用語「陰性」は、所与のマーカーに適用される場合、本発明の方法により作出された寛容原性ＤＣ上での特定の細胞表面マーカーの発現レベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）上での同じ細胞表面マーカーの発現レベルに比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％低下しているか、または検出不能であることを示す。
−前記細胞がＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−８および／またはＩＬ−６などの炎症性サイトカインを分泌しないか、または成熟樹状細胞に比べて低い量で分泌すること。用語「低い量で分泌する」とは、所与のサイトカインに適用される場合、本発明の方法により作出された寛容原性ＤＣ上での特定のサイトカインの分泌レベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）上での同じ細胞表面マーカーの分泌レベルに比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％低下しているか、または検出不能であることを示す。
−前記細胞が成熟樹状細胞に比べて、高い量のＩＬ−１０を分泌すること。用語「高い量を分泌する」とは、所与のサイトカインに適用される場合、本発明の方法により作出された寛容原性ＤＣ上での特定のサイトカインの分泌レベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）上での同じ細胞表面マーカーの分泌レベルに比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％増加していることを示す。
−前記細胞が丸い形態を示すこと。本明細書において用語「丸い形態」とは、細胞の、細胞表面から突出している突起の数が、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）上の突起の数に比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％低下しているか、または検出不能である形態を意味する。細胞の形態は、本発明の実施例４に記載のように、すなわち走査型電子顕微鏡により測定可能である。
−前記細胞が分化／成熟過程の後も生存を維持すること。本明細書において用語「生存」とは、成熟刺激による処理後にアポトーシスを受けるものが、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、２％未満または１％未満である集団を意味する。アポトーシスは、アネキシンＶ／７−ＡＤＤ染色、カスパーゼ−３活性化アッセイ、ＴＵＮＥＬおよびＤＮＡ断片化アッセイ、ミトコンドリア膜電位の測定などの当技術分野で一般に公知のいずれの方法によって測定してもよい。
−前記細胞は成熟樹状細胞に比べて、ＣＣＬ２１に対する走化性挙動が低下したこと。本明細書において「走化性挙動が低下した」とは、本発明の方法により作出された細胞の、寛容原性ＤＣ上のＣＣＬ２１に対する走化性のレベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）上の同じサイトカインに対する走化性のレベルに比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％低下しているか、または検出不能であることを示す。ＣＣＬ２１に対する寛容原性樹状細胞の走化性挙動は、例えば本発明の実施例５に記載のように決定することができるか、かつ／または、
−前記細胞は成熟樹状細胞に比べて、同種異系Ｔ細胞増殖を阻害する能力が低下したこと。本明細書において用語「同種異系Ｔ細胞増殖を阻害する能力が低下した」とは、本発明の方法により作出された細胞と接触させた同種異系Ｔ細胞の増殖レベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）と接触させた同種異系Ｔ細胞で見られる増殖レベルに比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％低下しているか、または検出不能であることを示す。寛容原性樹状細胞の同種異系Ｔ細胞増殖を阻害する能力は、例えば本発明の実施例６に記載のように実施することができる。
−前記細胞が未熟ＤＣとは対照的に、炎症誘発シグナルの存在下で保持される安定な免疫調節表現型を示すこと。寛容原性樹状細胞の、安定な免疫調節表現型を示す能力は、例えば、本発明の実施例１６に記載のように決定することができる。
−前記細胞が成熟樹状細胞に比べて、炎症誘発条件下でＴｈ１分化を阻害する能力を示すこと。本明細書において用語「Ｔｈ１分化(differentitation)を阻害する」とは、本発明の方法により作出された細胞と接触させたＴ細胞により作出されるＴｈ１細胞のレベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）と接触させたＴ細胞で見られるＴｈ１分化のレベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％低下している、または検出不能であることを示す。寛容原性樹状細胞の、Ｔｈ１分化を阻害する能力は、例えば、本発明の実施例１７に記載のように、ＩＦＮ−γ産生を測定することにより決定することができる。
前記細胞は成熟樹状細胞に比べて、高い制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）生成能を示すこと。本明細書において用語「高い制御性Ｔ細胞生成能」とは、本発明の方法により作出された細胞と接触させたＴ細胞の制御性Ｔ細胞の生成レベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）と接触させたＴ細胞の生成レベルに比べて、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％増加していることを示す。寛容原性樹状細胞の、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）生成能は、例えば本発明の実施例１７に記載のように決定することができる。好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８３−、ＣＤ８６−、ＣＤ１ａ−、ＣＣＲ７−、ＩＤＯ−および／またはＢＩＣ−１−である。好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ４０＋である。別の好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ４０−である。
好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞は、上の特徴のうち１以上を示すことを特徴とする。
・ＣＤ１ａ−
・ＣＤ８６−
・ＩＤＯ−
・アポトーシス耐性
好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ１ａ−である。別の好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ１ａ−およびＣＤ８６−である。別の好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ１ａ−、ＣＤ８６−およびＩＤＯ−である。別の好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ１ａ−、ＣＤ８６−、ＩＤＯ−およびアポトーシス耐性である。好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ１ａ−およびＩＤＯ−である。別の好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ１ａ−およびアポトーシス耐性である。好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ８６−およびＩＤＯ−である。別の好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ８６−およびアポトーシス耐性である。別の好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＩＤＯ−およびアポトーシス耐性である。
別の実施態様では、本発明による寛容原性樹状細胞は、本発明者らの寛容原性Ｃ４ＢＰ（ｂ−）処理ＤＣまたはＨ因子処理ＤＣにより、ヒト記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｇ特異的免疫寛容（または低反応性）を誘導することができる。表３に、本発明による寛容原性細胞の特徴の概要を、未熟樹状細胞、成熟樹状細胞、および未熟樹状細胞をビタミンＤ３で処理することにより得られる寛容原性樹状細胞と比較して示す。
Figure 2014523252
 別の面において、本発明は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の本発明の寛容原性樹状細胞を含んでなる細胞集団に関し、好ましくは、この細胞集団は少なくとも８０％の本発明の寛容原性樹状細胞を含んでなる。さらに別の面では、本発明は、免疫疾患の予防および／または治療において使用するための、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、本発明に定義されるＣ４ＢＰ α鎖を含んでなるポリペプチド、本発明に定義されるペプチド、前記ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドを含んでなるベクターを用いて得られる寛容原性樹状細胞集団に関する。
別の面において、本発明は、免疫疾患の予防および／または治療用薬剤の製造のための、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、本発明に定義されるＣ４ＢＰ α鎖を含んでなるポリペプチド、本発明に定義されるペプチド、前記ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドを含んでなるベクターを用いて得られる寛容原性細胞の使用に関する。
別の面において、本発明は、必要とする対象における免疫疾患の予防および／または治療のための方法であって、前記対象に、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、本発明に定義されるＣ４ＢＰ α鎖を含んでなるポリペプチド、本発明に定義されるペプチド、前記ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドを含んでなるベクターを用いて得られる寛容原性細胞を投与することを含んでなる方法に関する。
別の面において、本発明は、必要とする対象において制御性Ｔ細胞集団を増加させるための方法であって、前記対象に、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、本発明に定義されるＣ４ＢＰ α鎖を含んでなるポリペプチド、本発明に定義されるペプチド、前記ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドを含んでなるベクターを用いて得られる寛容原性樹状細胞集団を投与することを含んでなる方法に関する。
別の面において、本発明は、制御性Ｔ細胞集団の増加において使用するための、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、本発明に定義されるＣ４ＢＰ α鎖を含んでなるポリペプチド、本発明に定義されるペプチド、前記ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドを含んでなるベクターを用いて得られる寛容原性樹状細胞集団に関する。
免疫疾患の予防および／または治療は、制御性Ｔ細胞集団を増加させることによって達成される。
本明細書において「制御性Ｔ細胞集団を増加させる」という表現は、本発明の寛容原性樹状細胞集団が、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）で処置した対象に比べて制御性Ｔ細胞の数の増加をもたらすことを意味する。制御性Ｔ細胞集団は、対照細胞で処置した対象に比べて、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％増加される。本発明の寛容原性樹状細胞集団の、制御性Ｔ細胞集団を増加させる能力は、例えば、実施例１７に記載のように決定することができる。
本発明の治療方法
別の実施態様では、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびベクターを用いて免疫疾患を治療および／または予防するための方法が提供される。本発明による組成物で処置される免疫疾患には、限定されるものではないが、免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主病および過敏性疾患が含まれる。このような処置を必要とする対象はヒトであってもよいし、または免疫疾患の症状を発症した、もしくは免疫疾患を発症するリスクのある非ヒト霊長類またはその他の動物であってもよい（すなわち、獣医学的使用）。非ヒト霊長類およびその他の動物の例としては、限定されるものではないが、農用動物、ペット、および動物園動物（例えば、ウマ、ウシ、バッファロー、ラマ、ヤギ、ウサギ、ネコ、イヌ、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、サル、ゾウ、クマ、大型のネコ科など）が含まれる。
「免疫炎症性疾患」、「敗血症」、「自己免疫疾患」および「移植拒絶」という表現は、上記に詳細に記載されており、本発明の治療方法に関しても同じ意味で使用される。
本明細書において、患者（または対象）は、免疫疾患または障害に罹患したもしくは罹患している可能性があるか、または検出可能な疾患がないと見られる、ヒトを含むいずれの哺乳動物であってもよい。従って、この処置は既存の疾患を有する対象に行ってもよいし、または疾患もしくは病態を発症するリスクのある対象に予防的に行ってもよい。
免疫疾患または障害を処置するための組成物の用量は、医学分野の当業者により理解されているパラメーターに従って決定され得る。従って、適当な用量は、患者（例えば、ヒト）の状態、すなわち、疾患の病期、健康状態、ならびに年齢、性別、および体重、および医学分野の当業者によく知られている他の因子に依存し得る。
一態様において、本発明は、必要とする対象において寛容原性樹状細胞および／または制御性Ｔ細胞集団を増加させるための方法であって、前記対象に本発明によるポリペプチド、本発明によるペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、または本発明によるベクターを投与することを含んでなる方法に関する。
さらに別の態様では、本発明は、寛容原性樹状細胞集団および／または制御性Ｔ細胞集団の増加において使用するための、本発明によるポリペプチド、本発明によるペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、または本発明によるベクターに関する。
免疫疾患の予防および／または治療は、寛容原性樹状細胞集団および／または制御性Ｔ細胞集団の増加させることによって達成される。
「寛容原性樹状細胞集団を増加させる」という表現は、本発明によるポリペプチド、本発明によるペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、または本発明によるベクターの投与が、非処置対象に比べて寛容原性樹状細胞の数の増加をもたらすことを意味すると理解される。寛容原性樹状細胞集団は、非処置対象に比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％増加される。本発明によるポリペプチド、本発明によるペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、または本発明によるベクターの、寛容原性樹状細胞集団を増加させる能力は、例えば実施例１〜５に記載のよう決定することができる。
本明細書において「制御性Ｔ細胞集団を増加させる」という表現は、本発明によるポリペプチド、本発明によるペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、または本発明によるベクターが、非処置対象に比べて制御性Ｔ細胞の数の増加をもたらすことを意味する。制御性Ｔ細胞集団は、非処置対象の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％増加される。本発明によるポリペプチド、本発明によるペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、または本発明によるベクターの、制御性Ｔ細胞集団を増加させる能力は、例えば実施例１７に記載のように決定することができる。
本発明の医薬組成物
本発明はまた、本発明によるポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による細胞、または本発明による寛容原性樹状細胞を含んでなる医薬組成物も提供する。
組成物は、無菌水性または非水性の溶液、懸濁液またはエマルションであり、生理学的に許容可能または好適な担体を付加的に含んでなる、医薬組成物であり得る。薬学的に許容可能または好適な担体としては、賦形剤（すなわち、有効成分の活性を妨げない無毒な材料）および／または希釈剤を含み得る（または意味する）。このような組成物は、固体、液体または気体（エアゾール）の形態であり得る。あるいは、本明細書に記載の組成物は凍結乾燥品として処方してもよく、または当技術分野で公知の技術を用いて化合物をリポソーム内に封入してもよい。医薬組成物はまた他の成分を含んでもよく、これらの成分は生物学的に活性であっても不活性であってもよい。このような成分には、限定されるものではないが、バッファー（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡもしくはグルタチオン）、安定剤、色素、香味剤、ならびに沈殿防止剤および／または保存剤が含まれる。
医薬組成物において使用するための当業者に公知のいずれの好適な賦形剤または担体も、本明細書に記載の組成物に使用することができる。治療的使用のための賦形剤は周知であり、例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro ed. 1985)に記載されている。一般に、賦形剤のタイプは、投与様式に基づいて選択される。医薬組成物は、例えば、局所、経口、鼻腔、くも膜下腔内、直腸、膣、眼内、結膜下、舌下または非経口投与（皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、洞内、道内(intrameatal)または尿道内注射または注入を含む）を含む、いずれの適当な投与様式向けに処方してもよい。非経口投与としては、担体は好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたはバッファーを含んでなる。経口投与としては、上記の賦形剤のいずれか、またはマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、カオリン、グリセリン、デキストリンデンプン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、グルコース、スクロースおよび／もしくは炭酸マグネシウムなどの固体賦形剤もしくは担体が使用可能である。
医薬組成物（例えば、経口投与または注射送達用）は液体の形態であってもよい。液体医薬組成物は、例えば、下記のうちの１以上を含み得る：無菌希釈剤、例えば、注射水、食塩水、好ましくは、生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム液、溶媒または懸濁媒として働き得る硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の溶媒；抗菌剤；抗酸化剤；キレート剤；バッファー、ならびに張力の調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアル内に密封することができる。生理食塩水の使用が好ましく、注射用医薬組成物は好ましくは無菌である。
ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター細胞および寛容原性樹状細胞を含む本明細書に記載の薬剤は、持続放出または緩徐放出用に処方してもよい。このような組成物は一般に、周知の技術を用いて調製し、例えば、経口、直腸または皮下埋め込みによるか、または所望の標的部位への埋め込みによって投与することができる。持続放出処方物は担体マトリックス中に分散された、および／または速度制御膜に囲まれたリザーバー内に含まれた薬剤を含有し得る。このような処方物内で使用するための賦形剤は生体適合性であり、また生分解性でもあり得、この処方物は比較的一定レベルの有効成分放出を提供することが好ましい。持続放出処方物内に含有される有効化合物の量は、埋め込み部位、放出の速度および期待持続時間、ならびに治療または予防される病態の性質に依存する。
医薬組成物は、医学分野の当業者により決定されるような、治療（または予防）される疾患に適当な様式で投与することができる。適当な用量ならびに好適な持続期間および投与頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプおよび重篤度、特定の形態の有効成分、ならびに投与方法などの要因によって決定される。一般に、適当な用量および処置計画は、治療利益および／または予防利益（例えば、完全緩解または部分緩解の高頻度化、または無病生存期間および／または全生存期間の延長、または症状の重篤度の軽減などの臨床転帰の改善）を提供するのに十分な量の組成物を提供する。予防的使用としては、用量は、免疫疾患または障害に関連する疾患の予防、発症遅延、または重篤度の軽減に十分なものとすべきである。
最適な用量は一般に、試験モデルおよび／または臨床試験を用いて決定することができる。最適用量は、患者の体格、体重または血液量に依存し得る。一般に、一用量中に存在するか、または一用量中に存在するＤＮＡによりｉｎ ｓｉｔｕで産生されるポリペプチドの量は、約０．０１μｇ〜約１０００μｇ／ｋｇ宿主の範囲である。有効な療法を提供するのに十分な最少用量を使用することが通常好ましい。患者には一般に、治療または予防される病態に好適なアッセイを用いて治療または予防有効性のモニタリングを行うことができ、このようなアッセイは当業者によく知られている。液体形態で投与する場合、好適な用量は患者の大きさによって異なるが、一般に、１０〜６０ｋｇの対象で約１ｍｌ〜約５００ｍｌ（約０．０１μｇ〜約１０００μｇ／ｋｇを含んでなる）の範囲である。
アプタマーを含む核酸分子である薬剤を含んでなる医薬組成物では、その核酸分子は、核酸、ならびに細菌、ウイルスおよび哺乳動物発現系を含む当業者に公知の様々な送達系（例えば、本明細書に提供される組換え発現構築物を含む）のいずれかの中に存在してよい。このような発現系にＤＮＡを組み込むための技術は当業者に周知である。ＤＮＡはまた、例えば、Ulmer et al., Science 259:1745-49, 1993に記載され、Cohen, Science 259:1691-1692, 1993により概説されているように、「裸」であってもよい。裸のＤＮＡの取り込みは、ＤＮＡを生分解性ビーズにコーティングすることによって増加させることができ、これは細胞に効果的に輸送される。
核酸分子は、当技術分野で記載されているいくつかの方法のいずれか１つに従って細胞に送達することができる（例えば、Akhtar et al., Trends Cell Bio. 2:139 (1992); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., Mol. Membr. Biol. 16:129-40 (1999); Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol. 137:165-92 (1999); Lee et al., ACS Symp. Ser. 752:184-92 (2000);米国特許第６，３９５，７１３号; 国際特許出願公開第ＷＯ９４／０２５９５号); Selbo et al., Int. J. Cancer 87:853-59 (2000); Selbo et al., Tumour Biol. 23:103-12 (2002); 米国特許出願公開第２００１／０００７６６６号および同第２００３／０７７８２９号参照）。当業者に公知のこのよな送達方法には、限定されるものではないが、リポソームへの封入、イオン泳動によるもの、またはその他のビヒクル、例えば、生分解性ポリマー；ヒドロゲル；シクロデキストリン（例えば、Gonzalez et al., Bioconjug. Chem. 10: 1068-74 (1999); Wang et al., 国際出願公開第ＷＯ０３／４７５１８号および同第ＷＯ０３／４６１８５号参照）；ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）酸（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフェア（ペプチドおよびポリペプチドおよびその他の物質の送達にも有用）（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号；米国特許出願公開第２００２／１３０４３０号参照）；生分解性ナノカプセル；および生体接着剤ミクロスフェアなどへの組み込みによるもの、またはタンパク質性ベクター（国際出願公開第ＷＯ００／５３７２２号）によるものが含まれる。別の実施態様では、免疫細胞における免疫応答の変更（抑制または増強）、および免疫疾患または障害の治療に使用するための核酸分子は、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、例えば、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体とともに処方または複合体化することもできる（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号も参照）。
本発明の医薬組成物／薬剤は、上記のように、例えば、有効成分、例えば、他の免疫調節抗体（例えば、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ１５４、抗ＣＤ１３４Ｌ）または組換えタンパク質（例えば、限定されるものではないが、ｒＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ｒＯＸ４０（ＣＤ１３４））、または抗炎症性もしくは免疫調節化合物（例えば、限定されるものではないが、シクロスポリンＡ、ＦＴＹ７２０、ＲＡＤ、ラパマイシン、ＦＫ５０６、１５−デオキシスペルグアリン、ステロイド）をさらに含んでなってもよい。
Ｈ因子の治療的使用
本発明者らはまた、Ｈ因子が樹状細胞の活性化を阻害することができ、かつ、寛容原性細胞に独特な特徴の獲得を促進することができることを見出した。本発明の実施例９〜１５に示されるように、Ｈ因子は、ヒトＭｏ−ＤＣの活性化マーカーおよびＬＰＳ成熟ヒトＭｏ−ＤＣによる炎症性サイトカインの放出をダウンレギュレートすることができる。さらに、Ｈ因子は、樹状細胞への曝露に応答して、ヒトＭｏ−ＤＣの形態を改変し、未熟ＤＣのエンドサイトーシス能を低下させ、ヒトＭｏ−ＤＣの走化性および同種異系Ｔ細胞の増殖を低下させる。
加えて、本発明の筆者らは、Ｈ因子が、低下したＴ細胞刺激能と、炎症状態下でＴｈ１分化を妨げるだけでなく制御性Ｔ細胞生成能も有する寛容原性樹状細胞を生成することを見出した。
よって、別の面において、本発明は、免疫疾患の予防および／または治療において使用するための、
（ｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体、
（ｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター
からなる群から選択される材料の組成物に関する。
よって、別の面において、本発明は、免疫疾患の予防および／または治療用薬剤の製造のための、
（ｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体、
（ｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター
からなる群から選択される材料の組成物に関する。
別の面において、本発明は、必要とする対象における免疫疾患の予防および／または治療のための方法であって、前記対象に、
（ｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体、
（ｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター
の群から選択される材料の組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
別の面において、本発明は、必要とする対象において寛容原性樹状細胞および／または制御性Ｔ細胞集団を増加させるための方法であって、前記対象に、
（ｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体、
（ｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター
の群から選択される材料の組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
別の態様において、本発明は、寛容原性樹状細胞および／または制御性Ｔ細胞集団の増加において使用するための、
（ｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体、
（ｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター
の群から選択される材料の組成物に関する。
本明細書において用語「Ｈ因子」は、ヒト血漿中に約５５０μｇ／ｍｌの濃度で見られる１５５ｋＤａの糖タンパク質であり、ヘッド−テールで配置された２０のＣＣＰを含んでなり、そのうち４つのＮ末端ＣＣＰは補体調節活性を含み、Ｃ末端の２つのＣＣＰは表面結合と標的認識を仲介する。Ｈ因子は、因子Ｉを介したＣ３ｂ切断のための補因子活性と代替経路Ｃ３コンベルターゼＣ３ｂＢｂに対する減衰加速化活性の両方を有することで自己細胞上で補体の活性化を調節する。Ｈ因子は、宿主細胞上には存在するが病原体の細胞表面には存在しないグリコサミノグリカンと結合することから、自己細胞を補体の活性化からは保護するが、細菌／ウイルスからは保護しない。本発明に従って使用するための好適なＨ因子ポリペプチドには、限定されるものではないが、
−ヒトＨ因子（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（２０１１年５月３１日公開）に受託番号Ｐ０８６０３として提供されているポリペプチドのアミノ酸１９〜１２３１に相当する）、
−ウシＨ因子（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（２０１１年５月３１日公開）に受託番号Ｑ２８０８５として提供されているポリペプチドのアミノ酸１９〜１２３６に相当する）、
−ラットＨ因子（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（２０１１年５月３１日公開）に受託番号Ｑ９１ＹＢ６として提供されているポリペプチドのアミノ酸１９〜１２３６に相当する、
−マウスＨ因子（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（２０１１年５月３日公開）に受託番号Ｐ０６９０９として提供されているポリペプチドのアミノ酸１９〜１２３４に相当する）、
−ヒト補体Ｈ因子関連タンパク質１（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（２０１１年２月８日公開）に受託番号Ｑ０３５９１として提供されているポリペプチドのアミノ酸１９〜３３０に相当する）、
−ヒト補体Ｈ因子関連タンパク質２（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（２０１１年４月５日公開）に受託番号Ｐ３６９８０として提供されているポリペプチドのアミノ酸１９〜２７０に相当する）、
−ヒト補体Ｈ因子関連タンパク質３（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（２０１１年５月３１日公開）に受託番号Ｑ０２９８５として提供されているポリペプチドのアミノ酸１９〜３３０に相当する）、
−ヒト補体Ｈ因子関連タンパク質４（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（２０１１年５月３日公開）に受託番号Ｑ９２４９６として提供されているポリペプチドのアミノ酸１９〜２７０に相当する）、および
−ヒト補体Ｈ因子関連タンパク質５（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（２０１１年４月５日公開）に受託番号Ｑ９ＢＸＲ６として提供されているポリペプチドのアミノ酸１９〜５６９に相当する）
が含まれる。
Ｈ因子に関して用語「機能的に等価な変異体」は、上記で定義されるＨ因子ポリペプチドの１以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換から生じ、Ｈ因子の、樹状細胞増殖を阻害する能力を実質的に保持するポリペプチドを意味する。本発明による使用に好適なＨ因子変異体には、限定されるものではないが、上記で定義される天然型Ｈ因子と少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドが含まれる。あるポリペプチドがＨ因子の機能的に等価な変異体かどうかを決定するための方法には、限定されるものではないが、
−変異体の、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０、ＣＤ１ａ、ＣＣＲ７、ＩＤＯ、ＢＩＣ−１および／またはＳＯＤ２などのＤＣ活性化マーカーの発現をダウンレギュレートする能力の決定、
−変異体の、ＬＰＳ用いた刺激に応答した樹状細胞による炎症性サイトカインの放出を阻害する能力の決定、
−変異体ポリペプチドの、ＬＰＳ刺激に応答した未熟樹状細胞の樹状細胞形態の獲得を阻害する能力の決定、
−変異体の、未熟樹状細胞のエンドサイトーシス能を低下させる能力の決定、
−変異体ポリペプチドの、走化性シグナル（例えば、ＣＣＬ２１）に対する樹状細胞の走化性を低下させる能力の決定、および／または
−変異体ポリペプチドの、樹状細胞による刺激に応答した同種異系Ｔ細胞の増殖を低下させる能力の決定
に基づく、本発明の実施例９〜１５に記載される方法が含まれる。
よって、ポリペプチドは、前述のようにＨ因子の活性の少なくとも１００％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％または少なくとも５０％を示す場合にＨ因子と機能的に等価と見なされる。
別の実施態様では、Ｈ因子の機能的に等価な変異体は、Ｈ因子ドメインを含んでなる第１の領域と、Ｈ因子の一部を形成しないポリペプチドを含んでなる第２の領域とを含んでなる融合タンパク質である。本発明の融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）Ｈ因子を含んでなる領域、および（ｂ）Ｈ因子の一部を形成しないポリペプチドを含んでなる領域を含んでなり得る。あるいは、本発明の融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）Ｈ因子の一部を形成しないポリペプチドを含んでなる領域、および（ｂ）Ｈ因子を含んでなる領域を含んでなり得る。
本発明による融合タンパク質を形成するために使用可能な好適なポリペプチドには、限定されるものではないが、免疫グロブリンＦｃ領域、アルブミン、フェリチンまたはトランスフェリンが含まれる。
好ましい実施態様では、Ｈ因子の一部を形成しないポリペプチドを含んでなる領域は、免疫グロブリンＦｃ領域である。
本明細書において、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリン鎖定常領域、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分、またはその一部を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２以上のＣＨドメインの組合せと免疫グロブリンヒンジ領域とを含んでなり得る。本発明の融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域は、好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、さらに好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ｌｇＡ２、ｓＩｇＡ、より好ましくは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４、最も好ましくは、ＩｇＧ２から選択されるアイソタイプの免疫グロブリンのＦｃまたはＦｃの一部を含んでなる、またはからなる。
本発明はまた、Ｈ因子またはその変異体をコードするポリヌクレオチド、ならびに前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクターの治療的使用を提供する。用語「ポリヌクレオチド」および「ベクター」は上記に詳細に定義されており、本発明に関しては同じ意味で使用される。
「免疫疾患」という表現は上記に詳細に記載されており、Ｈ因子の使用を含む治療的方法に関しては同じ意味で使用される。好ましい実施態様では、免疫疾患は、免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患および移植拒絶からなる群から選択される。「免疫炎症性疾患」、「敗血症」、「自己免疫疾患」および「移植拒絶」という表現は上記に詳細に記載されており、本発明では同じ意味で使用される。
別の好ましい実施態様では、免疫疾患は自己免疫疾患ではなく、好ましくは、敗血症、移植拒絶、移植片対宿主病および過敏性疾患から選択される。
免疫疾患の予防および／または治療は、寛容原性樹状細胞および／または制御性Ｔ細胞集団の増加させることにより達成される。
「寛容原性樹状細胞集団を増加させる」という表現は、本発明の組成物の投与が、非処置対象に比べて寛容原性樹状細胞の数の増加をもたらすことを意味すると理解される。寛容原性樹状細胞集団は、非処置対象に比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％増加される。本発明の組成物の、寛容原性樹状細胞集団を増加させる能力は、例えば実施例９〜１４に記載のように決定することができる。
本明細書において「制御性Ｔ細胞集団を増加させる」とは、本発明の組成物が、非処置対象に比べて制御性Ｔ細胞の数の増加をもたらすことを意味する。制御性Ｔ細胞集団は、非処置対象に比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％増加される。本発明の組成物の、制御性Ｔ細胞集団を増加させる能力は、例えば実施例１７に記載のように決定することができる。
Ｈ因子を用いて寛容原性樹状細胞集団を生成するための方法
本発明の筆者らは、Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体、Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクターは、樹状細胞前駆体の寛容原性樹状細胞への成熟を促進することができることを見出した。よって、別の面において、本発明は、寛容原性樹状細胞集団の生成方法であって、
（ｉ）樹状前駆細胞集団を未熟樹状細胞集団の形成に十分な条件下でインキュベートする工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた未熟樹状細胞集団を成熟樹状細胞の形成に十分な条件下でインキュベートする工程
を含んでなり、工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体、
（ｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター
からなる群から選択される材料の組成物の存在下で行われる方法に関する。
「寛容原性樹状細胞」、「樹状前駆細胞」、「未熟樹状細胞集団の形成に十分な条件」、「未熟樹状細胞」、「成熟樹状細胞の形成に十分な条件」という表現は上記に詳細に記載されており、本発明に関しては同じ意味で使用される。
β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームを用いて寛容原性樹状細胞集団を得るための方法に関して上記で説明したように、Ｈ因子、その機能的に等価な変異体、Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド、Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターは、分化段階（すなわち、樹状前駆細胞が未熟樹状細胞に分化する間）、成熟過程（すなわち、未熟樹状細胞が樹状細胞に成熟する間）、または両方の段階の細胞と接触させることができる。
Ｈ因子またはＨ因子をコードするポリヌクレオチドの存在下で行われるこの工程は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行うことができる。一般に、これらの方法では、未熟樹状細胞をＨ因子に、下端０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、５０、または１００マイクログラム／ｍｌの培地；および上端０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、５０、１００、または２００マイクログラム／ｍｌの培地の範囲内で曝すことができる。最も好ましくは、ＤＣは、１〜１０μｇ／ｍｌのＨ因子の存在下で、最も好ましくは、２、５および１０μｇ／ｍｌで成熟させる。
好ましい実施態様では、樹状細胞前駆体集団は単球集団である。
用語「Ｈ因子」、「Ｈ因子の機能的に等価な変異体」、「Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド」、「Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター」、「樹状細胞」、「寛容原性樹状細胞」は、上記に詳細に記載されている。
Ｈ因子を用いて得られる本発明の寛容原性樹状細胞およびその治療的使用
別の面において、本発明は、Ｈ因子もしくはその機能的に等価な変異体、またはＨ因子もしくはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを用いて得られる寛容原性細胞集団に関する。
別の面において、本発明は、Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリペプチドを含んでなるベクターの存在下で樹状細胞を分化および／または成熟させることにより得られる本発明の寛容原性樹状細胞に関する。
本発明による寛容原性樹状細胞は、以下の特徴のうち１以上を示すことを特徴とする。
−ＨＬＡ−ＤＲ＋および／またはＣＤ１４＋であること。用語「陽性」は、所与のマーカーに適用される場合、本発明の方法により作出された寛容原性ＤＣ上での特定の細胞表面マーカーの発現のレベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）の場合と実質的に同じであることを示す。
−ＣＤ８０−、ＣＤ８３−、ＣＤ８６−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ４０−、ＣＣＲ７−、ＩＤＯ− ＢＩＣ−１−および／またはＳＯＤ２−であること。用語「陰性」は、所与のマーカーに適用される場合、本発明の方法により作出された寛容原性ＤＣ上での特定の細胞表面マーカーの発現レベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）上での同じ細胞表面マーカーの発現レベルに比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％低下しているか、または検出不能であることを示す。
−ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＦＮ−γなどの炎症性サイトカインを分泌しないか、または成熟樹状細胞に比べて減少した量で分泌すること。用語「減少した量で分泌する」とは、所与のサイトカインに適用される場合、本発明の方法により作出された寛容原性ＤＣ上での特定のサイトカインの分泌レベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）上での同じ細胞表面マーカーの分泌レベルに比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％低下しているか、または検出不能であることを示す。
−丸い形態を示すこと。本明細書において用語「丸い形態」とは、細胞の、細胞表面から突出している突起の数が、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）上の突起の数に比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％低下しているか、または検出不能である形態を意味する。細胞の形態は、本発明の実施例４に記載のように、すなわち走査型電子顕微鏡により決定可能である。
−未熟の場合、低いエンドサイトーシス能を示すこと。本明細書において用語「低いエンドサイトーシス能」とは、未熟寛容原性ＤＣのエンドサイトーシス活性が、適当な対照細胞（例えば、天然未熟免疫刺激性ＤＣ）でのエンドサイトーシスレベルに比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％低下しているか、または検出不能であることを示す。エンドサイトーシス能は、例えば本発明の実施例１３に記載のように決定することができる。
−細胞が分化／成熟過程の後も生存を維持する、すなわち、細胞がアポトーシスを受けないこと。本明細書において用語「生存」とは、成熟刺激（例えば、ＬＰＳ）による処理後にアポトーシスを受ける細胞が、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満である集団を意味する。アポトーシスは、アネキシンＶ／７−ＡＤＤ染色、カスパーゼ−３活性化アッセイ、ＴＵＮＥＬおよびＤＮＡ断片化アッセイ、ミトコンドリア膜電位の測定などの当技術分野で一般に公知のいずれの方法によって測定してもよい。
−成熟樹状細胞に比べて、ＣＣＬ２１に対する走化性挙動が低下したこと。本明細書において「走化性挙動が低下した」とは、本発明の方法により作出された細胞の、寛容原性ＤＣ上のＣＣＬ２１に対する走化性のレベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）上の同じサイトカインに対する走化性のレベルに比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％低下しているか、または検出不能であることを示す。ＣＣＬ２１に対する寛容原性樹状細胞の走化性挙動は、例えば本発明の実施例５に記載のように決定することができる。
−成熟樹状細胞に比べて、同種異系Ｔ細胞増殖を阻害する能力が低下したこと。本明細書において用語「同種異系Ｔ細胞増殖を阻害する能力が低下した」とは、本発明の方法により作出された細胞と接触させた同種異系Ｔ細胞の増殖レベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）と接触させた同種異系Ｔ細胞で見られる増殖レベルに比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％低下しているか、または検出不能であることを示す。寛容原性樹状細胞の同種異系Ｔ細胞増殖を阻害する能力は、例えば本発明の実施例６に記載のように実施することができる。
−未熟ＤＣとは対照的に、炎症誘発シグナルの存在下で保持される安定な免疫調節表現型を示すこと。寛容原性樹状細胞の、安定な免疫調節表現型を示す能力は、例えば、本発明の実施例１６に記載のように決定することができる。
−成熟樹状細胞に比べて、炎症誘発条件下でＴｈ１分化を阻害する能力を示すこと。本明細書において用語「Ｔｈ１分化を阻害する」とは、本発明の方法により作出された細胞と接触させたＴ細胞により作出されるＴｈ１細胞のレベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）と接触させたＴ細胞で見られるＴｈ１分化のレベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％低下している、または検出不能であることを示す。寛容原性樹状細胞の、Ｔｈ１分化を阻害する能力は、例えば、本発明の実施例１７に記載のように、ＩＦＮ−γ産生を測定することにより決定することができる。
成熟樹状細胞に比べて、高い制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）生成能を示すこと。本明細書において用語「高い制御性Ｔ細胞生成能」とは、本発明の方法により作出された細胞と接触させたＴ細胞の制御性Ｔ細胞の生成レベルが、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）と接触させたＴ細胞の生成レベルに比べて、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％増加していることを示す。寛容原性樹状細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）生成能は、例えば本発明の実施例１７に記載のように決定することができる。好ましい実施形態では、本発明による寛容原性細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８３−、ＣＤ８６−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ４０−、ＣＣＲ７−、ＩＤＯ−、ＢＩＣ−１−および／またはＳＯＤ２−である。
好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ１ａ−である。別の好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ１ａ−およびＣＤ８６−である。別の好ましい実施形態では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ１ａ−、ＣＤ８６−およびＩＤＯ−である。別の好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ１ａ−、ＣＤ８６−、ＩＤＯ−およびアポトーシス耐性である。好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ１ａ−およびＩＤＯ−である。別の好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ１ａ−およびアポトーシス耐性である。好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ８６−およびＩＤＯ−である。別の好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＣＤ８６−およびアポトーシス耐性である。別の好ましい実施態様では、本発明による寛容原性細胞はＩＤＯ−およびアポトーシス耐性である。
別の実施態様では、本発明による寛容原性樹状細胞は、本発明者らの寛容原性Ｃ４ＢＰ（ｂ−）処理ＤＣまたはＨ因子処理ＤＣにより、ヒトメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｇ特異的免疫寛容（または低反応性）を誘導することができる。
本発明による寛容原性細胞の特徴は表３に提供されている。
別の面において、本発明は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の本発明の寛容原性樹状細胞を含んでなる細胞集団に関し、好ましくは、この細胞集団は少なくとも８０％の本発明の寛容原性樹状細胞を含んでなる。
さらに別の面では、本発明は、免疫疾患の予防および／または治療において使用するための、Ｈ因子もしくはその機能的に等価な変異体、またはＨ因子もしくはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを用いて得られる寛容原性細胞集団に関する。
別の面において、本発明は、免疫疾患の予防および／または治療用薬剤の製造のための、Ｈ因子またはＨ因子をコードするポリヌクレオチドを用いて得られる寛容原性細胞の使用に関する。
別の態様において、本発明は、必要とする対象における免疫疾患の予防および／または治療のための方法であって、前記対象に、Ｈ因子またはＨ因子をコードするポリヌクレオチドを用いて得られる寛容原性細胞を投与することを含んでなる方法に関する。
別の態様において、本発明は、必要とする対象において制御性Ｔ細胞集団を増加させるための方法であって、前記対象に、Ｈ因子またはＨ因子をコードするポリヌクレオチドを用いて得られる寛容原性樹状細胞集団を投与することを含んでなる方法に関する。
「免疫疾患」という表現は、上記に詳細に記載されており、Ｈ因子の使用を含む治療的方法に関しても同じ意味で使用される。好ましい実施態様では、免疫疾患は、免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患および移植拒絶からなる群から選択される。「免疫炎症性疾患」、「敗血症」、「自己免疫疾患」および「移植拒絶」という表現は、上記に詳細に記載されており、本発明の治療方法に関しても同じ意味で使用される。
本明細書において「制御性Ｔ細胞集団を増加させる」という表現は、本発明の寛容原性樹状細胞集団が、適当な対照細胞（例えば、天然成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟により得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）で処置された対象に比べて制御性Ｔ細胞の数の増加をもたらすことを意味する。制御性Ｔ細胞集団は、対照細胞で処置した対象非処置対象に比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％増加される。本発明の寛容原性樹状細胞集団の、制御性Ｔ細胞集団を増加させる能力は、例えば実施例１７に記載のように決定することができる。
本発明を以下の実施例により詳しく説明するが、これらの実施例は単に例示であって、本発明の範囲を限定するものではないとみなされるべきである。
材料および方法
培養培地およびタンパク質
ＲＰＭＩ １６４０に、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミン（総てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡから）＋／−１０％熱失活ウシ胎児血清（Ｌｉｎｕｓ、カルテック、スペイン）を添加した。
本発明者らは、本研究を通して、３つのＣ４ＢＰアイソフォームを用いた。Ｃ４ＢＰ α７β１（プロテインＳとの複合体）とＣ４ＢＰ α７β０は、プールされたヒト血漿から以前 (Dahlback, B. et al., Biochem J. 1983. 209: 847-856) に記載されたように精製した。重合組換え全長Ｃ４ＢＰ α６β０と個々のα鎖 ＣＣＰを欠く（ΔＣＣＰ１〜８）突然変異体の両方を真核細胞で発現させ、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した(Blom, A. M., L. et al., 2001,J Biol Chem. 276: 27136-27144)。
Ｃ４ＢＰ α鎖 ＣＣＰ６由来ペプチドＰＳ６−０１、ＰＳ６−０２、ＰＳ６−０３、およびＰＳ６−０４はＣａｓｌｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｓ（デンマーク）から合成した。
ヒト血清から精製した因子は商業的に入手した（１０−１５−１１０６、Ｂｉｏｐｕｒ ＡＧ、スイス）。
細胞培養
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ（バルセロナ、スペイン）の健常ドナーに属するバフィーコート調製物から、フィコール−パーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）（商標）密度勾配遠心分離（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ；ウプサラ、スウェーデン）の後に得た。単球を次の２つの異なる方法により精製した。１）細胞を６０ｍｍ培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、スペイン）にて血清不含ＲＰＭＩ中、１×１０６細胞／ｍｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２中で２時間接着させた。非接着細胞をＰＢＳで洗浄することにより除去した。抗ＣＤ１４染色単離物のフローサイトメトリーにより示されるように、最終的な集団は８０％を超える単球を含んでいた。２）細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１４抗体（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、オーバーン、ＣＡまたはＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グレノーブル、フランス）を結合させたコロイド状超常磁性マイクロビーズを用いて精製した。ＣＤ１４＋細胞の純度は、ＣＤ１４染色およびフローサイトメトリー分析（＞９０％ＣＤ１４＋細胞）により試験した。単球由来ＤＣ（Ｍｏ−ＤＣ）は、培養０日目および３日目に単球培養に完全ＲＰＭＩ １６４０培地＋ＧＭ−ＣＳＦ（８００ＵＩ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００ＵＩ／ｍｌ）（両方ともＧｅｎｔａｕｒ、カンペンハウト、ベルギー）を添加することにより生成した。ＤＣ成熟のため、５日目にｉＤＣを、５μｇ／ｍｌ ＬＰＳ（大腸菌(Escherichia coli)０５５．Ｂ５、Ｓｉｇｍａ Ｌ２８８０、コペンハーゲン、デンマーク）で４８時間さらに刺激した。
ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グレノーブル、フランス）を用いた陰性選択(negative selection)によりＰＢＭＣから単離した。ＦＡＣＳｃａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、バーゼル、スイス）を用いたＣＤ３染色により評価したところ、ＣＤ３＋Ｔ細胞は９０％を超える純度であった。
抗体およびフローサイトメトリー
以下のモノクローナル抗体：ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｉｍｍｕ−３５７）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８３（ＨＢ１５ａ）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１４（ＲＭＯ５２）、ＰＥ結合抗ＣＤ４０（ＭＡＢ８９）、ＰＥ結合抗ＣＤ１ａ（ＢＬ６）、ＰＥ結合抗ＣＤ８０（ＭＡＢ１０４）、ＰＥ結合抗ＣＤ８６（ＨＡ５．２Ｂ７）（総てＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒから）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合抗ＣＣＲ７（ＴＧ８／ＣＣＲ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、ＣＡ）、および同じ商業供給者からの個々のアイソタイプ対照を用いて細胞表面表現型を分析した。ＰＢＳで洗浄した後、続いて細胞を１００μｌのＦＡＣＳバッファー（１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）中、３μｌ ＭｏＡｂ／１０５細胞で、室温にて２０分間染色した。染色細胞を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）パラメーターに従ってＭｏ−ＤＣのゲートを設定した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用い、結果を解析した。
Ｃ４ＢＰおよびＨ因子処理
異なるＣ４ＢＰアイソフォーム（α７β１、α７β０およびα６β０）とＨ因子の両方を、Ｍｏ−ＤＣ分化、成熟またはその両方を通して、２、５および１０μｇ／ｍｌで加えた。すなわち、分化アッセイでは、０日目にタンパク質を加え、３日目に補充した。成熟アッセイでは、５日目にタンパク質を単独またはＬＰＳと組み合わせて加えた。最後に、分化＋成熟アッセイでは、０日目、３日目および５日目にタンパク質を加えた（最後の時点でＬＰＳと組み合わせた）。
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）
単球をスライドガラスに播種し、ポリ−Ｌ−リシン（２５μｇ／ｍｌ）またはフィブロネクチン（４２μｇ／ｍｌ）のいずれかで覆い、８００Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ、５００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−４、およびＣ４ＢＰアイソフォームα７β１、α７β０、またはＨ因子（１０μｇ／ｍｌ）を添加した完全ＲＰＭＩ培地中で５日間培養し、さらに、同じ培地中で４８時間ＬＰＳで刺激した。得られたＤＣをカコジル酸バッファー中、１％パラホルムアルデヒドおよび１．２５％グルタルアルデヒドで２時間固定した。最後に、これらの細胞を１％ＯｓＯ４中で後固定し、一連の段階的エタノール、次いでアセトンで脱水した。脱水後、細胞を臨界点乾燥機で乾燥させ、金でコーティングした後、走査型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＤＳＭ９４０Ａ）により観察した。
混合白血球反応
ＣＤ３＋Ｔ細胞（１０５／ウェル）とＣ４ＢＰ処理（α７β１およびα７β０）、またはＨ因子処理、かつＬＰＳ活性化Ｍｏ−ＤＣを９６ウェル丸底プレートに様々なＤＣ：Ｔ細胞比（１：４０、１：８０および１：１６０）で播種し、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミン（総てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）＋２％ヒトＡＢ血清を添加したＸ−ＶＩＶＯ １５培地（Ｂｉｏｗｉｔｔａｋｅｒ、ウォーカーズビル、ＭＤ）中で培養した。５日間のインキュベーション後にアロ特異的増殖を測定した。４日目に、これらの共培養物に５０００ｒａｄで５分の照射を行った後、［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウェル、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ビストン、ＭＡ）を加え、その後、さらに１６時間インキュベートした。次いで、標識細胞をＦｉｌｔｅｒｍａｔｅ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ、メリデン、ＣＴ）でガラス線維フィルターに回収し、Ｔ細胞増殖速度を、ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した［３Ｈ］−チミジン取り込みにより求めた。結果を、４反復の培養ウェルでのチミジン取り込みの平均ｃｐｍ±ＳＤで報告する。
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
Ｍｏ−ＤＣ（１０６／条件）を７日目に回収し、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｍＲＮＡを抽出し、ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼＩ（Ａｍｂｉｏｎ、オースティン、ＴＸ）とともに製造者のプロトコールに従ってインキュベートした。二工程リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、ヒトＣＣＲ７、ＢＩＣ−１、ＩＤＯおよびＳＯＤ２の相対的ｍＲＮＡレベルを決定した。逆転写反応は、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、５００ｎｇの全ＲＮＡで行った。ｍＲＮＡレベルの定量は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ技術（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｒｍｉｃａｌｓ、インディアナポリス、ＩＮ）を用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。以下のプライマー：
CCR7-f(5’-TGGGCATCTGGATACTAGC-3’)(配列番号6);CCR7-r(5’-AAGAAAGGGTTGACGCAGC-3’)(配列番号7);IDO-f(5’-GGTCATGGAGATGTCCGTAA-3’)(配列番号8);IDO-r(5’-ACCAATAGAGAGACCAGGAAGAA-3’)(配列番号9);BIC-1-f(5’-AACCTACCAGAGACCTTACC-3’ )(配列番号10);BIC-1-r(5’-ATGCTTCTTTGTCATCCTCC-3’)(配列番号11);SOD2-f(5’-GACAAACCTCAGCCCTAAC-3’)(配列番号12);SOD2-r(5’-ACACATCAATCCCCAGCAGT-3’)(配列番号13)を用いて、それぞれ４３５ｂｐ、２２７ｂｐ、２９６ｂｐ、および２４８ｂｐの産物を得た。これらの遺伝子特異的プライマー対は、Ｏｌｉｇｏ ４．０およびＰｒｉｍｅｒ ３ソフトウエアパッケージ（ＭＢＩ、Ｃａｓｃａｄｅ、ＣＯ）を用いて設計し、プライマーダイマーの形成を防ぐように選択した。
総てのサンプルは、下記のプライマーセットを用いて、構成的に発現するヒトシクロフィリン遺伝子に関して正規化した。
CypA-f(5’-CTCCTTTGAGCTGTTTGCAG-3’)(配列番号14)およびCypA-r(5’-CACCACATGCTTGCCATCC-3’)(配列番号15)(Pluvinet R. et al., 2004, Blood. 104: 3642-3646)。プライマーは総て、Ｂｏｎｓａｉ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コペンハーゲン、デンマーク）から購入した。
ＰＣＲ増幅は、２μｌの調製済み反応ミックス、１０×ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）；ＭｇＣｌ２（ＣＣＲ７の場合には３ｍＭ；ＢＩＣ−１およびＳＯＤ２の場合には４ｍＭ；そしてＩＤＯの場合には５ｍＭ）；０．１５μＭの各プライマー；５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；および鋳型としての７５ｎｇ ｃＤＮＡを含有する２０μｌ容量で行った。増幅プログラムは、９５℃で１０分間の初期変性、次いで、９５℃で１秒；５８℃（ＣＣＲ７およびＳＯＤ２）／６０℃（ＢＩＣ−１およびＩＤＯ）で５秒；７２℃で１０秒の４５サイクルを用いた。このアッセイの再現性が確認され、これら４つの遺伝子の発現は選択した細胞濃度では直線範囲にあることが示された。
走化性アッセイ
Ｃ４ＢＰアイソフォームα７β１、α７β０、またはＨ因子の存在下で分化および成熟した（ＬＰＳ、４８時間）Ｍｏ−ＤＣを、トランスウェルアッセイを用い、ＣＣＬ２１ケモカインへと向かう移動に関して調べた。簡単に述べると、トランスウェルプレート（孔径８．０μｍのポリカーボネートフィルター；Ｃｏｓｔａｒ、コーニング、ＮＹ）の下方のチャンバーを、ＣＣＬ２１（２００ｎｇ／ｍｌ）を含むまたは含まない４００μｌの完全ＲＰＭＩで満たした。１００μｌの完全ＲＰＭＩ中、合計１×１０５個のＤＣを上方のチャンバーに加え、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。下方のチャンバーへ移動した細胞を回収し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて２分の一定時間の現象を取得するＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターでカウントを行った。総ての刺激条件の移動アッセイを２反復のウェルで実施した。値は非処理ｍＤＣ（１００％）に対する移動細胞のパーセンテージとして示す。
ＤＣサイトカイン分泌
Ｔｈ１／Ｔｈ２ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｉｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘキット（Ｂｅｎｄｅｒ−Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ、ウィーン、オーストリア）を製造者の説明書に従って用い、Ｃ４ＢＰアイソフォームα７β１およびα７β０で処理したＤＣ上清から、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−６およびＩＬ−８の濃度を測定した。
エンドサイトーシス活性
ｉＤＣの食作用活性を測定するために、２×１０５細胞／ｍｌを１００μｌのＰＢＳに再懸濁させ、４μｌのＢＯＤＩＰＹ ＦＬ結合ＤＱ−オボアルブミン（１ｍｇ／ｍｌ、ＤＱ−ＯＶＡ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ライデン、オランダ）とともに３７℃または０℃で１５分間インキュベートした。１ｍｌの冷ＦＡＣＳバッファーを加えることによりインキュベーションを停止させた。細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、それらの蛍光を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
アポトーシスの測定
蛍光色素アネキシンＶ（アネキシンＶ−ＰＥアポトーシス検出キットＩ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）と７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＤＤ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を用いた二重染色およびフローサイトメトリー分析を用いて、Ｃ４ＢＰ α７β１−、Ｃ４ＢＰ α７β０−、ｒｅｃＣ４ＢＰ α６β０−、またはＨ因子処理および非処理Ｍｏ−ＤＣ生存／アポトーシス状態を評価した。
細胞内サイトカイン染色
健常ドナーから単離した単核細胞を９６ウェル丸底プレート（Ｎｕｎｃ）に１×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、同種異系ＤＣ（５×１０３ＤＣ／ウェル）で６日間刺激した。その後、全細胞を１０μｇ／ｍｌブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ）の存在下、５０ｎｇ／ｍｌ ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ）＋５００ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）で５時間刺激した。刺激後、細胞をＰＢＳで洗浄し、固定し、ＩｎｔｒａＳｔａｉｎキット（Ｄａｋｏ）を用いて透過処理を施し、抗ヒトＩＦＮ−γ ＡＰＣ ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに室温で２８分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を搭載したＦＡＣＳｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
ＣＤ４ ＋ ＣＤ１２７ ｌｏｗ／ｎｅｇａｔｉｖｅ ＣＤ２５ ｈｉｇｈ かつＦｏｘｐ３ ＋ Ｔ細胞の判定
ＣＤ３＋Ｔリンパ球は、単核細胞からＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の説明書に従って用いた陰性選択(negative selection)により精製した。純度は、総ての実験で９５％を超えた。富化されたＴ細胞を９６ウェル丸底プレートに播種した（１０５細胞／ウェル）。５日間の共培養（１ＤＣ：４０Ｔ）の後、本発明者らはフローサイトメトリーを用い、ＣＤ４＋，ＣＤ１２７ｌｏｗ／ｎｅｇａｔｉｖｅ，ＣＤ２５ｈｉｇｈかつ細胞内Ｆｏｘｐ３＋として定義されるＴｒｅｇｓのパーセンテージを決定した（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）。染色細胞を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析し、結果を、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いて分析した。
統計分析
結果を平均＋／−ＳＤとして表す。参照条件（通常、ｍＤＣｓまたはｉＤＣ）に対する種々の試験条件下のＭｏ−ＤＣ変量を独立スチューデントのｔ検定を用いて比較し、ｐ＜０．０５を有意とみなした。
実施例１
β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームはヒトＭｏ−ＤＣの活性化表現型をダウンレギュレートする
本発明者らは、まず、 主要な天然Ｃ４ＢＰアイソフォームα７β１およびα７β０と、組換えＣ４ＢＰ α６β０が、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＣＤ１ａを含む種々の単球およびＤＣ表面マーカーの発現に影響を及ぼすかどうかを評価した。独立した８実験からのデータを、独立スチューデントのｔ検定を用いて分析した（図１）。興味深いことに、７日間の分化および成熟過程中、Ｍｏ−ＤＣとＣ４ＢＰとの共インキュベーションにより、異なるＣ４ＢＰアイソフォーム間の有意な表現型の違いが明らかになった。よって、主要なＣ４ＢＰ α７β１アイソフォームはＬＰＳ成熟ＤＣ上での上記マーカーのいずれの発現にも影響を及ぼさず、Ｃ４ＢＰ βーアイソフォーム（α７β０および組換えα６β０）は、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８０およびＣＤ１ａを有意に用量依存的にダウンレギュレートした。逆に、Ｍｏ−ＤＣ上でのＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ４０発現はＣ４ＢＰ β−アイソフォーム処理により変化しなかった。これらのデータを考え合わせると、様々な細胞表面マーカーの発現パターンによって判断して、Ｃ４ＢＰ β−アイソフォームが炎症誘発性ＭｏＤＣの分化／成熟を改変する能力を有することが明らかである。さらに、種々のＣ４ＢＰアイソフォームで処理したＭｏ−ＤＣは、アネキシンＶ／７−ＡＤＤ染色により評価したところ、分化／成熟過程を通して高い生存率を維持しており、ＬＰＳを介したＤＣ成熟の４８時間後に明示されたアポトーシス細胞は１０％未満であった（図２）。
実施例２
β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームに曝されたヒトＭｏ−ＤＣはＣＣＲ７およびＤＣ成熟マーカーＩＤＯおよびＢＩＣ−１の発現が低い
成熟中のＤＣの分子サインを適合させる重要な転写物[Jin et al., 2010, J Transl Med. 8: 4]に対するＣ４ＢＰアイソフォームの影響をさらに評価するために、ＤＣ移動に関与するケモカイン受容体ＣＣＲ７の発現、トリプトファン代謝に関与する免疫調節酵素ＩＤＯ、および免疫機能に関与する重要なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１５５をコードするＢＩＣ−１遺伝子を、ＲＴ−ｑＰＣＲにより分析した。これらの分子バイオマーカーは総て、ＬＰＳを介したＭｏ−ＤＣ成熟時にアップレギュレートされることが判明した。しかしながら、Ｃ４ＢＰ α７β０およびＣ４ＢＰ α６β０（Ｃ４ＢＰ α７β１は除く）で前処理したＭｏ−ＤＣは、上記の転写プロフィールを有意にダウンレギュレートし、ＣＣＲ７、ＩＤＯおよびＢＩＣ−１転写物レベルを未熟ＤＣからの転写物レベルと同等にした（図３Ａ）。さらに、Ｃ４ＢＰ β−アイソフォーム処理は、Ｍｏ−ＤＣ上の表面受容体ＣＣＲ７の一貫したダウンレギュレーションを誘導した（図３Ｂ）。
実施例３
β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームはＬＰＳ成熟ヒトＭｏ−ＤＣによる炎症性サイトカインの放出を阻害する
本発明者らは、次に、Ｍｏ−ＤＣ表現型に対する種々のＣ４ＢＰアイソフォームの効果が、それらのサイトカイン（ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γ）放出の変化を伴うかどうかを評価した（図４）。非処理ｉＤＣに比べ、ｉＤＣをＬＰＳで成熟させた場合には、これらの各サイトカインの分泌がアップレギュレートされた。Ｍｏ−ＤＣをＣ４ＢＰ α７β１で前処理すると、成熟時の非処理Ｍｏ−ＤＣと同等のサイトカインレベルが分泌された。これに対して、Ｃ４ＢＰ β−アイソフォームのいずれかで前処理すると、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの放出は妨げられ、ＩＬ−８およびＩＬ−６の放出は低下し、ＩＬ−１０の産生は高まった。よって、ＬＰＳを介したＭｏ−ＤＣ刺激時の炎症誘発性サイトカイン産生は、Ｃ４ＢＰ β−処理ＤＣでは有意に低減された。
実施例４
β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームはヒトＭｏ−ＤＣの形態を改変する
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、Ｍｏ−ＤＣの詳細な表面形態を評価した（図５）。ＬＰＳ曝露前の非処理ｉＤＣは本質的に丸い形態であったが、４８時間のＬＰＳ成熟の後には樹状形態が顕著となり、細胞表面から突出している多くの長い突起を有していた。この場合にも、Ｃ４ＢＰ α７β１処理Ｍｏ−ＤＣは、ＬＰＳ刺激時の非処理Ｍｏ−ＤＣと類似の外観を持っていた。逆に、Ｃ４ＢＰ α７β０（図５）およびＣ４ＢＰ α６β０（示されていない）でのＭｏ−ＤＣ処理は両方とも、ＬＰＳ誘導時の結果としての「ヤマアラシ様」のＤＣ形態を逆戻りさせた。
実施例５
β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームはヒトＭｏ−ＤＣの走化性を変化させる
成熟シグナルは、リンパ節指向性ケモカインへの移動などの明瞭なＭｏ−ＤＣ機能の発現を決定付ける。従前に示されるように、Ｃ４ＢＰ β−アイソフォーム処理は、ケモカイン受容体ＣＣＲ７をダウンレギュレートした。表面ＣＣＲ７発現の低下は、次に、ケモカインＣＣＬ２１へと向かうＬＰＳ成熟Ｍｏ−ＤＣの移動を停止させた（図６）。これに対して、非処理Ｍｏ−ＤＣおよびＣ４ＢＰ α７β１処理Ｍｏ−ＤＣのＬＰＳ成熟は両方ともＣＣＬ２１に応答して最大の移動を誘導した。
実施例６
β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームに曝されたヒトＭｏ−ＤＣは同種異系Ｔ細胞の増殖を 阻害する
Ｃ４ＢＰ β−アイソフォームが表現型成熟およびＭｏ−ＤＣにより放出される炎症性サイトカインの量に対して影響を及ぼすことが判明したので、本発明者らは、次に、主要なＣ４ＢＰアイソフォームに曝されたＭｏ−ＤＣの免疫刺激能を調べた。Ｍｏ−ＤＣをＣ４ＢＰ α７β１アイソフォームとともにプレインキュベートし、かつ、ＬＰＳで成熟させた場合には、非処理のＬＰＳ成熟Ｍｏ−ＤＣを用いて得られたものと同様の、同種異系Ｔ細胞の最大増殖が見られた。これに対して、Ｃ４ＢＰ α７β０とともにプレインキュベートした成熟Ｍｏ−ＤＣが誘導したＴ細胞増殖は有意に低く、ｉＤＣを用いた場合に見られたレベルに近かった（図７）。同様の結果がナイーブＴ細胞を用いた場合にも見られた（データは示されていない）。
実施例７
Ｃ４ＢＰＡのＣＣＰ６ドメインはヒトＭｏ−ＤＣに対するＣ４ＢＰ「寛容原性」活性に必要である
本発明者らは、次に、Ｃ４ＢＰ β−アイソフォームの、Ｍｏ−ＤＣに対するそれらの免疫調節活性または「寛容原」活性の構造要件をさらに同定することにねらいを定めた。よって、個々のＣＣＰドメインを欠く組換えＣ４ＢＰアイソフォーム（α６β０）を、Ｍｏ−ＤＣの活性化表現型をダウンレギュレートする能力に関して試験した。図８に示されるように、個々の欠失突然変異体は、ΔＣＣＰ６の１つを除いて総てが、ＬＰＳ誘導時のＣＤ８３成熟マーカーのアップレギュレーションを有意に妨げることができた。逆に、Ｃ４ＢＰ ΔＣＣＰ６処理Ｍｏ−ＤＣは、ＬＰＳ誘導時の非処理またはＣ４ＢＰ α７β１処理Ｍｏ−ＤＣと同様の挙動を見せ、ＣＤ８３発現をアップレギュレートし（図８）、また、分子バイオマーカー（ＩＤＯ）のアップレギュレーション、炎症誘発性サイトカイン分泌、または表面形態の変化などの他の典型的な成熟形質の誘導も妨げなかった（データは示されていない）。よって、Ｃ４ＢＰ α鎖ＣＣＰ６ドメインは、ＤＣにおけるＣ４ＢＰ β−アイソフォームの免疫調節剤活性に必要である。
実施例８
ＣＣＰ６に基づくペプチドＰＳ６−０４はヒトＭｏ−ＤＣの成熟表現型を妨げる
本発明者らは、Ｎ末端でアセチル化されＣ末端でアミド化され、Ｃｙｓアミノ酸がＳｅｒで置換された全ＣＣＰ６ドメイン配列を包含する４つの合成ペプチド（ＰＳ６−０１、ＰＳ６−０２、ＰＳ６−０３、およびＰＳ６−０４）を作成し、それらがＬＰＳ刺激Ｍｏ−ＤＣに対するＣ４ＢＰ β−アイソフォームの免疫調節活性または「寛容原」活性を模倣するかを試験した（図９）。これらのペプチドのうちＰＳ６−０２およびＰＳ６−０３の２つは、ＬＰＳ成熟Ｍｏ−ＤＣ時のＣＤ８３のアップレギュレーションを妨げると思われた。ＰＳ６−０２は、ＤＣに対して毒性であった。よって、短い１４マーのペプチドＰＳ６−０４は１００μＭで、Ｍｏ−ＤＣに対し、そのＣ４ＢＰ α６β０対応物に匹敵する効果を誘導した。
実施例９
Ｈ因子はヒトＭｏ−ＤＣの活性化表現型をダウンレギュレートする
本発明者らは、まず、ヒト血漿から精製したＨ因子が、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＣＤ１ａを含む種々の単球およびＤＣ表面マーカーの発現に影響を及ぼすかどうかを評価した。独立した５実験のデータを、独立スチューデントのｔ検定を用いて分析した（図１０）。興味深いことに、それらの分化および成熟過程を通してＭｏ−ＤＣとＨ因子との共インキュベーションを行うことにより、非処理Ｍｏ−ＤＣに対する有意な表現型の違いが明らかになった。よって、Ｈ因子は、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０およびＣＤ１ａを有意に用量依存的にダウンレギュレートした。逆に、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ１４の発現は若干の増強を受けた。これらのデータを考え合わせると、様々な細胞表面マーカーの発現パターンによって判断して、Ｈ因子は炎症誘発性Ｍｏ−ＤＣ分化／成熟を改変する能力を有することが明らかである。さらに、Ｈ因子で処理したＭｏ−ＤＣは、アネキシンＶ／７−ＡＤＤ染色により評価したところ、分化／成熟過程を通して高い生存率を維持しており、ＬＰＳを介したＤＣ成熟の４８時間後に明示されたアポトーシス細胞は１０％未満であった（図１１）。
実施例１０
Ｈ因子に曝されたヒトＭｏ−ＤＣはＣＣＲ７およびＤＣ成熟マーカーＩＤＯ、ＢＩＣ−１およびＳＯＤ２の発現が低い
成熟中のＤＣの分子サインを適合させる重要な転写物(Jin et al., 2010, J Transl Med. 8: 4)に対するＨ因子の影響をさらに評価するために、ＤＣ移動に関与するケモカイン受容体ＣＣＲ７の発現、トリプトファン代謝に関与する免疫調節酵素ＩＤＯ、免疫機能に関与する重要なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１５５をコードするＢＩＣ−１遺伝子、および抗酸化酵素ＳＯＤ２を、ＲＴ−ｑＰＣＲにより分析した。これらの分子バイオマーカーは総て、ＬＰＳを介したＭｏ−ＤＣ成熟時にアップレギュレートされることが判明した。しかしながら、Ｈ因子で前処理したＭｏ−ＤＣは、上記の転写プロフィールを有意にダウンレギュレートし、ＣＣＲ７、ＩＤＯおよびＢＩＣ−１およびＳＯＤ２転写物レベルを未熟ＤＣからの転写物レベルを下回るまでにした（図１２Ａ）。さらに、Ｈ因子処理は、Ｍｏ−ＤＣ上の表面受容体ＣＣＲ７の一貫したダウンレギュレーションを誘導した（図１２Ｂ）。
実施例１１
Ｈ因子はＬＰＳ成熟ヒトＭｏ−ＤＣによる炎症性サイトカインの放出を阻害する
本発明者らは、次に、Ｈ因子の効果が、それらのサイトカイン（ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γ）放出の変化を伴うかどうかを評価した（図１３）。非処理ｉＤＣに比べ、ｉＤＣをＬＰＳで成熟させた場合には、これらの各サイトカインの分泌がアップレギュレートされた。Ｈ因子で前処理すると、上述の総ての炎症性サイトカインの放出が妨げられ、そのレベルは非処理ｉＤＣからのレベル付近に維持された。よって、ＬＰＳを介したＭｏ−ＤＣ刺激時の炎症誘発性サイトカイン産生は、Ｈ因子処理ＤＣでは有意に低減された。
実施例１２
Ｈ因子はヒトＭｏ−ＤＣの形態を改変する
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、Ｍｏ−ＤＣの詳細な表面形態を評価した（図１４）。ＬＰＳ曝露前の非処理ｉＤＣは本質的に丸い形態であったが、４８時間のＬＰＳ成熟の後には樹状形態が顕著となり、細胞表面から突出している多くの長い突起を有していた。この場合にも、Ｍｏ−ＤＣのＨ因子による処理（図１４）は、ＬＰＳ刺激時の結果としての「ヤマアラシ様」のＤＣ形態を逆戻りさせた。
実施例１３
Ｈ因子はｉＤＣのエンドサイトーシス能を低下させる
本発明者らは、次に、Ｈ因子が未熟Ｍｏ−ＤＣのエンドサイトーシス活性に影響を及ぼすかどうかを調べた。Ｍｏ−ＤＣを蛍光ＤＱ−ＯＶＡとともに３７℃でインキュベートして特異的取り込みを測定し、４℃で非特異的結合を定量した。Ｈ因子はｉＤＣのエンドサイトーシス能を有意に低下させた（図１５）。特に、Ｈ因子はｉＤＣの食作用を、ｍＤＣに見られる食作用のレベルにまで低下させた（データは示されていない）。４℃では、未熟Ｍｏ−ＤＣによるＤＱ−ＯＶＡの取り込みは見られなかった。これらのデータは、Ｈ因子がｉＤＣのエンドサイトーシス能を低下させることを示す。
実施例１４
Ｈ因子はヒトＭｏ−ＤＣの走化性を変化させる
成熟シグナルは、リンパ節指向性ケモカインへの移動などの明瞭なＭｏ−ＤＣ機能の発現を決定付ける。従前に示されるように、Ｈ因子処理は、ケモカイン受容体ＣＣＲ７をダウンレギュレートした。表面ＣＣＲ７発現の低下は、次に、ケモカインＣＣＬ２１へと向かうＬＰＳ成熟Ｍｏ−ＤＣの移動を停止させた（図１６）。これに対して、非処理Ｍｏ−ＤＣのＬＰＳ成熟はＣＣＬ２１に応答して最大の移動を誘導した。
実施例１５
Ｈ因子に曝されたヒトＭｏ−ＤＣは同種異系Ｔ細胞増殖を阻害する
Ｈ因子が活性化表現型およびＭｏ−ＤＣにより放出される炎症性サイトカインの量に対して影響を及ぼすことが判明したので、本発明者らは、次に、Ｈ因子に曝されたＭｏ−ＤＣの免疫刺激能を調べた。非処理のＬＰＳ成熟Ｍｏ−ＤＣを混合白血球反応で使用した場合、同種異系Ｔ細胞の最大増殖が見られた。これに対して、Ｈ因子とともにプレインキュベートしたＭｏ−ＤＣが誘導したＴ細胞増殖は有意に低く、ｉＤＣを用いた場合に見られたレベルに近かった（図１７）。同様の結果がナイーブＴ細胞を用いた場合にも見られた（データは示されていない）。
実施例１６
Ｃ４ＢＰ（β−）およびＦＨはＤＣに安定な表現型を誘導する
臨床現場におけるそれらの使用の可能性のため、本発明者らは、Ｃ４ＢＰ（β−）またはＦＨ処理かつＬＰＳ成熟ＤＣの潜在的活性化がこれらの寛容原性ＤＣの表現型を改変するかどうかを検討することにねらいを定めた。従って、非処理ＤＣおよびＣ４ＢＰ（β−）またはＦＨ処理ＤＣの両方を前述のようにＬＰＳで成熟させた後、免疫調節剤（Ｃ４ＢＰ（β−）またはＦＨ）を用いずに、ＴＮＦ−α＋ＩＦＮ−γを用いて２４時間再刺激した。ＴＮＦ−α＋ＩＦＮ−γを用いた再刺激は、ＤＣ生存率（示されていない）においてもＣＤ８３およびＣＤ８６マーカーに関するＤＣ表現型（図１８）においても、有意な変化は誘導しなかった。これらの寛容原性Ｃ４ＢＰ（β−）またはＦＨ処理ＤＣは二次刺激には表現型的に不応であり、それらの安定な非炎症誘導性プロフィールが確認された。
実施例１７
Ｃ４ＢＰ（β−）またはＦＨ処理かつＬＰＳ成熟ＤＣはＣＤ４＋Ｔｈ１分極を妨げるとともに同種異系Ｔ細胞にＴｒｅｇ表現型を誘導する
Ｃ４ＢＰ（β−）およびＦＨ処理およびＬＰＳ成熟ＤＣが同種異系Ｔ細胞の増殖を阻害するできたことを確認した後、本発明者らは、これらの応答Ｔ細胞により分泌されたサイトカインに関して洞察を得ることを考え、ＣＦＳＥｌｏｗアロ増殖性Ｔリンパ球をＰＭＡ＋イオノマイシンで再刺激し、ＩＦＮ−γ産生を細胞内染色により測定した。これらの結果により、ＬＰＳ成熟した非処理ＤＣのＩＦＮ−γ産生の約５０〜６０％という有意な低下が確認された（図１９）。
最後に、ＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５ｈｉｇｈおよびＦｏｘｐ３＋として定義されるＴｒｅｇ細胞の存在を、これらの培養条件で評価した。６日間の刺激を１回行った後、本発明者らは図２０に示されるように、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋およびＣＤ２５ｈｉｇｈ，ＣＤ１２７ｌｏｗ／ｎｅｇａｔｉｖｅ細胞の誘導を分析した。Ｃ４ＢＰ（β−）処理およびＬＰＳ成熟ＤＣで刺激したＴ細胞ならびにＦＨ処理およびＬＰＳ成熟ＤＣで刺激したＴ細胞は両方とも、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋およびＣＤ２５ｈｉｇｈ，ＣＤ１２７ｌｏｗ／ｎｅｇａｔｉｖｅ細胞のパーセンテージに有意な増加を示し、この増加は非処理の未熟ＤＣで得られたものと類似していた。
実施例１８
養子導入されたＣ４ＢＰ（β − ）処理またはＨ因子処理ＤＣはｉｎ ｖｉｖｏにおいて同種免疫を抑制する
本発明者らは、ヒト異種移植片対宿主病（ｘｅｎｏ−ＧｖＨＤ）モデル(King et al.(2009) Clin. Exp. Immunol. 157: 104-118)において、Ｃ４ＢＰ（β−）処理またはＨ因子処理された単球由来ＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ寛容原性または調節能を評価した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；１０×１０６／マウス）の静脈注射は、ＮＳＧ免疫欠陥マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（８〜１２週齢）にｘｅｎｏ−ＧｖＨＤを誘発した（生存期間中央値３０〜４０日）。Ｃ４ＢＰ（β−）処理またはＨ因子処理した単球由来ＤＣ（５×１０５／マウス）とＰＢＭＣとの同時導入（予防試験）または後の注入（ＰＢＭＣ注射の２５日後、またはＰＢＭＣ注射動物に、例えば体重減少、姿勢の屈曲、体毛損失、運動低下などの最初の病徴が現れた際）（治療試験）は、ＰＢＭＣ単独を注射した動物よりも生存期間を有意に延長したが、非処理ＤＣまたはＣ４ＢＰ（β＋）処理ＤＣの導入によっては有意な保護は付与されなかった。

Claims (27)

  1. 免疫疾患の予防および／または治療に使用するための、
    （ｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体、
    （ｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド、および
    （ｉｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター
    からなる群から選択される材料の組成物。
  2. 免疫疾患が敗血症、移植拒絶、移植片対宿主病および過敏性疾患から選択される、請求項１に記載の組成物。
  3. 免疫疾患の予防および／または治療に使用するための、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム。
  4. 免疫疾患が免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主病および過敏性疾患からなる群から選択される、請求項３に記載の使用のためのβ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム。
  5. Ｃ４ＢＰアイソフォームがα７β０およびα６β０からなる群から選択される、請求項３に記載の使用のためのＣ４ＢＰアイソフォーム。
  6. Ｃ４ＢＰ α鎖のＣＣＰ６ドメインまたはその機能的に等価な変異体を含んでなり、全長Ｃ４ＢＰ α鎖を含まない、ポリペプチド。
  7. 配列番号２、３、４および５からなる群から選択される配列を有するペプチドまたはその機能的に等価な変異体。
  8. 請求項６に記載のポリペプチドまたは請求項７に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  9. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
  10. 請求項６に定義されるポリペプチド、請求項７に定義されるペプチド、請求項８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９に記載のベクターと薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
  11. 薬剤に使用するための、請求項６に定義されるポリペプチド、請求項７に定義されるペプチド、請求項８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９に記載のベクター。
  12. 免疫疾患の予防および／または治療に使用するための、請求項６に定義されるポリペプチド、請求項７に定義されるペプチド、請求項８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９に記載のベクター。
  13. 免疫疾患が免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主病および過敏性疾患からなる群から選択される、請求項１２に記載の使用のためのポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクター。
  14. 寛容原性樹状細胞集団の生成方法であって、
    （ｉ）樹状前駆細胞集団を未熟樹状細胞集団の形成に十分な条件下でインキュベートする工程、および
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られた未熟樹状細胞集団を成熟樹状細胞の形成に十分な条件下でインキュベートする工程
    を含んでなり、工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
    （ａ）β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、
    （ｂ）請求項６に記載のポリペプチド、
    （ｃ）請求項７に記載のペプチド、
    （ｄ）請求項８に記載のポリヌクレオチド、
    （ｅ）請求項９に記載のベクター、
    （ｆ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体、
    （ｇ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド、および
    （ｈ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター
    からなる群から選択される材料の組成物の存在下で行われる、方法。
  15. 前記樹状細胞前駆体集団が単球集団である、請求項１４に定義される方法。
  16. 請求項１４または１５に記載の方法により得られる、寛容原性樹状細胞。
  17. ａ）ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８３−、ＣＤ８６−、ＣＤ１ａ−、ＣＣＲ７−、ＩＤＯ−および／またはＢＩＣ−１−である、寛容原性樹状細胞、および
    ｂ）ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８３−、ＣＤ８６−、ＣＤ１ａ−、ＣＤ４０−、ＣＣＲ７−、ＩＤＯ−、ＢＩＣ−１−および／またはＳＯＤ２−である、寛容原性樹状細胞
    から選択される、寛容原性樹状細胞。
  18. 少なくとも８０％の、請求項１６または１７に記載の寛容原性樹状細胞を含んでなる、細胞集団。
  19. 請求項１６もしくは１７に記載の寛容原性樹状細胞、または請求項１８に記載の寛容原性樹状細胞集団を含んでなる、医薬組成物。
  20. 薬剤に使用するための、請求項１６もしくは１７に記載の寛容原性樹状細胞、 または請求項１８に記載の寛容原性樹状細胞集団。
  21. 免疫疾患の予防および／または治療に使用するための、請求項１６もしくは１７に記載の寛容原性樹状細胞、または請求項１８に記載の寛容原性樹状細胞集団。
  22. 免疫疾患が免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主病および過敏性疾患からなる群から選択される、請求項に記載の寛容原性樹状細胞、または請求項２１に記載の使用のための寛容原性樹状細胞集団。
  23. 寛容原性樹状細胞および／または制御性Ｔ細胞集団をそれを必要とする対象において増加させるための方法であって、前記対象に、
    （ｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体、
    （ｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチド、および
    （ｉｉｉ）Ｈ因子またはその機能的に等価な変異体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター
    の群から選択される材料の組成物を投与することを含んでなる、方法。
  24. 寛容原性樹状細胞および／または制御性Ｔ細胞集団をそれを必要とする対象において増加させるための方法であって、前記対象に、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームを投与することを含んでなる、方法。
  25. 前記Ｃ４ＢＰアイソフォームがα７β０およびα６β０からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 寛容原性樹状細胞および／または制御性Ｔ細胞集団をそれを必要とする対象において増加させるための方法であって、前記対象に、請求項６に定義されるポリペプチド、請求項７に定義されるペプチド、請求項８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９に記載のベクターを投与することを含んでなる、方法。
  27. 制御性Ｔ細胞集団をそれを必要とする対象において増加させるための方法であって、前記対象に、請求項１６もしくは１７に記載の寛容原性樹状細胞、または請求項１８に記載の寛容原性樹状細胞集団を投与することを含んでなる、方法。
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