JP2014504298A - 二価結合剤による翻訳後修飾されたポリペプチドの検出 - Google Patents

二価結合剤による翻訳後修飾されたポリペプチドの検出 Download PDF

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Abstract

本発明は、標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープに結合する第１一価結合剤、その標的ポリペプチド上の翻訳後ポリペプチド修飾に結合する第２一価結合剤およびリンカーからなる二価結合剤に関する。さらに、そのような二価結合剤の助けによる翻訳後修飾された標的ポリペプチドの検出のための方法、そのような二価結合剤を作製する方法および組織染色手順におけるそのような二価薬剤の使用を開示する。
【選択図】図２

Description

本発明は、標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープに結合する第１一価結合剤、その標的ポリペプチド上の翻訳後ポリペプチド修飾に結合する第２一価結合剤およびリンカーからなる二価結合剤に関する。さらに、そのような二価結合剤の助けによる翻訳後修飾された標的ポリペプチドの検出のための方法、そのような二価結合剤を作製する方法および組織染色手順におけるそのような二価薬剤の使用を開示する。
ポリペプチドの一次構造、すなわちその配列は、それをコードする核酸により決定される。しかし、ポリペプチドの一次構造を知ることは、その話の一部にすぎない。多くのポリペプチド−５０から９０％までに及ぶと推定される−は二次修飾を受ける。例えば二次修飾のタイプ、修飾されたポリペプチドの割合に、および／または例えば二次修飾の正確な位置／部位に依存して、同一の一次構造を有するポリペプチドが極めて異なる生物学的機能を有し得る。
二次タンパク質修飾は、それぞれのタンパク質の細胞機能を精密に調整する。翻訳後修飾および機能変化の間の関係を理解すること（“ポストトランスレートミクス（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｏｍｉｃｓ）”）は世界中で続いている莫大な努力であり、それはヒトゲノム計画に似ていなくもない。プロテオミクスは、分離技術および質量分析と組み合わせて、翻訳後修飾の個々の部分を細かく調べて特性付けし、系統的分析を提供することを可能にする。
数十年前、タンパク質はアミノ酸の線状ポリマーであると考えられていたが、そのようなポリペプチド鎖が単純なアミノ酸修飾により装飾される可能性があることが初めて明らかになった。しかし、最近１つのタンパク質中の非常に複雑な修飾が多くのプロセスで発見された。様々な化学修飾が単一のタンパク質中で観察されており、これらの修飾は単独または様々な組み合わせで、時間およびシグナル依存性の様式で起こる。タンパク質の翻訳後修飾はそれらの三次および四次構造を決定し、それらの活性および機能を制御する。“ポストトランスレートミクス”における進歩は、例えば生化学的経路の制御に、およびこれらのタンパク質に関わる疾患状態に関する二次修飾および生物学的機能の相互影響への多くの草分け的洞察をもたらしてきた。
しかし、二次修飾されたポリペプチドの検出および定量化は極めて複雑な道具および技法を必要とする。
翻訳後修飾されたポリペプチドを同定するために、しばしば様々なタイプの分離および場合により断片化技法が質量分析と組み合わせられる。
翻訳後修飾されたポリペプチドの免疫学的検出はかなり難しいことが一貫して判明してきた。様々なタイプの問題に直面する可能性がある。必要とされる免疫原を十分な純度および量で得ることが難しい可能性がある。標準的な免疫処置およびスクリーニング法に従って得られた抗体は、必要とされる特異性および／または親和性を有しない可能性がある。特に、高度に再現性のある、一貫した質の抗体、例えばモノクローナル抗体に関する必要性が存在する場合、そのような抗体を得ることは非常に厳しいことが判明する可能性がある。そのような抗体は、二次修飾およびそれを有するポリペプチドの一部からなるエピトープに強く結合しなければならないであろう。しかし、型にはまった手順により生成される多くの結合剤は同じ種類の翻訳後修飾を有する他のポリペプチドに対する交差反応を示し、認識されるエピトープに対する必要とされる親和性を示さず、および／または未修飾のポリペプチドに対する交差反応性を示す。
より大きなポリペプチドの多くは、１つのタイプの翻訳後修飾が起こるためのいくつかの部位を含んでさえいる。例えば、統計学的な様式で糖鎖付加されるいくつかのスレオニン残基が存在する可能性がある。そのようなポリペプチドの糖鎖付加状態を評価することは、翻訳後修飾を有する可能性のある位置のそれぞれに関する特異性を有するいくつかの異なる抗体を必要とする可能性がある。
現状技術の手順および結合剤に関する様々な可能性のある問題の上記の完全に網羅しているわけではない論考から、翻訳後修飾されたポリペプチドに高い親和性で結合し、再現性よく、事実上無制限の量および妥協のない質で生産することができる結合剤を提供する差し迫った必要性が存在することが明らかになる。
驚くべきことに、翻訳後修飾された標的ポリペプチドはリンカーを介して互いに連結された２個の一価結合剤からなる二価結合剤により検出することができることが分かっており、ここでその第１一価結合剤は前記の標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープに結合し、その第２一価結合剤は翻訳後ポリペプチド修飾に結合し、ここでそれぞれの一価結合剤は５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有する。
翻訳後ポリペプチド修飾は、ポリペプチドの特性および／または活性を調節および／または制御するために非常に重要である。標的ポリペプチド上の特定のタイプの二次修飾の検出における使用のための１つの好都合な方法は、特異的な結合剤によるものであろう。
本発明は、リンカーを介して互いに連結されている２個の一価結合剤からなる、翻訳後修飾された標的ポリペプチドに結合する二価結合剤に関し、ここでその第１一価結合剤は前記の標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープに結合し、ここでその第２一価結合剤は翻訳後ポリペプチド修飾に結合し、ここでそれぞれの一価結合剤は５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のｋｄｉｓｓを有し、ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のｋｄｉｓｓを有する。
翻訳後修飾された標的ポリペプチドに特異的に結合する二価結合剤を得るための方法も開示し、その方法は、前記の標的ポリペプチドの翻訳後修飾されていないエピトープに５×１０−３／秒〜１０−４／秒のｋｄｉｓｓで結合する第１一価結合剤を選択し、翻訳後ポリペプチド修飾に５×１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合する結合する第２一価結合剤を選択し、両方の一価結合剤をリンカーにより連結し、そして３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓ値を有する二価結合剤を選択する工程を含む。
新規の二価結合剤の、特に免疫組織化学的手順における使用も記述および特許請求する。
図１ 抗ｐＩＧＦ１−Ｒ二重結合剤の組み立ての効率を評価する分析的ゲル濾過実験。線図ａ、ｂおよびｃは、個々の二重結合剤構成要素（フルオレセイン−ｓｓＦａｂ’ １．４．１６８、Ｃｙ５−ｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびリンカーＤＮＡ（Ｔ＝０）；ｓｓＦａｂ’は一本鎖オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたＦａｂ’断片を意味する）の溶離プロフィールを示す。線図ｄは、二価結合剤を形成するのに必要な３種類の構成要素を１：１：１のモル比で混合した後の溶離プロフィールを示す。より太い（一番下の）曲線は、ｓｓＦａｂ’タンパク質またはリンカーＤＮＡそれぞれの存在を示す２８０ｎｍにおいて測定された吸光度を表す。ｂ）およびｄ）におけるより細い一番上の曲線（４９５ｎｍにおける吸光度）はフルオレセインの存在を示し、ａ）におけるより細い一番上の曲線およびｄ）における中央の曲線（６３５ｎｍにおける吸光度）は、Ｃｙ５の存在を示す。単一の二重結合剤の構成要素の溶離体積（ＶＥｓｓＦａｂ’ １．４．１６８ 約１５ｍｌ；ＶＥｓｓＦａｂ’ ８．１．２ 約１５ｍｌ；ＶＥリンカー 約１６ｍｌ）の反応混合物の溶離体積（ＶＥ混合物 約１２ｍｌ）との比較は、二重結合剤組み立て反応が成功であったことを示す（収率：約９０％）。溶離された二重結合剤に相当する主な２８０ｎｍのピークは、４９５ｎｍおよび６３５ｎｍのチャンネルにおける主なピークとうまく重なっており、二価結合剤に相当するピーク中にｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８の両方が存在することを証明している。 図２ 図２：Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）実験のスキーム。模式的および例示的に、溶液中の２種類の結合分子を示す：Ｔ０−Ｔ−Ｄｉｇ（リンカー１６）、二価結合剤およびＴ４０−Ｔ−Ｄｉｇ（リンカー１５）、二価結合剤。これら両方の二価結合剤はそれらのリンカーの長さにおいてのみ異なる（２個のハイブリダイズする核酸配列の間に追加のＴを有しない中心のジゴキシゲニン化された（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｙｌａｔｅｄ）Ｔ対４０個の追加のＴ（中心のＴ−Ｄｉｇのそれぞれの側に２０個）を有する中心のジゴキシゲニン化されたＴ）。さらに、ｓｓＦａｂ’断片８．１．２および１．４．１６８を用いた。 図３ １００ｎＭ二価結合剤（Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８からなる）の固定されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を、１００ｎＭ ｓｓＦａｂ’ １．４．１６８または１００ｎＭ ｓｓＦａｂ’ ８．１．２の同じペプチドに対する結合特性と比較して示す、３つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）。最も高い結合性能は二重結合剤コンストラクトを用いて得られ、これはその二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒに対する親和性を増大させることを明確に示している。 図４ Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８からなる二価結合剤の固定されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒ（リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒ）、ＩＧＦ−１ＲまたはｐＩＲ（リン酸化されたインスリン受容体）との相互作用を示す３つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。最も高い結合性能はｐＩＧＦ−１Ｒペプチドで得られ、これは二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒに対する特異性を例えばリン酸化されたインスリン受容体ペプチド（ｐＩＲ）と比較して増大させることを明確に示している。 図５ Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８からなる１００ｎＭ二価結合剤ならびにリンカーＤＮＡを有しない１００ｎＭ ｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８の混合物の相互作用を示す２つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｏｒｅ（商標）センサーグラム。最高の結合性能は二価結合剤を用いてのみ得られ、一方でリンカーを有しないｓｓＦａｂ’の混合物は、これらのｓｓＦａｂ’の合計濃度が２００ｎＭであったという事実にも関わらず、観察可能な協同的結合作用を示さない。 図６ Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）サンドイッチアッセイの概略図。このアッセイは、両方の抗体のリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドへのエピトープ接近可能性を調べるために用いられた。＜ＭＩｇＧＦｃｙ＞Ｒはマウス抗体Ｍ−１．４．１６８を捕捉するために用いられたウサギ抗マウス抗体を示す。次いでＭ−１．４．１６８を用いてｐＩＧＦ−１Ｒペプチドを捕捉する。Ｍ−８．１．２が最終的にＭ−１．４．１６８、ペプチドおよびＭ−８．１．２からなるサンドイッチを形成する。 図７ 二次抗体８．１．２のｐＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する、これがＢｉａｃｏｒｅ（商標）チップ上で抗体１．４．１６８により捕捉された後の結合シグナル（太線）を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。その他のシグナル（細い線）は対照シグナルである：一番上から一番下に向かって、それぞれ５００ｎＭの８．１．２、５００ｎＭの１．４．１６８；５００ｎＭの標的と無関係の抗体＜ＣＫＭＭ＞Ｍ−３３−ＩｇＧ；および５００ｎＭの標的と無関係の対照抗体＜ＴＳＨ＞Ｍ−１．２０−ＩｇＧの線を示す。これらの対照にいずれにおいても結合事象を検出することはできなかった。 図８ センサー表面上のビオチン化二重結合剤を示す、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイの概略図。フローセル１（＝ＦＣ１）（示していない）上で、アミノ−ＰＥＯ−ビオチンを捕捉させた。ＦＣ２、ＦＣ３およびＦＣ４上で、増大するリンカーの長さを有する二価結合剤を固定した（ＦＣ２上の二重結合剤（Ｔ０−ｂｉ＝１個の中央のＴ−Ｂｉのみ）およびＦＣ４上の二重結合剤（Ｔ４０−ｂｉ＝１個の中央のＴ−Ｂｉならびに上流および下流それぞれの２０個のＴ）をそれぞれ示す）。分析物１：そのペプチドの右側の末端においてＭ−１．４．１６８ ｓｓＦａｂ’エピトープを含有するＩＧＦ−１Ｒペプチド（一番上の線）−このペプチドはリン酸化されていないため、Ｍ−８．１．２ ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープは存在しない；分析物２：Ｍ−８．１．２ ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープ（Ｐ）およびＭ−１．４．１６８ ｓｓＦａｂ’エピトープを含有するｐＩＧＦ−１Ｒペプチド（２番目の線）；分析物３：交差反応するＭ−８．１．２ ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープを含有するがＭ−１．４．１６８ ｓｓＦａｂ’に関するエピトープは含有しない、ｐＩＲペプチド（３番目の線）。 図９ 二重結合剤実験の速度論データ。ｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８を有するＴ４０−Ｔ−Ｂｉリンカー二重結合剤（＝図中のＴ４０）は、ｐＩＧＦ−１Ｒに対して、ｐＩＲ（ｋｄ＝３．７０Ｅ−０２／ｓ）と比較した場合に１３００倍低い解離速度（ｋｄ＝２．７９Ｅ−０５／ｓ）を示す。 図１０ Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のｐＩＧＦ−１Ｒペプチド（リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ｐＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３０ｎＭ、１０ｎＭ、２×３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。 図１１ Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のＩＧＦ−１Ｒペプチド（リン酸化されていないＩＧＦ−１Ｒペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３００ｎＭ、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。 図１２ Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のｐＩＲペプチド（リン酸化されたインスリン受容体ペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ｐＩＲペプチドの濃度系列は、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。 図１３ （Ａ）ホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）３Ｔ３細胞のペレットの生成のために用いられた３Ｔ３細胞の溶解物を用いたウェスタンブロッティング実験。それぞれの溶解物の５μｇの総タンパク質に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを行った。検出は抗ホスホチロシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、クローン４Ｇ１０）を用いて行われた。アスタリスク（＊）またはアスタリスクの対（＊＊）は、リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒまたはリン酸化されたＩＲタンパク質に関するバンドの位置を示している。（Ｂ）ＦＦＰＥ ３Ｔ３細胞ペレットを用いたＩＨＣ実験の結果。８×Ｃ１８リンカー分子（実施例２．４のリンカー１４）およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８のみまたはｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３のみからなる検出分子は、試験したＦＦＰＥ ３Ｔ３細胞ペレットのいずれに対する染色ももたらさなかった（横列１および２）。対照的に、完全な二重結合剤分子（両方のｓｓＦａｂ’断片＋８×Ｃ１８リンカーからなる）を用いた検出は染色をもたらしたが、ＩＧＦ−１により刺激されたＩＧＦ−１Ｒ過剰発現細胞においてのみであった（横列３）。ＩＲを過剰発現する細胞に対する交差反応性は、ＩＲのリン酸化が誘導された場合でさえも観察されなかった。（Ｃ）異なるリンカーの長さ（リンカーは２×Ｃ１８、４×Ｃ１８、６×Ｃ１８または８×Ｃ１８スペーサーを含有していた；実施例２．４を参照）を有する抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤の、ＩＧＦ−１で刺激してＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を誘導しておいたＩＧＦ−１Ｒを過剰発現するＦＦＰＥ ３Ｔ３細胞に対する性能を比較するＩＨＣ実験。 図１４ Ｈ３２２Ｍ異種移植片切片の免疫染色。ｓｓＦａｂ’断片（ｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３または／およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８それぞれ）につき１０μｇ／ｍｌおよび等モル量の８×Ｃ１８リンカー分子を検出のために用いた。リンカー分子内のビオチン標識は、ストレプトアビジンに基づくＶｅｎｔａｎａ ｉＶＩＥＷ ＤＡＢ検出キットのための検出タグの役目を果たした。 図１５ センサー表面上のビオチン化された二重結合剤を示す、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイの概略図。ビオチン化された８×Ｃ１８リンカー分子を固定し、それをｓｓＦａｂ’ １．４．１６８および／またはｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３をそれぞれ捕捉するために用いた。分析物は、Ｍ−１．４．１６８ ｓｓＦａｂエピトープをペプチドの一方の末端に、Ｍ−３０．４．３３ ｓｓＦａｂホスホ−エピトープを他方の末端に含有するｐＩＧＦ−１Ｒペプチドであった。 図１６ 二重結合剤実験の速度論データを要約した表。ｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８の両方を含有する二重結合剤は、ｓｓＦａｂ’ １．４．１６８単独（ｋｄ＝３．２２Ｅ−０３／ｓ）よりも２３０倍低い解離速度（ｋｄ＝１．３９Ｅ−０５／ｓ）およびｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３単独（ｋｄ＝１．５７Ｅ−０３／ｓ）よりも１１０倍低い解離速度を示す。 図１７ ８×Ｃ１８リンカー分子およびｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３からなる一価結合剤のリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラム。そのアッセイの構成は図１５において示されている通りである。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の合成によるリン酸化されたｐＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３０ｎＭ、１０ｎＭ、２×３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応する速度論データが図１６において示されている。 図１８ ８×Ｃ１８リンカー分子およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８からなる一価結合剤のリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラム。そのアッセイの構成は図１５において示されている通りである。ｐＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３０ｎＭ、１０ｎＭ、２×３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応する速度論データが図１６において示されている。 図１９ ８×Ｃ１８リンカー分子、ｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８からなる二価結合剤のリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラム。そのアッセイの構成は図１５において示されている通りである。ｐＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３０ｎＭ、１０ｎＭ、２×３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応する速度論データが図１６において示されている。 図２０ （Ａ）ホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）２９３細胞のペレットの生成のために用いられたＨｅｋ２９３細胞の溶解物を用いたウェスタンブロッティング実験。それぞれの溶解物の５μｇの総タンパク質に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを行った。検出は抗ホスホチロシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、クローン４Ｇ１０）を用いて行われた。（Ｂ）Ｈｅｋ２９３細胞ペレットを用いたＩＨＣ実験の結果。４×Ｃ１８リンカー分子（実施例２．４のリンカー１２）およびｓｓＦａｂ’ ４．１．１５のみまたはｓｓＦａｂ’ ７．２．３２のみからなる検出分子は、試験したＦＦＰＥ Ｈｅｋ２９３細胞ペレットのいずれに対する染色ももたらさなかった（横列１および２）。対照的に、完全な二重結合剤分子（両方のｓｓＦａｂ’断片＋４×Ｃ１８リンカーからなる）を用いた検出は染色をもたらしたが、ＮＲＧ１−β１により刺激された野生型のＨＥＲ３を過剰発現する細胞においてのみであった（横列３；縦列２）。未刺激の細胞（横列３；縦列１）およびＮＲＧ１−β１で刺激された野生型ＨＥＲ３の代わりに変異型ＨＥＲ３（Ｙ＞Ｆ）（Ｔｙｒ１２８９リン酸化部位を欠いている）を過剰発現する細胞（横列３；縦列３）においてはそれぞれ染色は観察されなかった。
本発明は、翻訳後修飾された標的ポリペプチドに結合する二価結合剤に関し、その結合剤はリンカーを介して互いに連結されている２個の一価結合剤からなり、ここでａ）その第１一価結合剤は前記の標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープに結合し、ｂ）その第２一価結合剤は翻訳後ポリペプチド修飾に結合し、ｃ）それぞれの一価結合剤は５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、そしてｄ）ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有する。
本発明に従う二価結合剤は、正確に２個の異なる特異性の一価結合剤を含む結合剤である。
１態様において、それぞれの一価結合剤の、および二価結合剤の動態学的速度特性は、実施例において詳細に記述されるようなＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ技術により特性付けられる。
当業者は理解するであろうように、本発明において記述される二価結合剤は、望まれるように単離および精製することができる。１態様において、本発明は本明細書において開示されるような単離された二価結合剤に関する。“単離された”二価結合剤は、同定され、例えばそのような二価結合剤の合成において用いられる試薬混合物から分離および／または回収された二価結合剤である。そのような反応混合物の望まれない構成要素は、例えば最終的にその望まれる二価結合剤にならなかった一価結合剤である。１態様において、その二価結合剤は８０％より大きい純度まで精製される。一部の態様において、その二価結合剤はそれぞれ９０重量％、９５重量％、９８重量％または９９重量％より大きい純度まで精製される。両方の一価結合剤がポリペプチドである場合、純度は例えば還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質検出において例えばクーマシーブルーまたは銀染色を用いて容易に決定される。純度を核酸レベルで評価する場合、サイズ排除クロマトグラフィーを適用して二価結合剤を副産物から分離し、２６０ｎｍにおけるＤＯを監視してその純度を評価する。
冠詞“ａ”および“ａｎ”は、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語の１個を、または１個より多くを（すなわち少なくとも１個を）指して用いられる。例として、“抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は１個の抗体または１個より多くの抗体を意味する。
用語“オリゴヌクレオチド”または“核酸配列”は、本明細書で用いられる際、一般に短い、一般に一本鎖の、少なくとも８ヌクレオチドを、最大で約１０００ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも９、１０、１１、１２、１５、１８、２１、２４、２７または３０ヌクレオチドの長さを有するであろう。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５または３０ヌクレオチドより長くない長さを有するであろう。下記でポリヌクレオチドに関して示す記述は、オリゴヌクレオチドに等しく、かつ完全に適用可能である。
オリゴヌクレオチドという用語は広く理解されるべきであり、ＤＮＡおよびＲＮＡならびにそれらの類似体および修飾を含む。
オリゴヌクレオチドは、例えば標準的な塩基であるデオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシシトシン（ｄＣ）、デオキシチミジン（ｄＴ）、デオキシウラシル（ｄＵ）において置換基を有する置換されたヌクレオチドを含有していてよい。そのような置換された核酸塩基の例は次のものである：５−置換ピリミジン類、例えば５メチルｄＣ、アミノアリルｄＵまたはｄＣ、５−（アミノエチル−３−アクリルイミド）−ｄＵ、５−プロピニル−ｄＵまたはｄＣ、５ハロゲン化−ｄＵまたはｄＣ；Ｎ置換ピリミジン類、例えばＮ４−エチル−ｄＣ；Ｎ置換プリン類、例えばＮ６−エチル−ｄＡ、Ｎ２−エチル−ｄＧ；８置換プリン類、例えば８−［６−アミノ）−ヘキサ−１−イル］−８−アミノ−ｄＧまたはｄＡ、８ハロゲン化ｄＡまたはｄＧ、８−アルキルｄＧまたはｄＡ；および２置換ｄＡ、例えば２アミノｄＡ。
オリゴヌクレオチドはヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体を含有していてよい。すなわち、天然存在核酸塩基を以下のような核酸塩基類似体を用いることにより交換することができる：５−ニトロインドール ｄ リボシド；３ニトロピロール ｄ リボシド、デオキシイノシン（ｄＩ）、デオキシキサントシン（ｄｅｏｙｘａｎｔｈｏｓｉｎｅ）（ｄＸ）；７デアザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩまたは−ｄＸ；７−デアザ−８−アザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩまたは−ｄＸ；８−アザ−ｄＡ、−ｄＧ、−ｄＩまたは−ｄＸ；ｄホルマイシン；プソイドｄＵ；プソイドイソｄＣ；４チオｄＴ；６チオｄＧ；２チオｄＴ；イソｄＧ；５−メチル−イソ−ｄＣ；Ｎ８−結合型８−アザ−７−デアザ−ｄＡ；５，６−ジヒドロ−５−アザ−ｄＣ；およびエテノ−ｄＡまたはピロロ−ｄＣ（ｐｙｒｏｌｌｏ−ｄＣ）。当業者には明らかであるように、相補鎖中の核酸塩基は二本鎖形成が特異的であるような様式で選択されなければならない。例えば、５−メチル−イソ−ｄＣが一方の鎖（例えば（ａ））において用いられるならば、イソｄＧがその相補鎖（例えば（ａ’））中になければならない。
そのオリゴヌクレオチド主鎖は、置換された糖残基、糖類似体、ヌクレオシド間ホスフェート部分における改変を含有するように改変されてよく、および／またはＰＮＡであってよい。
オリゴヌクレオチドは、例えば２’−メトキシ、２’−フルオロ、２’−メチルセレノ、２’−アリルオキシ、４’−メチルｄＮ（ここでＮは核酸塩基、例えばＡ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵである）のような置換されたデオキシリボースを有するヌクレオチドを含有していてよい。
糖類似体は、例えばキシロース；（２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン）−（ＬＮＡとして知られるオリゴマー）または（２’−Ｏ，４’−Ｃエチレン）−（ＥＮＡとして知られるオリゴマー）のような２’，４’架橋リボース；Ｌ−リボース、Ｌ−ｄ−リボース、ヘキシトール（ＨＮＡとして知られるオリゴマー）；シクロヘキセニル（ＣｅＮＡとして知られるオリゴマー）；アルトリトール（ＡＮＡとして知られるオリゴマー）；Ｃ３’およびＣ５’原子がエチレン架橋により連結されており、それが縮合してシクロプロパン環になっている三環式リボース類似体（トリシクロＤＮＡとして知られるオリゴマー）；グリセリン（ＧＮＡとして知られるオリゴマー）；グルコピラノース（ホモＤＮＡ（Ｈｏｍｏ ＤＮＡ）として知られるオリゴマー）；カルバリボース（ｃａｒｂａｒｉｂｏｓｅ）（テトラヒドロフラン小単位の代わりにシクロペンタンを有する）；ヒドロキシメチル−モルホリン（モルホリノＤＮＡとして知られるオリゴマー）である。
多数のヌクレオシド間ホスフェート部分の改変もハイブリダイゼーション特性に干渉しないことが分かっており、そのような主鎖の改変は置換されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と組み合わせることもできる。例はホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートおよびメチルホスホネートオリゴヌクレオチドである。
ＰＮＡ（ホスフェートおよびｄ−リボースなしの主鎖を有する）もＤＮＡ類似体として用いることができる。
上記で言及した修飾されたヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ならびにオリゴヌクレオチド主鎖の改変は、本発明の意味でのオリゴヌクレオチド中で望まれるように組み合わせることができる。
用語“ポリペプチド”および“タンパク質”は互換的に用いられる。本発明の意味でのポリペプチドは、アルファアミノペプチド結合により連結された少なくとも５個のアミノ酸からなる。
“標的ポリペプチド”は、それに関して決定または測定のための方法が求められている対象のポリペプチドである。本発明の標的ポリペプチドは、翻訳後ポリペプチド修飾を有することが既知である、または疑われるポリペプチドである。
本発明に従う“一価結合剤”は、標的ポリペプチドと単一の結合部位において５×１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで相互作用する分子である。動態学的結合速度特性の生物物理学的特性付け、それぞれラングミュアモデルに従う解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）の決定は、好ましくはバイオセンサーに基づく表面プラズモン共鳴分光法により分析される。好ましくは、実施例の節において詳細に記述されるようなＢｉａｃｏｒｅ（商標）技術が用いられる。
一価結合剤の例は、ペプチド、ペプチド模倣物、アプタマー、ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ、ｄａｒｐｉｎ、レクチン、アンキリンリピートタンパク質、Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン、単一ドメイン抗体（Hey, T. et al., Trends Biotechnol 23 (2005) 514-522参照）および抗体の一価断片である。
特定の好ましい態様において、その一価結合剤は一価抗体断片、好ましくはモノクローナル抗体に由来する一価断片である。
一価抗体断片には下記で提供するようなＦａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ（Ｆａｂ’）、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片が含まれるが、それらに限定されない。
好ましい態様において、その一価結合剤のすくなくとも一方は、単一ドメイン抗体、モノクローナル抗体のＦａｂ断片またはＦａｂ’断片である。
本明細書で開示される二価結合剤においてその一価結合剤の両方がモノクローナル抗体に由来し、Ｆａｂ断片である、またはＦａｂ’断片である、またはＦａｂ断片およびＦａｂ’断片であることも、好ましい態様である。
モノクローナル抗体の技法は、特異的なモノクローナル抗体またはその断片の形態の極めて特異的な結合剤の製造を可能にする。当技術で特に周知であるのは、マウス、ウサギ、ハムスター、またはあらゆる他の哺乳類を目的のポリペプチドで免疫することによりモノクローナル抗体またはその断片を作り出すための技法である。モノクローナル抗体またはその断片を作り出す別の方法は、ｓＦｖ（単鎖可変領域）、特にヒトのｓＦｖのファージライブラリーの使用である（例えば、Griffiths et al.，米国特許第5,885,793号；McCafferty et al.，国際公開第92/01047号；Liming et al.，国際公開第99/06587号を参照）。
抗体断片は伝統的な手段、例えば酵素消化により、または組み換え技法により生成されてよい。特定の抗体断片の総説に関して、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照。
Ｆｖは完全な抗原結合部位を含有する最小限の抗体断片であり、定常領域を欠いている。１態様において、２鎖Ｆｖ種は堅固に非共有結合的に会合した１個の重鎖可変ドメインおよび１個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種の１態様において、１個の重鎖可変ドメインおよび１個の軽鎖可変ドメインが、その軽鎖および重鎖が２鎖Ｆｖ種における二量体構造に類似した二量体構造で会合することができるように、柔軟なペプチドリンカーにより共有結合的に連結されていることができる。ｓｃＦｖの総説に関して、例えばPlueckthun, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (編者), Springer-Verlag, ニューヨーク(1994), pp. 269-315を参照；国際公開第93/16185号ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号も参照。一般に、６個の超可変領域（ＨＶＲ）が抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変領域（または抗原に特異的な３個のＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも抗原を認識して結合する能力を有する。
Ｆａｂ断片は重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１個以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における少数の残基の追加によりＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、その定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離のチオール基を有するＦａｂ’に関する本明細書における名称である。
抗体断片の生成のために様々な技法が開発されてきた。伝統的に、抗体断片は完全な抗体のタンパク質分解による消化により得られた(例えばMorimoto, K. et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24 (1992) 107-117;およびBrennan et al., Science 229 (1985) 81-83を参照)。例えば、抗体のパパイン消化は、“Ｆａｂ”断片と呼ばれそれぞれが単一の抗原結合部位を有する２個の同一の抗原結合断片および残りの“Ｆｃ”断片を生成し、その名前は容易に結晶化するその能力を反映している。
抗体断片は組み換え宿主細胞により直接生成することもできる。Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ抗体断片は全て大腸菌中で発現させてそれから分泌させることができ、従ってこれらの断片の容易な大量生産が可能である。抗体断片は、標準的な手順に従って抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができる(Carter, P. et al., Bio/Technology 10 (1992) 163-167)。哺乳類細胞系も、抗体断片を発現させる、そして望まれるならば分泌させるために用いることができる。
特定の態様において、本発明の一価結合剤は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む単一のポリペプチド鎖である。特定の態様において、単一ドメイン抗体はヒトの単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば米国特許第6,248,516 B1号を参照）。１態様において、単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部からなる。
２個の一価結合剤の１つである第１一価結合剤は、その標的ポリペプチド上のポリペプチドエピトープに結合する。
本発明に従う“ポリペプチドエピトープ”−対応する一価結合剤により結合される標的ポリペプチド上の結合部位−は、アミノ酸からなる。この結合剤は線状エピトープ、すなわち一続きの５〜１２個の連続したアミノ酸からなるエピトープに結合するか、またはその一価結合剤はその標的ポリペプチドのいくつかの短い一続きの空間的配置により形成される三次構造に結合するかのどちらかである。結合剤により、例えば抗体の抗原認識部位またはパラトープにより認識される三次エピトープは、抗原分子の三次元表面特徴であると考えることができ；これらの特徴はその結合剤の対応する結合部位（中）に正確に納まり、それにより結合剤および標的ポリペプチドの間の結合が促進される。
本明細書で開示されるような二価結合剤において、第１一価結合剤はポリペプチドエピトープに結合する一方で、第２一価結合剤は翻訳後ポリペプチド修飾に結合する。
“翻訳後ポリペプチド修飾”は、ポリペプチド（タンパク質）内の、またはその末端のアミノ酸の共有結合性修飾である。二次修飾および翻訳後修飾という用語は互換的である。
多くのタイプの共有結合性アミノ酸修飾が既知であり、科学的総説の対象となってきた。MannおよびJensenによる総説(2003)ならびにSeoおよびLeeによる総説(2004)において記述されている翻訳後修飾を本明細書に援用する(Mann, M. and Jensen, O.N., Nat. Biotechnol. 21 (2003) 255-261; Seo, J. and Lee, K.-J., Biochem. Mol. Biol. 37/1 (2004) 35-44)。
好ましい態様において、翻訳後修飾はアセチル化、リン酸化、アシル化、メチル化、糖鎖付加、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、硫酸化およびニトロ化からなる群から選択される。
アセチル化（＋４２Ｄａ）はかなり安定な二次修飾である。例は、多くのタンパク質のＮ末端上に見られるアセチル化またはリシンもしくはセリン残基上のアセチル化である。通常、リシン残基のアセチル化はポリペプチド鎖内の１個以上の正確に定められた位置（単数または複数）において見られ、一方で他のリシン残基はより低い頻度でアセチル化されるか、または全くアセチル化されない。
タンパク質のリン酸化および脱リン酸化（その正味の釣り合いはリン酸化状態と呼ばれ得る）はタンパク質の生物学的活性の制御における重要な要素の１つであることが知られている。低い割合のリン酸化されたアミノ酸残基は、既に特定の生物学的活性を誘発するのに十分である可能性がある。リン酸化は結果として８０Ｄａの質量の増大をもたらす。アミノ酸チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびアスパラギン酸（Ｄ）がリン酸化され得る。ポリペプチドの生物学的機能がより複雑であるほど、対応するリン酸化の可能性のある部位のパターンもより複雑である。これは膜結合型受容体、特にいわゆる受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に関して特に知られており、当てはまる。名称が既に示唆しているように、そのＲＴＫの細胞内シグナル伝達の少なくとも一部はそのようなＲＴＫの細胞内ドメインの特定のチロシンのリン酸化状態により媒介される。
ポリペプチドは、ファルネシル、ミリストイルまたはパルミトイル基によりアシル化され得る。アシル化は通常システイン残基の側鎖上で起こる。
二次修飾としてのメチル化はリシン残基の側鎖により起こる。核酸に結合することができる制御タンパク質の結合特性が例えばメチル化により調節され得ることが示されている。
糖鎖付加は非常に重要な二次修飾である。それはタンパク質間相互作用、タンパク質の可溶化、それらの安定性等に大きな影響を有する。２つの異なるタイプの糖鎖付加が既知である：（アミノ酸Ｎ（アスパラギン）を介した）Ｎ結合型側鎖および（セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）を介した）Ｏ結合型側鎖。（線状の、または分枝した側鎖を有する）多くの異なる多糖類が同定されており、一部はＯ−Ｇｌｃ−ＮＡｃのような糖誘導体を含有する。
ユビキチン化およびＳＵＭＯ化はそれぞれ循環中におけるタンパク質の半減期に影響を及ぼすことが知られている。ユビキチン化は破壊シグナルの役目を果たし、結果としてユビキチン化されたポリペプチドの切断および／または除去をもたらす。
チロシン残基（Ｙ）を介した硫酸化は、タンパク質間（細胞間）相互作用ならびにタンパク質リガンド相互作用の調節において重要であるようである。
チロシン残基（Ｙ）のニトロ化は、例えば炎症プロセスにおけるような酸化的損傷の顕著な特徴であるようである。
第２一価結合剤により結合される翻訳後修飾は、好ましくはリン酸化、糖鎖付加およびアセチル化からなる群から選択される。
上記で言及したように、リン酸化、脱リン酸化およびリン酸化状態は、細胞シグナル伝達およびタンパク質活性の制御に対する鍵である。これは膜結合型受容体、特にいわゆる受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に関して特に知られており、当てはまる。名称が既に示唆しているように、そのＲＴＫの細胞内シグナル伝達の少なくとも一部はそのようなＲＴＫの細胞内ドメインの特定のチロシンのリン酸化状態により媒介される。従って、１つの好ましい態様において、本発明はリン酸化された標的タンパク質に結合する二価結合剤に関する。明らかに、そのような二価結合剤はリン酸化された標的ポリペプチドの検出において非常に有用である。
１つの好ましい態様において、本発明は本明細書において上記で開示したような二価結合剤に関し、ここでその標的ポリペプチドは、細胞内リン酸化部位を有する膜結合型受容体分子および細胞内細胞シグナル伝達分子からなる群から選択される。そのような二価結合剤において、標的タンパク質上のポリペプチドエピトープに結合する第１一価結合剤は前記の受容体分子または前記の細胞内細胞シグナル伝達分子に特異的に結合すると考えられるが、リン酸化を標的とする第２一価結合剤は前記の標的タンパク質上のリン酸化部位に特異的に結合する必要はない。例えば関連する受容体上のリン酸化部位との交差反応性は、著しい結合は第１一価結合剤の結合および第２一価結合剤の結合の両方を必要とするため、その標的ポリペプチドの特異的検出を損なわないであろう。
一部の態様において、そのＲＴＫは以下のものからなる群から選択される：ＡＬＫ、接着関連キナーゼ受容体（例えばＡｘｌ）、ＥＲＢＢ受容体（例えばＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４）、エリスロポエチン産生肝細胞性（ＥＰＨ）受容体（例えばＥｐｈＡ１；ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ５、ＥｐｈＢ６）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体（例えばＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ５）、Ｆｇｒ、ＩＧＦＩＲ、インスリンＲ、ＬＴＫ、Ｍ−ＣＳＦＲ、ＭＵＳＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体（例えばＰＤＧＦＲ−Ａ、ＰＤＧＦＲ−Ｂ）、ＲＥＴ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＯＳ、ＲＹＫ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体（例えばＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１、ＶＥＧＦ３）、免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ（ＴＩＥ）の受容体（例えばＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２／ＴＥＫ）、Ｔｅｃ、ＴＹＲＯ１０、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体（例えばＩＮＳ−Ｒ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＲ−Ｒ）、ジスコイジンドメイン（ＤＤ）受容体（例えばＤＤＲ１、ＤＤＲ２）、ｃ−Ｍｅｔに関する受容体（ＭＥＴ）、マクロファージ刺激１受容体（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）としても知られているｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ（ＲＯＮ）、Ｆｌｔ３ ｆｉｎｓ関連チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ３）、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）受容体、ｃ−ｋｉｔに関する受容体（ＫＩＴ、ＳＣＦＲ）およびインスリン受容体関連（ＩＲＲ）受容体。
一部の態様において、その細胞内細胞シグナル伝達分子は以下のものからなる群から選択される：ＡＫＴ、ａｂｌ、ｃｂｌ、ｅｒｂＡ、ＥＲＫ、ｆｅｓ、ｆｇｒ、ｆｍｓ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ｍｅｔ、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ＰＩ３Ｋ、ｒａｆ、ｒｅｔ、ｒｙｋ、およびｓｒｃ。１つの好ましい態様において、本発明は、リンカーを介して互いに連結されている２個の一価結合剤からなる、翻訳後修飾された標的ポリペプチドに結合する二価結合剤に関し、ここでａ）その第１一価結合剤は前記の標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープに結合し、ｂ）その第２一価結合剤は翻訳後ポリペプチド修飾に結合し、ｃ）それぞれの一価結合剤は５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、ｄ）ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のｋｄｉｓｓを有し、ここでその翻訳後修飾はリン酸化、ユビキチン化および糖鎖付加からなる群から選択される。
好ましい態様において、それぞれの一価結合剤の、および二価結合剤の動態学的速度特性は、実施例において詳細に記述されるようなＢｉａｃｏｒｅ ＳＰＲ技術により特性付けられる。
１つの好ましい態様において、本発明に従う二価結合剤は翻訳後修飾を有する標的ポリペプチドに結合すると考えられ、ここでその翻訳後修飾はリン酸化である。
論じられたように、本明細書で開示されるような二価結合剤の構築における使用のための一価結合剤は、５×１０−３／秒から１０−４／秒までのＫｄｉｓｓを有していなければならない。
好ましくは、その第１一価結合剤はポリペプチドエピトープに特異的に結合する。すなわち、この結合剤は二次修飾を受けにくいエピトープに結合するか、またはその代わりにそれはネイティブな（ｎａｔｉｖｅ）（二次修飾されていない）エピトープに特異的に結合するかのどちらかである。ポリペプチドエピトープへの特異的な結合は、前記の結合剤が翻訳後修飾されていないポリペプチドに関して翻訳後修飾を有する同じポリペプチドと比較して少なくとも２０倍低いＫｄｉｓｓを有する場合に認められる。その第１一価結合剤の未修飾のポリペプチドに対するＫｄｉｓｓがその第１一価結合剤により結合されるポリペプチドエピトープ中に翻訳後修飾を有する同じポリペプチドと比較して少なくとも３０、４０、５０、８０、９０、９５または少なくとも１００倍高いことも好ましい。
好ましくは、その第２一価結合剤は翻訳後ポリペプチド修飾に特異的に結合し、すなわち前記の結合剤はこの翻訳後修飾を有するポリペプチドに関して同じ翻訳後修飾されていないポリペプチドと比較して少なくとも２０倍低いＫｄｉｓｓを有する。第２一価結合剤の翻訳後修飾を有するポリペプチドに対するＫｄｉｓｓが同じ未修飾のポリペプチドと比較して少なくとも３０、４０、５０、８０、９０、９５または少なくとも１００倍低いことも好ましい。
上記で言及したように、本発明に従う二価結合剤は最大で３×１０−５／秒の、またはより低い、すなわちより良いＫｄｉｓｓを有するであろう。
この発明に従う二価結合剤における１態様において、それぞれの一価結合剤は２×１０−３／秒から１０−４／秒までのＫｄｉｓｓを有する。
この発明に従う二価結合剤における１態様において、それぞれの一価結合剤は１０−３／秒から１０−４／秒までのＫｄｉｓｓを有する。
Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（ツーソン）が流通させている自動免疫組織化学染色機械は、かなりストリンジェントな洗浄条件を用いる。ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）分析器シリーズにおいて用いられる抗体は、適当な染色強度を与えるために最大で５×１０−５／秒のＫｄｉｓｓを有するべきである。Ｋｄｉｓｓがより良いほど、染色強度もより良いであろう。本明細書で開示するような二価結合剤は、最大で３×１０−５／秒のＫｄｉｓｓを有する。さらなる態様において、本明細書で開示するような二価結合剤は２×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有し、または１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓも好ましい。
１態様において、それぞれの一価結合剤の、およびその二価結合剤の動態学的速度特性は、実施例において詳細に記述されるようなＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ技術により特性付けられる。
本発明に従う二価結合剤はリンカーを含有する。そのリンカーがその２個の一価結合剤を共有結合的に連結することもでき、またはそのリンカーおよびその一価結合剤が２個の異なる特異的な結合対ａ：ａ’およびｂ：ｂ’により結合していることもできる。
そのリンカーは、例えば一緒に、およびその２個の一価結合剤に共有結合により連結された適切な単量体で構成されていてよい。好ましくは、そのリンカーは糖部分、ヌクレオチド部分、ヌクレオシド部分および／またはアミノ酸を含有するであろう。特定の好ましい態様において、そのリンカーは本質的にヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはアミノ酸からなるであろう。
好ましくは、その２個の一価結合剤を結合対により共有結合的に連結している、または結合させているリンカーは、６〜１００ｎｍの長さを有する。そのリンカーが６〜５０ｎｍの、または６〜４０ｎｍの長さを有することも好ましい。やはり好ましい態様において、そのリンカーは１０ｎｍ以上の、または１５ｎｍ以上の長さを有するであろう。１態様において、本発明に従う二価結合剤中に含まれるリンカーは１０ｎｍ〜５０ｎｍの長さを有する。
理論上の、および複合的な方法による、所与のリンカー（ａ−Ｓ−ｂ）の非ヌクレオシド構成要素の長さは、その非ヌクレオシド構成要素に化学的に類似した化合物の既知の結合距離および結合角を用いることにより計算することができる。そのような結合距離は、標準的な教本：CRC Handbook of Chemistry and Physics, 第９１版, 2010-2011, 第９節においていくつかの分子に関して要約されている。しかし、正確な結合距離はそれぞれの化合物に関して異なる。その結合角においても変動性が存在する。
従って、そのような計算において平均のパラメーター（分かりやすい近似値）を用いることがより実際的である。
スペーサーまたはリンカーの長さの計算において、以下の近似値が適用される：ａ）非ヌクレオシド構成要素の長さの計算に関して、連結された原子の性質とは無関係に、１８０°の結合角を伴う１３０ｐｍの平均結合長が用いられ；ｂ）一本鎖中の１個のヌクレオチドは５００ｐｍで計算され、そしてｃ）二本鎖中の１個のヌクレオチドは３３０ｐｍで計算される。
１３０ｐｍの値は、２個のＣ（ｓｐ３）の間の結合角が１０９°２８’および距離が１５３ｐｍであるＣ（ｓｐ３）−Ｃ（ｓｐ３）−Ｃ（ｓｐ３）鎖の２個の末端の炭素原子の距離がおおよそ２５０ｐｍであり、それは１８０°の仮定された結合角および１２５ｐｍの２個のＣ（Ｓｐ３）の間の結合距離に換算されるという計算に基づく。ＰおよびＳのような複素原子ならびにｓｐ２およびｓｐ１のＣ原子もそのスペーサーの一部であり得ることを考慮して、１３０ｐｍの値が採用される。スペーサーがシクロアルキルまたはアリールのような環構造を含む場合、その距離は類似の方法で、その距離を定めている原子鎖全体の一部である前記の環構造の結合の数を数えることにより計算される。
上記で言及したように、そのリンカーがその２個の一価結合剤を共有結合的に連結することもでき、またはそのリンカーおよびその一価結合剤が２個の異なる特異的な結合対ａ：ａ’およびｂ：ｂ’により結合していることもできる。従って、翻訳後修飾された標的ポリペプチドに結合する本発明に従う二価結合剤は、下記の式Ｉにより表すこともでき：
Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂ、
ここでＡは前記の標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープに結合する第１一価結合剤であり、ここでＢは翻訳後ポリペプチド修飾に結合する第２一価結合剤であり、ここでそれぞれの一価結合剤ＡおよびＢは５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、ここでａ’：ａならびにｂ：ｂ’は独立して結合対であり、またはａ’：ａおよび／またはｂ：ｂ’は共有結合しており、ここでａ’：ａおよびｂ：ｂ’は異なり、ここでＳはスペーサーであり、ここで−は共有結合を表し、ここでそのリンカーａ−Ｓ−ｂは６〜１００ｎｍの長さを有し、ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有する。
ａ−Ｓ−ｂからなるリンカーＬは、６〜１００ｎｍの長さを有する。好ましくは、ａ−Ｓ−ｂからなるリンカーＬは６〜８０ｎｍの長さを有する。そのリンカーが６〜５０ｎｍの、または６〜４０ｎｍの長さを有することも好ましい。やはり好ましい態様において、そのリンカーは１０ｎｍ以上の長さを、または１５ｎｍ以上の長さを有するであろう。１態様において、そのリンカーは１０ｎｍ〜５０ｎｍの長さを有する。１態様において、ａおよびｂはそれぞれ結合対のメンバーであり、それぞれ少なくとも２．５ｎｍの長さを有する。
スペーサーＳは、例えば望まれる長さを、ならびに他の望まれる特性を提供するために必要であると解釈することができる。そのスペーサーは、例えば完全または部分的に天然存在または非天然存在アミノ酸で、ホスフェート−糖単位、例えば核酸塩基なしのＤＮＡ様主鎖で、グリコペプチド性（ｇｌｙｃｏ−ｐｅｐｔｉｄｉｃ）構造で、または少なくとも部分的に糖単位で、または少なくとも部分的にグリコール類もしくはアクリルアミドのような重合可能な小単位で構成されていることができる。
本発明に従う化合物中のスペーサーＳの長さは、望まれるように異なっていてよい。多様な長さの利用可能なスペーサー（ライブラリー）を容易に作製するために、そのようなライブラリーのスペーサーへの簡単な合成経路（ａｃｃｅｓｓ）を有することが好ましい。スペーサーの組み合わせ固相合成が好ましい。スペーサーは約１００ｎｍの長さまで合成されなければならないため、その合成戦略は、その単量体合成構築ブロックが固相合成の間に高い効率で組み立てられるような方法で選択される。単量体構築ブロックとしてのホスホラミダイトの組み立てに基づくデオキシオリゴヌクレオチドの合成は、完全にこの要求を満たす。そのようなスペーサー中で、スペーサー内の単量体単位は、それぞれの場合においてホスフェートまたはホスフェート類似体部分により連結されている。
そのスペーサーＳは、多官能性アミノカルボン酸の遊離の正または／および負に荷電した基、例えばアミノ、カルボキシレートまたはホスフェートを含有することができる。例えば、その電荷担体は、ａ）１個のアミノ基および２個のカルボキシレート基またはｂ）２個のアミノ基および１個のカルボキシレート基を含有する三官能性アミノカルボン酸に由来することができる。そのような三官能性アミノカルボン酸の例は、リシン、オルニチン、ヒドロキシリシン、α，β−ジアミノプロピオン酸、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸、カルボキシグルタミン酸ならびにEP-A-0 618 192またはUS-A-5,519,142において記述されている合成三官能性カルボン酸のような合成三官能性カルボン酸である。あるいは、その三官能性アミノカルボン酸ａ）中のカルボキシレート基の１つをホスフェート、スルホネートまたはサルフェート基により置き換えることができる。そのような三官能性アミノ酸の例はホスホセリンである。
そのスペーサーＳは、無電荷の親水基も含有することができる。無電荷の親水基の好ましい例は、エチレンオキシドまたは好ましくは少なくとも３個のエチレンオキシド単位を有するポリエチレンオキシド基、スルホキシド、スルホン、カルボン酸アミド、カルボン酸エステル、ホスホン酸アミド、ホスホン酸エステル、リン酸アミド、リン酸エステル、スルホン酸アミド、スルホン酸エステル、硫酸アミドおよび硫酸エステル基である。そのアミド基は、好ましくは第１級アミド基、特に好ましくはアミノ酸（例えばアミノ酸アスパラギンおよびグルタミン）側鎖基中のカルボン酸アミド残基である。そのエステルは好ましくは親水性アルコール類、特にＣ１〜Ｃ３アルコール類またはジオール類またはトリオール類に由来する。
１態様において、そのスペーサーＳは１タイプの単量体からなる。例えば、そのスペーサーは排他的にアミノ酸、糖残基、ジオール類、リン糖酸（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｕｇａｒ）単位からなり、またはそれはそれぞれ核酸であることができる。
１態様において、そのスペーサーはＤＮＡである。１つの好ましい態様において、そのスペーサーは、ベータ−Ｌ−ＤＮＡ、Ｌ−ＤＮＡまたは鏡像ＤＮＡとしても知られているＤＮＡのＬ−立体異性体である。Ｌ−ＤＮＡは、２本のＬ−ＤＮＡの相補的な一本鎖の間でのみ二本鎖が形成され、Ｌ−ＤＮＡの一本鎖および相補的なＤＮＡ鎖の間では二本鎖が形成されないことを意味する直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ハイブリダイゼーション挙動、ヌクレアーゼ耐性、ならびに長いスペーサーでさえも合成が容易であることのような利点を特徴とする。指摘したように、合成の容易さおよびスペーサーの長さにおける変動可能性は、スペーサーライブラリーに関して重要である。変動可能な長さのスペーサーは、最適な長さのスペーサーを有する本発明に従う二価二重結合剤の同定、従って２個の一価結合剤の間の最適な距離の提供において極めて有用である。
スペーサー構築ブロックは、その名の通り、間隔を空ける部分をスペーサーＳの中に導入するために、またはリンカーａ−Ｓ−ｂのスペーサーＳを構築するために用いることができる。
異なる数および種類の非ヌクレオチド性ならびにヌクレオチド性スペーサー構築ブロックが、間隔を空ける部分を導入するためにすぐに利用できる。
多くの異なる非ヌクレオチド性二官能性スペーサー構築ブロックが文献において既知であり、多種多様なものが商業的に入手可能である。非ヌクレオチド性二官能性スペーサー構築の選択は、そのスペーサー分子の電荷および柔軟性に影響を及ぼす。
二官能性スペーサー構築ブロックにおいて、酸不安定性保護基で保護されたヒドロキシル基がホスホラミダイト基に連結されている。
１態様における二官能性スペーサー構築ブロックは、非ヌクレオシド性化合物である。例えば、そのようなスペーサーはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）炭素鎖であるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）鎖はそのリンカーの親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび／またはアミド部分または四級化された（ｑｕａｒｔｅｒｎｉｚｅｄ）陽イオン性アミン部分により遮られていてよい。場合により１または２個のＣ１〜Ｃ６アルキル基で置換されているＣ５〜Ｃ６−シクロアルキル、Ｃ４Ｎ、Ｃ５Ｎ、Ｃ４Ｏ、Ｃ５Ｏ−ヘテロシクロアルキル、フェニルのような環状部分も、非ヌクレオシド性二官能性スペーサー部分として用いることができる。好ましい二官能性構築ブロックは、Ｃ３〜Ｃ６アルキル部分およびトリ−〜ヘキサ−エチレングリコール鎖を含む。表Ｉは、異なる親水性、異なる剛性および異なる電荷を有するヌクレオチド性二官能性スペーサー構築ブロックのいくつかの例を示す。一方の酸素原子は酸不安定性保護基、好ましくはジメトキシトリチルに連結されており、他方はホスホラミダイトの一部である。
スペーサーＳを構築する、またはスペーサーＳ中に間隔を空ける部分を導入するための簡単な方法は、標準的なＤまたはＬヌクレオシドホスホラミダイト構築ブロックを用いることである。１態様において、一本鎖の一続きのｄＴが用いられる。ｄＴは塩基保護基を有しないため、これは好都合である。
二本鎖の長さは一本鎖と比較して低減し、二本鎖は一本鎖よりも堅いため、スペーサーの長さ（結合対のメンバーａおよびｂの間の距離）およびスペーサーの柔軟性を変化させるためにハイブリダイゼーションを用いることができる。
ハイブリダイゼーションに関して、１態様において、官能性部分Ｘで修飾されたオリゴヌクレオチドが用いられる。ハイブリダイゼーションのために用いられるオリゴヌクレオチドは、そのスペーサーとハイブリダイズしない１または２個の末端の延長部分を有することができ、および／またはそれは内部で分枝している。そのようなスペーサーとハイブリダイズしない（かつ結合対ａ：ａ’およびｂ：ｂ’に干渉しない）末端の延長部分は、さらなるハイブリダイゼーション事象のために用いることができる。１態様において、末端の延長部分とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは標識されたオリゴヌクレオチドである。この標識されたオリゴヌクレオチドも、さらなるハイブリダイゼーションを可能にするための末端の延長部分を含んでいてよく、または分枝していてよく、それによりポリヌクレオチドの凝集体またはデンドリマーを得ることができる。多数の標識（ｐｏｌｙｌａｂｅｌ）をもたらすために、またはＸの高い局所的濃度を得るために、好ましくはポリオリゴ核酸デンドリマーが用いられる。
１態様において、スペーサーＳは１〜１００ｎｍの主鎖の長さを有する。言い換えると、ここで式Ｉの基ａおよびｂは１〜１００ｎｍ離れている。１態様において、ａおよびｂはそれぞれ結合対のメンバーであり、そのスペーサーＳは１〜９５ｎｍの主鎖の長さを有する。
“ａ’：ａ”ならびに“ｂ：ｂ’”はそれぞれ独立して結合対を表し、またはそれぞれ共有結合したａ’：ａおよび／またはｂ：ｂ’を表す。
“ａ’：ａ”ならびに“ｂ：ｂ’”は異なる。異なるという用語は、ａ対ａ’の結合（結合対内結合または共有結合性カップリング）が他方の対ｂ対ｂ’の結合対内結合または共有結合性カップリングに干渉せず、逆もまた同じであることを示す。
１態様において、ａ’：ａまたはｂ：ｂ’のどちらかは共有結合しており、他方、すなわちそれぞれｂ：ｂ’またはａ’：ａは結合対を表す。
１態様において、ａ’：ａおよびｂ：ｂ’の両方が共有結合している。
ａ’：ａおよびｂ：ｂ’の間のカップリング化学は互いに異なっており、標準的なプロトコルから選択される。結合パートナーの、およびスペーサーの性質に応じて、適切なコンジュゲーション化学が選択される。
（ａ’）の（ａ）へのカップリングにおいて、すなわちＡ−（ａ’）の（ａ）を含むリンカーへのカップリングにおいて用いられる化学は、（ｂ）の（ｂ’）へのカップリングにおいて、すなわち（ｂ’）−Ｂの（ｂ）を含むリンカーへのカップリングにおいて用いられる化学に干渉しない。当業者は理解しているであろうように、それぞれ共有結合ａ’：ａならびにｂ：ｂ’をもたらす反応部位（ａ）、（ａ’）、（ｂ）および（ｂ’）は、それぞれ好ましくは一価結合剤（式ＩのＡおよび／またはＢ）上に存在する可能性のあるあらゆる官能基にも干渉しない。
その一価結合剤の少なくとも一方がタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物である場合、それはおそらく１個以上のＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２および／またはＳＨ基を有し、それは潜在的に特定のカップリング試薬と反応する可能性がある。そのような（副）反応は、例えば表ＩＩにおいて示したカップリング化学の１つを選択することにより回避することができる。
表ＩＩは、Ａ−（ａ’）および（ｂ’）−Ｂそれぞれを両方ともリンカーに共有結合している（ａ−Ｓ−ｂ）（ａ）および（ｂ）それぞれに結合させるためのルーチン的に用いられる反応基に関する概要を提供する。
上記の双直交（ｂｉ−ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）カップリング化学は、例えばその一価結合剤の少なくとも一方がポリペプチドである場合に適切である。その２個の結合パートナーが一価結合剤ＡおよびＢとしてそれぞれ特定の反応性官能基を有していない場合、例えば２種類のアプタマーの組み合わせの場合、その反応部位（ａ’）、（ａ）、（ｂ）および（ｂ’）それぞれの選択にはより大きな自由度が存在する。従って、上記の表において示した対応する反応部位の対に加えて、またはそれとの組み合わせで、アミノ／活性エステル（例えばＮＨＳエステル）、およびＳＨ／ＳＨまたはＳＨ／マレインイミドを直交カップリングのために用いることができる。
上記の例から明らかであるように、ａ’：ａ間およびｂ：ｂ’間それぞれの共有結合の少なくとも一方はアルファアミノペプチド結合ではない。両方の共有結合がアルファアミノペプチド結合ではないことも好ましい。
１態様において、ａ’：ａおよびｂ：ｂ’の両方が結合対である。結果的に、１態様において、本発明は式Ｉ：Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂの少なくとも二重特異性の結合剤に関し；ここでＡは標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープに結合する第１一価結合剤であり、ここでＢは標的ポリペプチド上の翻訳後ポリペプチド修飾に結合する第２一価結合剤であり、ここでそれぞれの一価結合剤ＡおよびＢは５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、ここでａ’：ａならびにｂ：ｂ’は独立して結合対であり、かつ異なっており、ここでＳはスペーサーであり、ここで−は共有結合を表し、ここでそのリンカーａ−Ｓ−ｂは６〜１００ｎｍの長さを有し、ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有する。
この態様において、それぞれａおよびａ’は結合対ａ’：ａのメンバーであり、ｂおよびｂ’は結合対ｂ：ｂ’のメンバーである。好ましくは、結合対のそれぞれのメンバーは１０ｋＤ以下の分子量である。さらなるやはり好ましい態様において、そのような結合対のそれぞれの結合剤の分子量は８、７、６、５または４ｋＤ以下である。
１態様において、ａ’：ａおよびｂ：ｂ’は結合対であり、結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’のメンバーはロイシンジッパードメイン二量体およびハイブリダイズする核酸配列からなる群から選択される。１態様において、両方の結合対はロイシンジッパードメイン二量体を表す。１態様において、両方の結合対はハイブリダイズする核酸配列である。
ａ：ａ’またはｂ’：ｂが結合対を表す場合、そのような結合対に関する（そのような結合対内の）結合親和性は少なくとも１０８ｌ／ｍｏｌである。両方の結合対は異なる。ある結合対に関して、違いは例えば相互結合（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）、例えばａならびにａ’のｂまたはｂ’に対する結合に関する親和性が対ａ：ａ’内の親和性の１０％以下である場合に認められる。その相互結合、すなわちａならびにａ’のｂまたはｂ’それぞれに対する結合が対ａ：ａ’内の親和性の５％以下である、またはそれが対ａ：ａ’内の親和性の２％以下である場合も好ましい。１態様において、その違いは、その相互（交差反応性）結合が結合対内の特異的結合親和性と比較して１％以下であるほど顕著である。
用語“ロイシンジッパードメイン”は、一続きのおおよそ３５残基中に７残基ごとにロイシン残基が存在することを特徴とする一般的に認識されている二量体化ドメインを示すために用いられている。ロイシンジッパードメインは、それらがあるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーはいくつかのＤＮＡ結合タンパク質中で最初に同定され(Landschulz, W.H. et al., Science 240 (1988) 1759-1764)、それ以来様々な異なるタンパク質中で見付かってきた。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または３量体化する天然存在ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性多量体タンパク質を生成するのに適したロイシンジッパードメインの例がＰＣＴ出願国際公開第94/10308号において記述されており、そのロイシンジッパーはHoppe, H.J. et al., FEBS Lett. 344 (1994) 191-195において記述されている肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来する。
ロイシンジッパードメインは、アルファらせんのコイルドコイルにより一緒の状態を保たれた二量体（結合対）を形成する。コイルドコイルは一周につき３．５残基を有し、それは７残基ごとにそのらせんの軸に関して同等の位置を占めることを意味する。そのコイルドコイルの内側のロイシンの規則的な配列は、疎水性およびファンデルワールス相互作用によりその構造を安定化する。
ロイシンジッパードメインが第１結合対（ａ’：ａ）および第２結合対（ｂ：ｂ’）を形成する場合、両方のロイシンジッパー配列は異なり、すなわち、配列ａおよびａ’はｂおよびｂ’に結合しない。ロイシンジッパードメインは、そのようなドメインを含有することが既知である天然タンパク質、例えば転写因子から単離することができる。１つのロイシンジッパードメインが例えば転写因子ｆｏｓに由来し、第２のロイシンジッパードメインが転写因子ｊｕｎに由来することができる。ロイシンジッパードメインは合成および設計のための当技術で既知の標準的な技法を用いて人工的に設計および合成することもできる。
１つの好ましい態様において、結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’の両方のメンバー、すなわちａ、ａ’、ｂおよびｂ’はロイシンジッパードメインを表し、スペーサーＳはアミノ酸からなる。この態様において、コンストラクトａ−Ｓ−ｂの生成は容易に可能である。そのようなスペーサーＳの長さを望まれるように変えることは、当業者にとって簡単である。そのようなポリペプチドは合成することができ、または組み換えにより生成することができる。
例えば、Ｎ末端においてロイシンジッパーペプチドに、そしてＣ末端においてロイシンジッパーペプチドに融合したスペーサーポリペプチドを含む組み換え融合タンパク質を、標準的な技法に従って適切な宿主細胞中で発現させることができる。望まれるペプチドスペーサーをコードするＤＮＡ配列を、第１ロイシンジッパードメインａのメンバーをコードする配列および同じ読み枠中で第２ロイシンジッパードメインｂのメンバーをコードするＤＮＡ配列の間に挿入することができる。
そのスペーサーＳは、そのリンカーａ−Ｓ−ｂがポリペプチドである場合、１態様において、GGGGS(SEQ ID NO:13)アミノ酸配列モチーフを１回または数回含む。そのスペーサーＳはタグ配列も含んでいてよい。そのタグ配列は、一般的に用いられるタンパク質認識タグ、例えばYPYDVPDYA(HA-タグ)(SEQ ID NO:14)またはGLNDIFEAQKIEWHE(Avi-タグ)(SEQ ID NO:15)から選択されてよい。
１つの好ましい態様において、結合対（ａ’：ａ）および（ｂ：ｂ’）の両方がハイブリダイズする核酸配列である。
名称により既に示されているように、ａおよびａ’ならびにｂおよびｂ’はそれぞれ互いにハイブリダイズする。一方でａおよびａ’中に含まれる核酸配列と他方でｂおよびｂ’中に含まれる核酸配列は異なる。言い換えると、結合対ａ’：ａ中の配列はそれぞれ結合対ｂ：ｂ’の配列に結合せず、逆もまた同じである。１態様において、本発明は式Ｉの少なくとも二重の結合剤に関し、ここでその結合対ａ：ａ’およびｂ：ｂ’それぞれは両方ともハイブリダイズする核酸配列であり、ここでその異なる結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’のハイブリダイズする核酸配列は互いとハイブリダイズしない。言い換えると、ａおよびａ’は互いにハイブリダイズするが、ｂまたはｂ’のいずれにも結合せず、それらのハイブリダイゼーションにも干渉せず、逆もまた同じである。ハイブリダイゼーションの速度論およびハイブリダイゼーションの特異性は、融点分析により容易に監視することができる。結合対（例えばａ：ａ’）の特異的なハイブリダイゼーションおよび（例えばｂまたはｂ’への）不干渉は、対ａ：ａ’に関する融解温度がｂまたはｂ’とのあらゆる可能性のある組み合わせそれぞれ（すなわちａ：ｂ；ａ：ｂ’；ａ’：ｂおよびａ’：ｂ’）と比較して少なくとも２０℃高い場合に認められる。
結合対、例えば（ａ：ａ’）またはあらゆる他の核酸配列に基づく結合対を形成する核酸配列は、あらゆる天然存在核酸塩基またはそれらに対する類似体を弱めて（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）よく、上記で記述したような改変された、もしくは改変されていない主鎖を、それが多数の塩基対合により安定な二本鎖を形成することができる限り、有していてよい。安定は、その二本鎖の融解温度が３７℃より高いことを意味する。好ましくは、その二本鎖は２本の完全に相補的な一本鎖からなる。しかし、３７℃における安定性が与えられる限り、ミスマッチまたは挿入が可能である。
当業者は理解しているであろうように、核酸二本鎖は鎖間架橋によりさらに安定化され得る。いくつかの適切な架橋法、例えばソラレンを用いる、またはチオヌクレオシドに基づく方法が当業者に既知である。
結合対のメンバーである核酸配列は、好ましくは１２〜５０ヌクレオチドからなる。そのような核酸配列が１５〜３５ヌクレオチドからなるであろうことも好ましい。
ＲＮアーゼは至る所にあり、ＲＮＡに基づく結合対および／またはスペーサー配列の望まれない消化を避けるために特別な注意を払わなければならない。例えばＲＮＡに基づく結合対および／またはスペーサーを用いることは確かに可能であるが、ＤＮＡに基づく結合対および／またはスペーサーが好ましい態様である。
直交相補性オリゴヌクレオチドの２つより多くの対を提供するために、適切なハイブリダイズする核酸配列を容易に設計することができ、２つより多くの結合対の容易な生成および使用が可能になる。本発明の二重結合剤においてハイブリダイズする核酸配列を用いることの別の利点は、核酸配列中に容易に修飾を導入することができることである。修飾された構築ブロックは商業的に入手可能であり、それは例えば官能性部分を含むリンカーの容易な合成を可能にする。そのような官能性部分は、あらゆる望まれる位置において、構造ａおよびａ’ならびにｂおよびｂ’および／またはＳのいずれの中にも、それらがオリゴヌクレオチドを表す限り、容易に導入することができる。
１つの好ましい態様において、式Ｉに従う結合剤中に含まれるスペーサーＳは核酸である。１つの好ましい態様において、両方の結合対がハイブリダイズする核酸配列であり、スペーサーＳも核酸である。この態様において、ａ−Ｓ−ｂからなるリンカーＬはオリゴヌクレオチドである。
そのスペーサーＳならびに配列ａ、ａ’、ｂおよびｂ’が全てオリゴヌクレオチド配列である場合、Ｓならびに結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’それぞれのメンバーａおよびｂを含むリンカーＬに相当する単一のオリゴヌクレオチドを提供および合成することは、容易に可能である。その一価結合剤ＡおよびＢがそれぞれポリペプチドである場合、それらはそれぞれそのハイブリダイズする核酸配列ａ’およびｂ’それぞれに容易に連結することができる。そのようなコンストラクト中に含まれるスペーサーＳの長さは、あらゆる望まれる方法で容易に変えることができる。３つのコンストラクトａ−Ｓ−ｂ、Ａ−ａ’およびｂ’−Ｂを元にして、式Ｉの結合剤を、標準的な手順に従って、ａ’：ａおよびｂ：ｂ’それぞれの間のハイブリダイゼーションにより最も用意に得ることができる。異なる長さのスペーサーが用いられる場合、結果として得られるコンストラクトは他の点では同一の二重結合剤を提供するが、一価結合剤ＡおよびＢの間において異なる距離を有する。これは最適な距離および／または柔軟性を可能にする。
１つの好ましい態様において、そのスペーサＳならびに配列ａ、ａ’、ｂおよびｂ’はＤＮＡである。
鏡像異性のＬ−ＤＮＡは、その直交ハイブリダイゼーション挙動、そのヌクレアーゼ耐性に関して、および変動可能な長さのオリゴヌクレオチドの合成の容易さに関して知られている。この適切なスペーサーを設計することによるリンカーの長さの変動の容易さは、本明細書で開示されるような結合剤のその抗原（単数または複数）への結合を最適化するために重要である。
１つの好ましい態様において、そのリンカーＬ（＝ａ−Ｓ−ｂ）は鏡像異性のＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡである。１つの好ましい態様において、リンカーａ−Ｓ−ｂは鏡像異性のＬ−ＤＮＡである。１つの好ましい態様において、ａ、ａ’、ｂおよびｂ’ならびにそのスペーサーＳは鏡像異性のＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡである。１つの好ましい態様において、ａ、ａ’、ｂおよびｂ’ならびにそのスペーサーＳは鏡像異性のＬ−ＤＮＡである。
１態様において、そのスペーサーＳはオリゴヌクレオチドであり、互いにハイブリダイズすることができる末端を含む２つの部分で合成される。この場合、そのスペーサーＳはこれらのハイブリダイズすることができる末端の互いとのハイブリダイゼーションにより簡単に構築することができる。結果として得られたスペーサーコンストラクトは、オリゴヌクレオチド二本鎖部分を含む。明らかであるように、そのスペーサーをその方法で解釈した（ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ）場合、前記の二本鎖を形成するそのハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド構成要素の配列は、結合対ａ：ａ’およびｂ：ｂ’とのハイブリダイゼーションまたはそれらへの干渉が起こり得ないような様式で選択される。
上記で既に記述したように、式Ｉの一価特異的結合剤ＡおよびＢは核酸であってよい。本発明の１態様において、ａ’、ａ、ｂ、ｂ’、Ａ、ＢおよびＳは全てオリゴヌクレオチド配列である。この態様において、式ＩのサブユニットＡ−ａ’、ａ−Ｓ−ｂおよびｂ’−Ｂは標準的な手順に従って容易に、かつ独立して合成することができ、一般に用いられる標準的な手順に従ってハイブリダイゼーションにより組み合わせることができる。
上記で詳細に論じたように、そのカップリングは共有結合性であることもでき、またはそれは特異的な結合対によることもできる。
当業者は容易に理解するであろうように、本発明に従う二価結合剤は１個以上の官能性部分を有するようにさらに修飾されてよい。そのような官能性部分Ｘは、好ましくは結合基、標識基、エフェクター基および反応基からなる群から選択される。
１個より多くの官能性部分Ｘが存在する場合、それぞれのそのような官能性部分はそれぞれの場合において独立して結合基、標識基、エフェクター基または反応基であることができる。
１態様において、その官能性部分Ｘは好ましくは結合基、標識基およびエフェクター基からなる群から選択される。
１態様において、その基Ｘは結合基である。当業者には明らかであるように、その結合基Ｘは対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’に干渉しないように選択されるであろう。
結合基の例はバイオアフィン（ｂｉｏａｆｆｉｎｅ）結合対のパートナーであり、それはそのバイオアフィン結合対の他方のパートナーと特異的に相互作用することができる。適切なバイオアフィン結合対は、ハプテンまたは抗原および抗体；ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン；糖およびレクチン、オリゴヌクレオチドおよび相補性オリゴヌクレオチド、受容体およびリガンド、例えばステロイドホルモン受容体およびステロイドホルモンである。１態様において、Ｘは結合基であり、式Ｉの化合物のａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つに共有結合している。好ましくは、バイオアフィン結合対のより小さいパートナー、例えばビオチンもしくはそれに対する類似体、受容体リガンド、ハプテンまたはオリゴヌクレオチドは、上記で定義されたようなａ’、ａ、Ｌ、ｂまたはｂ’の少なくとも（ａｔ ｌｅｓｔ）１個に共有結合している。
１態様において、官能性部分Ｘは、ハプテン；ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン；オリゴヌクレオチドおよびステロイドホルモンから選択される結合基である。
１態様において、その官能性部分Ｘは反応基である。その反応基は、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシレート、ヒドロキシル、アジド、アルキニル（Ａｌｋｉｎｙｌ）またはアルケニルのようなあらゆる既知の反応基から選択することができる。１態様において、その反応基はマレインイミド、スクシンイミジル、ジチオピリジル、ニトロフェニルエステル、ヘキサフルオロフェニルエステルから選択される。
１態様において、その官能性部分Ｘは標識基である。その標識基はあらゆる既知の検出可能な基から選択することができる。当業者は、最少の消光での最高の感度のために適切であるように標識の数を選択するであろう。
その標識基はあらゆる既知の検出可能な基から選択することができる。１態様において、その標識基は、色素、例えば発光標識基、例えば化学発光基、例えばアクリジニウムエステル類もしくはジオキセタン類、または蛍光色素、例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびそれらの誘導体、発光性金属錯体、例えばルテニウムもしくはユーロピウム錯体、ＣＥＤＩＡ（クローン化酵素供与体免疫アッセイ（Ｃｌｏｎｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｄｏｎｏｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、例えば欧州特許第0 061 888号）に関して用いられるような酵素、微粒子もしくはナノ粒子、例えばラテックス粒子または金属ゾル、ならびに放射性同位体から選択される。
１態様において、その標識基は発光性金属錯体であり、その化合物は一般式（ＩＩ）の構造を有し：
［Ｍ（Ｌ１Ｌ２Ｌ３）］ｎ − Ｙ − ＸｍＡ （ＩＩ）
式中、Ｍは希土類または遷移金属イオンから選択される二価または三価金属陽イオンであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は同じまたは異なっており、少なくとも２個の窒素含有複素環を有するリガンドを示し、ここでＬ１、Ｌ２およびＬ３はその金属陽イオンに窒素原子を介して結合しており、ＸはリンカーＹを介してそのリガンドＬ１、Ｌ２およびＬ３の少なくとも１個に共有結合している反応性官能基であり、ｎは１から１０まで、好ましくは１から４までの整数であり、ｍは１または２、好ましくは１であり、Ａは電荷を等しくするために必要である可能性のある対イオンを示す。
その金属錯体は好ましくは発光性金属錯体、すなわち適切な励起後に検出可能な発光反応を経る金属錯体である。その発光反応は、例えば蛍光または電気化学発光測定により検出することができる。この錯体中の金属陽イオンは、例えば遷移金属または希土類金属である。その金属は好ましくはルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロムまたはタングステンである。ルテニウム、イリジウム、レニウム、クロムおよびオスミウムが特に好ましい。ルテニウムが最も好ましい。
リガンドＬ１、Ｌ２およびＬ３は、少なくとも２個の窒素含有複素環を有するリガンドである。芳香族複素環、例えばビピリジル、ビピラジル、ターピリジルおよびフェナントロリルが好ましい。そのリガンドＬ１、Ｌ２およびＬ３は、特に好ましくはビピリジンおよびフェナントロリン環系から選択される。
その錯体はさらに電荷を等しくするための１個または数個の対イオンＡを含有することができる。適切な負に荷電した対イオンの例は、ハロゲン化物、ＯＨ−、カーボネート、アルキルカルボキシレート、例えばトリフルオロアセテート、サルフェート、ヘキサフルオロホスフェートおよびテトラフルオロボレート基である。ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロアセテートおよびテトラフルオロボレート基が特に好ましい。適切な正に荷電した対イオンの例は、一価陽イオン、例えばアルカリ金属およびアンモニウムイオンである。
さらに好ましい態様において、その官能性部分Ｘはエフェクター基である。好ましいエフェクター基は療法上有効物質である。
療法上有効物質は、例えば癌の抑制においてそれらが有効である方式が異なる。それらはアルキル化により、架橋により、またはＤＮＡの二本鎖の切断によりＤＮＡ鋳型を損傷することができる。他の療法上有効物質はインターカレーションによりＲＮＡ合成を遮断することができる。一部の薬剤は紡錘体毒、例えばビンカアルカロイド類、または酵素活性を阻害する抗代謝剤、またはホルモン性薬剤および抗ホルモン性薬剤である。エフェクター基Ｘは、アルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍性抗生物質、ビンカアルカロイド類、エピポドフィロトキシン類、ニトロソ尿素類、ホルモン性薬剤および抗ホルモン性薬剤、ならびに毒素から選択されてよい。
現在より好ましいアルキル化剤は、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、チオテパ、イホスファミド、ナイトロジェンマスタードにより例示することができる。
現在より好ましい抗代謝剤は、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、６−チオグアニン、６−メルカプトプリンにより例示することができる。
現在より好ましい抗腫瘍性抗生物質は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イドルビシン（ｉｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ニミトキサントロン（ｎｉｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎ）、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、およびプリカマイシンにより例示することができる。
現在より好ましい紡錘体毒はメイタンシンおよびメイタンシノイド類により例示することができ、ビンカアルカロイド類およびエピポドフィロトキシン類はビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデスチン（ｖｉｎｄｅｓｔｉｎ）、エトポシド、テニポシドにより例示することができる。
現在より好ましいニトロソ尿素類は、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシンにより例示することができる。
現在より好ましいホルモン性薬剤および抗ホルモン性薬剤は、アドレノコルチコルチコイド類（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ）、エストロゲン類、抗エストロゲン剤、プロゲスチン類、アロマターゼ阻害剤、アンドロゲン類、抗アンドロゲン剤により例示することができる。
追加の好ましい無作為な合成薬剤は、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、プロカルバジド（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｄｅ）、シスプラチン、カルボプラチンにより例示することができる。
官能性部分Ｘは、共有結合的に、または追加の結合対を介してのどちらかで、例えば（ａ’）、（ａ）、（ｂ）、（ｂ’）またはＳの少なくとも１つに結合している。その官能性部分Ｘは１回または数（ｎ）回存在することができる。（ｎ）は整数であり、１または１より大きい。好ましくは、（ｎ）は１〜１００である。（ｎ）が１〜５０であることも好ましい。特定の態様において、ｎは１〜１０、または１〜５である。さらなる態様において、ｎは１または２である。
官能性部分Ｘのａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つへの共有結合に関して、あらゆる適切なカップリング化学を用いることができる。当業者はそのようなカップリング化学を標準的なプロトコルから容易に選択することができる。ａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳを合成する際に適切な構築ブロックの使用により官能性部分を組み込むことも可能である。
１つの好ましい態様において、官能性部分Ｘは式Ｉにより定義されるような結合剤のａ、ｂ、またはＳに結合している。
１つの好ましい態様において、官能性部分Ｘは式Ｉにより定義されるような結合剤のスペーサーＳに結合している。
１つの好ましい態様において、官能性部分Ｘは式Ｉにより定義されるような結合剤のａ、ｂ、またはＳに共有結合している。
官能性部分Ｘがａ、ａ’、ｂまたはｂ’それぞれに相当するハイブリダイズするオリゴヌクレオチド内に位置する場合、好ましくはそのような官能性部分は修飾されたヌクレオチドに結合しており、またはヌクレオシド間のＰ原子に結合している（国際公開第2007/059816号）。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに干渉しない修飾されたヌクレオチドがそれらのオリゴヌクレオチド中に組み込まれる。そのような修飾されたヌクレオチドは、好ましくはＣ５置換ピリミジン類またはＣ７置換７デアザプリン類である。
オリゴヌクレオチドは、内部で、または５’もしくは３’末端において、官能性部分の導入のために用いられる非ヌクレオチド性構成要素で修飾することができる。好ましくは、そのような非ヌクレオチド性構成要素はスペーサーＳの内部、すなわち２個の結合対メンバーａおよびｂの間に位置している。
スペーサーの構築のための多くの異なる非ヌクレオチド性修飾剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）構築ブロックが文献において既知であり、多種多様なものが商業的に入手可能である。官能性部分の導入に関して、非ヌクレオシド性二官能性修飾剤構築ブロックまたは非ヌクレオシド性の三官能性修飾された構築ブロックのどちらも、末端標識のためのＣＰＧとして、または内部標識のためのホスホラミダイトとしてのどちらでも用いられる（Wojczewski, C. et al., Synlett 10 (1999) 1667-1678参照）。
二官能性修飾剤構築ブロック
二官能性修飾剤構築ブロックは、官能性部分または（必要であれば）保護された官能性部分をホスホラミダイト基に、その構築ブロックを成長しているオリゴヌクレオチド鎖の末端のヒドロキシル基に５’末端において（通常の合成）または３’末端において（逆向きの合成）取り付けるために連結する。
二官能性修飾剤構築ブロックは、好ましくは非ヌクレオシド性化合物である。例えば、そのような修飾された構築ブロックはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖であるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニル鎖はそのスペーサーの、それによりリンカー構造全体の親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび／またはアミド部分により遮られていてよい。場合により１または２個のＣ１〜Ｃ６アルキル基で置換されているＣ５〜Ｃ６−シクロアルキル、Ｃ４Ｎ、Ｃ５Ｎ、Ｃ４Ｏ、Ｃ５Ｏ−ヘテロシクロアルキル、フェニルのような環状部分も、非ヌクレオシド性の二官能性修飾された構築ブロックとして用いることができる。好ましい修飾された二官能性構築ブロックは、Ｃ３〜Ｃ６アルキル部分およびトリ−〜ヘキサ−エチレングリコール鎖を含む。二官能性修飾剤構築ブロックの限定的でないが好ましい例を、下記の表ＩＩＩにおいて示す。
三官能性修飾剤構築ブロック
三官能性構築ブロックは、（ｉ）官能性部分または（必要であれば）保護された官能性部分、（ｉｉ）レポーターまたは官能性部分または（必要であれば）保護された官能性部分をオリゴヌクレオチド合成の間に成長しているオリゴヌクレオチド鎖のヒドロキシル基に連結するためのホスホラミダイト基、および（ｉｉｉ）酸不安定性保護基で、好ましくはジメトキシトリチル保護基で保護されているヒドロキシル基を連結する。この酸不安定性保護基を除去した後、ヒドロキシル基が解放され、それはさらなるホスホラミダイトと反応することができる。従って、三官能性構築ブロックは官能性部分をオリゴヌクレオチド内のあらゆる位置に配置することを可能にする。三官能性構築ブロックは、固体支持体、例えば制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）を用いる合成にも必須であり、それはオリゴヌクレオチドの３’末端標識のために用いられる。この場合、その三官能性構築ブロックは官能性部分または（必要であれば）保護された官能性部分にＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）炭素鎖を介して連結されるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｙｉｎｙｌ）鎖はそのスペーサーの、それによりリンカー構造全体の親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび／またはアミド部分により遮られていてよく、切断可能なスペーサーを介して固体支持体に結合したヒドロキシル基および酸不安定性保護基で保護されたヒドロキシル基を含む。この保護基の除去の後、ヒドロキシル基が解放され、次いでそれはホスホラミダイトと反応することができるであろう。
三官能性構築ブロックは非ヌクレオシド性またはヌクレオシド性であってよい。
非ヌクレオシド性三官能性構築ブロックはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖であるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニルはそのスペーサーの、それによりリンカー構造全体の親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび／またはアミド部分により遮られている。他の三官能性構築ブロックは、場合により１または２個のＣ１〜Ｃ６アルキル基で置換されているＣ５〜Ｃ６−シクロアルキル、Ｃ４Ｎ、Ｃ５Ｎ、Ｃ４Ｏ、Ｃ５Ｏヘテロシクロアルキル、フェニルのような環式基である。環式および非環式基は１個の−（Ｃ１〜Ｃ１８）アルキル−Ｏ−ＰＧ基により置換されていてよいが、前記のＣ１〜Ｃ１８アルキルは（エチレンオキシ）ｎ、（アミド）ｍ部分を含み、ｎおよびｍは互いに独立して０〜６であり、ＰＧは酸不安定性保護基である。好ましい三官能性構築ブロックは、場合により１個のアミド結合を含みＣ１〜Ｃ６アルキルＯ−ＰＧ基で置換されたＣ３〜Ｃ６アルキル、シクロアルキル、Ｃ５Ｏヘテロシクロアルキル部分であり、ここでＰＧは酸不安定性保護基、好ましくはモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ピキシル、キサンチル、最も好ましくはジメトキシトリチルである。
非ヌクレオシド性三官能性構築ブロックに関する限定的でないが好ましい例が、例えば表ＩＶにおいて要約されている。
ヌクレオシド性修飾剤構築ブロック：
ヌクレオシド性修飾剤構築ブロックは、未修飾のオリゴヌクレオチドと比較してそのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性に影響を及ぼさない必要がある場合に内部標識のために用いられる。従って、ヌクレオシド性構築ブロックは、なお相補的塩基とハイブリダイズすることができる塩基または塩基類似体を含む。本発明の式Ｉに従う結合剤中に含まれるａ、ａ’、ｂ、ｂ’またはＳの１個以上の核酸配列を標識するための標識化合物の一般式は、式ＩＩにおいて与えられる。
式中、ＰＧは酸不安定性保護基、好ましくはモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ピキシル、キサンチル、最も好ましくはジメトキシトリチルであり、ここでＹはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）であり、ここで前記のアルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）はエチレンオキシおよび／またはアミド部分を含んでいてよく、ここでＹは好ましくはＣ４〜Ｃ１８アルキル、アルケニルまたはアルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）であり、１個のアミド部分を含有し、ここでＸは官能性部分であり、それに標識を結合させることができる。
その塩基の具体的な位置は、そのような置換に関してハイブリダイゼーション特性への影響が最小限になるように選択されてよい。従って、以下の位置が置換に関して好ましい：ａ）天然塩基に関して：Ｃ５で置換されたウラシル；Ｃ５で、またはＮ４で置換されたシトシン；Ｃ８で、またはＮ６で置換されたアデニン、およびＣ８で、またはＮ２で置換されたグアニン、ならびにｂ）塩基類似体に関して：Ｃ７で置換された７デアザＡおよび７デアザＧ；Ｃ７で置換された７デアザ８アザＡおよび７デアザ８アザＧ；Ｃ７で置換された７デアザアザ２アミノＡ；Ｎ１で置換されたプソイドウリジンおよびＮ２で置換されたホルマイシン。
ヌクレオシド性三官能性構築ブロックに関する限定的でないが好ましい例を表Ｖにおいて示す。
表ＩＩＩ、ＩＶおよびＶにおいて、二官能性部分の末端の酸素原子の１個または三官能性部分の末端の酸素原子の１個はホスホラミダイトの一部であり、それは完全に詳細には示されていないが当業者には明らかである。三官能性構築ブロックの第２の末端の酸素原子は、上記で式ＩＩに関して定義されたように、酸不安定性保護基ＰＧで保護されている。
合成後修飾は、共有結合した官能性部分をリンカーまたはスペーサー分子中に導入するための別の戦略である。このアプローチにおいて、固相合成の間に二官能性または三官能性構築ブロックを用いることによりアミノ基が導入される。そのアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドの支持体からの切断および精製の後、官能性部分の活性化されたエステルと、またはその中の１個の官能基が活性エステルである二官能性試薬と反応させる。好ましい活性エステルはＮＨＳエステルまたはペンタフルオロ（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒ）フェニルエステル類である。
合成後修飾は、固相合成および脱保護の間に安定でない官能性部分を導入するために特に有用である。例は、シュタウディンガーライゲーションのためのトリフェニルホスフィンカルボキシメチルエステルによる修飾(Wang, C.C. et al., Bioconjugate Chemistry 14 (2003) 697-701)、ジゴキシゲニンによる、または商業的に入手できるスルホＳＭＣＣを用いてマレインイミド基を導入するための修飾である。
官能性部分Ｘは、１態様において、ａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１個に追加の結合対を介して結合している。
官能性部分Ｘを結合させることができる追加の結合対は、好ましくはロイシンジッパードメインまたはハイブリダイズする核酸である。その官能性部分Ｘがａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１個に追加の結合対のメンバーを介して結合している場合、Ｘが結合している結合対のメンバーならびに結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’それぞれは全て異なる特異性を有するように選択される。その結合対ａ：ａ’、ｂ：ｂ’およびＸが結合している結合対はそれぞれ、その他の結合対のいずれの結合にも干渉せずに、それらのそれぞれのパートナーに結合する（例えばハイブリダイズする）。
結合対のメンバーの一価結合剤への共有結合性カップリング
その結合剤の生化学的性質に応じて、異なるコンジュゲーション戦略がすぐに利用できる。
その結合剤が５０〜５００アミノ酸の天然存在タンパク質または組み換えポリペプチドである場合、タンパク質コンジュゲートの合成に関する化学を記述する教本中に標準的な手順があり、当業者は容易にそれに従うことができる(Hackenberger, C.P. and Schwarzer, D., Angew. Chem., Int. Ed., 47 (2008) 10030-10074)。
１態様において、マレインイミド部分のそのタンパク質内のシステイン残基との反応が用いられる。これは、例えば抗体のＦａｂまたはＦａｂ’断片が一価結合剤として用いられる場合に好ましいカップリング化学である。あるいは、１態様において、結合対のメンバー（式Ｉのａ’またはｂ’それぞれ）のその結合剤ポリペプチドのＣ末端へのカップリングが実施される。タンパク質の、例えばＦａｂ断片のＣ末端修飾は、例えばSunbul, M. et al., Organic & Biomolecular Chemistry 7 (2009) 3361-3371により記述されたように実施することができる。
一般に、結合対のメンバーの一価ポリペプチド性結合剤への部位特異的反応および共有結合性カップリングは、天然アミノ酸をタンパク質中に存在する他の官能基の反応性に対して直交性である反応性を有するアミノ酸に変換することに基づく。例えば、稀な配列前後関係（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｔｅｘｔ）内の特定のシステインをアルデヒド中で酵素的に変換することができる（ホルミルグリシンアルデヒドタグ−新規の翻訳後修飾によるタンパク質工学(Frese, M.-A. et al., ChemBioChem 10 (2009) 425-427)を参照)。特定の酵素の所与の配列前後関係中の天然アミノ酸との特異的な酵素反応性を利用することにより望まれるアミノ酸修飾を得ることも可能である（例えば以下の参考文献を参照：Taki, M. et al., Protein Engineering, Design & Selection 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al., Chemistry & Biology 15 (2008) 128-136;プロテアーゼに触媒されるＣ−Ｎ結合の形成がBordusa, F., HighlightsによりBioorganic Chemistry (2004) 389-403において用いられており、ソルターゼ（Ｓｏｒｔａｓｅ）に媒介されるタンパク質ライゲーションがMao, H.らによりJ. Am Chem Soc. 126 (2004) 2670-2671において用いられており、Proft, T.によりBiotechnol. Lett 32 (2010) 1-10において総説されている）。
結合対のメンバーの一価ポリペプチド性結合剤への部位特異的反応および共有結合性カップリングは、末端のアミノ酸の適切な修飾試薬との選択的反応によっても達成することができる。
Ｎ末端システインのベンゾニトリル類との反応性(Ren, Hongjun Xiao et al., Angewandte Chemie, International Edition 48 (2009) 9658-9662)を、部位特異的共有結合性カップリングを達成するために用いることができる。
天然型（Ｎａｔｉｖｅ）化学的ライゲーションはＣ末端システイン残基に頼ることもできる(Taylor, E. et al., Nucleic Acids and Molecular Biology 22 (2009) 65-96)。
欧州特許第1 074 563号は、一続きの負に荷電したアミノ酸内のシステインの一続きの正に荷電したアミノ酸中に位置するシステインとのより速い反応に基づくコンジュゲーション法を記述している。
その一価結合剤は、合成ペプチドまたはペプチド模倣物であってもよい。ポリペプチドが化学的に合成される場合、直交性化学反応性を有するアミノ酸をそのような合成の間に組み込むことができる(de Graaf, A.J. et al., Bioconjugate Chemistry 20 (2009) 1281-1295)。多種多様な直交性官能基が賭かっており（ａｔ ｓｔａｋｅ）、合成ペプチド中に導入することができるため、そのようなペプチドのリンカー中へのコンジュゲーションは標準的な化学である。
単一標識された（ｍｏｎｏ−ｌａｂｅｌｅｄ）タンパク質を得るため、１：１の化学量論を有するコンジュゲートをクロマトグラフィーにより他のコンジュゲーション産物から分離することができる。この手順は色素標識された結合対のメンバーおよび荷電したスペーサーを用いることにより促進される。この種類の標識された、および高度に負に荷電した結合対のメンバーを用いることにより、電荷および分子量の違いを分離のために用いることができるため、１コンジュゲート化タンパク質が未標識のタンパク質および１個より多くのリンカーを有するタンパク質から容易に分離される。その蛍光色素は、二価結合剤（ｂｉｎｄｉｇ ａｇｅｎｔ）を標識された一価結合剤のような未結合の構成要素から精製するために役立つ。
従って、１態様において、本発明の二価結合剤を形成するために、（例えば合成の間に二官能性または三官能性修飾剤構築ブロックを二官能性スペーサー構築ブロックとの組み合わせで用いて合成された）蛍光色素で標識されている結合対のメンバー（式Ｉのａ’および／またはｂ’それぞれ）を用いることが好ましい。１つの好ましい態様において、そのスペーサーＳならびにその配列ａ、ａ’、ｂおよびｂ’はＤＮＡであり、ａ’またはｂ’それぞれの少なくとも一方は蛍光色素で標識されている。１つの好ましい態様において、そのスペーサーＳならびにその配列ａ、ａ’、ｂおよびｂ’はＤＮＡであり、ａ’およびｂ’それぞれは両方ともそれぞれ異なる蛍光色素で標識されている。
１態様において、翻訳後修飾された標的ポリペプチドに特異的に結合する二価結合剤を製造するための方法を開示する。その方法は、以下の工程を含む：（ａ）前記の標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープに５×１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合する第１一価結合剤を選択し、（ｂ）翻訳後ポリペプチド修飾に５×１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合する第２一価結合剤を選択し、ｃ）両方の一価結合剤をリンカーにより連結し、そしてｄ）３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓ値を有する二価結合剤を選択する。
当業者は理解しているであろうように、そのＫｄｉｓｓは温度依存性の値である。理論上、両方の一価結合剤の、ならびに本発明に従う二価結合剤のＫｄｉｓｓ値は同じ温度で決定される。理解されるであろうように、好ましくはＫｄｉｓｓ値はその二価結合剤が用いられることになる、例えばアッセイが実施されることになる温度と同じ温度で決定される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は室温で、すなわち２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃それぞれで確立される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は４または８℃それぞれで確立される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は２５℃で確立される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は３７℃で確立される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は４０℃で確立される。１つの好ましい態様において、Ｋｄｉｓｓの決定、すなわちそれぞれの一価結合剤に関するＫｄｉｓｓの決定および二重結合剤に関するＫｄｉｓｓの決定は３７℃においてなされる。
本発明において開示されるような方法を用いて、それぞれが異なる長さのリンカーを含む様々な二価結合剤を製造すること、および望まれる結合特性、すなわち３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓ値を有するそれらの二価結合剤を選択することは、今ではかなり容易である。望まれるＫｄｉｓｓを有する二価結合剤の選択は、実施例２．８において開示されるようなＢｉａｃｏｒｅ（商標）分析により実施される。
１態様において、本発明は本発明に従う二価結合剤を形成する方法に関し、ここで、標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープに１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合し、第１結合対のメンバーに連結された第１一価結合剤、翻訳後ポリペプチド修飾に１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合し、第２結合対のメンバーに連結された第２一価結合剤、ならびにスペーサーならびにその第１および第２結合対のメンバーに対する相補的な結合対のメンバーを含むリンカーを一緒に保温し、それにより１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓ値を有する二価結合剤が形成され、ここでその第１および第２結合対は互いに干渉しない。
１態様において、上記の方法はさらにその二価結合剤を単離する工程を含む。
本発明に従う二価結合剤の組み立てに関する好ましい化学量論比は１：１：１である。
１つの好ましい態様において、本発明に従う二価結合試薬を製造する方法はＬ−ＤＮＡリンカーを利用する。１つの好ましい態様において、本発明に従う二価結合試薬を製造する方法はＤＮＡ、好ましくはＬ−ＤＮＡからなる２個の特異的な結合対およびＬ−ＤＮＡリンカーを利用する。
二価結合剤の形成および形成された二価結合剤の化学量論は、現状技術の手順に従うサイズ排除クロマトグラフィーにより分析することができる。望まれるならば、その形成された複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析することもできる。
免疫組織化学染色手順において用いられる場合、この発明で開示される二価結合剤のみが著しく結合し、それが３×１０−５／秒またはより優れたＫｄｉｓｓを有する場合、そのような手順の様々な保温工程の間に洗い落とされない。このＫｄｉｓｓは、両方の一価結合剤がそれらの対応する結合部位に結合する場合にのみ達成され得る。ポリペプチドエピトープのみまたは翻訳後修飾のみが試料中の分子上に存在する場合、著しい染色は見られないであろう。従って、そしてこれは非常に好都合なことだが、免疫組織化学染色は（関係する修飾を有する）翻訳後修飾された標的ポリペプチドがその試料中に存在する場合にのみ観察されるであろう。
従って、好ましい態様において、本発明は組織染色法に関し、その方法は以下の工程を含む：（ａ）細胞または組織試料を提供し、（ｂ）前記の試料をリンカーを介して互いに連結された２個の一価結合剤からなる二価結合剤と共に保温し、ここでその２個の一価結合剤の一方は前記の標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープに結合し、その２個の一価結合剤の一方は翻訳後ポリペプチド修飾に結合し、それぞれの一価結合剤は５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有し、そして（ｃ）その二価結合剤を検出し、それにより前記の試料を翻訳後修飾された標的ポリペプチドに関して染色する。
本発明に従う二価結合剤の免疫組織化学的方法による細胞または組織試料の染色における使用は、さらなる好ましい態様である。
より一般的に言うと、本発明はリンカーを介して互いに連結された２個の一価結合剤からなる二価結合剤に関し、その結合剤は翻訳後修飾された標的ポリペプチドに（自動化された）アッセイ系の要求を満たすＫｄｉｓｓまたはよりよいＫｄｉｓｓで結合し、ここで（ａ）第１一価結合剤は前記の標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープにその（自動化された）アッセイ系の要求より少なくとも１０倍上のＫｄｉｓｓで結合し、（ｂ）第２一価結合剤は翻訳後ポリペプチド修飾にその（自動化された）アッセイ系の要求より少なくとも１０倍上のＫｄｉｓｓで結合し、そして（ｃ）ここでその２種類の一価結合剤（ａ）および（ｂ）のＫｄｉｓｓ値の積は少なくともその（自動化された）系により要求されるＫｄｉｓｓ以下である。
一般的に言うと、翻訳後修飾された標的ポリペプチドに少なくとも（自動化された）アッセイ系の最小限のアッセイ要求を満たすＫｄｉｓｓまたはよりよいＫｄｉｓｓで特異的に結合する二価結合剤を得るための方法が記述され、その方法は以下の工程を含む：（ａ）前記の標的ポリペプチドの翻訳後修飾されていないエピトープにその（自動化された）アッセイ系の最小限のアッセイ要求より少なくとも１０倍上のＫｄｉｓｓで結合する第１一価結合剤を選択し、（ｂ）翻訳後ポリペプチド修飾にその（自動化された）アッセイ系の最小限のアッセイ要求より少なくとも１０倍上のＫｄｉｓｓで結合する第２一価結合剤を選択し、ここで工程（ａ）および（ｂ）におけるその２種類の一価結合剤のＫｄｉｓｓ値の積は少なくともその（自動化された）系により要求されるＫｄｉｓｓ以下であり、そして（ｃ）両方の一価結合剤をリンカーにより連結する。
１態様において、その自動化された系はＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（ツーソン）が流通させているようなＢｅｎｃｈｍａｒｋ（登録商標）分析器である。
以下の実施例、配列リストおよび図は本発明の理解を助けるために提供されており、その正確な範囲は添付された特許請求の範囲において述べられている。述べられた手順において本発明の精神から逸脱することなく修正を行うことができることは理解されている。
配列リストの記述
１．抗体断片
２．ｓｓＤＮＡの配列
ａ） １９塩基長ｓｓＤＮＡ（３’末端により抗トロポニンＴ ＭＡＢ ｂのＦａｂ’またはリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂ’ ８．１．２それぞれに共有結合している）
5’-A GTC TAT TAA TGC TTC TGC-3’(SEQ ID NO:5)
ｂ）１７塩基長ｓｓＤＮＡ（５’末端により抗トロポニンＴ ＭＡＢ ａのＦａｂ’またはＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂ’ １．４．１６８それぞれに共有結合している）
5’-AGT TCT ATC GTC GTC CA-3’(SEQ ID NO:6)
ｃ）相補性１９塩基長ｓｓＤＮＡ（リンカーの一部として用いられる）
5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-3’(SEQ ID NO:7)
ｄ）相補性１７塩基長ｓｓＤＮＡ（リンカーの一部として用いられる）
5’-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’(SEQ ID NO:8)
３．トロポニンＴエピトープの配列
SEQ ID NO:9 = ERAEQQRIRAEREKEUUSLKDRIEKRRRAERAEアミド、ここでＵはβアラニンを表す。（抗トロポニン抗体ａに関するエピトープ“Ａ”）
SEQ ID NO:10 = SLKDRIERRRAERAEOOERAEQQRIRAEREKEアミド、ここでＯはアミノ−トリオキサ−オクタン酸を表す。（抗トロポニン抗体ｂに関するエピトープ“Ｂ”）
４．ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲエピトープの配列：
SEQ ID NO:11 = FDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSST; IGF-1R (1340〜1366)
SEQ ID NO:12 = YEEHIPYTHMNGGKKNGRILTLPRSNPS; hIR(1355〜1382)
５．タンパク質リンカーおよびタグ配列：
SEQ ID NO:13 = GGGGS (=G4S)モチーフ（例えばポリペプチドリンカーの一部として）
SEQ ID NO:14 = YPYDVPDYA （ＨＡ−タグ）
SEQ ID NO:15 = GLNDIFEAQKIEWHE （Ａｖｉ−タグ）
SEQ ID NO:16 = LPETGGGSGS （ソルターゼ切断タグ）
６．ＨＥＲ３エピトープの配列：
SEQ ID NO:17 = PLHPVPIMPTAGTTPDEDYEYMNRQR; hHER3 (1242〜1267)
SEQ ID NO:18 =PASEQGYEEMRAF; hHER3 (1283〜1295)
７．ソルターゼに媒介されるＦａｂ標識のためのｓｓＤＮＡの配列
SEQ ID NO:25 = 5’-(Gly)2-アミノリンカー-(スペーサーC3)3-AGT TCT ATC GTC GTC CA-フルオレセイン-3’（１７塩基長−オリゴ）
SEQ ID NO:26 = 5’-フルオレセイン-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-(スペーサーC3)3-アミノリンカー-’-(Gly)2-3’（１９塩基長−オリゴ）
図の説明
図１ 抗ｐＩＧＦ１−Ｒ二重結合剤の組み立ての効率を評価する分析的ゲル濾過実験。線図ａ、ｂおよびｃは、個々の二重結合剤構成要素（フルオレセイン−ｓｓＦａｂ’ １．４．１６８、Ｃｙ５−ｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびリンカーＤＮＡ（Ｔ＝０）；ｓｓＦａｂ’は一本鎖オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたＦａｂ’断片を意味する）の溶離プロフィールを示す。線図ｄは、二価結合剤を形成するのに必要な３種類の構成要素を１：１：１のモル比で混合した後の溶離プロフィールを示す。より太い（一番下の）曲線は、ｓｓＦａｂ’タンパク質またはリンカーＤＮＡそれぞれの存在を示す２８０ｎｍにおいて測定された吸光度を表す。ｂ）およびｄ）におけるより細い一番上の曲線（４９５ｎｍにおける吸光度）はフルオレセインの存在を示し、ａ）におけるより細い一番上の曲線およびｄ）における中央の曲線（６３５ｎｍにおける吸光度）は、Ｃｙ５の存在を示す。単一の二重結合剤の構成要素の溶離体積（ＶＥｓｓＦａｂ’ １．４．１６８ 約１５ｍｌ；ＶＥｓｓＦａｂ’ ８．１．２ 約１５ｍｌ；ＶＥリンカー 約１６ｍｌ）の反応混合物の溶離体積（ＶＥ混合物 約１２ｍｌ）との比較は、二重結合剤組み立て反応が成功であったことを示す（収率：約９０％）。溶離された二重結合剤に相当する主な２８０ｎｍのピークは、４９５ｎｍおよび６３５ｎｍのチャンネルにおける主なピークとうまく重なっており、二価結合剤に相当するピーク中にｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８の両方が存在することを証明している。
図２ 図２：Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）実験のスキーム。模式的および例示的に、溶液中の２種類の結合分子を示す：Ｔ０−Ｔ−Ｄｉｇ（リンカー１６）、二価結合剤およびＴ４０−Ｔ−Ｄｉｇ（リンカー１５）、二価結合剤。これら両方の二価結合剤はそれらのリンカーの長さにおいてのみ異なる（２個のハイブリダイズする核酸配列の間に追加のＴを有しない中心のジゴキシゲニン化された（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｙｌａｔｅｄ）Ｔ対４０個の追加のＴ（中心のＴ−Ｄｉｇのそれぞれの側に２０個）を有する中心のジゴキシゲニン化されたＴ）。さらに、ｓｓＦａｂ’断片８．１．２および１．４．１６８を用いた。
図３ １００ｎＭ二価結合剤（Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８からなる）の固定されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を、１００ｎＭ ｓｓＦａｂ’ １．４．１６８または１００ｎＭ ｓｓＦａｂ’ ８．１．２の同じペプチドに対する結合特性と比較して示す、３つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）。最も高い結合性能は二重結合剤コンストラクトを用いて得られ、これはその二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒに対する親和性を増大させることを明確に示している。
図４ Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８からなる二価結合剤の固定されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒ（リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒ）、ＩＧＦ−１ＲまたはｐＩＲ（リン酸化されたインスリン受容体）との相互作用を示す３つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。最も高い結合性能はｐＩＧＦ−１Ｒペプチドで得られ、これは二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒに対する特異性を例えばリン酸化されたインスリン受容体ペプチド（ｐＩＲ）と比較して増大させることを明確に示している。
図５ Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８からなる１００ｎＭ二価結合剤ならびにリンカーＤＮＡを有しない１００ｎＭ ｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８の混合物の相互作用を示す２つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｏｒｅ（商標）センサーグラム。最高の結合性能は二価結合剤を用いてのみ得られ、一方でリンカーを有しないｓｓＦａｂ’の混合物は、これらのｓｓＦａｂ’の合計濃度が２００ｎＭであったという事実にも関わらず、観察可能な協同的結合作用を示さない。
図６ Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）サンドイッチアッセイの概略図。このアッセイは、両方の抗体のリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドへのエピトープ接近可能性を調べるために用いられた。＜ＭＩｇＧＦｃｙ＞Ｒはマウス抗体Ｍ−１．４．１６８を捕捉するために用いられたウサギ抗マウス抗体を示す。次いでＭ−１．４．１６８を用いてｐＩＧＦ−１Ｒペプチドを捕捉する。Ｍ−８．１．２が最終的にＭ−１．４．１６８、ペプチドおよびＭ−８．１．２からなるサンドイッチを形成する。
図７ 二次抗体８．１．２のｐＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する、これがＢｉａｃｏｒｅ（商標）チップ上で抗体１．４．１６８により捕捉された後の結合シグナル（太線）を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。その他のシグナル（細い線）は対照シグナルである：一番上から一番下に向かって、それぞれ５００ｎＭの８．１．２、５００ｎＭの１．４．１６８；５００ｎＭの標的と無関係の抗体＜ＣＫＭＭ＞Ｍ−３３−ＩｇＧ；および５００ｎＭの標的と無関係の対照抗体＜ＴＳＨ＞Ｍ−１．２０−ＩｇＧの線を示す。これらの対照にいずれにおいても結合事象を検出することはできなかった。
図８ センサー表面上のビオチン化二重結合剤を示す、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイの概略図。フローセル１（＝ＦＣ１）（示していない）上で、アミノ−ＰＥＯ−ビオチンを捕捉させた。ＦＣ２、ＦＣ３およびＦＣ４上で、増大するリンカーの長さを有する二価結合剤を固定した（ＦＣ２上の二重結合剤（Ｔ０−ｂｉ＝１個の中央のＴ−Ｂｉのみ）およびＦＣ４上の二重結合剤（Ｔ４０−ｂｉ＝１個の中央のＴ−Ｂｉならびに上流および下流それぞれの２０個のＴ）をそれぞれ示す）。分析物１：そのペプチドの右側の末端においてＭ−１．４．１６８ ｓｓＦａｂ’エピトープを含有するＩＧＦ−１Ｒペプチド（一番上の線）−このペプチドはリン酸化されていないため、Ｍ−８．１．２ ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープは存在しない；分析物２：Ｍ−８．１．２ ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープ（Ｐ）およびＭ−１．４．１６８ ｓｓＦａｂ’エピトープを含有するｐＩＧＦ−１Ｒペプチド（２番目の線）；分析物３：交差反応するＭ−８．１．２ ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープを含有するがＭ−１．４．１６８ ｓｓＦａｂ’に関するエピトープは含有しない、ｐＩＲペプチド（３番目の線）。
図９ 二重結合剤実験の速度論データ。ｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８を有するＴ４０−Ｔ−Ｂｉリンカー二重結合剤（＝図中のＴ４０）は、ｐＩＧＦ−１Ｒに対して、ｐＩＲ（ｋｄ＝３．７０Ｅ−０２／ｓ）と比較した場合に１３００倍低い解離速度（ｋｄ＝２．７９Ｅ−０５／ｓ）を示す。
図１０ Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のｐＩＧＦ−１Ｒペプチド（リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ｐＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３０ｎＭ、１０ｎＭ、２×３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。
図１１ Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のＩＧＦ−１Ｒペプチド（リン酸化されていないＩＧＦ−１Ｒペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３００ｎＭ、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。
図１２ Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のｐＩＲペプチド（リン酸化されたインスリン受容体ペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ｐＩＲペプチドの濃度系列は、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。
図１３ （Ａ）ホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）３Ｔ３細胞のペレットの生成のために用いられた３Ｔ３細胞の溶解物を用いたウェスタンブロッティング実験。それぞれの溶解物の５μｇの総タンパク質に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを行った。検出は抗ホスホチロシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、クローン４Ｇ１０）を用いて行われた。アスタリスク（＊）またはアスタリスクの対（＊＊）は、リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒまたはリン酸化されたＩＲタンパク質に関するバンドの位置を示している。（Ｂ）ＦＦＰＥ ３Ｔ３細胞ペレットを用いたＩＨＣ実験の結果。８×Ｃ１８リンカー分子（実施例２．４のリンカー１４）およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８のみまたはｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３のみからなる検出分子は、試験したＦＦＰＥ ３Ｔ３細胞ペレットのいずれに対する染色ももたらさなかった（横列１および２）。対照的に、完全な二重結合剤分子（両方のｓｓＦａｂ’断片＋８×Ｃ１８リンカーからなる）を用いた検出は染色をもたらしたが、ＩＧＦ−１により刺激されたＩＧＦ−１Ｒ過剰発現細胞においてのみであった（横列３）。ＩＲを過剰発現する細胞に対する交差反応性は、ＩＲのリン酸化が誘導された場合でさえも観察されなかった。（Ｃ）異なるリンカーの長さ（リンカーは２×Ｃ１８、４×Ｃ１８、６×Ｃ１８または８×Ｃ１８スペーサーを含有していた；実施例２．４を参照）を有する抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤の、ＩＧＦ−１で刺激してＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を誘導しておいたＩＧＦ−１Ｒを過剰発現するＦＦＰＥ ３Ｔ３細胞に対する性能を比較するＩＨＣ実験。
図１４ Ｈ３２２Ｍ異種移植片切片の免疫染色。ｓｓＦａｂ’断片（ｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３または／およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８それぞれ）につき１０μｇ／ｍｌおよび等モル量の８×Ｃ１８リンカー分子を検出のために用いた。リンカー分子内のビオチン標識は、ストレプトアビジンに基づくＶｅｎｔａｎａ ｉＶＩＥＷ ＤＡＢ検出キットのための検出タグの役目を果たした。
図１５ センサー表面上のビオチン化された二重結合剤を示す、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイの概略図。ビオチン化された８×Ｃ１８リンカー分子を固定し、それをｓｓＦａｂ’ １．４．１６８および／またはｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３をそれぞれ捕捉するために用いた。分析物は、Ｍ−１．４．１６８ ｓｓＦａｂエピトープをペプチドの一方の末端に、Ｍ−３０．４．３３ ｓｓＦａｂホスホ−エピトープを他方の末端に含有するｐＩＧＦ−１Ｒペプチドであった。
図１６ 二重結合剤実験の速度論データを要約した表。ｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８の両方を含有する二重結合剤は、ｓｓＦａｂ’ １．４．１６８単独（ｋｄ＝３．２２Ｅ−０３／ｓ）よりも２３０倍低い解離速度（ｋｄ＝１．３９Ｅ−０５／ｓ）およびｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３単独（ｋｄ＝１．５７Ｅ−０３／ｓ）よりも１１０倍低い解離速度を示す。
図１７ ８×Ｃ１８リンカー分子およびｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３からなる一価結合剤のリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラム。そのアッセイの構成は図１５において示されている通りである。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の合成によるリン酸化されたｐＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３０ｎＭ、１０ｎＭ、２×３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応する速度論データが図１６において示されている。
図１８ ８×Ｃ１８リンカー分子およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８からなる一価結合剤のリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラム。そのアッセイの構成は図１５において示されている通りである。ｐＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３０ｎＭ、１０ｎＭ、２×３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応する速度論データが図１６において示されている。
図１９ ８×Ｃ１８リンカー分子、ｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８からなる二価結合剤のリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラム。そのアッセイの構成は図１５において示されている通りである。ｐＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３０ｎＭ、１０ｎＭ、２×３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応する速度論データが図１６において示されている。
図２０ （Ａ）ホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）２９３細胞のペレットの生成のために用いられたＨｅｋ２９３細胞の溶解物を用いたウェスタンブロッティング実験。それぞれの溶解物の５μｇの総タンパク質に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを行った。検出は抗ホスホチロシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、クローン４Ｇ１０）を用いて行われた。（Ｂ）Ｈｅｋ２９３細胞ペレットを用いたＩＨＣ実験の結果。４×Ｃ１８リンカー分子（実施例２．４のリンカー１２）およびｓｓＦａｂ’ ４．１．１５のみまたはｓｓＦａｂ’ ７．２．３２のみからなる検出分子は、試験したＦＦＰＥ Ｈｅｋ２９３細胞ペレットのいずれに対する染色ももたらさなかった（横列１および２）。対照的に、完全な二重結合剤分子（両方のｓｓＦａｂ’断片＋４×Ｃ１８リンカーからなる）を用いた検出は染色をもたらしたが、ＮＲＧ１−β１により刺激された野生型のＨＥＲ３を過剰発現する細胞においてのみであった（横列３；縦列２）。未刺激の細胞（横列３；縦列１）およびＮＲＧ１−β１で刺激された野生型ＨＥＲ３の代わりに変異型ＨＥＲ３（Ｙ＞Ｆ）（Ｔｙｒ１２８９リン酸化部位を欠いている）を過剰発現する細胞（横列３；縦列３）においてはそれぞれ染色は観察されなかった。
実施例１
トロポニンＴに対する二価結合剤
１．１ モノクローナル抗体およびＦａｂ’断片
ヒト心臓トロポニンＴに異なる重複しないエピトープ（それぞれエピトープＡ’およびエピトープＢ’）で結合する２種類のモノクローナル抗体を用いた。これらの抗体は両方とも最新のＲｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（商標）トロポニンＴアッセイにおいて用いられ、ここでトロポニンＴはサンドイッチ免疫アッセイの形式で検出される。
モノクローナル抗体の培養上清からの精製は、タンパク質化学の現状技術の方法を用いて実施された。
その精製されたモノクローナル抗体を、予め活性化した（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）パパイン（抗エピトープＡ’ ＭＡｂ）またはペプシン（抗エピトープＢ’ ＭＡｂ）のどちらかを用いてプロテアーゼ消化するとＦ（ａｂ’）２断片が得られ、続いてそれを低濃度のシステアミンを用いて３７℃で還元すると、Ｆａｂ’断片、すなわち式Ｉ（Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂ）におけるＡおよびＢそれぞれになる。その反応を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でシステアミンをその試料のポリペプチド含有部分から分離することにより停止する。
１．２ Ｆａｂ’断片のｓｓＤＮＡ−オリゴヌクレオチドへのコンジュゲーション
そのＦａｂ’断片を、下記で記述する活性化されたｓｓＤＮＡａおよびｓｓＤＮＡｂオリゴヌクレオチドとそれぞれコンジュゲートさせる。
Ｆａｂ−断片−ｓｓＤＮＡコンジュゲートＡ”およびＢ”それぞれの調製：
ａ）Ｆａｂ’−抗トロポニンＴ＜エピトープＡ’＞−ｓｓＤＮＡ−コンジュゲート（＝Ａ”）
Ｆａｂ’−抗トロポニンＴ＜エピトープＡ’＞−ｓｓＤＮＡ−コンジュゲートＡ”の調製のために、SED ID NO:5の誘導体、すなわち5’-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C(=SEQ ID NO:5)-XXX-Y-Z-3’が用いられ、ここでX＝ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)により導入されたプロピレン−ホスフェートであり、ここでY＝3’-アミノ修飾剤TFAアミノC-6 lcaa CPG (ChemGenes)により導入された3’-アミノ-修飾剤C6であり、ここでZ＝スルホスクシンイミジル 4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)により導入された4[N-マレインイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
ｂ）Ｆａｂ’−抗トロポニンＴ＜エピトープＢ’＞−ｓｓＤＮＡ−コンジュゲート（＝Ｂ”）
Ｆａｂ−抗トロポニンＴ＜エピトープＢ’＞−ｓｓＤＮＡｂ−コンジュゲート（Ｂ”）の調製のために、SED ID NO:6の誘導体、すなわち5’-Y-Z-XXX-AGT TCT ATC GTC GTC CA-3’が用いられ、ここでX＝ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)により導入されたプロピレン−ホスフェートであり、ここでY＝(6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)により導入された5'-アミノ-修飾剤C6であり、Z＝スルホスクシンイミジル 4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)により導入された4[N-マレインイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
SEQ ID NO:5または6のオリゴヌクレオチドはそれぞれ現状技術のオリゴヌクレオチド合成法により合成された。そのマレインイミド基の導入は、Yのアミノ基のZのスクシンイミジル基との反応により行われ、それは固相オリゴヌクレオチド合成プロセスの間に組み込まれた。
上記で示した一本鎖ＤＮＡコンストラクトはチオール反応性マレイミド基を有し、それはシステアミン処理により生成されたＦａｂ’のヒンジ領域のシステインと反応する。高い百分率の単一標識されたＦａｂ’断片を得るため、ｓｓＤＮＡのＦａｂ’断片に対する相対的なモル比は低く保たれる。単一標識されたＦａｂ’断片（ｓｓＤＮＡ：Ｆａｂ’＝１：１）の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＭｏｎｏＱ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により行われる。効率的な標識および精製の検証は、分析的ゲル濾過クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより達成される。
１．３ ビオチン化されたリンカー分子
ｓｓＤＮＡリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３それぞれにおいて用いられるオリゴヌクレオチドは、現状技術のオリゴヌクレオチド合成法により、ビオチン化に関してビオチン化ホスホラミダイト試薬を用いて合成された。
リンカー１（＝Ｌ１）（スペーサーを有しないビオチン化ｓｓＤＮＡリンカー１）は、以下の組成を有する：
5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T (ビオチン-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’。それはそれぞれSEQ ID NO:7および8のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、ビオチン-dT (5’-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3’-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)の使用によりビオチン化された。
リンカー２（＝Ｌ２）（１１塩基長のスペーサーを有するビオチン化ｓｓＤＮＡリンカー２）は、以下の組成を有する：
5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T5-(ビオチン-dT)-T5 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’。それはそれぞれSEQ ID NO:7および8のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、それぞれ５個のチミジンからなる２回のオリゴヌクレオチドの一続きを含み、そのスペーサーの中央においてビオチン-dT (=T-Bi) (5’-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3’-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)の使用によりビオチン化された。
リンカー３（＝Ｌ３）（３１塩基長のスペーサーを有するビオチン化ｓｓＤＮＡリンカー３）は、以下の組成を有する：
5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T15-(ビオチン-dT)-T15 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’。それはそれぞれSEQ ID NO:7および8のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、それぞれ１５個のチミジンからなる２回のオリゴヌクレオチドの一続きを含み、そのスペーサーの中央においてビオチン-dT (5’-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3’-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)の使用によりビオチン化された。
１．４ 一価トロポニンＴ結合剤ＡおよびＢそれぞれに関するエピトープ
抗トロポニンＴ抗体ａおよびｂそれぞれに由来する対応するＦａｂ’断片に対してそれぞれ中程度の親和性しか有しない合成ペプチドが考えられた（ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ）。
ａ）抗体ａに関するエピトープＡ’は次の配列中に含まれ：
SEQ ID NO:9 = ERAEQQRIRAEREKEUUSLKDRIEKRRRAERAEアミド
ここでUはβアラニンを表す。
ｂ）抗体ｂに関するエピトープＢ’は次の配列中に含まれ：
SEQ ID NO:10 = SLKDRIERRRAERAEOOERAEQQRIRAEREKEアミド
ここでOはアミノ-トリオキサ-オクタン酸を表す。
当業者は理解するであろうように、これら２種類のエピトープを含有するペプチドを２通りで組み合わせることが可能であり、両方の変種はエピトープＡ’およびＢ’を線状に組み合わせることにより設計および調製された。両方の変種の配列：エピトープの線状配列Ａ’−Ｂ’（＝ＴｎＴ−１）およびＢ’−Ａ’（＝ＴｎＴ−２）はそれぞれ現状技術のペプチド合成法により調製された。
エピトープＡ’およびＢ’に関する配列はそれぞれ、ヒトの心臓トロポニンＴの配列（Ｐ４５３７９／ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）上の本来のエピトープと比較してそれらに対するＦａｂのそれぞれに関する結合親和性を低減するために修正されていた。これらの状況下で、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）技術により結合親和性を分析することにより、ヘテロ二価結合の作用の動態をよりよく観察することができる。
１．５ 生体分子相互作用分析
この実験に関して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、系の中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＡセンサーと共にＴ＝２５℃で用いた。前条件付け（Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）は１００μｌ／分で５０ｍＭ ＮａＯＨ中の１Ｍ ＮａＣｌの３×１分間の注入および１分間の１０ｍＭ ＨＣｌの注入で行われた。
ＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）をシステム緩衝液として用いた。試料緩衝液はシステム緩衝液と同一であった。
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００システムは制御ソフトウェアＶ１．１．１の下で運転された。フローセル１を７ＲＵのＤ−ビオチンで飽和させた。フローセル２上に１０６３ＲＵのビオチン化ｓｓＤＮＡリンカーＬ１を固定した。フローセル３上に８７９ＲＵのビオチン化ｓｓＤＮＡリンカーＬ２を固定した。フローセル４上に６７４ＲＵのビオチン化ｓｓＤＮＡリンカーＬ３を捕捉させた。
その後、Ｆａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＡ”を６００ｎＭで注入した。Ｆａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＢ”をシステム中に９００ｎＭで注入した。そのコンジュゲートを２μｌ／分の流速で３分間注入した。そのコンジュゲートを連続的に注入してそれぞれのＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートのそのそれぞれのリンカー上でのそれぞれの飽和シグナルを監視した。Ｆａｂ’の組み合わせは、それぞれのリンカー上に存在する単一のＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＡ”、単一のＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＢ”ならびに両方のＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＡ”およびＢ”を用いて駆動された（ｄｒｉｖｅｎ）。安定なベースラインはそのリンカーがＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートにより飽和された後に生成され、それはさらなる速度論的測定のための必要条件であった。
人工のペプチド分析物ＴｎＴ−１およびＴｎＴ−２を、溶液中の分析物として、表面に提示されたＦａｂ’断片と相互作用させるためにそのシステム中に注入した。
ＴｎＴ−１を５００ｎＭの分析物濃度で注入し、ＴｎＴ−２を９００ｎＭの分析物濃度で注入した。両方のペプチドを５０μｌ／分で４分間の会合時間で注入した。解離を５分間監視した。全てのフローセルに関して、５０ｍＭ ＮａＯＨの５０μｌ／分での１分間の注入により再生を行った。
速度論データをＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｖ．４．１）を用いて決定した。ＴｎＴ−１およびＴｎＴ−２ペプチドのそれぞれの表面に提示されたＦａｂ’断片の組み合わせからの解離速度ｋｄ（１／ｓ）を、線形ラングミュア１：１当てはめ（ｆｉｔｔｉｎｇ）モデルに従って決定した。その複合体の分での半減時間を一次速度方程式：ｌｎ（２）／（６０＊ｋｄ）の解法に従って計算した。
結果：
表１および２それぞれにおいて示した実験データは、分析物（ＴｎＴ−１またはＴｎＴ−２）それぞれおよび様々なヘテロ二価Ｆａｂ’−Ｆａｂ’二量体Ａ”−Ｂ”の間の複合体の安定性における一価ｄｓＤＮＡ Ｆａｂ’Ａ”またはＢ”コンジュゲートそれぞれと比較した場合の増大を実証している。この作用はそれぞれの表において２および３行目（ｌｉｎｅ）と比較した１行目において見られる。
その結合活性作用はさらにそのリンカーの長さに依存している。表１の下に示した副表（ｓｕｂ−ｔａｂｌｅｓ）において、すなわち人工分析物ＴｎＴ−１に関して、チミジンに基づく３１塩基長のスペーサーを含むリンカーＬ３は最低の解離速度または最高の複合体安定性を示す。
表２の下に示した副表において、チミジンに基づく１１塩基長のスペーサーを含むリンカーＬ２は人工分析物ＴｎＴ−２に関して最低の解離速度または最高の複合体安定性を示す。
これらのデータをまとめると、本発明において与えられるアプローチに本来備わっているようなリンカーの長さにおける柔軟性は非常に有用かつ好都合であることを実証している。
実施例２
リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒに対する二価結合剤
２．１ モノクローナル抗体の開発（ｍＡｂ ８．１．２、ｍＡｂ １．４．１６８およびｍＡＢ ３０．４．３３）
ａ）マウスの免疫処置
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを０、３、６および９週目においてそれぞれ免疫する。免疫処置あたり１００μｇのリン酸化されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）(SEQ ID NO:11)を含むコンジュゲートを用いる。このペプチドは、チロシン１３４６においてリン酸化され（＝１３４６−ｐＴｙｒ）、Ｃ末端のシステインを介してＫＬＨに連結されて（＝Ａｏｃ−Ｃｙｓ−ＭＰ−ＫＬＨ−１３４０）、免疫処置のために用いられるコンジュゲートがもたらされた。０および６週目それぞれにおいて腹腔内に、３および９週目それぞれにおいてマウスの体の様々な部分において皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｕｏｓｌｙ）免疫処置を実施する。
ｂ）融合およびクローニング
免疫したマウスの脾臓細胞を、Galfre G., and Milstein C., Methods in Enzymology 73 (1981) 3-46に従って骨髄腫細胞と融合させる。このプロセスにおいて、免疫したマウスの約１×１０８個の脾臓細胞を２×１０７個の骨髄腫細胞ａ（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８６５３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）と混合し、遠心分離する（２５０ｇおよび３７℃において１０分間）。次いでその細胞をウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含まないＲＰＭＩ １６４０培地で１回洗浄し、５０ｍｌコニカルチューブ中で２５０ｇで再度遠心分離する。上清を廃棄し、細胞沈降物をタッピングにより穏やかにほぐし、１ｍｌのＰＥＧ（分子量４０００、Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット）を添加し、ピペット操作により混合する。３７℃の水浴中で１分間保温した後、５ｍｌのＦＣＳを含まないＲＰＭＩ １６４０を室温で４〜５分の期間内に滴加する。この工程をさらに１０ｍｌのＦＣＳを含まないＲＰＭＩ １６４０を用いて繰り返す。その後、２５ｍｌの１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０を添加し、続いて３７℃、５％ＣＯ２において３０分間の保温工程を行う。２５０ｇおよび４℃において１０分間の遠心分離の後、その沈降した細胞を１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０中に回収し、ヒポキサンチン−アザセリン選択培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ ＦＣＳ中１００ｍｍｏｌ／ｌヒポキサンチン、１μｇ／ｍｌアザセリン）中で蒔く。１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン６をその培地に増殖因子として添加する。７日後、その培地を新しい培地と交換する。１０日目に、その初代培養物を特異的な抗体に関して試験する。陽性の初代培養物を、蛍光活性化セルソーターにより、９６ウェル細胞培養プレートにおいてクローニングする。
ｃ）細胞培養上清からの免疫グロブリンの単離
得られたハイブリドーマ細胞をＣＥＬＬｉｎｅ １０００ ＣＬフラスコ（Ｉｎｔｅｇｒａ）中で１×１０７細胞の密度で蒔く。ＩｇＧを含有するハイブリドーマ細胞上清を週２回収集する。収量は典型的には１ｍｌの上清あたり４００μｇ〜２０００μｇのモノクローナル抗体の範囲である。抗体の培養上清からの精製は、タンパク質化学の一般的に用いられる方法を用いて（例えばBruck, C., Methods in Enzymology 121 (1986) 587-596に従って）実施した。
２．２ ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの合成
それぞれSEQ ID NO: 5および6において示した配列を含む、以下のアミノ修飾された前駆体を、標準的な方法に従って合成した。下記で示したオリゴヌクレオチドは、いわゆるアミノリンカーだけでなく蛍光色素も含む。当業者はすぐに理解するであろうように、この蛍光色素はオリゴヌクレオチド自体の、ならびにそれらを含む構成要素の精製を促進するために非常に好都合である。
ａ） 5’-フルオレセイン-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-(スペーサーC3)3-C7アミノリンカー-;
ｂ） 5’-Cy5 AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-(スペーサーC3)3-C7アミノリンカー-;
ｃ） 5’-アミノリンカー-(スペーサーC3)3-AGT TCT ATC GTC GTC CA-フルオレセイン-3’;
ｄ） 5’-フルオレセイン-(ベータL AGT CTA TTA ATG CTT CTG C)-(スペーサーC3)3-C7アミノリンカー-;（ベータLはこれがＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドであることを示す）および
ｅ） 5’-アミノリンカー-(スペーサーC3)3-(ベータL-AGT TCT ATC GTC GTC CA)-フルオレセイン-3’（ベータLはこれがＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドであることを示す）。
合成はＡＢＩ ３９４合成装置上で１０μｍｏｌスケールで、（５’アミノ修飾に関して）トリチルオンまたは（３’アミノ修飾に関して）トリチルオフモードで、固体支持体として商業的に入手可能なＣＰＧを、ならびに標準的なｄＡ（ｂｚ）、ｄＴ、ｄＧ（ｉＢｕ）およびｄＣ（Ｂｚ）ホスホラミダイト（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて実施された。
オリゴヌクレオチド合成の間に以下のアミダイト類、アミノ修飾剤およびＣＰＧ支持体を用いてＣ３スペーサー、色素およびアミノ部分をそれぞれ導入した：
スペーサーホスホラミダイトC3(3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
5’アミノ修飾剤は、5’-アミノ-修飾剤C6(6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)を用いることにより導入した;
5’-フルオレセインホスホラミダイト 6-(3',6'-ジピバロイルフルオレセイニル-6-カルボキサミド)-ヘキシル-1-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research);
Cy5（商標）ホスホラミダイト 1-[3-(4-モノメトキシトリチルオキシ)プロピル]-1'-[3-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピルホスホラミジチル]プロピル]-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニンクロリド(1-[3-(4-monomethoxytrityloxy)propyl]-1'-[3-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl phosphoramidityl]propyl]-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine chloride)(Glen Research);
LightCyclerフルオレセインCPG 500 A (Roche Applied Science);および
3’-アミノ修飾剤TFAアミノC-6 lcaa CPG 500 A (Chemgenes)。
Cy5標識されたオリゴヌクレオチドに関して、dA(tac)、dT、dG(tac)、dC(tac)ホスホラミダイト(Sigma Aldrich)を用いて、３３％アンモニアによる脱保護を室温で２時間実施した。
Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ベータ-L-dA(bz)、dT、dG(iBu)およびdC(Bz)ホスホラミダイト(Chemgenes)を用いることにより合成された。
フルオレセイン修飾されたハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの精製は、２工程の手順により実施された：まず、そのオリゴヌクレオチドを逆相HPLC(Merck-Hitachi-HPLC; RP-18カラム;勾配系[A: 0.1 M (Et3NH)OAc (pH 7.0)/MeCN 95:5; B: MeCN]: 3分間のA中20% B、12分間のA中20〜50% Bおよび25分間のA中20% B、1.0 ml/分の流速、260 nmにおいて検出)上で精製した。望まれる生成物を含有する画分（分析的RP HPLCにより監視した）を合わせ、蒸発させて乾燥させた（５’末端においてモノメトキシトリチル保護されたアルキルアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドは、２０％酢酸と共に２０分間保温することにより脱トリチル化する）。フルオレセインを標識として含有するオリゴマーは、HPLC上でのIEXクロマトグラフィー[Mono Qカラム：緩衝液A：水酸化ナトリウム(10 mM/l; pH約12)；緩衝液B：水酸化ナトリウム(10 mM/l; pH約12)中で溶解させた1M塩化ナトリウム；勾配：３０分間で100%緩衝液Aから100%緩衝液Bまで、流速1 ml/分、260 nmにおいて検出]により再度精製した。その生成物を透析により脱塩した。
Cy5標識されたオリゴマーは、逆相ＨＰＬＣ上での最初の精製(Merck-Hitachi-HPLC; RP-18カラム;勾配系[A: 0.1 M (Et3NH)OAc (pH 7.0)/MeCN 95:5; B: MeCN]:3分間のA中20% B、12分間のA中20〜50% Bおよび25分間のA中20% B、1.0 ml/分の流速、260 nmにおいて検出)の後に用いられた。そのオリゴマーを透析により脱塩し、Speed-Vacエバポレーター上で凍結乾燥させると固体が得られ、それを-24℃で凍結させた。
２．３ ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの活性化
実施例２からのアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドを0.1 Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH 8.5)中で溶解させ(c= 600 μmol)、DMF中で溶解させた１８倍モル過剰量のThermo ScientificからのスルホSMCC (スルホスクシンイミジル 4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート) (c= 3mg/100μl)と反応させた。その反応生成物を、スルホSMCCの加水分解分解産物である4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレートを除去するために、水に対して完全に透析した。
その透析物を蒸発により濃縮し、チオール基を含む一価結合剤とのコンジュゲーションのために直接用いた。
２．４ 両端においてハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むリンカーオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、標準的な方法により、ＡＢＩ ３９４合成装置上で１０μｍｏｌスケールで、トリチルオンモードで、固体支持体として商業的に入手可能なｄＴ−ＣＰＧを用いて、標準的なｄＡ（ｂｚ）、ｄＴ、ｄＧ（ｉＢｕ）およびｄＣ（Ｂｚ）ホスホラミダイト（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて合成された。
Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、固体支持体として商業的に入手可能なベータＬ−ｄＴ−ＣＰＧを、ならびにベータ−Ｌ−ｄＡ（ｂｚ）、ｄＴ、ｄＧ（ｉＢｕ）およびｄＣ（Ｂｚ）ホスホラミダイト（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）を用いることにより合成された。
オリゴヌクレオチドの精製を、実施例２．３の下で記述したように逆相ＨＰＬＣ上で実施した。望まれる生成物を含有する画分（分析的ＲＰ ＨＰＬＣにより分析／監視した）を合わせ、蒸発させて乾燥させた。脱トリチル化を、８０％酢酸と共に１５分間保温することにより実施した。酢酸を蒸発により除去した。残留物（ｒｅｍｉｎｄｅｒ）を水中で溶解させ、凍結乾燥した。
オリゴヌクレオチド合成の間に以下のアミダイト類およびＣＰＧ支持体を用いてＣ１８スペーサー、ジゴキシゲニンおよびビオチン基を導入した：
スペーサーホスホラミダイト18 (18-O-ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
ビオチン-dT (5'-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
ビオチンホスホラミダイト 1-ジメトキシトリチルオキシ-2-(N-ビオチニル-4-アミノブチル)-プロピル-3-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイトならびに
ジゴキシゲニン-N-ヒドロキシル-スクシンイミジルエステルによるアミノ修飾および後標識に関して、5'-ジメトキシトリチル-5-[N-(トリフルオロアセチルアミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン、3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト。
以下の架橋コンストラクトまたはリンカーを合成した：
リンカー1: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー2: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(T40)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー3: 5’-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(ビオチン-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー4: 5’-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T5-(ビオチン-dT)-T5-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー5: 5’-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T20-(ビオチン-dT)-T20-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー6: 5’-[B-L] G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T30-(ビオチン-dT)-T30-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー7: 5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T5-(ビオチン-dT)-T5 TG GAC GAC GAT AGA ACT-3’
リンカー8: 5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T10-(ビオチン-dT)-T10 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー9: 5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T15-(ビオチン-dT)-T15 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー10: 5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T20-(ビオチン-dT)-T20 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー11: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-スペーサーC18-(ビオチン-dT)-スペーサーC18-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー12: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(スペーサーC18)2-(ビオチン-dT)-(スペーサーC18)2-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー13: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(スペーサーC18)3-(ビオチン-dT)-(スペーサーC18)3-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー14: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(スペーサーC18)4-(ビオチン-dT)-(スペーサーC18)4-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー15: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T20-(Dig-dT)-T20-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー16: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(Dig-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー17: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(ビオチン-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’。
上記の架橋コンストラクトの実施例は、少なくとも第１のハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドおよび第２のハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含む。リンカー３〜１７は、そのハイブリダイズ可能な核酸の一続きに加えて、中央のそれぞれビオチン化もしくはジゴキシゲニン化されたチミジンまたは上記で示した長さのチミジン単位からなるスペーサーを含む。
その5’ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:7に、その3’ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:8にそれぞれ対応する。SEQ ID NO:7のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:5のオリゴヌクレオチドに容易にハイブリダイズするであろう。SEQ ID NO:8のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:6のオリゴヌクレオチドに容易にハイブリダイズするであろう。
上記の架橋コンストラクトの実施例において、[B-L]はＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列が示されていることを示し；スペーサーＣ１８、ビオチンおよびビオチンｄＴはそれぞれ上記で示した構築ブロックに由来するようなＣ１８スペーサー、ビオチンおよびビオチン−ｄＴを指し；そして数を伴うＴは示した位置においてそのリンカー中に組み込まれたチミジン残基の数を示す。
２．５ 二重結合剤コンストラクトの組み立て
Ａ）ＩｇＧの切断およびＦａｂ’断片のｓｓＤＮＡによる標識
精製したモノクローナル抗体をペプシンプロテアーゼの助けにより切断するとＦ（ａｂ’）２断片が得られ、続いてそれを３７℃での低濃度のシステアミンでの処理により還元するとＦａｂ’断片になる。その反応を、ＰＤ １０カラム上でのシステアミンの分離により停止する。そのＦａｂ’断片を、実施例３に従って生成されるような活性化されたオリゴヌクレオチドにより標識する。この一本鎖ＤＮＡ（＝ｓｓＤＮＡ）はチオール反応性マレイミド基を有し、それはＦａｂ’のヒンジ領域のシステインと反応する。高い百分率の単一標識されたＦａｂ’断片を得るため、ｓｓＤＮＡのＦａｂ’断片に対する相対的なモル比は低く保たれる。単一標識されたＦａｂ’断片（ｓｓＤＮＡ：Ｆａｂ’＝１：１）の精製は、イオン交換クロマトグラフィー（カラム：Ｓｏｕｒｃｅ １５ Ｑ ＰＥ ４．６／１００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＧＥ）により行われる。効率的な精製の検証は、分析的ゲル濾過およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより達成される。
Ｂ）抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤の組み立て
抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤は、ＩＧＦ−１Ｒの細胞内ドメインの異なるエピトープを標的とする２種類のＦａｂ’断片に基づいている：Ｆａｂ’ ８．１．２は前記の標的タンパク質のリン酸化部位（ｐＴｙｒ １３４６）を検出し、Ｆａｂ’ １．４．１６８は前記の標的タンパク質の非ホスホ部位を検出する。そのＦａｂ’断片は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に共有結合的に連結されている：Ｆａｂ’ １．４．１６８はSEQ ID NO:6を含みフルオレセインを蛍光マーカーとして含有する１７塩基長のｓｓＤＮＡに、そしてＦａｂ’ ８．１．２はSEQ ID NO:5を含みＣｙ５を蛍光マーカーとして含有する１９塩基長のｓｓＤＮＡに共有結合的に連結されている。以下、共有結合した１７塩基長または１９塩基長のｓｓＤＮＡを有するこれらのＦａｂ’をそれぞれｓｓＦａｂ’ １．４．１６８およびｓｓＦａｂ’ ８．１．２と呼ぶ。二重結合剤の組み立ては、そのｓｓＦａｂ’断片の対応するｓｓＤＮＡにハイブリダイズする２種類の相補性ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（それぞれSEQ ID NO:7および8）を含むリンカー（すなわち架橋コンストラクト）により媒介される。その二重結合剤の２個のｓｓＦａｂ’断片の間の距離は、スペーサー、例えばＣ１８スペーサーまたは異なる長さのＤＮＡをそれぞれ用いることにより修正することができる。
組み立て評価のために、その二重結合剤構成要素ｓｓＦａｂ’ ８．１．２、ｓｓＦａｂ’ １．４．１６８ならびにリンカーコンストラクト（Ｉ）（＝実施例２．４のリンカー１７）5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT T(-Bi)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’および（ＩＩ）（＝実施例２．４のリンカー１０）5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(T20)-T(-Bi)-(T20)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’を室温で等モル量で混合した。１分間の保温工程の後、その反応混合物を分析的ゲル濾過カラム(Superdex（商標）200、10/300 GL、GE Healthcare)上で分析した。単一の二重結合剤構成要素の溶離体積（ＶＥ）のその反応混合物のＶＥとの比較は、その二重結合剤がうまく形成されたことを実証している（図１）。（そのリンカーの両方の中央にあるビオチン化チミジン(T-(Bi))は、これらの実験において機能を有しない。）
２．６ 抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤の固定されたＩＧＦ−１ＲおよびＩＲペプチドへの結合を評価するＢｉａｃｏｒｅ（商標）実験
この実験に関して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、系の中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＡセンサーと共にＴ＝２５℃で用いた。前条件付けは１００μｌ／分で５０ｍＭ ＮａＯＨ中の１Ｍ ＮａＣｌの３×１分間の注入および１分間の１０ｍＭ ＨＣｌの注入で行われた。
ＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）をシステム緩衝液として用いた。試料緩衝液はシステム緩衝液と同一であった。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００システムは制御ソフトウェアＶ１．１．１の下で運転された。
続いてビオチン化されたペプチドをそれぞれのフローセル中のＳＡ表面上に捕捉させた。１６ＲＵのＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）［１３４６−ｐＴｙｒ；Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ−１３４０］アミド（すなわち、１３４６位のチロシンがリン酸化されており、位置１３４０に対応するグルタミン酸を介して結合したＰＥＧリンカーを含み、そのリンカーの他方の末端においてビオチン化されている、SEQ ID NO:11のペプチド）をフローセル２上に捕捉させた。１８ＲＵのＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）；Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ−１３４０］アミド（すなわち、１３４６位のチロシンがリン酸化されておらず、位置１３４０に対応するグルタミン酸を介して結合したＰＥＧリンカーを含み、そのリンカーの他方の末端においてビオチン化されている、SEQ ID NO:11のペプチド）をフローセル３上に捕捉させた。２０ＲＵのｈＩＲ（１３５５〜１３８２）［１３６１−ｐＴｙｒ；Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ−１３５５］アミド（すなわち、１３６１位のチロシンがリン酸化されており、ヒトインスリン受容体の位置１３５５に対応するグルタミン酸を介して結合したＰＥＧリンカーを含み、そのリンカーの他方の末端においてビオチン化されている、SEQ ID NO:12のペプチド）をフローセル４上に捕捉させた。最後に、全てのフローセルをｄ−ビオチンで飽和させた。
二重結合剤の形成に関して、実施例２．５において記述したような組み立てプロトコルを用いた。２種類のｓｓＦａｂ’の一方のみを用いて個々の運転を実施した際、リンカーＤＮＡの非存在または存在は会合または解離曲線に影響を及ぼさなかった（データは示していない）。
１００ｎＭの溶液中の分析物（これらの実験では二価二重結合剤）を５０μｌ／分で２４０秒の会合時間の間に注入し、解離を５００秒間監視した。８０ｍＭ ＮａＯＨを用いた５０μｌ／分での１分間の注入工程を用いることにより、効率的な再生が達成された。フローセル１は基準の役目を果たした。抗原の注入の代わりにブランク緩衝液の注入を用いて、緩衝液のシグナルを引くことによりそのデータを二重に参照した。
それぞれの測定サイクルにおいて、溶液中の以下の分析物の１つを４つのフローセル全てにわたってそれぞれ注入した：１００ｎＭのｓｓＦａｂ’ ８．１．２、１００ｎＭのｓｓＦａｂ’ １．４．１６８、１００ｎＭのｓｓＦａｂ’ ８．１．２および１００ｎＭのｓｓＦａｂ’の混合物、リンカー（ＩＩＩ）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(20)-T(-Dig)-(T20)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’（＝実施例２．４のリンカー１５））上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８からなる１００ｎＭの二価結合剤、ならびにリンカー（ＩＶ）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(-Dig)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’（＝実施例２．４のリンカー１６））上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’ ８．１．２およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８からなる１００ｎＭの二価結合剤。（上記のリンカー中の中央のチミジンのジゴキシゲニン化(T(-Dig))は、これらの実験に関連しない。）
そのシグナルは、時間依存性Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラムとして監視された。
報告の時点は、それぞれの相互作用の応答単位シグナルの高さを監視するため、分析物の会合段階の終了時（結合末期（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｌａｔｅ）、ＢＬ）に、および分析物の解離段階の終了時（安定性末期（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｌａｔｅ）、ＳＬ）に設定された。解離速度ｋｄ（１／ｓ）をＢｉａｃｏｒｅ（商標）評価ソフトウェア４．１を用いて線形１：１ラングミュア当てはめに従って計算した。その複合体の分での半減時間を式ｌｎ（２）／（６０＊ｋｄ）に基づいて計算した。
そのセンサーグラム（図２−５）は、ｓｓＦａｂ’ １．４．１６８およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８が二重結合剤（＝二価結合剤）の形態で用いられた際の、おそらく基礎になっている協同的結合作用による、ｐＩＧＦ−１Ｒ結合における特異性および複合体の安定性の両方における増大を示している。Ｆａｂ’ １．４．１６８単独ではｐＩＲペプチドに関する交差反応性を示さないが、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化型および非リン酸化型を識別しない（両方の場合においてＴ１／２ ｄｉｓ＝３分）。しかし、Ｆａｂ’ ８．１．２はＩＧＦ１−Ｒペプチドのリン酸化版にのみ結合するが、リン酸化されたインスリン受容体とのいくらかの望まれない交差反応性を示す。その二重結合剤はｐＩＧＦ−１Ｒペプチドおよび両方の他のペプチドを十分に識別し（図４参照）、従って非特異的結合の問題の克服を助ける。その特異性における増大は、両方のＦａｂ’がリンカーＤＮＡなしで適用された場合には失われることを特筆する（図５）。その二重結合剤のｐＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する親和性における増大は、個々のＦａｂ’およびそのリンカーＤＮＡを抜かしたＦａｂ’混合物と比較して増大した解離半減時間において示される（図３および図５）。試験した２種類の異なるＤＮＡリンカーの長さを有する二重結合剤は標的結合特異性および親和性への全体的なプラスの作用を共有しているが、より長いリンカー（Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇをスペーサーとして有する（ＩＩＩ））（すなわち実施例２．４のリンカー１５）が両方の基準に関して好都合であるように思われる。
２．７ Ｍ−１．４．１６８−ＩｇＧおよびＭ−８．１．２−ＩｇＧのＢｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイサンドイッチ
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をシステム中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５センサーと共に用いた。そのセンサーは、０．１％ ＳＤＳ、５０ｍＭ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＨＣｌおよび１００ｍＭ Ｈ３ＰＯ４の１００μｌ／分での１分間の注入により前条件付けされた。
システム緩衝液はＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液はシステム緩衝液であった。
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００システムは制御ソフトウェアＶ１．１．１の下で運転された。１０ｍＭ酢酸Ｎａ（ｐＨ４．５）中で３０μｇ／ｍｌのポリクローナルウサギＩｇＧ抗体＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を、１００００ＲＵでフローセル１、２、３、および４それぞれの上に、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学により、製造業者の説明書に従って固定した。最後に、そのセンサー表面を１Ｍエタノールアミンでブロッキングした。全部の実験を１３℃で運転した。
５００ｎＭの一次ｍＡｂ Ｍ−１．００４．１６８−ＩｇＧを＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ表面上に１０μｌ／分で１分間捕捉させた。ブロッキング溶液を含有する３μＭの（ＩｇＧクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３の）ＩｇＧ断片混合物を３０μｌ／分で５分間注入した。ペプチドＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）［１３４６−ｐＴｙｒ；Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ−１３４０］アミドを３００ｎＭで３０μｌ／分において３分間注入した。３００ｎＭの二次抗体Ｍ−８．１．２−ＩｇＧを３０μｌ／分で注入した。１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．７）を５０μｌ／分で３分間用いてセンサーを再生させた。
図６はそのアッセイの構成を説明している。図７において、その測定の結果を示す。その測定は、両方のモノクローナル抗体がそれらのそれぞれの標的ペプチド上の２つの別個の無関係なエピトープに同時に結合することができることを明確に示している。これは、協同的結合事象を生じさせる目的を有するあらゆる後の実験のための必要条件である。
２．８ センサー表面上の二重結合剤のＢｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をシステム中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＡセンサーと共にＴ＝２５℃で用いた。そのシステムは、１００μｌ／分での５０ｍＭ ＮａＯＨ中１Ｍ ＮａＣｌの３×１分間の注入および１分間の１０ｍＭ ＨＣｌの注入により前条件付けされた。
システム緩衝液はＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液はシステム緩衝液であった。
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００システムは制御ソフトウェアＶ４．１の下で運転された。
１２４ＲＵのアミノ−ＰＥＯ−ビオチンを基準フローセル１上に捕捉させた。１５９５ＲＵのビオチン化された１４．６ｋＤａのＴ０−Ｂｉ ３７塩基長ｓｓＤＮＡ−リンカー（Ｉ）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(-Bi)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’）（＝実施例２．４のリンカー１７）および１０４２ＲＵのビオチン化された２３．７ｋＤａのＴ４０−Ｂｉ ７７塩基長ｓｓＤＮＡ−リンカー（ＩＩ）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(20)-(ビオチン-dT)-(T20)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’＝実施例２．４のリンカー１０）を、異なるフローセル上に捕捉させた。
３００ｎＭのｓｓＦａｂ’ ８．１．２および３００ｎＭのｓｓＦａｂ’ １．００４．１６８をそのシステムの中に５０μｌ／分で３分間注入した。それぞれのｓｓＦａｂの速度論的寄与を試験するため、対照として３００ｎＭのｓｓＦａｂ’ ８．１．２または３００ｎＭのｓｓＦａｂ’ １．００４．１６８のみを注入した。対照として、緩衝液をｓｓＦａｂの代わりに注入した。ペプチドｐＩＲ（１３５５〜１３８２）［１３６１−ｐＴｙｒ］アミドおよびＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）アミドそれぞれ（溶液中で遊離している（ｆｒｅｅ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ））をシステム中に０ｎＭ、４ｎＭ、１１ｎＭ、３３ｎＭ（２回）、１００ｎＭおよび３００ｎＭの濃度段階で５０μｌ／分で４分間注入した。ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）［１３４６−ｐＴｙｒ］アミドに対する親和性を測定するための実験の別のセットにおいて、０ｎＭ、０．４ｎＭ、１．１ｎＭ、３．３ｎＭ（２回）、１０ｎＭおよび３０ｎＭの濃度段階を用いた。
解離を５０μｌ／分で５．３分間監視した。それぞれの濃度工程の後、２５０ｍＭのＮａＯＨの１２秒間のパルスによりシステムを再生し、ｓｓＦａｂ’リガンドを再装填した（ｒｅｌｏａｄｅｄ）。
図８はＢｉａｃｏｒｅ（商標）機器上のアッセイ構成を模式的に説明している。図９で示した表は、このアプローチからの定量の結果を示す。図１０、１１および１２はＴ４０二重結合剤を用いたこのアッセイ構成からの典型的なＢｉａｃｏｒｅ（商標）の結果を示す。
図９における表は、二重結合剤の概念の利益を実証している。Ｔ４０二重結合剤（実施例２．４のリンカー１０、すなわちＴ２０−ビオチン−ｄＴ−Ｔ２０のスペーサーを有するリンカーを有する二重結合剤）は結果として、それぞれ１９２分および３０ｐＭであるＴ０二重結合剤（すなわち実施例２．４のリンカー１６を有する二重結合剤）と比較した場合に、２倍向上した抗原複合体の半減時間（４１４分）および３倍向上した親和性（１０ｐＭ）をもたらす。これは最適な協同的結合作用をもたらすためにリンカーの長さを最適化する必要性を強調する。
Ｔ４０二重結合剤（すなわちＴ４０−Ｂｉリンカー（実施例２．４のリンカー１０）を含む二重結合剤）は、リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する１０ｐＭの親和性を示す（図９、図１０における表）。これはリン酸化されたインスリン受容体ペプチド（２４ｎＭ）に対する２４００倍の親和性の向上であり、リン酸化されていないＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する１００倍の向上である。
従って、２種類の別個の分離された結合事象の組み合わせにより特異性および親和性を増大させる目的は達成されている。
協同的結合作用は特にリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する解離速度から明らかになり、ここで二重結合剤は、一価結合剤８．１．２単独による０．５分および一価結合剤１．４．１６８単独による３分それぞれに対して４１４分の抗原複合体半減時間を示す。
さらに、完全に組み立てられたコンストラクトは、単独でＦａｂ’がハイブリダイズしたコンストラクトと比較した場合に、その解離速度ｋｄ（１／ｓ）をおおよそ掛け合わせる（図１０、１１、１２および図９中の表）。興味深いことに、会合速度ｋａ（１／Ｍｓ）も単独のＦａｂ’の相互作用事象と比較した場合にわずかに増大し、これはそのコンストラクトの分子の柔軟性の増大によるものである可能性がある。
強い洗浄手順を用いる診断系は、個々の（一価の）Ｆａｂ’分子とは対照的に、そのＴ４０二重結合剤の高い性能を確実に促進するはずである。そのハイブリダイズしたコンストラクト、すなわち本発明に従う二価結合剤は特異的かつ極めて安定な結合事象をもたらすが、一価結合剤はより急速に解離し、例えばそれらはより急速に洗い流される。
２．９ 免疫組織化学（ＩＨＣ）実験における抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤分子の評価
ここで記述するＩＨＣ実験は、ＶｅｎｔａｎａからのＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＸＴプラットフォーム上で実施された。そのアッセイに関して、ｓｓＦａｂ’ １．４．１６８（ＩＧＦ−１Ｒの細胞内ドメインの非ホスホエピトープに結合する）、ｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３（ＩＧＦ−１Ｒの細胞内ドメインのｐＴｙｒ１３４６ホスホエピトープに結合する）および柔軟なリンカーからなる抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤を用いた。抗体１．４．１６８の生成は実施例２．１において記述されており、抗体３０．４．３３（それぞれSEQ ID NO:19で示した可変領域重鎖およびSEQ ID NO:20で示した可変領域軽鎖）はそこで記述したものと同じ手順を用いて生成された。３０．４．３３のＦａｂ’断片は、ｐＴｙｒ １３４６ ＩＧＦ−１Ｒリン酸化部位に対して以前に用いられた抗体８．１．２のＦａｂ’断片よりも高い親和性を有する（ｓｓＦａｂ’ ８．１．２のＴ１／２ ｄｉｓｓは約０．５分、ｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３のＴ１／２ ｄｉｓｓは約７分）。
異なる長さのスペーサーを有する柔軟なリンカー（＝実施例２．４のリンカー１１、１２、１３、１４）をこのアッセイにおいて用いた。そのリンカー分子内のビオチン標識は、ストレプトアビジンに基づくＶｅｎｔａｎａ ｉＶＩＥＷ ＤＡＢ検出キットのための検出タグの役目を果たした。
抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤分子の特異性を試験するため、ホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）３Ｔ３細胞に基づく精巧な試験系を用いた。３Ｔ３細胞にＩＧＦ−１ＲまたはＩＲ発現ベクターのどちらかを安定導入しておいた。細胞を標準的なプロトコルに従ってホルマリンで固定し、パラフィン中に包理した。固定の前に細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１もしくはインスリンのどちらかで刺激してＩＧＦ１−ＲもしくはＩＲのリン酸化を誘導し、または未処理のままにした。ウェスタンブロッティング実験（図１３Ａ）は、受容体リン酸化の刺激の成功を証明した。
ｓｓＦａｂ’断片あたり０．５μｇ／ｍｌのｓｓＦａｂ’ １．４．１６８のみまたはｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３のみそれぞれ、および等モル量の８×Ｃ１８リンカー、ならびにｓｓＦａｂ’ １．４．１６８およびｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３の両方のｓｓＦａｂ’断片（両方０．５μｇ／ｍｌで）ならびに等モル量の８×Ｃ１８リンカーの混合物それぞれを検出のために用いた。そのリンカー分子内のビオチン標識は、ストレプトアビジンに基づくＶｅｎｔａｎａ ｉＶＩＥＷ ＤＡＢ検出キットのための検出タグの役目を果たした。ベンチマークプロトコルの詳細：細胞条件付け緩衝液１（ＣＣ１）を用いて前処理を行い、その結合分子の保温時間は３２分であり、保温温度は３７℃であった。
８×Ｃ１８リンカー分子（実施例２．４のリンカー１４）およびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８のみまたはｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３のみからなる検出分子は試験したＦＦＰＥ ３Ｔ３細胞のペレットのいずれにおいても染色をもたらさなかった（図１３Ｂ、横列１および２）。対照的に、（両方のｓｓＦａｂ’断片＋８×Ｃ１８リンカーからなる）完全な二重結合剤分子を用いた検出は染色をもたらした−しかし、ＩＧＦ−１で刺激したＩＧＦ−１Ｒ過剰発現細胞においてのみであった（図１３Ｂ、横列３）。ＩＲを過剰発現する細胞に対する交差反応性は、ＩＲのリン酸化が誘導されていた場合でさえも観察されなかった。その実験は、リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒに関する二重結合剤の高い特異性を証明している。
リンカーの長さの染色性能への影響を評価するため、２×Ｃ１８、４×Ｃ１８、６×Ｃ１８および８×Ｃ１８リンカー分子（実施例２．４のリンカー１１、１２、１３、１４）を同じＩＨＣ構成において用いた。試験した二重結合剤の内で、最も長いリンカー（８×Ｃ１８）を有する二重結合剤が優秀な染色結果を示している（図１３Ｃ）。これは、少なくともこの場合においては長い柔軟なリンカーが両方の二重結合剤の腕のｐＩＧＦ−１Ｒ上の２つの異なるエピトープへの同時結合を促進することを示している。
ｓｓＦａｂ’ １．４．１６８、ｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３および８×Ｃ１８リンカー分子（実施例２．４のリンカー１４）からなる二重結合剤を、ＦＦＰＥ Ｈ３２２Ｍ異種移植片組織に対してさらに試験した。ベンチマークプロトコルの詳細：細胞条件付け緩衝液１（ＣＣ１）を用いて前処理を行い、その結合分子の保温時間は３２分であり、保温温度は２５℃であった。やはり８×Ｃ１８リンカーおよびｓｓＦａｂ’ １．４．１６８またはｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３のどちらか一方のみからなる検出分子ではｐＩＧＦ−１Ｒの染色は観察されなかった。しかし、（両方のｓｓＦａｂ’断片＋８×Ｃ１８リンカーからなる）完全な二重結合剤分子を用いた検出は、特徴的なｐＩＧＦ−１Ｒ膜染色をもたらした（図１４）。
２．１０ センサー表面上の二重結合剤のＢｉａｃｏｒｅアッセイ
実施例２．９の抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤の最適化版に関しても速度論データを得るため、追加のＢｉａｃｏｒｅ実験を実施した。
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をシステム中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ ＳＡセンサーと共にＴ＝２５℃で用いた。そのシステムは、１００μｌ／分での５０ｍＭ ＮａＯＨ中１Ｍ ＮａＣｌの３×１分間の注入および１分間の１０ｍＭ ＨＣｌの注入により前条件付けされた。
システム緩衝液はＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液はシステム緩衝液であった。
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００システムは制御ソフトウェアＶ４．１の下で運転された。
８９ＲＵのアミノ−ＰＥＯ−ビオチンを基準フローセル１上に捕捉させた。５９５ＲＵのビオチン化された８×Ｃ１８リンカー（Ｉ）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(スペーサーC18)4-(ビオチン-dT)-(スペーサーC18)4-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’）（＝実施例２．４のリンカー１４）を、第２フローセル上に捕捉させた。
３００ｎＭのｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３および３００ｎＭのｓｓＦａｂ’ １．００４．１６８をそのシステムの中に５０μｌ／分で３分間注入した。それぞれのｓｓＦａｂの速度論的寄与を試験するため、対照として３００ｎＭのｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３または３００ｎＭのｓｓＦａｂ’ １．００４．１６８それぞれのみを注入した。ペプチドＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）［１３４６−ｐＴｙｒ］アミド（１３４６位のチロシンがリン酸化されているSEQ ID NO:11のペプチド＝合成分析物）（溶液中で遊離している）をシステム中に０ｎＭ、０．４ｎＭ、１．１ｎＭ、３．３ｎＭ（２回）、１０ｎＭおよび３０ｎＭの濃度段階で５０μｌ／分で４分間注入した。解離を５０μｌ／分で５．３分間監視した。それぞれの濃度段階の後、２５０ｍＭのＮａＯＨの１２秒間のパルスによりシステムを再生し、ｓｓＦａｂ’リガンドを再装填した。
さらなる対照として、ａ）緩衝液をｓｓＦａｂ’の代わりに注入し、ｂ）その上にアミノ−ＰＥＯ−ビオチンを固定したフローセルを用いた（データは示していない）。これらの実験において、“分析物”の非特異的結合は観察されなかった。
図１５はＢｉａｃｏｒｅ機器のアッセイ構成を模式的に説明している。図１６で示した表は、このアプローチからの定量の結果を示す。図１７、１８および１９はこのアッセイ構成からのＢｉａｃｏｒｅの結果を示す。
図１６において示したように、その二重結合剤分子はリン酸化された合成ＩＧＦ−１Ｒ分析物に対して約１０ｐＭの親和性を示す。これはｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３またはｓｓＦａｂ’ １．４．１６８単独からなる結合分子と比較して２００倍または３００倍の親和性の向上である。決定された解離速度は、その二重結合剤に関して８３０分、一価結合剤ｓｓＦａｂ’ ３０．４．３３に関して７．３分および一価結合剤ｓｓＦａｂ’ １．４．１６８に関して３．５分である。これらのデータは用いた二重結合剤分子の協同的結合作用を明確に実証している。
実施例３
リン酸化されたＨＥＲ３に対する二価結合剤
ＨＥＲタンパク質の受容体型チロシンキナーゼファミリーは４つのメンバー：ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる。リガンド結合の際、その受容体は様々な方法でホモまたはヘテロ二量体として二量体化し、そのリガンドおよびその４つのファミリーのメンバーのそれぞれの発現レベルに依存して異なるシグナル伝達経路の引き金を引く。例えば、ＨＥＲ３はそれがそのリガンドであるニューレグリン１（ＮＲＧ１）またはニューレグリン２（ＮＲＧ２）に結合した際に立体構造変化を経てＨＥＲ３二量体化ドメインが露出し、それは他のＨＥＲ受容体と相互作用することができる。二量体化の際、ＨＥＲ３はリン酸化される。この実施例において、我々はＨＥＲ３のリン酸化型を検出するための二重結合剤を開発した。
３．１ モノクローナル抗体の開発（ｍＡｂ ７．２．３２およびｍＡｂ ４．１．１５）
ａ）マウスの免疫
Ｂａｌｂ／ｃおよびＮＭＲＩマウスをＨＥＲ３（１２４３〜１２６７）［ＫＬＨ−ＭＰ−Ｃｙｓ−ＵＺＵ−１２４３］アミドまたはｐＨＥＲ３（１２８３〜１２９５）［ｐＴｙｒ１２８９；ＫＬＨ−ＭＰ−Ｃｙｓ−ＵＺＵ−１２８３］アミドで免疫する。最初の免疫用量は１００μｇである。そのマウスを６および１０週間後に１００μｇのその免疫原でさらに免疫する。
ｂ）融合およびクローニング
融合およびクローニングの工程は２．１ｂ）で記述したように実施された。
ｃ）細胞培養上清からの免疫グロブリンの単離
免疫グロブリンの単離は２．１ｃ）で記述したように実施された。
ｄ）モノクローナル抗体の生物物理学的特性付け
モノクローナル抗体およびＨＥＲ３またはリン酸化型であるｐＨＥＲ３の間の相互作用の速度論的特性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）技術を用いた表面プラズモン共鳴での速度論的スクリーニングにより調べた。
ソフトウェアバージョンＶ１．１の制御下にあるＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ａ１００機器を用いる。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップがその機器の中に取り付けられており、それは製造業者の説明書に従って水力学的に処理され（ａｄｄｒｅｓｓｅｄ）、条件付けされる。運転緩衝液として、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いる（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ２０）。ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ捕捉抗体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中３０μｇ／ｍｌでフローセル１、２、３および４中のスポット１、２、４および５に１０，０００ＲＵで固定する。その抗体はＮＨＳ／ＥＤＣ化学により共有結合的に固定される。その後、そのセンサーを１Ｍエタノールアミン溶液で不活性化する。スポット１および５は決定のために用いられ、スポット２および４は基準として用いられる。センサーチップへの適用の前に、ｍＡｂを含有するハイブリドーマ上清をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で１：２希釈する。その希釈された溶液を３０μｌ／分の流速で１分間適用する。その後すぐに分析物である個々にストレプトアビジン上に移植された（ｇｒａｆｔｅｄ）ヒト＿ＨＥＲ３（１２４２〜１２６７）−Ｂｉ−ＰＥＧ−アミド(SEQ ID NO:17)、ヒトｐＨＥＲ３（１２８３〜１２９５［ｐＴｙｒ１２８９］）−ＰＥＧ２−ＥＤＡ−Ｂｔｎ(SEQ ID NO:18)またはヒト＿ＨＥＲ３（１２８３〜１２９５）−ＰＥＧ２−ＥＤＡ−Ｂｔｎ(SEQ ID NO:18)を３０μｌ／分の流速で２分間注入する。その後、シグナルを５分間の解離時間の間記録する。そのセンサーを、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ溶液（ｐＨ１．７）を３０μｌ／分の流速で２分間注入することにより再生させる。解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）を、ラングミュアモデルに従って、評価ソフトウェアを用いて製造業者の説明書に従って計算する。選択されたモノクローナル抗体は、アミノ酸１２４２〜１２６７を含むＨＥＲ３エピトープと、またはアミノ酸１２８３〜１２９５を含むリン酸化された（ｐＴｙｒ１２８９）ＨＥＲ３エピトープと、特許請求の境界内にある解離速度定数で相互作用する。エピトープＨＥＲ３（１２８３〜１２９５）の非リン酸化型に結合した抗体は、さらなる研究から除外された。
選択されたＨＥＲ３（１２４２〜１２６７）に対して向けられた抗体を７．２．３２と名付け（それぞれSEQ ID NO:21において示されている可変領域重鎖およびSEQ ID NO:22において示されている可変領域軽鎖）、その解離速度定数は２．３×１０−３１／ｓであると決定され、結果的に二重結合剤アプローチに関して要求される必要な範囲内であった。選択されたｐＨＥＲ３（１２８３〜１２９５［ｐＴｙｒ１２８９］）に対して向けられた抗体を４．１．１５と名付け（それぞれSEQ ID NO:23において示されている可変領域重鎖およびSEQ ID NO:24において示されている可変領域軽鎖）、その解離速度定数は２．５×１０−３１／ｓであり、従ってそれも二重結合剤アプローチに関して要求される定められた範囲内であった。
ｅ）選択された抗体の可変領域の配列決定
選択された抗体の可変領域を、標準的な分子生物学の方法を用いて配列決定した。配列をSEQ ID NO:21〜24において示す。
３．２ リン酸化されたＨＥＲ３（ｐＴｙｒ１２８９）を認識する二重結合剤の開発
ａ）Ｆａｂ融合タンパク質の組み換え発現
Ｆａｂ断片７．２．３２および４．１．１５を、Ｈｅｋ２９３Ｆ細胞中で８×ＨＩＳ−タグおよびソルターゼ切断認識配列(SEQ ID NO:16)を有する融合タンパク質として発現させた。９０％より大きい生存度を有する１Ｌの１×１０６ＨＥＫ２９３細胞／ｍｌを、１：１の比率で７．２．３２または４．１．１５の重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを用いて、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用いて形質移入した。形質移入後、そのＨＥＫ２９３Ｆ細胞を１３０ｒｐｍ、３７℃および８％ＣＯ２において７日間培養した。次いで細胞を４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。組み換えタンパク質を含有する上清をさらに０．２２μｍ ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）真空濾過システムを用いて濾過した。Ｆａｂ断片を、ＡＫＴＡエクスプローラーＦＰＬＣシステムを用いるニッケル親和性カラムクロマトグラフィーおよび分取ゲル濾過により、標準的な精製法を用いて精製した。純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析的ゲル濾過により評価した。
ｂ）酵素ソルターゼをトランスペプチダーゼ反応において用いるＤＮＡ−オリゴコンジュゲーション
酵素ソルターゼはトランスペプチダーゼ活性も有する原核生物のタンパク質分解酵素である(Ton-That et al, PNAS 1999)。ここで、その酵素はＬＰＸＴＧ（ソルターゼ切断モチーフ）およびＤＮＡ−オリゴに結合したグリシン残基の間のトランスペプチダーゼ反応を触媒する。１７塩基長のオリゴ（SEQ ID NO:25で示した４．１．１５標識のためのオリゴ）および１９塩基長のオリゴ（SEQ ID NO:26で示した７．２．３２標識のためのオリゴ）を標識反応のために用いた。その標識は、２０ｍＭトリス（ｐＨ ８）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２の緩衝液中で、２０μＭ組み換えソルターゼ、５０μＭ Ｆａｂ断片および２００μＭオリゴを用いて３７℃で一夜実施された。次に、その標識反応物を２０ｍＭトリス（ｐＨ ８．０）中で１０倍希釈し、２０ｍＭトリス（ｐＨ ８．０）中で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑイオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用する。その強く負に荷電したオリゴおよびオリゴ−Ｆａｂ断片を２０ｍＭトリス（ｐＨ ８．０）および１Ｍ ＮａＣｌの高い塩勾配で溶離し、そうして低い塩濃度で溶離するソルターゼおよび未標識のＦａｂ断片から分離する。溶離を４９５ｎｍにおける吸光度を追跡して監視し、オリゴの蛍光標識を検出する。オリゴおよびＦａｂ−オリゴを含有する溶離された画分をプールし、２０ｍＭトリス（８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌを平衡化および運転緩衝液として用いるＨｉＬｏａｄ １６／６０カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での分取ゲル濾過により、Ｆａｂ−オリゴをコンジュゲートしていないオリゴから分離する。最終生成物の純度を分析的ゲル濾過およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて評価し、純度が９０％より大きい最終生成物のみが二重結合剤の組み立てにおいて用いられるであろう。以下において、Ｆａｂ−オリゴを“ｓｓＦａｂ”と呼ぶ。
ｃ）抗ｐＨＥＲ３二重結合剤の組み立て
抗ｐＨＥＲ３二重結合剤はｓｓＤＮＡリンカー分子およびＨＥＲ３の細胞内ドメインの異なるエピトープを標的とする２種類のｓｓＦａｂ断片に基づく：ｓｓＦａｂ ４．１．１５はリン酸化部位（ｐＴｙｒ１２８９）を検出し、ｓｓＦａｂ ７．２．３２は前記の標的タンパク質の非ホスホ部位を検出する。組み立ての評価を２．５．Ｂにおいて記述したように実施した。実験はその二重結合剤分子の効率的な組み立てを示した。
３．３ 免疫組織化学（ＩＨＣ）実験における抗ｐＨＥＲ３二重結合剤分子の評価
そのＩＨＣ実験は、ＶｅｎｔａｎａからのＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＸＴプラットフォーム上で実施された。そのアッセイに関して、ｓｓＦａｂ ７．２．３２（ＨＥＲ３の細胞内ドメインの非ホスホエピトープに結合する）、ｓｓＦａｂ ４．１．１５（ＨＥＲ３の細胞内ドメインのｐＴｙｒ１２８９ホスホエピトープに結合する）および柔軟なリンカーからなる抗ｐＨＥＲ３二重結合剤を用いた。４×Ｃ１８スペーサーを有する柔軟なリンカー（＝実施例２．４のリンカー１２）をこのアッセイにおいて用いた。そのリンカー分子内のビオチン標識は、ストレプトアビジンに基づくＶｅｎｔａｎａ ｉＶＩＥＷ ＤＡＢ検出キットのための検出タグの役目を果たした。
抗ｐＨＥＲ３二重結合剤分子の特異性を試験するため、ホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）Ｈｅｋ２９３細胞に基づく精巧な試験系を用いた。Ｈｅｋ２９３細胞にＨＥＲ２およびＨＥＲ３発現ベクターの両方を一過性導入しておいた。１つの場合において、リン酸化部位の役目を果たす細胞内ドメインの１４個のチロシンがフェニルアラニンで置き換えられている（Ｙ９７５Ｆ、Ｙ１０５４Ｆ、Ｙ１１３２Ｆ、Ｙ１１５９Ｆ、Ｙ１１９７Ｆ、Ｙ１１９９Ｆ、Ｙ１２２２Ｆ、Ｙ１２２４Ｆ、Ｙ１２６０Ｆ、Ｙ１２６２Ｆ、Ｙ１２７６Ｆ、Ｙ１２８９Ｆ、Ｙ１３０７Ｆ、Ｙ１３２８Ｆ）ＨＥＲ３の変異版をコードするＨＥＲ３発現ベクターが用いられた。細胞を標準的なプロトコルに従ってホルマリンで固定し、パラフィン中に包理した。固定の前に細胞を２０ｎＭのＮＲＧ１−β１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で３７℃で１５分間刺激してＨＥＲ３のリン酸化を誘導し、または未処理のままにした。ウェスタンブロッティング実験（図２０Ａ）は、受容体リン酸化の刺激の成功を証明した。
ｓｓＦａｂ断片あたり１μｇ／ｍｌのｓｓＦａｂ ７．２．３２のみまたはｓｓＦａｂ ４．１．１５のみそれぞれ、および等モル量の４×Ｃ１８リンカー、ならびにｓｓＦａｂ ７．２．３２およびｓｓＦａｂ ４．１．１５の両方のｓｓＦａｂ’断片（両方１μｇ／ｍｌで）ならびに等モル量の４×Ｃ１８リンカーの混合物それぞれを検出のために用いた。そのリンカー分子内のビオチン標識は、ストレプトアビジンに基づくＶｅｎｔａｎａ ｉＶＩＥＷ ＤＡＢ検出キットのための検出タグの役目を果たした。ベンチマークプロトコルの詳細：細胞条件付け緩衝液１（ＣＣ１）を用いて前処理を行い、その結合分子の保温時間は３２分であり、保温温度は３７℃であった。
４×Ｃ１８リンカー分子（実施例２．４のリンカー１２）およびｓｓＦａｂ ７．２．３２のみまたはｓｓＦａｂ ４．１．１５のみからなる検出分子は試験したＦＦＰＥ細胞ペレットのいずれにおいても染色をもたらさなかった（図２０Ｂ、横列１および２）。対照的に、（両方のｓｓＦａｂ断片＋４×Ｃ１８リンカーからなる）完全な二重結合剤分子を用いた検出は染色をもたらした−しかし、ＮＲＧ１−β１で刺激された野生型ＨＥＲ３を発現する細胞においてのみであった（図２０Ｂ、横列３）。ＮＲＧ１−β１で刺激されたＴｙｒ１２８９リン酸化部位を欠くＨＥＲ３の変異版を過剰発現する細胞においては染色は観察されなかった。その実験は、リン酸化されたＨＥＲ３に関する二重結合剤の高い特異性を証明している。

Claims (12)

  1. リンカーを介して互いに連結されている２個の一価結合剤からなる、翻訳後修飾された標的ポリペプチドに結合する二価結合剤であって、ここで
    ａ）該第１一価結合剤は前記の標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープに結合し、
    ｂ）該第２一価結合剤は翻訳後ポリペプチド修飾に結合し、
    ｃ）それぞれの一価結合剤は５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、そして
    ｄ）該二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有する；
    前記二価結合剤。
  2. 一価結合剤の少なくとも一方が単鎖抗体、またはモノクローナル抗体のＦａｂ断片もしくはＦａｂ’断片である、請求項１に記載の二価結合剤。
  3. 一価結合剤がモノクローナル抗体に由来し、Ｆａｂ断片、またはＦａｂ’断片、またはＦａｂ断片およびＦａｂ’断片である、請求項１に記載の二価結合剤。
  4. 前記の二価結合剤が１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有する、請求項１〜３のいずれかに記載の二価結合剤。
  5. リンカーが６〜１００ｎｍの長さを有する、請求項１〜４のいずれかに記載の二価結合剤。
  6. 翻訳後修飾された標的ポリペプチドに特異的に結合する二価結合剤を得るための方法であって、以下の工程：
    ａ）前記の標的ポリペプチドの翻訳後修飾されていないエピトープに５×１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合する第１一価結合剤を選択し、
    ｂ）翻訳後ポリペプチド修飾に５×１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合する第２一価結合剤を選択し、
    ｃ）両方の一価結合剤をリンカーにより連結し、そして
    ｄ）３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓ値を有する二価結合剤を選択する；
    を含む、前記方法。
  7. さらに二価結合剤を単離する工程ｅ）を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 翻訳後修飾がアセチル化、リン酸化、アシル化、メチル化、糖鎖付加、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、硫酸化およびニトロ化からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の二価結合剤または請求項６もしくは７に記載の方法。
  9. 翻訳後修飾がリン酸化、糖鎖付加およびアセチル化からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の二価結合剤または請求項６もしくは７に記載の方法。
  10. 標的ポリペプチドが細胞内リン酸化部位を有する膜結合型受容体分子および細胞内細胞シグナル伝達分子からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の二価結合剤または請求項６もしくは７に記載の方法。
  11. 組織染色法であって、以下の工程：
    ａ）細胞または組織試料を提供し、
    ｂ）前記の試料を、リンカーを介して互いに連結されている２個の一価結合剤からなる、翻訳後修飾された標的ポリペプチドに結合する二価結合剤と共に保温し、ここで該２個の一価結合剤の一方は前記の標的ポリペプチドのポリペプチドエピトープに結合し、該２個の一価結合剤の一方は翻訳後ポリペプチド修飾に結合し、それぞれの一価結合剤は５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、ここで該二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有し、そして
    ｃ）該二価結合剤を検出し、それにより前記の試料を翻訳後修飾された標的ポリペプチドに関して染色する；
    を含む、前記方法。
  12. 細胞または組織試料の染色における、請求項１〜５のいずれかに記載の二価結合剤の使用。
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