KR20190140447A - 알데히드 함유 표적 분자의 라벨링 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 N-(2-아미노에틸)피롤에서 유래하는 화합물 (이 화합물은 또한 관심의 모이어티를 포함한다) 을 알데히드를 포함하는 표적 분자에 결합시키는 방법, 표적 분자 및 관심의 모이어티 둘 모두를 포함하는, 이 방법에 의해 수득되는 화합물 (접합체) 및 N-(2-아미노에틸)피롤에서 유래하는 신규한 물질에 관한 것이다.
식 I:
Figure pct00033

식 II:

Description

알데히드 함유 표적 분자의 라벨링 방법
본 발명은 N-(2-아미노에틸)피롤에서 유래하는 화합물 (이 화합물은 또한 관심의 모이어티를 포함한다) 을 알데히드를 포함하는 표적 분자에 결합시키는 방법, 표적 분자 및 관심의 모이어티 둘 모두를 포함하는, 이 방법에 의해 수득되는 화합물 (접합체) 및 N-(2-아미노에틸)피롤에서 유래하는 신규한 물질에 관한 것이다.
단백질의 부위-특이적 변형은 특히 진단적 또는 치료적 응용에서 사용되는 항체에 관해 도전해 볼 만한 과제이다. 경제적이고 산업적 규모로 적용가능한 부위-특이적 폴리펩티드 변형에 관한 신뢰할 수 있는 방법은 매우 중요하다.
초기의 단백질 작용화 방법은 단백질을 과량의 티올- 또는 아민-반응성 시약, 예컨대 말레이미드 또는 N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 각각과 반응시킴으로써 시스테인 또는 라이신 잔기의 반응성을 이용했다. 이들 아미노산은 풍부하고, 널리 분포되어 있고, 적당한 커플링 화학의 이용가능성으로 인해 용이하게 변형된다.
그러나, "라이신-라벨링" 전략은, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 라벨링하는데 사용될 때 여러 결점을 갖는다: a) 그것은 종종 항원-결합 활성의 유의한 감소를 초래한다 (항원 결합 부위 내의 또는 그에 인접한 라이신); b) 심지어 동일한 1:1 화학량론의 단일 라벨링된 접합체는 폴리펩티드 내의 라이신 중 상이한 것들을 통해 부착된 라벨을 포함하는 혼합물로 이루어진다; 및 c) 요망되는 1:1 산물의 수율이 상당히 낮다.
부위-특이적 단백질 라벨링을 위한 가장 중요한 최근의 접근법 중 하나는 효소 반응을 통해 단백질 내로 특정 부위에서 생물직교 작용기 (bioorthogonal fuctionality) 를 통합시키는 것이다. "단백질의 효소적 라벨링" 에 대한 최근의 리뷰에 관해 M. Rashidian et al., Bioconjugate Chemistry 24 (2013) 1277-1294 를 참조한다. 이 리뷰에서 다루어지는 부위-특이적 접합에 사용되는 효소는 포르밀글라이신 생성 효소, 시알릴트랜스페라아제, 포스포판테테이닐트랜스페라아제, O-GlcNAc 번역후 변형, 소르태깅 (sortagging), 트랜스글루타미나아제, 파르네실트랜스페라아제, 비오틴 리가아제, 리포산 리가아제, 및 N-미리스토일트랜스페라아제를 포함한다.
알데히드 및 케톤을 단백질 내로 부위-특이적으로 도입하는 다양한 화학적, 효소적, 및 유전학적 방법이 개발되었다. 이들은 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기의 페리오데이트 산화 (Geoghegan, K.F. & Stroh, J.G., Bioconjugate Chem. (1992), 3(2):138-146); 알파-케토아미드 또는 글리옥사미드를 산출하는 피리독살 포스페이트-매개 N-말단 아미노기전이 (Gilmore, J.M. et al., Angew. Chem. Int. Ed. (2006), 45(32):5307-5311; Scheck, R.A. et al., J. Am. Chem. Soc.(2008), 130(35):11762-11770; Witus, L.S. et al., J. Am. Chem. Soc. (2010), 132(47):16812-16817); 발현되는 단백질 결찰에 의해 생성되는 단백질 C-말단 티오에스테르에 대한 케톤-함유 소분자의 부가 (Esser-Kahn, A.P. & Francis, M.B. Angew. Chem. Int. Ed. (2008), 47(20):3751-3754); 앰버 (amber) 정지 코돈 억제를 통한 케톤 함유 비자연적 아미노산의 유전적으로 인코딩되는 통합 (Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (2003), 100(1):56-61; Hutchins, B.M., et al,. Chem. Biol. (2011), 18(3):299-303; Kim, C.H., et al., J. Am. Chem. Soc. (2012), 134(24):9918-9921); 알데히드- 또는 케톤-보유 소분자의 효소적 결찰을 유도하는 펩티드 태그의 유전적 인코딩 (Rashidian, M., et al., J Am. Chem. Soc. (2012), 134(20):8455-8467; Chen, I., et al., Nat. Methods (2005) 2(2):99-104); 및 포르밀글라이신 생성 효소 (FGE) 에 의한 변형을 위한 부위의 유전적 인코딩, Carrico 및 Bertozzi 에 의해 개발된 "알데히드 태그" 방법 (Carrico, I.S., et al., Nat. Chem. Biol. 3(6):321-322; Wu, P. et al,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2009), 106:3000-3005; Hudak, J.E., et al., J Am. Chem. Soc. (2011), 133(40):16127-16135; Hudak, J.E., et al. (2012), Chem. Int. Ed. (2012), 51(17):4161-4165; Rabuka, D. et al., Nat. Protoc. (2012), 7(6):1052-1067) 을 포함한다.
반응성 카르보닐 기를 단백질 내로 도입하는 방법의 다양성은 그것의 화학적 변형에 널리 채택되어 온 반응의 제한된 수와 대조적이다. 대부분의 연구는 위에서 언급된 하이드라존 및 옥심-형성 반응을, 그것의 생물직교성 (bioorthogonality), 작업 단순성 (즉, 보조 시약이 요구되지 않는다), 및 온화한 수성 조건 하에서의 양호한 수율로 인해, 사용한다. 불행히도, 결과적인 C=N 결합은 가수분해되기 쉬워서 (Mueller, B.M., et al., Bioconjugate Chem. (1990), 1(5):325-330) 불안정성을 초래한다. 그러나, 장기간 안정성이 많은 일상적 응용에 요구될 것이다.
베타-위치에서 치환된 인돌 화합물이 T. Sasaki, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2008), 18:4550-4553 에 의해 기재된 바 있다. WO 2009/150865 에서 피쳇 슈펭글러 (Pictet-Spengler) 반응을 사용함으로써 변형된 단백질을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 그것의 베타-C 위치에서 치환된 헤테로시클릭 인돌 유도체가 기재되어 있고, 실시예에서 배타적으로 그것의 베타-C 위치에서 치환된 인돌 유도체가 사용되고 제시되어 있다. Bertozzi 의 그룹은 피쳇 슈펭글러 유형의 반응에서 반응성을 증가시키는 인돌 아미노옥시 또는 히드라진 작용기를 기재했다 (P. Agarwal, et al., PNAS (2013), 110 (1), 46-51; P. Agarwal, et al., Bioconjugate Chem. (2013), 24 (6), 846-851; WO 2014/078733).
N-(2-아미노에틸)피롤에 기반하고 요망되는 관심의 모이어티를 추가로 포함하는 화합물 (여기에서 아미노-에틸이 피롤 고리의 질소를 통해 부착되어 있다) 이 피쳇 슈펭글러 유형의 반응에서, 예를 들어, 반응 역학 및 수율의 면에서, 크게 유리하게 사용될 수 있다는 것이 이제 놀랍게도 발견되었다. 게다가 이 방법에 의해 수득되는 접합체 (화합물) 뿐만 아니라 특정 N-(2-아미노에틸)피롤 물질이 개시된다.
발명의 요약
본 발명은 N-(2-아미노에틸)피롤에서 유래하는 화합물 (이 화합물은 또한 관심의 모이어티를 포함한다) 을 알데히드를 포함하는 표적 분자에 결합시키는 방법 을 개시한다. 더욱 구체적으로 본 발명은 식 II 에 따른 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이며, 방법은 하기 단계를 포함한다;
식 I 의 화합물을 아래 제시된 알데히드 기를 포함하는 표적 T 와 반응시켜
식 I:
Figure pct00001
그에 의해 식 II 에 따른 화합물 (= 접합체) 을 수득하는 단계,
식 II:
Figure pct00002
식에서 R1, R2 및 R3 은 독립적으로 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 알케닐, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴이고,
R4, R5, R6, R7 및 R8 은 독립적으로 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴, 또는 -LM 이고, R4, R5, R6, R7, 및 R8 중 둘은 임의로 연결되어 치환된 또는 치환되지 않은 시클로알킬 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로시클로알킬을 형성하고,
L 은 부재하거나 또는 링커이고, M 은 관심의 모이어티이고, T 는 표적 분자이고,
단, R4, R5, R6, R7 또는 R8 중 적어도 하나는 -LM 임.
추가로 개시되는 것은, 표적 분자 T 및 관심의 모이어티 M 둘 모두를 포함하는, 본원에 개시된 방법에 의해 수득되는 접합체, 예를 들어, 식 II 에 따른 화합물이다,
식 II:
Figure pct00003
식에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 및 T 는 위에서 정의된 바와 같음.
추가로 개시되는 것은 식 III 에 따른 물질이다,
식 III:
Figure pct00004
식에서 R1, R2 및 R3 은 독립적으로 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 알케닐, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴이고,
R4, R5, R6 및 R7 은 독립적으로 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴, 또는 -LM 이고,
R8 은 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴이고,
R4, R5, R6, R7, 및 R8 중 둘은 임의로 연결되어 치환된 또는 치환되지 않은 시클로알킬 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로시클로알킬을 형성하고,
M 은 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 라벨, 세포독성제, 결합쌍의 파트너 및 말레이미드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 관심의 모이어티이고,
링커 L 은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 또는 올리고펩티드로부터 선택되고, 아미드 연결, 에스테르 연결, 알켄 또는 트리아졸을 포함할 수 있으며,
단, R4, R5, R6 또는 R7 중 적어도 하나는 -LM 임.
발명의 상세한 설명
본 발명은 N-(2-아미노에틸)피롤에서 유래하는 화합물 (이 화합물은 또한 관심의 모이어티를 포함한다) 을 알데히드를 포함하는 표적 분자에 결합시키는 포괄적 방법을 개시한다.
하나의 실시형태에서 본 공개는 식 II 에 따른 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이며, 방법은 하기 단계를 포함한다;
식 I 의 화합물을 아래 제시된 알데히드 기를 포함하는 표적 T 와 반응시켜
식 I:
Figure pct00005
그에 의해 식 II 에 따른 화합물을 수득하는 단계,
식 II:
Figure pct00006
식에서 R1, R2 및 R3 은 독립적으로 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 알케닐, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴이고,
R4, R5, R6, R7 및 R8 은 독립적으로 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴, 또는 -LM 이고, R4, R5, R6, R7, 및 R8 중 둘은 임의로 연결되어 치환된 또는 치환되지 않은 시클로알킬 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로시클로알킬을 형성하고,
L 은 부재하거나 또는 링커이고, M 은 관심의 모이어티이고, T 는 표적 분자이고, 단, R4, R5, R6, R7 또는 R8 중 적어도 하나는 -LM 임.
단어 "포함한다", 및 변이형 예컨대 "포함하며" 및 "포함하는" 은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군의 포함을 의미하나 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군의 배제를 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다.
이 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는, 단수형은, 문맥이 명백히 다르게 지시하지 않으면, 복수형의 지시대상을 포함한다.
부수되는 ?구항을 포함하여, 본원에서 사용되는, 치환기는 당업자에게 일반적으로 알려진 의미를 갖는다.
용어 "알킬" 은 그것만으로 또는 또다른 치환기의 일부로서, 다르게 언급되지 않으면, 표시된 수의 탄소 원자를 갖는 (즉 C1-C20 은 1 내지 20 개의 탄소를 의미함), 직쇄형 또는 분지형 사슬, 또는 시클릭 탄화수소 라디칼, 또는 그들의 조합을 의미한다. 포화 탄화수소 라디칼의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 그의 동족체 및 이성질체, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실 등과 같은 기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서 알킬은 1-20 개의 탄소 원자의 길이를 갖는, 또는 1-10 개의 탄소 원자의 길이를 갖는, 또는 1-6 개의 탄소 원자의 길이를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 사슬이다. 하나의 실시형태에서, 알킬은 메틸 또는 에틸이다.
용어 "아릴" 및 "헤테로아릴" 은 그것만으로 또는 또다른 치환기의 일부로서, 다르게 언급되지 않으면, 또한 부가적 방향족 고리계와 융합될 수 있는 (바람직하게는 1 내지 4 개의 고리) 방향족 고리계 (즉 5 또는 6 원 고리) 를 의미한다. "헤테로아릴" 고리계는 O, S 및 N 로부터 선택되는 1-4 개의 헤테로원자를 포함한다. "아릴" 의 예는 페닐 및 나프틸과 같은 기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다. "헤테로아릴" 의 예는 푸란, 티오펜, 피롤, 이미다졸, 트리아졸 및 인돌에서 유래하는 기를 포함하나, 그에 제한되지 않는다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 화학적 실체 예컨대 알킬 또는 아릴 - 단지 두 가지 비제한적 예를 언급하면 - 은 "치환" 될 수 있으며, 즉 하나 이상의 수소(들)이 대체/치환될 수 있다. 하나의 실시형태에서 수소는 할로알킬 (예를 들어, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실 (예를 들어, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3), 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로시클로알킬, -OR', =O, -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)OR', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)OR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRS(O)2R', -CN, 할로겐 및 -NO2, -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되는 기에 의해 치환되며, 여기에서 R', R" 및 R"' 는 바람직하게는 독립적으로 수소 및 치환된 또는 치환되지 않은 알킬로부터 선택된다. 바람직한 치환기는 알킬 예컨대 메틸 또는 에틸, 아릴 예컨대 페닐 또는 벤질, 메톡시 또는 에톡시, 아민 예컨대 디메틸아미노, 카르복시산 유도체 예컨대 카르복시산, 에스테르 또는 아미드, 및 니트로, 시아노, 아지드 및 할로겐이다.
용어 "헤테로알킬" 은 그것만으로 또는 또다른 용어와의 조합으로, 위에서 "알킬" 하에 언급된 수의 탄소 원자 및 O, N, P 및 S 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자로 이루어지는, 안정적인 직쇄형 또는 분지형 사슬, 또는 시클릭 탄화수소 라디칼, 또는 그들의 조합을 의미한다. 헤테로원자(들)은 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치에 또는 말단 위치에, 즉 헤테로알킬 기가 분자의 나머지에 부착되는 위치의 반대편에 위치할 수 있다. 헤테로원자(들)은 또한 N-(2-아미노에틸)피롤 코어 구조의 피롤 고리와 (헤테로)알킬 또는 (헤테로)아릴 치환기 사이에 위치할 수 있다. 바람직하게는, 내부 위치에서 사슬 또는 사이클의 일원인 각각의 헤테로원자는 측면에 탄소 원자가 있다. 내부 위치에 있는 헤테로원자는 치환되지 않을 수 있으며, 예를 들어 수소 원자를 보유할 수 있으며, 또는 알킬 및 O 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환기를 가질 수 있다. 헤테로알킬의 예는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -O-CH3, -O-CH2-CH3, -NH-CH3, -NH-CH2-CH3, -N(CH3)2, -N(CH2-CH3)2 및 폴리(알킬렌 옥시드), 특히 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 유도체를 포함하나, 그에 제한되지 않는다.
용어 "알케닐" 은 적어도 하나의 이중 결합의 존재를 제외하고는, 위에서 알킬 하에 정의되는 바와 같은 화학적 기를 기재한다.
용어 "헤테로알케닐" 은 적어도 하나의 이중 결합의 존재를 제외하고는, 위에서 헤테로알킬 하에 정의되는 바와 같은 화학적 기를 기재한다.
하나의 실시형태에서 R1, R2 및 R3 은 독립적으로 H 또는 메틸이다.
하나의 실시형태에서 R1, R2 및 R3 은 모두 H 이다.
당업자가 이해할 바와 같이 "링커" 는 두 개의 모이어티 사이에 임의의 요망되는 거리의 부착을 제공하는 임의의 적당한 구조이다. 두 개의 모이어티는 따라서 서로에게 직접 결합되지 않고 그러한 연결 구조 또는 링커를 통해 결합된다.
식 I 또는 II, 각각에 포함되는 링커 L 은 하나의 실시형태에서 그것의 백본 길이에 의해 정의될 수 있고, 하나의 실시형태에서 1 내지 100 개 원자의 백본 길이를 갖는다. 하나의 실시형태에서 링커 L 은 1 내지 50 개 원자의 백본 길이를 갖는다. 하나의 실시형태에서, 링커 L 은 직쇄형 또는 분지형 포화, 불포화, 치환되지 않은 또는 치환된 C1-C50 알킬 사슬, 또는 탄소 원자 및 O, N 및 S 로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자로 이루어지는 백본을 갖는 1 내지 50 개 원자 사슬, 또는 적어도 하나의 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴 기를 포함하는 탄소 원자 및 O, N 및 S 로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자로 이루어지는 백본을 갖는 1 내지 50 개 원자 사슬 (여기에서 예를 들어 페닐렌 고리는 4 개 원자의 길이를 설명한다) 이다. 하나의 실시형태에서 본 발명에 따른 화합물에서 링커 L 은 포화 C1-C20 알킬 사슬, 또는 탄소 원자 및 O, N 및 S 로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자로 이루어지는 백본을 갖는 1 내지 20 개 원자 사슬, 또는 적어도 하나의 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 또는 치환된 헤테로아릴 기를 포함하는 탄소 원자 및 O, N 및 S 로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자로 이루어지는 백본을 갖는 1 내지 20 개 원자 사슬 (여기에서 예를 들어 페닐렌 고리는 4 개 원자의 길이를 설명한다) 이다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 링커 L 은 부재하거나 또는 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 또는 올리고펩티드로부터 선택되고, 아미드 연결, 에스테르 연결, 알켄 또는 트리아졸포함하거나 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 하나의 실시형태에서 링커 L 은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 또는 올리고펩티드로부터 선택되고, 아미드 연결, 에스테르 연결, 알켄 또는 트리아졸을 포함할 수 있거나 또는 그것으로 이루어질 수 있다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 관한 정의에 포함되는 링커 L 은 부재한다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 링커 L 은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 또는 올리고펩티드로부터 선택되고, 아미드 연결, 에스테르 연결, 알켄 또는 트리아졸을 포함할 수 있거나 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는 링커 L 은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 아미드 결합 및 올리고펩티드로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 링커 L 은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬 및 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬로부터 선택된다.
링커 L 에 포함될 수 있는 펩티드는 하나의 실시형태에서 올리고펩티드이고, 2 내지 20 개의 아미노산으로 이루어진다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 링커 L 은 관심의 모이어티 M 에 에스테르, 에테르, 티오에테르, 아민, 아미드, 다이설파이드, 카르보네이트, 카르바메이트, 알켄, 트리아졸, 디히드로피리다진 또는 포스포디에스테르 결합을 통해 결합된다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되고 본원에서 개시되는 방법에서 사용되는, "관심의 모이어티" (M) 는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 즉, 올리고펩티드, 또는 폴리펩티드, 라벨, 세포독성제, 결합쌍의 파트너 및 작용기로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 관심의 모이어티 M 은 저분자량의 것이며, 즉, 20000 달톤 미만의 분자량을 갖는다. 추가의 실시형태에서 관심의 모이어티는 100 내지 15000, 100 내지 10000, 100 내지 5000 및 100 내지 2000 달톤의 분자량을 갖는다.
본원에 개시되는 방법에서 사용되는 관심의 모이어티 M 에 해당할 수 있는 펩티드는, 하나의 실시형태에서 1 내지 100 개의 아미노산으로 이루어진다.
하나의 실시형태에서 링커 L 또는 관심의 모이어티 M 중 오직 하나가, 각각, 올리고펩티드 또는 펩티드이다.
본원에 개시되는 방법에서 사용되는 관심의 모이어티 M 에 해당할 수 있는 올리고뉴클레오티드는, 하나의 실시형태에서 2 내지 100 개의 뉴클레오티드로 이루어진다.
하나의 실시형태에서 관심의 모이어티 M 은 뉴클레오티드를 포함한다.
식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는 관심의 모이어티 M 중 하나는 라벨이다. 링커 (L) 에 공유적으로 부착될 수 있는 임의의 라벨이 사용될 수 있다. 라벨은 다음의 기능을 할 수 있다: (i) 검출가능한 신호를 제공한다; (ii) 제 2 라벨와 상호작용하여, 제 1 라벨 또는 제 2 라벨에 의해 제공되는 검출가능한 신호를 변경하며, 예를 들어 FRET (형광 공명 에너지 전이) 를 야기한다; (iii) 전하, 소수성, 형태, 또는 기타 물리적 파라미터에 의해 이동도, 예를 들어 전기영동 이동도 또는 세포-투과성에 영향을 미친다; 또는 (iv) 포획 모이어티 (capture moiety) 를 제공하여, 예를 들어 이온성 착화를 조정한다.
다수의 라벨 (또한 염료로서 언급됨) 이 이용가능하며, 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다:
(a) 형광 염료
형광 염료는 예를 들어 Briggs et al "Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058) 에 의해 기재된다.
형광 라벨 또는 형광단은 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 플루오레세인 유형 라벨, 예를 들어 FITC, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시 플루오레세인; 로다민 유형 라벨, 예를 들어 TAMRA; 리사민; 텍사스 레드; 단실; 시아닌; 피코에리트린; 및 이들의 유사체를 포함한다. 형광 라벨은 본원에 개시된 기술을 사용하여 표적 분자에 포함되는 알데히드 기에 접합될 수 있다. 형광 염료 및 형광 라벨 시약은, 예를 들어, Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA), ThermoFisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) 및 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill.) 로부터 상업적으로 입수가능한 것을 포함한다.
(b) 발광 염료
발광 염료 또는 라벨은 화학발광 및 전기화학발광 염료로 추가로 분류될 수 있다.
화학발광 라벨의 상이한 부류는, 루미놀, 아크리디늄 화합물, 코엘렌테라진 및 유사체, 디옥세탄, 퍼옥시옥살산 기반 시스템 및 이의 유도체를 포함한다. 면역진단 절차에서는 주로 아크리디늄 기반 라벨이 사용된다 (상세한 개관은 Dodeigne C. et al., Talanta 51 (2000) 415-439 에 제공되어 있다).
전기화학발광 라벨로서 사용되는 주요 관련된 라벨은 각각 루테늄- 및 이리듐-기반 전기화학발광 착물이다. 전기화학발광 (ECL) 은 분석 응용물에서 고도로 민감하고 선택적인 방법으로서 매우 유용한 것으로 입증되었다. 그것은 화학발광 분석의 분석적 이점 (백그라운드 광신호의 부재) 을 전극 전위를 가함으로써 반응 제어의 용이성과 조합한다. 일반적으로 액체 상 또는 액체-고체 계면에서 TPA (트리프로필아민) 와 함께 재생성하는 루테늄 착물, 특히 [Ru (Bpy)3]2+ (이는 ~620 ㎚ 에서 광자를 방출함) 가 ECL-라벨로서 사용된다. 최근에 또한 이리듐-기반 ECL-라벨이 기술된 바 있다 (WO2012107419(A1)).
(c) 방사성 라벨은 방사성 동위원소 (방사성 핵종), 예컨대 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Gn, 86Y, 89Zr, 99TC, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, 또는 131Bi 를 이용한다.
(d) 영상화 및 치료 목적의 라벨로서 적합한 금속-킬레이트 착물은 당업계에 널리 알려져 있다 (US 2010/0111856; US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990; US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US 5,834,456; Hnatowich et al, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares et al, Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78; Mirzadeh et al, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65; Meares et al, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26; Izard et al, Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346-350; Nikula et al, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110; Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera et al, J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646; Ruegg et al, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226; Verel et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee et al, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482; Mitchell, et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi et al Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111; Miederer et al, J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137; DeNardo et al, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula et al J. Nucl. Med. 40 (1999) 166-76; Kobayashi et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36; Mardirossian et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74; Roselli et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20).
식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는 관심의 모이어티 M 중 하나는 세포독성제이다. 하나의 실시형태에서 관심의 모이어티는 하기로부터 선택되는 세포독성제이다: (i) 미세소관 저해제, 유사분열 저해제, 토포이소머라아제 저해제, 또는 DNA 인터칼레이터로서 작용할 수 있는 화학요법제; (ii) 효소적으로 작용할 수 있는 단백질 독소; 및 (iii) 치료용 방사성 동위원소. 하나의 실시형태에서 관심의 모이어티는 화학요법제이다.
예시적 화학요법제는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065, 칼리키아미신 및 기타 에네디인 항생제, 탁산, 안트라사이클린 및 이들의 입체이성체, 동배체, 유사체 또는 유도체를 포함하나, 그에 제한되지 않는다.
단백질 독소는 디프테리아-A 사슬, 디프테리아 독소의 비(非)-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬 (Vitetta et al (1987) Science, 238:1098), 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레루리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-5), 모모르디카 카란티아 (Momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (Sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센 (WO 93/21232) 을 포함한다.
치료적 방사성 동위원소는 32P, 33P, 90Y, 125I, 131I, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212B, 212Pb, 및 Lu 의 방사성 동위원소를 포함한다.
방사성 동위원소는 알려진 방식으로 통합될 수 있다 (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989). 탄소-14-라벨링된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (MX-DTPA) 은 방사성 핵종을 착물에 접합시키기 위한 예시적 킬레이트화제이다 (WO 94/11026).
위에서 언급된 바와 같이, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는 가능한 관심의 모이어티 M 중 하나는 결합쌍의 파트너이다.
본원에서 사용되는 결합쌍은 서로에게 높은 친화도로, 즉 1 나노 몰 친화도이상으로 결합하는 두 개의 파트너로 이루어진다. 당업자가 쉽게 이해할 바와 같이, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는 M 은 두 개의 가능한 파트너 요소 중 하나, 예를 들어, 합텐/항-합텐 결합쌍 중 합텐에 해당한다. 결합쌍에 관한 실시형태는 예를 들어 수용체 및 리간드, 합텐 및 항-합텐 항체로 이루어지는 결합쌍, 및 자연 발생적 고친화도 결합쌍에 기반하는 결합쌍이다. 특정 실시형태에서 결합쌍의 파트너는 리간드 또는 합텐이거나, 또는 그것은 자연 발생적 고친화도 결합쌍 중 하나의 파트너이다.
수용체-리간드 결합쌍의 하나의 예는 스테로이드 호르몬 수용체 및 상응하는 스테로이드 호르몬으로 이루어지는 쌍이다. 하나의 실시형태에서 리간드는 스테로이드 호르몬이다.
하나의 실시형태에서 결합쌍의 파트너는 합텐이거나, 또는 그것은 자연 발생적 고친화도 결합쌍 중 하나의 파트너이다.
본 발명에 따른 하나의 실시형태에 대항하는 자연 발생적 고친화도 결합쌍에 기반하는 결합쌍의 예는 비오틴 또는 비오틴 유사체 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘 뿐만 아니라 FimG 및 DsF 결합쌍이다. 비오틴-(스트립트)아비딘 결합쌍은 당업계에 잘 알려져 있다. FimG-DsF 결합쌍의 기본 원리는 예를 들어 WO2012/028697 에 기재되어 있다.
하나의 다른 유형의 결합쌍은 본 발명의 실시형태에서 합텐 및 항-합텐 항체 결합쌍이다. 합텐은 100 내지 2000 달톤의 분자량을 갖는 유기 분자이다. 하나의 실시형태에서 합텐은 100 내지 1000 달톤의 분자량을 갖는 유기 분자이다. 통상적으로 그러한 분자량의 유기 분자는 면역원성이 아니거나 또는 비교적 낮은 면역원성을 갖는다. 합텐은 그것을 담체 분자에 커플링함으로써 면역원성으로 될 수 있고, 항-합텐 항체는 표준 절차에 따라서 생성될 수 있다. 하나의 실시형태에서 합텐은 스테롤, 담즙산, 성 호르몬, 코르티코이드, 카르데놀라이드, 카르데놀라이드-글리코시드, 부파디에놀라이드, 스테로이드-사포게닌 및 스테로이드 알칼로이드, 카르데놀라이드 및 카르데놀라이드-글리코시드를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 물질 부류의 대표예는 디곡시게닌, 디기톡시게닌, 기톡시게닌, 스트로판티딘, 디곡신, 디기톡신, 디톡신, 스트로판틴이다. 부가적인 적합한 합텐은 예를 들어 플루오레세인이다.
당업자에게 명백한 바와 같이 일부 물질, 예를 들어 비오틴 또는 그것의 유사체는 둘 모두; 자연 발생적 결합쌍의 파트너, 또는 합텐이며, 즉 그들이 사용되어 그에 결합하는 항체를 형성할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 관심의 모이어티 M 은 카르복시산, 카르복시산 에스테르, 에폭시드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 아미노 기, 할로겐, 히드라진, 히드록시l, 술프히드릴, 말레이미도, 알케닐, 알키닐, 아지드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 포스포라미다이트, 트랜스-시클로옥텐, 및 테트라진으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 작용기이다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 관심의 모이어티 M 은 카르복시산, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 아미노 기, 할로겐, 술프히드릴, 말레이미도, 알키닐, 아지드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트 및 포스포라미다이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 작용기이다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 관심의 모이어티 M 은 결합쌍의 파트너이다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 관심의 모이어티 M 은 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 형광 또는 발광 라벨, 세포독성제, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 디곡신 또는 디곡신 유사체, 및 말레이미드로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직한 디곡신 유사체는 디옥시게닌이다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 관심의 모이어티 M 은 합텐, 비오틴 또는 비오틴 유사체 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴, FimG, 리간드 및 올리고뉴클레오티드로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 관심의 모이어티 M 은 합텐 및 비오틴 또는 비오틴 유사체 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴으로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 관심의 모이어티 M 은 비오틴 또는 비오틴 유사체 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴이다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 관심의 모이어티 M 은 비오틴이다.
비오틴 유사체는 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 뉴클레오티드는 예를 들어 핵산 (예컨대 RNA 및 DNA) 의 기본 구조 단위인 퓨린 또는 피리미딘 염기에 및 포스페이트 기에 연결된 리보오스 또는 데옥시리보오스 당으로 이루어지는 화합물이다. 뉴클레오티드는 당, 염기 또는 포스페이트 부분에서 변형될 수 있으며, 예를 들어 그것은 피리미딘 염기의 C5-위치에서 변형될 수 있다. 바람직한 예는 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘 및 2'-데옥시티미딘의 5'-포스페이트 또는 폴리포스페이트이다. 다른 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체는 아래에서 올리고뉴클레오티드 (핵산) 에 대한 상세한 설명에서 추가로 기재된다.
올리고뉴클레오티드는 포스페이트 에스테르 연결을 통해 연결되어 있는 복수의 뉴클레오티드로 구성되고, 또한 비-뉴클레오티드성 빌딩 블록 예를 들어 스페이서 분자 예컨대 글리콜, 1,3-프로판디올, dSpacer® (Glen Research 또는 Chemgenes 로부터의 것), 또는 심지어는 방향족 빌딩 블록 예컨대 치환된 벤젠을, 그들이 올리고뉴클레오티드 내로 통합될 수 있는 한, 포함할 수 있다. 그러한 올리고뉴클레오티드에 포함되는 뉴클레오티드(들) 중 일부는 다른 작용기 예컨대 라벨링 모이어티 (예를 들어 비오틴, 플루오레세인) 로 치환될 수 있다.
하나의 실시형태에서 관심의 모이어티 M 에 해당하는 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드성 빌딩 블록으로부터 선택되는 2 내지 50 개의 서브유닛으로 이루어진다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되고 본원에서 개시되는 방법에서 사용되는 관심의 모이어티 M 은 20000 달톤 미만의 분자량을 갖고, 작용기, 결합쌍의 파트너, 세포독성제 또는 라벨이다.
하나의 실시형태에서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는, 관심의 모이어티 M 은 100 내지 20000 달톤의 분자량을 갖고, 결합쌍의 파트너 및 라벨로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
위에서 명시된 바와 같이 본원에 개시된 방법은 알데히드 기를 포함하는 임의의 종류의 표적 분자 T 를 식 I 의 화합물에 결합시키는데 매우 유용하다.
하나의 실시형태에서 표적 분자 T 는 고체상, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 뉴클레오티드 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
"고체상", "고체 지지체" 또는 "고체 표면" 은 전형적으로 유리 또는 중합체이며, 가장 흔히 사용되는 중합체는 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 또는 폴리프로필렌이다. 당업자가 이해할 바와 같이 고체상은 그것의 본질에 의해 알데히드 작용기를 함유할 수 있거나 또는 화학적으로 개질되어 알데히드 기를 도입할 수 있다. 추가의 증거로서, 고체상은 본 발명의 목적을 위해 알데히드 기를 포함하는 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 뉴클레오티드 및 핵산 중 임의의 것으로 코팅될 수 있다. 고체 지지체는 튜브, 비드, 또는 마이크로플레이트의 디스크의 형태일 수 있다. 하나의 실시형태에서 고체상은 유리 또는 위에서 언급된 중합체 중 임의의 것에 기반하는 상자성 비드이다.
하나의 실시형태에서 표적 분자 T 는 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 뉴클레오티드 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
"탄수화물" 은 탄소 (C), 수소 (H) 및 산소 (O) 원자로 이루어지는 생물학적 분자이며, 통상적으로 수소-산소 원자 비는 2:1 (물에서와 같이) 이다; 다시 말하면, 실험식 Cm(H2O)n (식에서 m 은 통상적으로 n 과 동일하다) 을 갖는다. 일부 예외가 존재한다 (m 은 n 과 상이하다); 예를 들어, 데옥시리보오스, DNA 의 당 구성요소는 실험식 C5H10O4 을 갖는다. 탄수화물은 기술적으로 탄소의 수화물이다; 구조적으로 그들을 폴리히드록시 알데히드 및 케톤으로서 보는 것이 더욱 정확하다.
용어 탄수화물은 생화학에서 가장 흔하며, 생화학에서 그것은 '당류' 의 유의어이며, 당, 전분, 및 셀룰로오스를 포함하는 분자의 군이다. 하나의 실시형태에서 탄수화물은 당, 전분, 및 셀룰로오스로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서 표적 분자 T 는 폴리펩티드, 단백질, 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서 표적 분자 T 는 단백질, 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서 표적 분자 T 는 폴리펩티드 또는 단백질이다.
용어 "펩티드", "올리고펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질" 은 당업자에게 알려져 있고, 본원에서 아래에서 추가로 정의된다.
일반적으로 용어 "펩티드" 는 아미노산의 단량체가 아미드 결합을 통해 함께 연결되어 있는 둘 이상의 아미노산 (= 아미노산 잔기) 을 포함하는 중합체를 나타낸다. 아미노산은 그의 D- 또는 L -이성질체일 수 있고, 폴리펩티드는 아미노산의 D-이성질체 또는 L-이성질체로 구성될 수 있다. 하나의 실시형태에서 펩티드는 아미노산의 L-이성질체로 이루어진다. 용어 펩티드는 올리고펩티드 및 폴리펩티드 둘 모두를 포함한다.
용어 "올리고펩티드" 는 적어도 2 개 및 최대 20 개의 아미노산을 포함하는 펩티드에 사용된다.
용어 "폴리펩티드" 는 적어도 21 개의 아미노산을 포함하는 펩티드에 사용된다. 자연 발생적 폴리펩티드는 자연 발생적 아미노산으로 구성된다. 부가적으로, 비자연적 아미노산, 예를 들어, β-알라닌, 페닐글라이신, 또는/및 호모아르기닌을 포함하는 폴리펩티드가 합성될 수 있다. 폴리펩티드는 소위 이차 변형, 예컨대 인산화 또는 글리코실화를 겪을 수 있다. 그러한 변형된 폴리펩티드는 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드이다. 하나의 실시형태에서 본 공개에 따른 방법에서 사용되는 폴리펩티드는 21 내지 1000 개의 아미노산 잔기를 갖는다.
본 발명의 상이한 양상의 맥락에서, 용어 "단백질" 은 이차 및 삼차 구조를 재개하는 하나 이상의 펩티드 사슬을 포함하는 분자를 나타내고, 부가적으로 사차 구조를 형성하는 여러 펩티드 사슬, 즉 여러 서브유닛으로 구성된 단백질을 나타낸다. 단백질은 때때로 보철 기 또는 보조인자로서 호칭될 수 있는 부착된 비-펩티드 기를 갖는다. 단백질은 또한 이차 변형, 예를 들어, 인산화, 글리코실화 등을 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 알데히드 기를 포함하는 표적 분자 T 에서, 알데히드 기는 포르밀-생성 효소 (FGE) 방법에 의해 도입된다. 간략히, 포르밀글라이신 생성 효소는 펜타펩티드 공통 서열, CxPxR 을 인지하고, 이 서열 내의 시스테인을 포르밀글라이신으로 특이적으로 산화시킨다. FGE 인지 서열 또는 알데히드 태그는 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 생산된 이종 재조합 단백질 내로 삽입될 수 있다 (참고, 예를 들어 Rabuka et al, Nature Protocols 2012, 7, 1052-1067). 또다른 실시형태에서 N-말단 글라이신은 아미노기전이 반응에 의한 알데히드이다 (참고, 예를 들어 Gilmore et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2006, 45, 5307). 다른 실시형태에서, 예를 들어, N-말단 세린 또는 트레오닌은 알데히드로 산화될 수 있고, 당-개질된 단백질의 당구조는 페리오데이트로 산화되어 알데히드 기를 생성할 수 있다.
하나의 실시형태에서 표적 분자 T 는 결합쌍의 폴리펩티드 파트너 및 항체로부터 선택되는 폴리펩티드 또는 단백질이다.
결합쌍의 폴리펩티드 파트너는 예를 들어 수용체 리간드 결합쌍의 수용체, 비오틴 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합쌍의 아비딘 또는 스트렙타비딘, 또는 FimG/DsF 결합쌍의 FimG 이다.
하나의 실시형태에서 본 공개에 따른 방법에서 사용되는 표적 분자 T 는 FimG, 아비딘, 스트렙타비딘 및 항체로부터 선택되는 폴리펩티드 또는 단백질이다.
하나의 실시형태에서 본 공개에 따른 방법에서 사용되는 표적 분자 T 는 아비딘, 스트렙타비딘 및 항체로부터 선택되는 폴리펩티드 또는 단백질이다.
용어 "항체" 는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 특히 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 2 개 이상의 무손상 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중 특이적 항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체) 를 포함한다.
"단리된" 항체는, 이의 자연 환경의 구성 요소로부터 확인되고, 분리되며, 및/또는 회수되는 것이다. 이의 자연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 항체는 (1) 예를 들어, 로우리 (Lowry) 방법에 의해 결정되는 바와 같은, 95 중량% 초과의 항체, 및 일부 실시형태에 있어서, 99 중량% 초과의 항체까지; (2) 예를 들어, 스피닝 컵 서열 분석기 (spinning cup sequenator) 의 사용에 의해, N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15 개 이상의 잔기를 수득하는데 충분한 정도까지, 또는 (3) 예를 들어, 쿠마시 블루 또는 실버 스테인을 사용하여, 환원 또는 비-환원 조건하에서 SDS-PAGE 에 의한 균질성까지 정제한다. 단리된 항체는, 항체의 자연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내에서 원위치에 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"고유의 항체" 는 통상적으로 2 개의 동일한 경 (L) 쇄 및 2 개의 동일한 중 (H) 쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로사합체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 디술파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 디술파이드 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 사이에서 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디술파이드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (VH), 이어서 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (VL), 및 이의 다른 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제 1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 의미한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH" 로서 지칭할 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL" 로서 지칭할 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이며, 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변" 은, 가변 도메인의 특정 부분이 항체 사이에서 서열이 광범위하게 다르며, 이의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되어 있지 않다. 이것은, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변 영역 (HVR) 이라고 불리는 3 개의 구획에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR) 이라고 부른다. 고유의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4 개의 FR 영역을 포함하고, 이들은 3 개의 HVR 에 의해 연결되는 베타-시트 구성을 주로 채택하며, 이들은 베타-시트 구조를 연결하는, 및 일부 경우에 있어서, 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 사슬에서의 HVR 은 FR 영역에 의해 매우 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 HVR 과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991) 참조). 불변 도메인은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서의 항체의 참여와 같은, 다양한 이펙터 (effector) 기능을 나타낸다.
임의의 척추 동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린) 의 "경쇄" 는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초해서, 카파 (κ) 및 람다 (λ) 라고 불리는 2 개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나에 지정될 수 있다.
이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린) 는 상이한 부류에 지정될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 의 5 가지 주요 부류의 면역글로불린이 있으며, 이들의 일부는 하위 부류 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린의 하위 단위 구조 및 3 차원 배치는 충분히 공지되어 있으며, 일반적으로, 예를 들어, Abbas et al., Cellular 및 Mol. Immunology, 4th ed., W.B. Saunders, Co. (2000) 에 기재되어 있다. 항체는, 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 결합에 의해 형성되는, 보다 커다란 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체" 는, 하기에서 정의하는 바와 같은 항체 단편이 아니라, 이의 실질적으로 무손상 형태의 항체를 지칭하기 위해서, 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특히, Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"항체 단편" 은, 바람직하게는 이의 항원-결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중 특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 소화는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편, 및 이의 명칭이 용이하게 결정화하는 이의 능력을 반영하는 잔여 "Fc" 단편이라고 불리는, 2 개의 동일한 항원-결합 단편을 생성한다. 펩신 처리는, 2 개의 항원-결합 부위를 가지며, 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv" 는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 하나의 실시형태에 있어서, 2-사슬 Fv 종은 밀접하게 비-공유 결합된, 하나의 중- 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이합체로 이루어진다. 단일-사슬 Fv (scFv) 종에 있어서, 하나의 중- 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합될 수 있으며, 따라서 경쇄 및 중쇄는 2-사슬 Fv 종에서의 것과 유사한 "이합체" 구조로 결합할 수 있다. 이러한 구성에 있어서, 각각의 가변 도메인의 3 개의 HVR 은 VH-VL 이합체의 표면 상에서 항원-결합 부위를 한정하기 위해 상호 작용한다. 종합적으로, 6 개의 HVR 은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 3 개의 HVR 만을 포함하는 Fv 의 절반) 조차도, 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만, 항원을 인식하고, 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 중- 및 경쇄 가변 도메인을 함유하며, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1) 을 함유한다. Fab' 단편은, 항체-힌지 (hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기가 부가된 것에 의해, Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH 는, 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 자유 (free) 티올기를 갖는 Fab' 에 대한 지정이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링은 또한 공지되어 있다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는, scFv 가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv 의 검토를 위해서는, 예를 들어, Plueckthun, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg 및 Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994) pp. 269-315 를 참조한다.
용어 "디아바디" 는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 의미하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 에서의 경쇄 가변 도메인 (VL) 에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) 을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2 개의 도메인 사이에 쌍을 이루도록 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 이루어, 2 개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2 가 또는 이중 특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어, EP 0404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 및 Holliger, P. et al., PNAS USA 90 (1993) 6444-6448 에 보다 완전하게 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134 에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 수득되는 항체를 의미하며, 즉, 모집단을 포함하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는, 가능한 돌연변이, 예를 들어, 자연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고는, 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날" 은, 항체의 특성이 개별 항체의 혼합물이 아니라는 것을 나타낸다. 특정 실시형태에 있어서, 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터의 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 프로세스에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선별 프로세스는 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀과 같은, 복수의 클론으로부터 특이적인 클론의 선별일 수 있다. 선별된 표적 결합 서열은, 예를 들어, 표적에 대한 친화성을 향상시키고, 표적-결합 서열을 인간화하고, 세포 배양에서 이의 생성을 향상시키고, 생체 내에서 이의 면역원성을 감소시키고, 다중 특이적 항체를 생성하는 등을 위해서 추가로 변경될 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체는 또한 본 발명의 모노클로날 항체인 것으로 이해해야 한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프) 에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날-항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 이들의 특이성 외에도, 모노클로날-항체 제제는, 이들이 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
위에서 언급된 바와 같이, 하나의 실시형태에서 본 공개에 따른 방법에서 사용되는 표적 분자 T 는 고체상, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 뉴클레오티드 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서 본 공개에 따른 방법에서 사용되는 표적 분자 T 는 핵산이다.
본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드" 또는 "핵산" 은 일반적으로 적어도 2 개의 뉴클레오티드 및 최대 약 1000 개의 뉴클레오티드를 포함하는 짧은, 일반적으로 단일 가닥의, 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 실시형태에서 올리고뉴클레오티드는 적어도 9, 10, 11, 12, 15, 18, 21, 24, 27 또는 30 개 뉴클레오티드의 길이를 가질 것이다. 바람직한 실시형태에서 올리고뉴클레오티드 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 또는 30 개 뉴클레오티드 이하의 길이를 가질 것이다. 하나의 실시형태에서 올리고뉴클레오티드는 천연 뉴클레오시드 2'-데옥시아데노신 (dA), 2'-데옥시구아노신 (dG), 2'-데옥시시티딘 (dC), 2'-데옥시티미딘 (dT), 아데노신, 구아노신, 시티딘 및 유리딘, 및 2'-데옥시유리딘 (dU) 을 포함한다. 또다른 실시형태에서 핵산은 이중-가닥일 수 있다.
용어 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 광범위하게 이해될 것이고, DNA 및 RNA 뿐만 아니라 그의 유사체 및 변형체를 포함한다. 핵산 유사체는 예를 들어 표준 염기 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실에서 치환기를 보유하는 치환된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 치환된 핵염기를 포함하는 그러한 뉴클레오시드의 예는 다음과 같다: 5-치환된 피리미딘 예컨대 5 메틸 dC, 아미노알릴 dU 또는 dC, 5-(아미노에틸-3-아크릴이미도)-dU, 5-프로피닐-dU 또는 -dC, 5 할로겐화된 -dU 또는 -dC; N 치환된 피리미딘 예컨대 N4-에틸-dC; N 치환된 퓨린 예컨대 N6-에틸-dA, N2-에틸-dG; 8 치환된 퓨린 예컨대 8-[(6-아미노-헥스-1-일)-아미노]-dG 또는 -dA, 8 할로겐화된 dA 또는 dG, 8-알킬 dG 또는 dA; 및 2 치환된 dA 예컨대 2 아미노 dA.
핵산 유사체는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유사체를 함유할 수 있다. 즉 자연 발생적 핵염기는 핵염기 유사체 예컨대 5-니트로인돌 d 리보시드; 3 니트로 피롤 d 리보시드, 데옥시이노신 (dI), 데옥시잔토신 (dX); 7 데아자 -dG, -dA, -dI 또는 -dX; 7-데아자-8-아자 -dG, -dA, -dI 또는 -dX; 8-아자 -dA, -dG, -dI 또는 -dX; d 포르마이신; 슈도 dU; 슈도 이소 dC; 4 티오 dT; 6 티오 dG; 2 티오 dT; 이소 dG; 5-메틸-이소-dC; N8-연결된 8-아자-7-데아자-dA; 5,6-디히드로-5-아자-dC; 및 에테노-dA 또는 피롤로-dC 를 사용하여 교환될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 상보적인 가닥에서의 핵염기는, 듀플렉스 (duplex) 형성이 특이적이게 되게 하는 방식으로 선택되어야 한다. 예를 들어, 5-메틸-이소-dC 가 하나의 가닥 (예를 들어 (a)) 에서 사용되는 경우 이소 dG 보적인 가닥 (예를 들어 (a')) 에 있어야 한다.
핵산 유사체에서 올리고뉴클레오티드 백본은 변형되어 치환된 당 잔기, 당 유사체, 뉴클레오시드간 포스페이트 모이어티에서의 변형체를 함유할 수 있으며, 및/또는 PNA 일 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 예를 들어 치환된 데옥시 리보오스 예컨대 2'-메톡시, 2'-플루오로, 2'-메틸셀레노, 2'-알릴옥시, 4'-메틸 dN (여기에서 N 은 핵염기, 예를 들어, A, G, C, T 또는 U 이다) 를 포함하는 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
당 유사체는 예를 들어 자일로오스; 2',4' 가교된 리보오스 예컨대 (2'-O, 4'-C 메틸렌)-가교된 리보오스 (LNA 로서 알려진 올리고머) 또는 (2'-O, 4'-C 에틸렌)-가교된 리보오스 (ENA 로서 알려진 올리고머); L-리보오스, L- d-리보오스, 헥시톨 (HNA 로서 알려진 올리고머); 시클로헥세닐 (CeNA 로서 알려진 올리고머); 알트리톨 (ANA 로서 알려진 올리고머); 시클로프로판 고리에 융합되는 에틸렌 가교에 의해 C3' 및 C5' 원자가 연결되는 트리시클릭 리보오스 유사체 (트리시클로DNA 로서 알려진 올리고머); 글리세롤 (GNA 로서 알려진 올리고머); 글루코피라노오스 (호모-DNA 로서 알려진 올리고머); 카르바리보오스 (테트라히드로푸란 서브유닛 대신에 시클로펜탄을 가짐); 히드록시메틸-모르폴린 (DNA 로서 알려진 올리고머) 이다.
변형된 뉴클레오시드간 포스페이트 모이어티를 포함하는 많은 수의 변형은 또한 혼성화 특성을 간섭하지 않는 것으로 알려져 있고, 그러한 백본 변형은 또한 치환된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체와 조합될 수 있다. 예는 포스포르티오에이트, 포스포르디티오에이트, 포스포라미데이트 및 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드이다.
PNA (포스페이트 및 d-리보오스가 없는 백본을 가짐) 가 또한 DNA 유사체로서 사용될 수 있다. 위에서 언급된 변형된 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 뿐만 아니라 올리고뉴클레오티드 백본 변형은 본 발명의 의미에서 올리고뉴클레오티드에서 원하는 대로 조합될 수 있다.
핵산 또는 올리고뉴클레오티드가 표적 분자 T 로서 사용되는 경우에, 특정 실시형태에서, 알데히드 변형은 화학적 또는 효소적 수단에 의해 통합될 수 있다. 화학적 수단에 의해, 포르밀 변형된 포스포라미다이트 (예를 들어 포르밀인돌 포스포라미다이트, Glen Research) 가 사용되어 알데히드 기를 도입할 수 있으며, 또한 NHS 에스테르 화학이 적용될 수 있다. 알데히드 변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트가 사용되어 알데히드 기를 효소적으로 통합할 수 있다.
본 공개에 따른 방법에서 위에서 식 I 의 화합물에 포함되는 관심의 모이어티 M 에 관해 뿐만 아니라 표적 모이어티 T 에 관해 제시된 다양한 실시형태가 조합될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시형태에서 식 I 의 화합물에 포함되는 관심의 모이어티 M 은 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 형광 또는 발광 라벨, 세포독성제, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 디곡신 또는 디곡신 유사체, 및 말레이미드로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 표적 분자 T 는 폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들어 항체이다. 또다른 예에서 식 I 의 화합물에 포함되는 관심의 모이어티 M 은 뉴클레오티드이고, 표적 분자 T 는 핵산이다.
하나의 실시형태에서 식 I 의 화합물에 포함되는 관심의 모이어티 M 은 올리고뉴클레오티드이고, 표적 분자 T 는 뉴클레오티드이다. 하나의 실시형태에서 식 I 의 화합물에 포함되는 관심의 모이어티 M 은 올리고뉴클레오티드이고, 표적 분자 T 는 올리고뉴클레오티드이다.
하나의 실시형태에서 표적 분자 T 는 복수의, 즉 2 내지 50 개의, 알데히드 기를 포함한다. 그 결과, 본원에 개시된 방법을 실시할 때, 복수의 관심의 모이어티 M 이 표적 분자 T 와 연결된다.
또한 본원에서 개시되는 것은 표적 분자 T 및 관심의 모이어티 M 둘 모두를 포함하는, 본 발명에서 기재되고 개시되는 방법에 의해 수득되는 접합체이다.
하나의 실시형태에서 본 공개는 식 II 에 따른 화합물 (또는 접합체) 에 관한 것이다,
식 II:
Figure pct00007
식에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 및 T 는 모두 위에서 식 I 하에 정의된 바와 같다. 즉 R4, R5, R6, R7 또는 R8 중 적어도 하나는 -LM 이며, L 및 M 은 위에서 정의된 바와 같다. 당업자가 이해하는 바와 같이 식 II 의 화합물은 본원에 개시된 방법을 실시하여 수득되는 생성물이다. 식 II 의 화합물에서 표적 분자 T 는 식 II 의 코어 구조, 1,2,3,4-테트라히드로피롤로[1,2-a]피라진을 통해, 관심의 모이어티 M 에 결합, 또는 당업자가 또한 언급하는 바와 같이 접합된다.
본 공개에 따른 방법에서 한편으로는 표적 분자 T 및 다른 한편으로는 다양한 관심의 모이어티 M 에 관한 다양한 실시형태가 원하는 대로 조합될 수 있다. 조합에 관한 이들 옵션은 다양한 사용 분야에서 매우 유용한 여러 가지 접합체를 초래한다.
하나의 실시형태에서, 표적 분자로서의 항체 및 관심의 모이어티로서의 형광 라벨 또는 발광 라벨, 또는 비오틴 또는 비오틴 유사체, 디곡신 또는 디곡신 유사체를 포함하는, 식 II 의 화합물 (접합체) 이 생산된다. 하나의 실시형태에서 그러한 화합물은 면역학적 검출 방법에서 사용된다.
하나의 실시형태에서, 표적 분자로서의 항체 및 관심의 모이어티로서의 세포독성제를 포함하는, 식 II 의 화합물 (접합체) 이 생산된다. 하나의 실시형태에서 그러한 화합물은 치료적 목적을 위해, 예를 들어 항-암 요법에서 사용된다.
하나의 실시형태에서, 표적 분자로서의 뉴클레오티드 및 관심의 모이어티로서의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 식 II 의 화합물 (접합체) 이 생산된다. 하나의 실시형태에서 그러한 화합물은 차세대 시퀀싱 접근법에서, 예를 들어 나노포어 시퀀싱에서 사용된다.
추가로 개시되는 것은 식 III 에 따른 물질이다,
식 III
Figure pct00008
식에서 R1, R2 및 R3 은 독립적으로 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 알케닐, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴이고, R4, R5, R6 및 R7 은 독립적으로 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴, 또는 -LM 이고,
R8 은 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴이고,
R4, R5, R6, R7, 및 R8 중 둘은 임의로 연결되어 치환된 또는 치환되지 않은 시클로알킬 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로시클로알킬을 형성하고,
M 은 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 라벨, 세포독성제, 결합쌍의 파트너 및 말레이미드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 관심의 모이어티이고,
링커 L 은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 또는 올리고펩티드로부터 선택되고, 아미드 연결, 에스테르 연결, 알켄 또는 트리아졸을 포함할 수 있고,
단, R4, R5, R6 또는 R7 중 적어도 하나는 -LM 임.
식 I 의 화합물과 식 III 의 물질, 각각 사이의 하나의 중요한 차이는 식 III 의 R8 이 -LM 이 아니라는 사실이다.
하나의 실시형태에서 식 III 의 물질에서 R1, R2 및 R3 은 독립적으로 H 또는 메틸이다.
하나의 실시형태에서 식 III 의 물질에서 R1, R2 및 R3 은 전부 H 이다.
위에서 명시된 바와 같이, 식 III 의 물질에 포함되는, 링커 L 은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 또는 올리고펩티드로부터 선택되고, 아미드 연결, 에스테르 연결, 알켄 또는 트리아졸을 포함할 수 있다. 이들 제한에 대한 예외로, 식 III 에 따른 물질에 포함되는 링커 L 은 식 I 및 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는 링커에 관해 위에서 기재된 바와 같은 정의를 만족시킨다.
하나의 실시형태에서, 식 III 의 물질에 포함되는, L 은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 및 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬로부터 선택되고, 아미드 연결, 에스테르 연결, 알켄 또는 트리아졸을 포함하거나 또는 그것으로 이루어질 수 있다.
하나의 실시형태에서, 식 III 의 물질에 포함되는, L 은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬 및 올리고펩티드로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 식 III 의 물질에 포함되는, L 은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬 및 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬로부터 선택된다.
식 III 의 물질에 포함되는, 링커 L 은 그것의 백본 길이에 의해 추가로 정의될 수 있고, 하나의 실시형태에서 1 내지 100 개 원자의 백본 길이를 갖는다.
식 III 의 물질에 포함되는, "관심의 모이어티" (M) 는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 라벨, 세포독성제, 결합쌍의 파트너 및 작용기로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 이들 제한에 대한 예외로 식 III 에 따른 물질에 포함되는 관심의 모이어티 M 은 식 I 및 식 II 의 화합물, 각각에 포함되는 관심의 모이어티 M 에 관해 위에서 기재된 바와 같은 정의를 만족시킨다.
식 III 의 물질에 포함되는, 관심의 모이어티 M 이 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 라벨, 세포독성제, 결합쌍의 파트너 또는 작용기인 경우에 모든 이들 모이어티는 위에서 정의된 바와 같다.
하나의 실시형태에서, 식 III 의 물질에 포함되는, 관심의 모이어티 M 은 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 형광 또는 발광 라벨, 세포독성제, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 디곡신 또는 디곡신 유사체, 및 말레이미드로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
식 III 의 물질에서 관심의 모이어티 M 로서 포함되는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 형광 라벨, 발광 라벨, 세포독성제, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 디곡신 또는 디곡신 유사체 전부는 위에서 정의된 바와 같다.
하나의 실시형태에서, 식 III 의 물질에 포함되는, 관심의 모이어티는 발광 라벨, 세포독성제, 및 비오틴 또는 비오틴 유사체로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 식 III 의 물질에 포함되는, 관심의 모이어티는 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드이다.
실시예 섹션에서 입증되는 바와 같이, 각각, 식 I 및 식 III 둘 모두에서 개시되는, 그들의 N 위치에서 치환된 피롤 화합물은 C-치환된 피롤 화합물보다 더 높은 반응성을 보인다. 또한, 알데히드를 포함하는 표적 분자 및, 피롤 고리의 N-위치에서 치환되는, 본 공개에 따른 피롤 화합물을 반응시켜 수득되는 접합 산물 (식 II 에 따른 물질) 은 또한 더 높은 안정성을 보였다.
도 1: α-, β- 및 N-(2-아미노에틸)피롤, 각각과 포르밀글라이신 함유 펩티드 (11) (SEQ ID NO:1) 의 반응. (A) 에서 반응은 도해적으로 나타나 있다. (B) 로부터 명백한 바와 같이 N-(2-아미노에틸)피롤 (도 1B 에서 N) 의 전환은, 각각, α- 및 β- (2-아미노에틸)피롤 (도 1B 에서 α, β) 둘 모두의 전환보다 유의하게 더욱 빠르고 더욱 효율적이다.
도 2: 이 도면은 C-말단에서 알데히드 태깅된 마우스 모노클로날 항-TSH 항체의 피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (5) 에 의한 부위-특이적 라벨링을 도해적으로 보여준다.
도 3: C-말단에서 (알데히드-)태깅된 마우스 모노클로날 항-TSH 항체의 피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (5) 에 의한 부위-특이적 라벨링. 포르밀 글라이신을 함유하지 않는 C-말단 돌연변이체 태그 (LATPSRAALLTGR = SEQ ID NO:4) 를 갖는 마우스 항-TSH 항체 (A) (접합체가 형성되지 않는다), 및 (B) 및 (C), 각각에서 C-말단 알데히드 태그 (L*포르밀Gly*TPSRAALLTGR = SEQ ID NO:3) 를 함유하는 마우스 항-TSH 항체 (고도로 효율적인 라벨링) 로 수득된 접합체에 대한 TSK GFC300 SA-FLUO 분석에 의해 수득된 결과가 보여진다.
도 4: TSH-Elecsys 어세이 및 안정성 시험에서 접합체의 성능. TSH 에 대항하는 C-말단에서 알데히드-태깅된 마우스 모노클로날 항체의 피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (5) 에 의한 부위-특이적 라벨링에 의해 수득된 접합체를 시험했다. 칼럼은 왼쪽에서부터 오른쪽으로 다음과 같다: t = 0 에서의 오리지날 (original) 접합체 (라벨링된 "ori"; 전통적 NHS 화학을 통해 수득됨); 35℃ 에서 7 일 후의 오리지날 접합체; t=0 에서의 신규한 접합체 (라벨링된 "5"); 및 35℃ 에서 7 일 후의 신규한 접합체.
도 5: TSH 항체에 대항하는 C-말단에서 알데히드-태깅된 마우스 모노클로날 항체의 N- 및 알파-치환된 피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 [화합물 (5) 및 (7), 각각] 에 의한 부위-특이적 라벨링. (A) N-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (5) 및 (B) α-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (7), 각각과 접합된 SEQ ID NO:3 (L*포르밀Gly*TPSRAALLTGR) 의 C-말단 알데히드 태그를 함유하는 TSH 에 대항하는 마우스 모노클로날 항체의 TSK GFC300 SA-FLUO 분석이 보여진다. 도 5 C 는 전통적 NHS 화학 (ori) 을 통해 또는 부위-특이적으로 알데히드 태그-라벨 N-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (5) 또는 α-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (7), 각각을 통해 수득된 접합체에 관한 t = 0 에서의, 또는 35℃ 에서 3 주 후의 TSH 에 대항하는 마우스 모노클로날 항체의 IgG-비오틴 접합체의 성능/안정성을 보여준다.
하기의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해서 제공되며, 이의 실제 범위는 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 사상을 벗어나지 않고서, 상기에서 기술한 절차에서 수정이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1
(1): Boc-N-피롤로-알라닌 (2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-(1H-피롤-1-일)프로판산) 의 합성
Figure pct00009
Chemical Science, 6(4), 2219-2223; 2015 로부터의 절차에 따라 합성했다.
Figure pct00010
실시예 2
(2): Fmoc-N-피롤로-알라닌-OH 의 합성
Figure pct00011
Boc-N-피롤로-알라닌 (1) (150 mg, 0.591 mmol) 을 CH2Cl2 / TFA (3 mL, 1:1) 에 용해시키고, 실온에서 1 h 동안 교반했다. 이 시간 후에 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 1,4-디옥산/H2O (5 mL, 1:1) 에 재용해시키고, 용액을 0℃ 로 냉각시켰다. NaHCO3 (150 mg, 1.77 mmol) 및 Fmoc-OSu (220 mg, 0.650 mmol) 를 첨가하고, 반응을 밤새 실온에서 교반했다. 1,4-디옥산을 감압 하에 제거하고, 수성 잔류물을 헥산으로 세정하고, 그 후 HCl (1M 수용액) 로 산성화시키고, EtOAc 로 추출했다. SiO2 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 요망되는 산물이 무색 고체로서 수득되었다.
MS (ESI): 관측치 377.1 [M + H]+, 계산치 377.1 [M + H]+
실시예 3
(3): Boc-N-피롤로-알라닌-펜타플루오로페닐 에스테르의 합성
Figure pct00012
DMF (1 mL) 및 트리에틸아민 (83 μL, 0.59 mmol) 중 Boc-N-피롤로-알라닌 (1) (100 mg, 0.39 mmol) 의 용액을 0 ℃ 로 냉각시켰다. 펜타플루오로페닐-트리플루오로아세테이트 (100 μL, 0.59 mmol) 를 첨가하고, 반응을 1 h 동안 실온에서 교반했다. 헥산을 용액에 첨가하고, 2 h 동안 냉각시키고, 백색 결정질 침전물을 수집하고, 다음 단계에 추가의 정제 없이 사용했다.
실시예 4
(4): Fmoc-N-피롤로-알라닌-펜타플루오로페닐 에스테르의 합성
Figure pct00013
DMF (2 mL) 및 디이소프로필에틸아민 (DIPEA) (93 μL, 0.534 mmol) 중 Fmoc-N-피롤로-알라닌 (2) (100 mg, 0.267 mmol) 의 용액을 0 ℃ 로 냉각시켰다. 펜타플루오로페닐-트리플루오로아세테이트 (50 μL, 0.292 mmol) 를 첨가하고, 반응을 1 h 동안 실온에서 교반했다. 포화 수성 NaCl 용액 (15 mL) 을 첨가하고, EtOAc (3 x 30 mL) 로 추출했다. 조합된 유기 층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, SiO2 칼럼 크로마토그래피 (헥산/EtOAc = 4:1) 에 의해 정제하여, 요망되는 산물 (58 mg, 40 %) 을 무색 고체로서 얻었다.
MS (ESI): 관측치 543.1 [M + H]+, 계산치 543.13 [M + H]+
실시예 5
(5): N-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴의 합성
Figure pct00014
Boc-N-피롤로-알라닌-OH (1) 를 주사기에서 전통적 HATU/DIPEA 화학으로 Fmoc-PEG 비오틴 NovaTag™ 수지 (0.31 mmol/g; Merck 로부터 구입) 상에 커플링시키고, 수지로부터 TFA 로 절단했다.
MS (ESI): 관측치 583.4 [M + H]+, 292.3 [M/2 + H]+, 계산치 583.8 [M + H]+
실시예 6
(6): N-피롤로-알라닌-(PEG10) 2 -PEG2-비오틴의 합성
Figure pct00015
N-Fmoc-PEG10-CH2CH2COOH (2 회) 및 Boc-N-피롤로-알라닌-OH (1 회) 를 순차적으로 주사기에서 전통적 고체상 펩티드 합성 조건으로 Fmoc-PEG 비오틴 NovaTag™ 수지 (0.31 mmol/g; Merck 로부터 구입) 상에 커플링시켰으며, 이 때 HATU/DIPEA 를 커플링 반응을 위한 시약으로서 사용하고, 피페리딘 (DMF 중 20%) 을 Fmoc 탈보호 단계에 사용했다. 수지로부터의 절단을 TFA 를 사용하는 처리에 의해 달성했다. HPLC 정제에 의해 요망되는 산물이 수득되었다.
MS (ESI): 관측치 536.1 [M/3 + H]+, 803.7 [M/2 + H]+, 계산치 1606.9 [M + H]+
실시예 7
(7): α-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴의 합성
Figure pct00016
DMF (3 mL) 및 DIPEA (231 μL, 1.33 mmol) 중 Fmoc-α-PyrAla (250 mg, 0.664 mmol) 의 용액을 0 ℃ 로 냉각시켰다. 펜타플루오로페닐-트리플루오로아세테이트 (100 μL, 0.59 mmol) 를 첨가하고, 반응을 2 h 동안 실온에서 교반했다. 600 μL 의 이 용액을 DMF (1 mL) 중 비오틴-PEG2-NH2 (50 mg, 0.133 mmol) 및 DIPEA (46 μL, 0.266 mmol) 의 용액에 첨가했다. 실온에서 2 h 교반 후에 디에틸아민 (400 μL) 을 용액에 첨가하고, 부가적 20 분 동안 교반했다. 반응 혼합물을 75 mL 의 냉각된 디이소프로필 에테르에 첨가하고, 요망되는 산물이 침전물로서 높은 순도로 단리될 수 있었다 (22 mg, 33 %).
MS (ESI): 관측치 511.2 [M + H]+, 계산치 511.6 [M + H]+
실시예 8
(8): Boc-N-피롤로-알라닌-PEG7-NH 2 의 합성
Figure pct00017
DMF (1 mL) 중 NH2-PEG7-NH2 (50 mg, 0.121 mmol) 및 DIPEA (21 μL, 0.121 mmol) 의 용액에 Boc-N-피롤로-알라닌-펜타플루오로페닐 에스테르 (3) (11 mg, 0.025 mmol) 를 첨가했다. 반응을 1 h 동안 실온에서 교반하고, 그 후 용매를 감압 하에 제거했다. 제조용 HPLC 크로마토그래피 (H2O + 0.1% TFA 중 20 % MeCN - 60 % MeCN) 에 의해 요망되는 산물이 무색 수지 (13 mg, 86 %) 로서 수득되었다.
MS (ESI): 605.5 [M + H]+
실시예 9
(9): N-피롤로-알라닌-PEG7-NH-CO(CH 2 ) 5 -말레이미드의 합성
Figure pct00018
1) CH2Cl2 (1 mL) 중 Boc-N-피롤로-알라닌-PEG7-NH2 (8) (16 mg, 0.022 mmol) 의 용액에 DIPEA (15 μL, 0.88 mmol) 및 6-말레이미도-헥산산 NHS 에스테르 (14 mg, 0.044 mmol) 를 첨가했다. 반응을 16 h 동안 교반하고, 그 후 용매를 제거했다. 제조용 HPLC (H2O + 0.1% TFA 중 20 % MeCN - 60 % MeCN) 에 의해 요망되는 산물이 무색 수지 (9 mg, 50 %) 로서 수득되었다.
MS (ESI): 관측치 798.5 [M + H]+, 계산치 798.9 [M + H]+
2) 수득된 물질을 CH2Cl2 (1 mL) 및 TFA (500 μL) 에 용해시키고, 30 min 동안 실온에서 교반했다. 감압 하에 용매를 제거하여 요망되는 산물 (8 mg, quant.) 이 무색 수지로서 수득되었다.
MS (ESI): 관측치 698.5 [M + H]+, 계산치 698.8 [M + H]+
실시예 10
(10): 술포BiPyRu-PEG2-N-피롤로-알라닌의 합성
Figure pct00019
DMF (1 mL) 중 술포BiPyRu-NHS 에스테르 (Roche Diagnostics) (15 mg, 0.0127 mmol) 의 용액에 DIPEA (22 μL, 0.127 mmol) 및 2,2'-(에틸렌디옥시)비스(에틸아민) (19 μL, 0.127 mmol) 를 첨가했다. 반응을 1 h 동안 실온에서 교반했다. 반응의 완료 후에 용매를 제거하고, 역상 제조용 HPLC 크로마토그래피 (H2O + 0.1 % TFA 중 0 % MeCN - 25 % MeCN) 에 의해 요망되는 산물이 오렌지색 고체 (8 mg, 0.0068 mmol, 54 %) 로서 수득되었다. 실온에서 DMF (250 μL) 중 결과적인 술포BiPyRu-PEG2-NH2 (10a) (4.5 mg, 0.0038 mmol) 의 용액에 DIPEA (2 μL, 0.115 mmol) 및 Fmoc-N-피롤로-알라닌-펜타플루오로페닐 에스테르 (6 mg, 0.0115 mmol) 를 첨가했다. 커플링 반응의 완료 후에 디에틸아민 (50 μL) 을 반응에 첨가하고, 부가적 30 분 동안 교반했다. 용매를 감압 하에 제거하고, 역상 제조용 HPLC (0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 완충제 중 0 % MeCN - 35 % MeCN, pH = 7) 에 의해 요망되는 산물 (10b) 이 오렌지색 고체 (2.5 mg, 50 %) 로서 수득되었다.
MS (ESI): 관측치 656.8 [M/2 + H]+, 1310.8 [M + H]+, 계산치 1311.2 [M + H]+
실시예 11
(11): 포르밀 글라이신 함유 펩티드의 합성
Figure pct00020
위의 펩티드 ((11) = SEQ ID NO:1) 를 Rush et al., Org. Lett., 2006, 8, 131-134 에 따라 합성했다. 간략히, 펩티드를 전통적 고체상 펩티드 합성에 의해 수득했으며, 이 때 디에틸 아세탈을 알데히드 작용기를 위한 보호된 전구체로서 사용했다.
MS (ESI): 관측치 774.3 [M/2 + H]+, 517.0 [M/3 + H]+
실시예 12
(12): 5'-피롤로-알라닌-아미노헥산올-T10-3' 의 합성
Figure pct00021
5'-아미노헥산올-T10-3' 올리고뉴클레오티드 (80 μL, H2O 중 2.15 mM, 172 nmol; 전통적 올리고뉴클레오티드 합성 절차에 따라 합성됨) 를 소듐 보레이트 완충제 (250 μL, pH=8.5, 0.1 M) 에 첨가했다. 후속적으로 Fmoc-N-피롤로-알라닌-펜타플루오로페닐 에스테르 (4) (150 μL, MeCN 중 10 mM, 1500 nmol) 를 첨가했다. 2 h 셰이킹 후에 실온에서 디에틸아민 (100 μL) 을 용액에 첨가하고, 이것을 부가적 30 분 동안 셰이킹했다. 주사기 여과 및 투석에 의해 요망되는 산물 (120 nmol, 70 %) 이 수득되었다.
MS (ESI): 관측치 1097.3 [(M- 3H)/3]-
실시예 13
(13): 4-포르밀벤조에이트 NHS-에스테르의 합성
Figure pct00022
DMF (30 mL) 중 4-포르밀벤조산 (1.00 g, 6.66 mmol) 의 용액에 EDC-HCl (1.40 g, 7.33 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드 (842 mg, 7.33 mmol) 를 첨가했다. 16 h 동안 실온에서 교반 후에 혼합물을 EtOAc (150 mL) 로 희석하고, 포화 수성 NaCl 용액 (3 x 50 mL) 으로 세정했다. 유기 상을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 용매를 제거하여 요망되는 산물 (1.40 g, 5.66 mmol, 85 %) 이 무색 고체로서 수득되었다.
Figure pct00023
실시예 14
(14): 4-포르밀벤즈아미도-운데칸올-헥사포스페이트-시티딘의 합성
Figure pct00024
NH2-운데칸올-헥사포스페이트-시티딘 (Fuller et al., PNAS, 113, 5233 에 따라 합성됨) (714 μL, H2O 중 5.6 mM, 4 μmol) 및 4-포르밀벤조에이트 NHS-에스테르 (13) (800 μL, MeCN 중 50 mM, 40 μmol) 를 소듐 보레이트 완충제 (500 μL, pH=8.5, 0.1M) 에 첨가했다. 실온에서 3 h 셰이킹 후에 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (H2O, 0.1 M 트리에틸암모늄아세테이트 중 0 - 35 % MeCN) 에 의해 정제하여 요망되는 산물 (1.82 μmol, 46 %) 이 수득되었다.
MS (ESI): 관측치 522.2 [(M-2H)/2 + 38]-, 1045.3 2 [M-H + 38]-
실시예 15 내지 21 은 알데히드 기를 함유하는 모델 화합물 뿐만 아니라 포르밀글라이신 함유 펩티드 및 항체를 사용하는 피롤로-유도체 (식 I 에 따른 화합물) 의 접합 실험을 보여준다.
실시예 15
2-(1H-피롤-1-일)에탄-1-아민을 위한 모델 피쳇 슈펭글러 반응
Figure pct00025
2-(1H-피롤-1-일)에탄-1-아민 (100 mg, 0.908 mmol) 및 2-(벤질옥시)아세트알데히드 (136 mg, 0.908 mmol) 를 아세테이트 완충제 (0.1M, pH = 5.4, 5 mL) 및 MeCN (5 mL) 에 용해시켰다. 24 h 후에 용매를 감압 하에 제거하고, SiO2 (EtOAc + 2 % TEA) 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 요망되는 산물이 무색 고체로서 수득되었다. NMR 분광법에 의해 고리화 산물을 확인했다.
Rf (EtOAc + 2 % TEA): 0.38
Figure pct00026
상세설명: 2-(1H-피롤-1-일)에탄-1-아민을 알데히드와 "단백질 화합성" 조건에서 반응시킨다. 1H NMR 은 피쳇 슈펭글러 반응 (이민 형성 및 후속적 C-C 고리 닫힘) 이 이들 조건 하에서 일어나서, 안정적인, 바이시클릭 산물 (15) 을 제공한다는 것을 증명한다.
실시예 16
포르밀글라이신 함유 펩티드 (11) 와 반응될 때 α-, β- 및 N-(2-아미노에틸)피롤, 각각의 전환율의 비교:
α-, β- 및 N-(2-아미노에틸)피롤을 포르밀글라이신 함유 펩티드 (11) (SEQ ID NO:1) 와 동일한 조건 하에서 반응시켰다. 반응 조건은 다음과 같았다: 10 μL 의 펩티드 (11) (SEQ ID NO:1) (10 mM 수용액) 및 20 μL 의 아민 (각각 α-, β- 및 N-(2-아미노에틸)피롤, 각각의 아민은 50 mM 수용액으로서) 을 170 μL 의 아세테이트 완충제 (0.05 M, pH = 5.4), 37 ℃ 에 첨가했다. 이 반응은 도 1A 에서 도해적으로 나타나 있다.
포르밀글라이신 함유 펩티드 (11) 와 동일한 조건 하에서 반응될 때 α-, β- 및 N-(2-아미노에틸)피롤의 반응 속도를 비교한다. 피롤은 그것의 α 위치에서 더욱 반응성인 것으로 알려져 있다: 이에 따르면 β-치환된 피롤 (α 에서 고리 닫힘이 일어남) 은 α-치환된 피롤보다 약간 더욱 빠르게 반응한다. 놀랍게도 N-(2-아미노에틸)피롤의 전환은 α- 및 β- (2-아미노에틸)피롤, 각각 둘 모두의 전환보다 유의하게 더욱 빠르다. N-(2-아미노에틸)피롤의 더욱 빠르고 더욱 효율적인 전환은 도 1B 로부터 쉽게 명백해진다.
실시예 17
포르밀글라이신 함유 펩티드 (11) 와 N-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (5) 의 접합
Figure pct00027
아세테이트 완충제 (0.1 M, pH = 5.4, 70 μL) 에 N-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (5) (20 μL, H2O 중 50 mM) 및 *Ac-*L*포르밀Gly*TPSRGSLFTGRK*-OH* (11) (참조, SEQ ID NO:1) (10 μL, H2O 중 10 mM) 를 첨가하고, 혼합물을 37 ℃ 에서 6 h 동안 셰이킹하여 요망되는 고리화된 접합체 (16) 로의 기질의 완전한 전환을 달성했다.
이 실험으로부터 분명해지는 바와 같이, 식 I 에 따른 라벨, 즉 화합물 (5) 를, 피롤로 피쳇 슈펭글러 화학을 통해 생체분자 (화합물 (11) 에 포함되는 펩티드) 에 온화한 (= 단백질 화합성) 조건 하에 접합시키는 것이 가능하다. 요망되는 산물로의 완전한 전환은 적당한 과잉의 피롤 라벨 (5) 로 6 시간 내에 달성된다.
실시예 18
4-포르밀벤즈아미드-운데칸올-헥사포스페이트-시티딘 (14) 과 5'-피롤로-알라닌-아미노헥산올-T10-3' (12) 의 접합
Figure pct00028
아세테이트 완충제 (0.1 M, pH = 5.4, 50 μL) 에 5'-피롤로-알라닌-아미노헥산올-T10-3' (12) (30 μL, H2O 중 1.2 mM) 및 4-포르밀벤즈아미드-운데칸올-헥사포스페이트-시티딘 (14) (10 μL, H2O 중 3.6 mM) 을 첨가하고, 혼합물을 37 ℃ 에서 16 h 동안 셰이킹하여, 요망되는 고리화된 접합체 (17) 로의 기질의 거의 완전한 전환을 달성했다.
(17): MS (ESI): 관측치 1439.7 [(M-3H)/3]- +38
이 실시예에서 올리고뉴클레오티드/뉴클레오티드 빌딩 블록의 접합에 관한 피롤로 피쳇 슈펭글러 반응의 실행가능성을 입증한다. 0.4 mM 의 농도에서 화학량론적 1:1 반응에서 LCMS 은 16 시간 내에 접합 산물로의 기질의 거의 정량적 전환을 보여준다.
실시예 19
포르밀글라이신 함유 항체와 비오틴-PEG3-N-PyrAl라벨의 생물접합
항체 발현 및 정제
TSH 에 대항하는 마우스 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 표준 클로닝 기술을 사용하여 중쇄 C-말단에서 13 아미노산 알데히드-태그 (LCTPSRAALLTGR; SEQ ID NO:2) 를 포함하는 포유류 발현 벡터 내로 클로닝했다. 중쇄 및 경쇄둘 모두를 인코딩하는 플라스미드 및 SUMF1 을 과발현하는 플라스미드 (pRECEIVER-SUMF1, GeneCopoeia 로부터 구입) 를 HEK293F 세포 내로 동시 트랜스펙션시켰다. SUMF1 은 알데히드 태그 서열에 포함된 시스테인을 포르밀글라이신으로, 및 그에 따라 LCTPSRAALLTGR (SEQ ID NO:2) 을 L*포르밀글라이신*TPSRAALLTGR (SEQ ID NO:3) 로 전환시킨다. IgG 를 배양 상청액으로부터 1-단계 단백질 A 친화도 정제 (HiTrap MabSelect SuRe, GE) 를 통해 공급사의 지침에 따라 정제했다.
비오틴일화
각각의 중쇄의 C-말단에서 L*포르밀글라이신*TPSRAALLTGR (200 μM) 로 태깅된 TSH 에 대항하는 마우스 모노클로날 항체를 37℃ 에서 24h 동안 5-배 또는 48h 동안 3-배 과잉의 피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (5) 과 접합시켰다. 모든 접합체를 Zeba 스핀 칼럼 (40K) (ThermoScientific 로부터 구입) 을 통해 정제하여 효소 및 미접합 라벨을 제거했다.
TSK GFC300 SA-FLUO-분석
IgG 비오틴일화를 플루오레세인-라벨링된 스트렙타비딘 (SA-FLUO) 과의 복합체 형성에 의해 평가했다. SA-FLUO-IgG-비오틴-SA-FLUO 복합체를 분석적 크기-배제 크로마토그래피 (TSK GFC300, TOSOH) 에 의해 분석했다. 더욱 상세히, 동등 부피 (50 μl) 의 비오틴일화된 IgG (c = 0,6 mg/ml) 및 SA-FLUO (c = 0,3 mg/ml) 를 혼합하고, 5 min 동안 RT 에서 인큐베이션했다. 20 μl 의 100 mM 비오틴을 첨가했다. 25 μl 의 각각의 샘플을 TSK GFC300 SW 7.8 x 150 mm 칼럼 상에 주입하고, 소광 프로파일을 280 및 494 nm 에서 모니터링했다. 성공적인 비오틴일화는 280 및 494 nm 에서 소광 프로파일을 갖는 SA-FLUO-IgG-비오틴 복합체의 존재에 의해 모니터링된다.
Elecsys TSH 면역어세이
위에 기재된 바와 같이 수득된, TSH 에 대항하는 마우스 모노클로날 항체로부터의 부위-특이적으로 라벨링된 IgG-비오틴 접합체를 비오틴일화된 항-TSH 항체를 함유하지 않는 오리지날 TSH 완충제 중 2,5 ㎍/ml 의 농도로 사용하여, Elecsys® 면역어세이 랙팩 (Roche Diagnostics) 의 R1 구획에서 비오틴일화된 시약을 대체하였다. TSH CalSet (Roche Diagnostics) 로부터의 두 개의 캘리브레이터, Cal1 및 Cal2 를 제조사 (Roche Diagnostics) 에 의해 제공되는 표준 어세이 프로토콜에 따라 Cobas® E170 모듈 상에서 TSH Elecsys® 면역어세이 (Roche Diagnostics) 에서 분석했다.
포르밀글라이신 함유 항체 및 서열 LATPSRAALLTGR (SEQ ID NO:4) 을 포함하는 돌연변이체 항체, 각각과 비오틴-PEG3-N-PyrAl라벨의 생물접합
(A) 알데히드 태깅에 그 외의 적당한 조건 하에 100-배 과잉의 N-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 라벨 (5) 은 SEQ ID NO:4, 즉 포르밀 글라이신을 함유하지 않는 폴리펩티드 서열 (시스테인 대신에 알라닌; 오직 후자는 포르밀 글라이신으로 전환될 수 있음) 을 포함하는 돌연변이체 항체와 비특이적으로 반응하지 않는다.
(B) & (C) 5-배 또는 3-배 과잉의 N-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (5) 과 SEQ ID NO:3 의 C-말단 알데히드 태그를 함유하는 항체를 각각 24 h 및 48 h 내에 정량적으로 접합시킨다. (B) 또는 (C) 의 접합 반응이도 2 에서 도해적으로 제시되어 있다.
이 방법에 의해 수득되는 접합체를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 TSK GFC300 SA-FLUO 분석을 사용하여 분석했다. TSK GFC300 SA-FLUO 분석의 결과가 도 3A 내지 3C 에 나타나 있다.
실시예 20
접합체의 안정성 시험
TSH 에 대항하는 마우스 모노클로날 항체로부터의 부위-특이적으로 라벨링된 IgG-비오틴 접합체 (실시예 19 에서 기재된 바와 같이 수득됨) 를 TSH Elecsys® 면역어세이 (Roche Diagnostics) 에서 Cobas® E170 모듈 상에서 분석했다. 신규한 접합체 뿐만 아니라 오리지날 (ori) 또는 표준 비오틴 접합체를 동일한 완충제에 각각 2,5 ㎍/ml 의 농도로 희석시켰다. 둘 모두를 Elecsys® 면역어세이 랙팩 (Roche Diagnostics) 의 R1 구획 내에 배치하고, 이 상업적으로 입수가능한 어세이 (Roche Diagnostics) 에 관해 제공되는 표준 절차에 따라 어세이를 수행했다. 안정성 평가를 위해 TSH CalSet (Roche Diagnostics) 로부터의 캘리브레이터 중 하나, Cal2 를 TSH Elecsys® 면역어세이 (Roche Diagnostics) 에서 Cobas® E170 모듈 상에서 t = 0 에 및 35℃ 에서 7d 후에, 각각, 오리지날 뿐만 아니라 신규한 접합체 둘 모두를 사용하여 측정했다.
C-말단 알데히드 태그를 함유하는 항체와 N-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 라벨 (5) 의 접합에 의해 수득되는, IgG-비오틴 접합체는 7 일 동안 35 ℃ 에서 인큐베이션 후에 양호한 안정성을 보인다.
실시예 21
N-피롤로-알라닌 또는 α-피롤로-알라닌을 사용하여 생성된 접합체의 항체 접합 효능 및 성능의 비교
SEQ ID NO:3 (L*포르밀Gly*TPSRAALLTGR) 의 C-말단 알데히드 태그를 함유하는 항체와 N-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (5) 및 α-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (7), 각각에 관한 접합 효능의 직접 비교는 N-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 라벨은 항체를 라벨링된 접합체로 거의 정량적으로 전환시키지만 (참고, 도 5A), α-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴과의 인큐베이션 후에 많은 양의 미접합 항체가 검출된다 (참고, 도 5B) 는 것을 보여준다. 3 주 후에 접합체의 TSH-Elecsys 어세이 성능 및 안정성을 본질적으로 실시예 20 에 기재된 바와 같이 조사했다. α-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 항체 접합체는 N-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 항체 접합체보다 덜 안정적이며, 이는 사용된 활성화된 α-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 (7) 의 더 적은 반응성 및/또는 이 커플링 시약과의 불완전한 고리화 반응을 시사한다. 반대로 N-피롤로-알라닌-PEG2-비오틴 항체 접합체, 즉 본원에서 개시되는 화합물 및 방법에 기반하는 접합체는 높은 수율로 생산될 수 있고, 면역 어세이에서의 양호한 성능 뿐만 아니라 양호한 저장 안정성 둘 모두를 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG <120> A method for labeling of aldehyde containing target molecules <130> P34235-WO <150> EP17166237 <151> 2017-04-12 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> formylglycine containing peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X at position 2 represents formylglycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 represents formylglycine <400> 1 Leu Xaa Thr Pro Ser Arg Gly Ser Leu Phe Thr Gly Arg Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> aldehyde tag sequence before formylglycine formation <400> 2 Leu Cys Thr Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> aldehyde tag after formation of formylglycine <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X represents formylglycine <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Xaa represents formylglycine <400> 3 Leu Xaa Thr Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence analogous to aldehyde tag sequence <400> 4 Leu Ala Thr Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg 1 5 10

Claims (15)

  1. 식 II 에 따른 화합물을 생산하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법;
    식 I 의 화합물을 아래 제시된 알데히드 기를 포함하는 표적과 반응시켜
    식 I:
    Figure pct00029

    그에 의해 식 II 에 따른 화합물을 수득하는 단계,
    식 II:
    Figure pct00030

    식에서 R1, R2 및 R3 은 독립적으로 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 알케닐, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴이고, R4, R5, R6, R7 및 R8 은 독립적으로 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴, 또는 -LM 이고, R4, R5, R6, R7, 및 R8 중 둘은 임의로 연결되어 치환된 또는 치환되지 않은 시클로알킬 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로시클로알킬을 형성하고,
    L 은 부재하거나 또는 링커이고,
    M 은 관심의 모이어티이고,
    T 는 표적 분자이고,
    단, R4, R5, R6, R7 또는 R8 중 적어도 하나는 -LM 임.
  2. 제 1 항에 있어서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에서 R1, R2 및 R3 은 독립적으로 H 또는 메틸인 생산 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에서 관심의 모이어티 M 은 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 라벨, 세포독성제, 결합쌍의 파트너 및 작용기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 생산 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에서 관심의 모이어티 M 은 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 형광 또는 발광 라벨, 세포독성제, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 디곡신 또는 디곡신 유사체, 및 말레이미드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 생산 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에서 표적 분자 T 는 고체상, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 뉴클레오티드 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 생산 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에서 표적 분자 T 는 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산인 생산 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에서 표적 분자 T 는 항체인 생산 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에서 링커 L 은 부재하거나 또는 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 또는 올리고펩티드로부터 선택되고, 아미드 연결, 에스테르 연결, 알켄 또는 트리아졸을 포함할 수 있거나 또는 그것으로 이루어질 수 있는 생산 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에서 링커 L 은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬 또는 올리고펩티드로부터 선택되는 생산 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 식 I 또는 식 II 의 화합물, 각각에서 링커 L 은 관심의 모이어티 M 에 에스테르, 에테르, 티오에테르, 아민, 아미드, 다이설파이드, 카르보네이트, 카르바메이트, 알켄, 트리아졸, 디히드로피리다진 또는 포스포디에스테르 결합을 통해 결합되는 생산 방법.
  11. 식 II 의 화합물
    식 II
    Figure pct00031

    식에서 R1 내지 R8 및 T 는 이전 청구항에서 정의된 바와 같음.
  12. 식 III 에 따른 물질,
    식 III
    Figure pct00032

    식에서 R1, R2 및 R3 은 독립적으로 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 알케닐, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴이고,
    R4, R5, R6 및 R7 은 독립적으로 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴, 또는 -LM 이고,
    R8 은 H, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴이고,
    R4, R5, R6, R7, 및 R8 중 둘은 임의로 연결되어 치환된 또는 치환되지 않은 시클로알킬 또는 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로시클로알킬을 형성하고,
    M 은 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 라벨, 세포독성제, 결합쌍의 파트너 및 말레이미드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 관심의 모이어티이고,
    링커 L 은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 또는 올리고펩티드로부터 선택되고, 아미드 연결, 에스테르 연결, 알켄 또는 트리아졸을 포함할 수 있으며,
    단, R4, R5, R6 또는 R7 중 적어도 하나는 -LM 임.
  13. 제 12 항에 있어서, M 은 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 형광 또는 발광 라벨, 세포독성제, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 디곡신 또는 디곡신 유사체 및 말레이미드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 물질.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, M 은 발광 라벨, 세포독성제 및 비오틴 또는 비오틴 유사체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 물질.
  15. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, M 은 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드인 물질.
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