JP2014240887A - 画像取得装置及び画像取得装置のフォーカス方法 - Google Patents

Abstract

【課題】撮像の際の光量を確保でき、かつ試料の焦点位置を精度良く検出できる画像取得装置及びそのフォーカス方法を提供する。【解決手段】画像取得装置Ｍでは、光路差生成部材２１により、第２の光路Ｌ２での光の分岐を行わずに第２の光像の光路長差を形成できる。したがって、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路Ｌ２への光量が抑えられ、第１の撮像装置１８で撮像を行う際の光量を確保できる。また、画像取得装置Ｍでは、試料Ｓにおける所定部位の光像が第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂで露光されるように、対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位の移動とローリング読み出しとを同期させている。得られた画像データには、試料Ｓの同一部位において対物レンズ１５の焦点位置が変更されたときと等価のコントラスト情報が含まれ、当該情報に基づいて合焦点情報を迅速かつ精度良く算出できる。【選択図】図４

Description

本発明は、画像取得装置及び画像取得装置のフォーカス方法に関する。

従来の画像取得装置として、例えば特許文献１に記載の装置がある。この装置では、被検物からの光をハーフプリズムで分割し、ＣＣＤエリアイメージセンサ等の２次元撮像素子からなる光電変換素子で受光する。光電変換素子の制御回路は、受光面を２次元的に走査する２つの走査領域を任意に設定可能な走査領域設定部を有している。そして、走査領域設定部によって設定された２つの走査領域で受光した光の合焦ずれ信号に基づいて合焦制御を実行する。

特開平８−３２０４３０号公報

上述した従来の装置では、ハーフプリズムを用いて被検物からの光を分割している。このため、光電変換素子での光量の確保が難しく、試料の焦点位置の検出精度が低下してしまうおそれがある。また、焦点位置の検出用の光の光量を増大させると、被検物の撮像用の光の光量が減少することとなり、撮像の際の光量の確保が困難となるおそれがある。

本発明は、上記課題の解決のためになされたものであり、撮像の際の光量を確保でき、かつ試料の焦点位置を精度良く検出できる画像取得装置及びそのフォーカス方法を提供することを目的とする。

上記課題の解決のため、本発明に係る画像取得装置は、試料が載置されるステージと、試料に向けて光を照射する光源と、ステージ上の試料と対峙するように配置された対物レンズ、及び試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、試料に対する対物レンズの視野位置を移動させる視野駆動手段と、第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて試料の合焦点情報を算出する合焦点算出手段と、視野駆動手段及び第２の撮像手段の動作を制御する動作制御手段と、第２の光路に配置され、第２の撮像手段の撮像面の面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を備え、第２の撮像手段は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を有し、動作制御手段は、試料における所定部位の光像が二次元撮像素子の各画素列で露光されるように、視野駆動手段による対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動と二次元撮像素子のローリング読み出しとを同期させることが好ましい。

この画像取得装置では、光路差生成部材の配置により、焦点制御用の第２の光路での光の分岐を行わずに第２の光像の光路長差を形成できる。したがって、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路への光量が抑えられ、第１の撮像手段で撮像を行う際の光量を確保できる。また、この画像取得装置では、ローリング読み出しにおける各画素列での画像データの読み出しタイミングの遅延を利用し、試料における所定部位（同一部位）の光像が第２の撮像手段の各画素列で露光されるように、対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動とローリング読み出しとを同期させている。第２の光路に光路差生成部材が配置されていることにより、各画素列からの画像データには、試料の同一部位において対物レンズの焦点位置が変更されたときと等価のコントラスト情報が含まれることとなり、当該情報に基づいて合焦点情報を迅速かつ精度良く算出できる。
また、光路差生成部材は、第２の光路の光軸に直交する面に対して傾斜する平面を有していることが好ましい。これにより、光路差生成部材による第２の光像の光路差を好適に形成できる。

また、合焦点算出手段は、二次元撮像素子の各画素列のうち、少なくとも２つの画素列で読み出された画像データのコントラスト値の差分に基づいて、試料の合焦点情報を算出することが好ましい。この場合、第２の撮像手段において、第１の撮像手段に入射する光像よりも前に焦点が合った光像（前ピン）と、後に焦点が合った光像（後ピン）とをそれぞれ取得できる。これらの画像データのコントラスト値の差分を用いることで、試料の合焦点情報を精度良く算出できる。

また、合焦点算出手段は、二次元撮像素子の各画素列で読み出された画像データのコントラスト値の分布に基づいて、試料の合焦点情報を算出することが好ましい。この場合、画像データのコントラスト値の分布に基づいて、試料の合焦点情報を精度良く算出できる。

また、本発明に係る画像取得装置のフォーカス方法は、試料が載置されるステージと、試料に向けて光を照射する光源と、ステージ上の試料と対峙するように配置された対物レンズ、及び試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、試料に対する対物レンズの視野位置を移動させる視野駆動手段と、第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて試料の合焦点情報を算出する合焦点算出手段と、視野駆動手段及び第２の撮像手段の動作を制御する動作制御手段と、を備えた画像取得装置のフォーカス方法であって、第２の撮像手段の撮像面の面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材を第２の光路に配置し、第２の撮像手段として、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用い、動作制御手段により、試料における所定部位の光像が二次元撮像素子の各画素列で露光されるように、視野駆動手段による対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動と二次元撮像素子のローリング読み出しとを同期させることを特徴としている。

この画像取得装置のフォーカス方法では、光路差生成部材の配置により、焦点制御用の第２の光路での光の分岐を行わずに第２の光像の光路長差を形成できる。したがって、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路への光量が抑えられ、第１の撮像手段で撮像を行う際の光量を確保できる。また、この画像取得装置のフォーカス方法では、ローリング読み出しにおける各画素列での画像データの読み出しタイミングの遅延を利用し、試料における所定部位（同一部位）の光像が第２の撮像手段の各画素列で露光されるように、対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動とローリング読み出しとを同期させている。第２の光路に光路差生成部材が配置されていることにより、各画素列からの画像データには、試料の同一部位において対物レンズの焦点位置が変更されたときと等価のコントラスト情報が含まれることとなり、当該情報に基づいて合焦点情報を迅速かつ精度良く算出できる。

本発明によれば、撮像の際の光量を確保でき、かつ試料の焦点位置を精度良く検出できる。

本発明に係る画像取得装置を構成するマクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。 本発明に係る画像取得装置を構成するミクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。 第２の撮像装置の一例を示す図である。 光路差生成部材及び第２の撮像装置の組み合わせの一例を示す図である。 画像取得装置の機能的な構成要素を示すブロック図である。 試料に対する対物レンズの視野のスキャンの一例を示す図である。 対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動と第２の撮像装置のローリング読み出しとの同期の様子を示す図であり、（ａ）は対物レンズの視野と分割領域との位置関係、（ｂ）各画素列に対する試料の所定部位と撮像素子の露光及び読み出しのタイミングを示す。 図７の後続の状態を示す図である。 図８の後続の状態を示す図である。 試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離に一致している場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。 試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離よりも長い場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。 試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離よりも短い場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。 合焦点算出部で処理されるコントラスト情報の一例を示す図である。 図１及び図２に示した画像取得装置のフォーカシング動作を示すフローチャートである。 光路差生成部材の変形例を示す図である。 光路差生成部材の別の変形例を示す図である。 光路差生成部材の更に別の変形例を示す図である。

以下、図面を参照しながら、本発明に係る画像取得装置及び画像取得装置のフォーカス方法の好適な実施形態について詳細に説明する。

図１は、本発明に係る画像取得装置を構成するマクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。また、図２は、本発明に係る画像取得装置を構成するミクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。図１及び図２に示すように、画像取得装置Ｍは、試料Ｓのマクロ画像を取得するマクロ画像取得装置Ｍ１と、試料Ｓのミクロ画像を取得するミクロ画像取得装置Ｍ２とによって構成されている。画像取得装置Ｍは、マクロ画像取得装置Ｍ１で取得したマクロ画像に対して例えばライン状の複数の分割領域４０（図６参照）を設定し、各分割領域４０をミクロ画像取得装置Ｍ２で高倍率に取得して合成することにより、デジタル画像であるバーチャルスライド画像を生成する装置である。

マクロ画像取得装置Ｍ１は、図１に示すように、試料Ｓが載置されるステージ１を備えている。ステージ１は、例えばステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータなどのモータやアクチュエータによって水平方向に駆動するＸＹステージである。画像取得装置Ｍで観察する試料Ｓは、例えば細胞などの生体サンプルであり、スライドガラスに密封された状態でステージ１に載置される。このステージ１をＸＹ面内で駆動させることにより、試料Ｓに対する撮像位置を移動させることができる。

ステージ１は、マクロ画像取得装置Ｍ１とミクロ画像取得装置Ｍ２との間を往復可能となっており、両装置間で試料Ｓを搬送する機能を有している。なお、マクロ画像取得においては、試料Ｓの全体画像を１度の撮像で取得してもよく、試料Ｓを複数の領域に分割して撮像してもよい。また、ステージ１は、マクロ画像取得装置Ｍ１及びミクロ画像取得装置Ｍ２の双方にそれぞれ設けておいてもよい。

ステージ１の底面側には、試料Ｓに向けて光を照射する光源２と、光源２からの光を試料Ｓに集光する集光レンズ３とが配置されている。光源２は、試料Ｓに向けて斜めに光を照射するように配置されていてもよい。また、ステージ１の上面側には、試料Ｓからの光像を導光する導光光学系４と、試料Ｓの光像を撮像する撮像装置５とが配置されている。導光光学系４は、試料Ｓからの光像を撮像装置５の撮像面に結像させる結像レンズ６を有している。また、撮像装置５は、例えば２次元画像を取得可能なエリアイメージセンサである。撮像装置５は、導光光学系４を経て撮像面に入射した試料Ｓの光像の全体画像を取得し、後述のバーチャルスライド画像格納部３９に格納する。

ミクロ画像取得装置Ｍ２は、図２に示すように、ステージ１の底面側にマクロ画像取得装置Ｍ１と同様の光源１２及び集光レンズ１３を有している。また、ステージ１の上面側には、試料Ｓからの光像を導光する導光光学系１４が配置されている。光源１２からの光を試料Ｓに照射させる光学系には、試料Ｓに励起光を照射するための励起光照射光学系や試料Ｓの暗視野画像を取得するための暗視野照明光学系を採用してもよい。

導光光学系４は、試料Ｓと対峙して配置された対物レンズ１５と、対物レンズ１５の後段に配置されたビームスプリッタ（光分岐手段）１６とを有している。対物レンズ１５には、ステージ１の載置面に直交するＺ方向に対物レンズ１５を駆動するステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータなどのモータやアクチュエータが設けられている。これらの駆動手段によって対物レンズ１５のＺ方向の位置を変えることにより、試料Ｓの画像取得における撮像の焦点位置が調整可能になっている。なお、焦点位置の調整は、ステージ１のＺ方向の位置を変えることで実施してもよく、対物レンズ１５及びステージ１の双方のＺ方向の位置を変えることによって実施してもよい。

ビームスプリッタ１６は、試料Ｓの光像を画像取得用の第１の光路Ｌ１と焦点制御用の第２の光路Ｌ２とに分岐する部分である。このビームスプリッタ１６は、光源１２からの光軸に対しておよそ４５度の角度で配置されており、図２において、ビームスプリッタ１６を通過する光路が第１の光路Ｌ１となっており、ビームスプリッタ１６で反射する光路が第２の光路となっている。

第１の光路Ｌ１には、ビームスプリッタ１６を通過した試料Ｓの光像（第１の光像）を結像させる結像レンズ１７と、結像レンズ１７の結像位置に撮像面を配置した第１の撮像装置（第１の撮像手段）１８とが配置されている。第１の撮像装置１８は、試料Ｓの第１の光像による１次元画像（第１の画像）を取得可能な装置であり、例えばＴＤＩ（Ｔｉｍｅ Ｄｅｌａｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）駆動が可能な２次元ＣＣＤイメージセンサやラインセンサが用いられる。また、ステージ１を一定の速度で制御しながら、試料Ｓの画像を順次取得する方式であれば、第１の撮像装置１８は、ＣＭＯＳイメージセンサやＣＣＤイメージセンサなどの２次元画像を取得可能な装置であってもよい。第１の撮像装置１８で撮像された第１の画像は、レーンバッファなどの一時保存メモリに順次保存された後、圧縮されて後述の画像生成部３８に出力される。

一方、第２の光路Ｌ２には、ビームスプリッタ１６で反射した試料の光像（第２の光像）を縮小する視野調整レンズ１９と、第２の撮像装置（第２の撮像手段）２０とが配置されている。また、第２の撮像装置２０の前段には、第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材２１が配置されている。視野調整レンズ１９は、第２の光像が第１の光像と同程度の大きさで第２の撮像装置２０に結像するように構成されていることが好ましい。

第２の撮像装置２０は、試料Ｓの第２の光像による２次元画像（第２の画像）を取得可能な装置である。第２の撮像装置２０は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を有している。このような二次元撮像素子としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサが挙げられる。第２の撮像装置２０の撮像面２０ａは、第２の光路Ｌ２に直交するＸＺ面と略一致するように配置されている。第２の撮像装置２０の撮像面２０ａには、図３（ａ）に示すように、読み出し方向に垂直な方向に複数の画素が配列されてなる画素列２０ｂが読み出し方向に複数配列されている。

第２の撮像装置２０では、図３（ｂ）に示すように、駆動クロックの駆動周期に基づいて、リセット信号、読み出し開始信号、及び読み出し終了信号が出力されることで、画素列２０ｂ毎に露光及び読み出しが制御される。一の画素列２０ｂの露光期間は、リセット信号に伴う電荷の排出から読み出し開始信号に伴う電荷の読み出しまでの期間である。また、一の画素列２０ｂの読み出し期間は、読み出し開始信号に伴う電荷の読み出し開始から読み出し終了信号に伴う電荷の読み出し終了までの期間である。なお、次の画素列に対する読み出し開始信号を読み出し終了信号として用いることもできる。

ローリング読み出しでは、画素列２０ｂ毎に出力する読み出し開始信号が所定の時間差で順次出力される。ローリング読み出しにおける読み出し速度は、各画素列２０ｂを読み出すための読み出し開始信号の時間間隔によって制御される。読み出し開始信号の時間間隔を短くすると読み出し速度は早くなり、読み出し開始信号の時間間隔を長くすると読み出し速度は遅くなる。隣接する画素列２０ｂ，２０ｂ間での読み出し間隔の調整は、例えば駆動クロックの周波数の調整、読み出し期間中の遅延期間の設定、読み出し開始信号を規定するクロック数の変更といった手法によって実施できる。

光路差生成部材２１は、撮像面２０ａの面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせるガラス部材である。図４（ａ）に示す例では、光路差生成部材２１は、断面直角三角形のプリズム状をなしており、撮像面２０ａの面内方向、すなわち、試料Ｓの走査に伴う撮像面２０ａ上での第２の光像の移動方向（Ｚ方向）に沿って連続的に厚さが増加するように配置されている。また、光路差生成部材２１は、第２の光路Ｌ２の光軸に直交する面に対して傾斜する平面を有するように配置されている。したがって、撮像面２０ａに入射する第２の光像は、撮像面２０ａにおいてＺ方向の一端部（図４（ｂ）における上端部）から他端部（図４（ｂ）における下端部）に向かうほど光路が長くなる。また、光路差生成部材２１は、第２の撮像装置２０と対向する面が第２の撮像装置の撮像面２０ａと平行となるように配置されることが好ましい。これにより、第２の撮像装置２０と対向する面による光の屈折を低減でき、第２の撮像装置２０で受光する光量を確保することができる。

図５は、画像取得装置の機能的な構成要素を示すブロック図である。同図に示すように、画像取得装置Ｍは、ＣＰＵ、メモリ、通信インタフェイス、ハードディスクといった格納部、キーボードなどの操作部３１、モニタ３２等を備えたコンピュータシステムを備えている。また、画像取得装置Ｍは、制御部３３の機能的な構成要素として、ステージ駆動部３４と、対物レンズ駆動部３５と、動作制御部３６と、合焦点算出部３７と、画像生成部３８と、バーチャルスライド画像格納部３９とを備えている。

ステージ駆動部３４は、試料Ｓに対する対物レンズ１５の視野位置を移動させる視野駆動手段として機能する部分である。ステージ駆動部３４は、例えばステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータといったモータやアクチュエータによって構成されている。ステージ駆動部３４は、動作制御部３６による制御に基づいて、ステージ２を対物レンズ１５の光軸の直交面に対して所定の角度（例えば９０度）を有する面についてＸＹ方向に移動させる。これにより、ステージ２に固定された試料Ｓが対物レンズ１５の光軸に対して移動し、試料Ｓに対する対物レンズ１５の視野位置が移動する。

より具体的には、ステージ駆動部３４は、動作制御部３６による制御に基づき、試料Ｓが載置されたステージ１を所定の速度で走査させる。このステージ１の走査により、第１の撮像装置１８及び第２の撮像装置２０での試料Ｓの撮像視野が相対的に順次移動する。試料Ｓの全体を撮像するために、画像取得装置Ｍでは、動作制御部３６が複数の分割領域４０から構成される撮像ラインＬｎ（ｎは自然数）に沿ったスキャン方向に試料Ｓに対する対物レンズ１５の視野位置を移動させるように制御する。

隣接する撮像ラインＬｎ間での試料Ｓに対する対物レンズ１５の視野位置の移動は、例えば図６に示すように、隣り合う撮像ラインＬｎ間でスキャン方向が反転する双方向スキャンが採用される。また、スキャン方向が各撮像ラインＬｎで同方向となる一方向スキャンであってもよい。なお、対物レンズ１５の視野位置が分割領域４０間をランダムに移動するランダムスキャンであってもよい。

また、画像取得の間のステージ１の走査速度は一定であるが、実際には走査の開始直後にステージ１の振動等の影響によって走査速度が不安定な期間が存在する。このため、分割領域４０よりも長い走査幅を設定し、ステージ１が加速する加速期間、ステージ１の走査速度が安定化するまでの安定化期間、及びステージ１が減速する減速期間のそれぞれが、分割領域４０よりも外側を走査しているときに生じるようにすることが好ましい。これにより、ステージ１の走査速度が一定となる一定速度期間に合わせて画像取得を行うことが可能となる。なお、安定化期間中に撮像を開始し、画像取得後に安定化期間中に取得したデータ部分を削除するようにしてもよい。このような手法は、データの空読みが必要な撮像装置を用いる場合に好適である。

対物レンズ駆動部３５は、ステージ駆動部３４と同様に、例えばステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータといったモータやアクチュエータによって構成されている。対物レンズ駆動部３５は、動作制御部３６による制御に基づいて、対物レンズ１５の光軸に沿ったＺ方向に対物レンズ１５を移動させる。これにより、試料Ｓに対する対物レンズ１５の焦点位置が移動する。

なお、対物レンズ駆動部３５は、合焦点算出部３７による焦点位置の解析中は対物レンズ１５の駆動は行わず、また、次の焦点位置の解析が開始されるまで、対物レンズ１５をＺ方向に沿って一方向にのみ駆動させることが好ましい。この場合、試料Ｓの走査中は、焦点位置の解析期間と、解析結果に基づく対物レンズ駆動期間とが交互に生じることとなる。焦点位置の解析中に対物レンズ１５と試料Ｓとの位置関係を変化させないことで、焦点位置の解析精度を担保できる。

動作制御部３６は、第２の撮像装置２０及びステージ駆動部３４の動作を制御する部分である。より具体的には、動作制御部３６は、試料Ｓにおける所定部位の光像が第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂで露光されるように、ステージ駆動部３４による対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位の移動と第２の撮像装置２０のローリング読み出しとを同期させる。

動作制御部３６は、図７（ａ）に示すように、対物レンズ１５の視野Ｖが一の分割領域４０を移動する際、対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの移動が一定速度となるようにステージ駆動部３４を制御する。また、動作制御部３６は、図７（ｂ）に示すように、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける試料Ｓの光像の結像Ｓｂの移動方向と、撮像面２０ａの各画素列２０ｂの読み出し方向とが一致するようにステージ駆動部３４及び第２の撮像装置２０を制御する。なお、ローリング読出しの読出し速度を可変に設定できる撮像素子を用いる場合、動作制御部３６は、対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの移動速度に基づいて、ローリング読出しの読出し速度を変更してもよい。

また、各画素列２０ｂにおける露光時間は、少なくとも試料Ｓの所定部位Ｓａのスキャン方向における幅及び対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動速度に基づいて設定される。より好ましくは、対物レンズ１５及び視野調整レンズ１９の倍率も考慮する。これにより、各画素列２０ｂにより、試料Ｓの所定部位Ｓａの光像を露光することができる。

時間Ｔ１において、図７（ｂ）に示すように、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが撮像領域の第１列目の画素列２０ｂに到達すると、この第１列目の画素列２０ｂの露光が開始される。時間Ｔ２に移ると、図８（ａ）に示すように、対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの位置が移動する。このとき、図８（ｂ）に示すように、試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが撮像領域の第２列目の画素列２０ｂに到達し、第２列目の画素列２０ｂの露光が開始される。また、試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが第１列目の画素列２０ｂを通過するタイミングで、第１列目の画素列２０ｂの読み出しが開始される。

さらに、時間Ｔ３に移ると、図９（ａ）に示すように、対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの位置がスキャン方向に更に移動する。このとき、図９（ｂ）に示すように、試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが撮像領域の第３列目の画素列２０ｂに到達し、第３列目の画素列２０ｂの露光が開始される。また、試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが第２列目の画素列２０ｂを通過するタイミングで、第２列目の画素列２０ｂの読み出しが開始される。さらに、第２列目の画素列２０ｂの読み出しと同時に第１列目の画素列２０ｂの読み出しが終了する。

以下、所定の画素列数に到達するまで、同様の手順で対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と、画素列２０ｂでのローリング読み出しとが実施される。各画素列２０ｂから読み出される画像データは、いずれも試料Ｓの同一部位についての画像データとなる。また、第２の光路Ｌ２に光路差生成部材２１が配置されていることにより、各画素列２０ｂから読み出される画像データは、それぞれ試料Ｓの同一部位について対物レンズ１５の焦点位置が変更されたときと等価のコントラスト情報が含まれる。各画素列２０ｂで読み出された画像データは、合焦点算出部３７に順次出力される。

なお、第２の撮像装置２０は、ローリング読み出しの読み出し方向を切り替え可能であることが好ましい。こうすると、双方向スキャンやランダムスキャンのように、試料Ｓに対する対物レンズ１５の視野位置のスキャン方向が変わる場合でも試料Ｓからの光の結像Ｓｂの移動方向と、第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂの読み出し方向とを容易に一致させることができる。

対物レンズ駆動部３５が対物レンズ１５を含む導光光学系１４をＸＹ方向に移動させることが可能な場合、動作制御部３６は、試料Ｓにおける所定部位の光像が第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂで露光されるように、対物レンズ駆動部３５による対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位の移動と第２の撮像装置２０のローリング読み出しとを同期させてもよい。この場合、対物レンズ駆動部３５は、試料Ｓに対する対物レンズ１５の視野位置を移動させる視野駆動手段として機能する。

合焦点算出部３７は、第２の撮像装置２０で取得された第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて試料Ｓの合焦点情報を算出する部分である。合焦点算出部３７での合焦点情報の算出方式としては、例えば前ピン・後ピン方式又はコントラスト分布方式が採用される。

前ピン・後ピン方式を用いる場合、合焦点算出部３７は、第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂのうち、少なくとも２つの画素列２０ｂの画素列２０ｂを選択する。上述したように、第２の光路Ｌ２には、試料Ｓの走査に伴う撮像面２０ａ上での第２の光像の移動方向（Ｚ方向）に沿って連続的に厚さが増加するように光路差生成部材２１が配置されている。したがって、第２の撮像装置２０では、選択する２つの画素列２０ｂの位置に基づいて、第１の撮像装置１８に入射する第１の光像よりも前に焦点が合った光像（前ピン）と、後に焦点が合った光像（後ピン）とを取得できる。合焦点算出部３７は。選択された画素列２０ｂで読み出された画像データのコントラスト値同士の差分を求める。

図１０に示すように、試料Ｓの表面に対して対物レンズ１５の焦点位置が合っている場合、前ピンの画像コントラスト値と後ピンの画像コントラスト値とが略一致し、これらの差分値はほぼゼロとなる。一方、図１１に示すように、試料Ｓの表面までの距離が対物レンズ１５の焦点距離よりも長い場合、前ピンの画像コントラスト値よりも後ピンの画像コントラスト値の方が大きくなり、これらの差分値はプラスとなる。この場合、合焦点算出部３７は、対物レンズ駆動部３５に対し、対物レンズ１５を試料Ｓに近づける向きに駆動する旨の指示情報を出力する。また、図１２に示すように、試料Ｓの表面までの距離が対物レンズ１５の焦点距離よりも短い場合、前ピンの画像コントラスト値よりも後ピンの画像コントラスト値の方が小さくなり、これらの差分値はマイナスとなる。この場合、合焦点算出部３７は、対物レンズ駆動部３５に対し、対物レンズ１５を試料Ｓに遠ざける向きに駆動する旨の指示情報を出力する。

前ピン・後ピン方式を用いる場合、合焦点算出部３７では、フォーカス中心に対応する画素列２０ｂを挟んで対称となるように、前ピンに相当する画素列２０ｂと後ピンに相当する画素列２０ｂとを選択する。フォーカス中心に対応する画素列２０ｂとは、第１の撮像装置１８で撮像される試料Ｓの光像の光路長と一致する光路長で第２の光路Ｌ２及び光路差生成部材２１を通った試料Ｓの光像が入射する画素列２０ｂを指す。合焦点算出部３７は、例えばフォーカス中心に対応する画素列２０ｂが第ｋ列目の画素列２０ｂである場合、第（ｋ−ｍ）列目の画素列２０ｂと第（ｋ＋ｍ）列目の画素列２０ｂとをそれぞれ選択する。試料Ｓの凹凸の度合いに応じてｍを設定することで、合焦点情報の精度を向上できる。

コントラスト分布方式を用いる場合、合焦点算出部３７は、第２の撮像装置２０の複数の画素列２０ｂからの画像データのコントラスト情報を取得する。図１３に示す例では、第２の撮像装置２０における第１列目の画素列２０ｂから第ｎ列目の画素列２０ｂまでの画像データのコントラスト値が示されており、第ｉ列目の画素列２０ｂにおける画像データのコントラスト値がピーク値となっている。この場合、合焦点算出部３７は、第ｉ列目の画素列２０ｂで試料Ｓの所定部位Ｓａの露光を行ったときの対物レンズ１５の焦点位置が合焦点位置であるとして合焦点情報を生成する。なお、コントラスト値は、各画素列２０ｂに含まれる画素のうちの特定の画素におけるコントラスト値を用いてもよく、各画素列２０ｂに含まれる画素の全体又は一部のコントラスト値の平均値を用いてもよい。

画像生成部３８は、取得した画像を合成してバーチャルスライド画像を生成する部分である。画像生成部３８は、第１の撮像装置１８から出力される第１の画像、すなわち、各分割領域４０の画像を順次受け取り、これらを合成して試料Ｓの全体の画像を合成する。そして、この合成画像に基づいてこれよりも低い解像度の画像を作成し、高解像度の画像と低解像度の画像とを関連付けてバーチャルスライド画像格納部３９に格納する。バーチャルスライド画像格納部３９では、マクロ画像取得装置Ｍ１で取得した画像も更に関連付けてもよい。バーチャルスライド画像は、１枚の画像として格納してもよく、複数に分割された画像として格納してもよい。

続いて、上述した画像取得装置Ｍにおけるフォーカシング動作について説明する。

図１４に示すように、画像取得装置Ｍでは、ステージ駆動部３４によるステージ１の移動が開始すると、一の撮像ラインＬｎに沿って対物レンズ１５の視野Ｖが移動する（ステップＳ１１）。また、試料Ｓにおける所定部位Ｓａからの光像の結像Ｓｂが第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂで露光されるように、対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と第２の撮像装置２０のローリング読み出しとが同期する（ステップＳ１２）。そして、各画素列２０ｂで取得した画像データのコントラスト値に基づいて分割領域４０における合焦点情報が算出されると共に（ステップＳ１３）、算出した合焦点情報に基づいて対物レンズ１５の焦点位置が調整され、分割領域４０の撮像が行われる（ステップＳ１４）。その後、所望の撮像ラインＬｎについて合焦点情報の算出の取得が完了したか否かが判断され（ステップＳ１５）、合焦点情報の算出の取得が完了していない場合には、次の撮像ラインＬｎに対物レンズ１５の視野Ｖが移動し（ステップＳ１６）、ステップＳ１１〜Ｓ１５の処理が繰り返し実行される。

以上説明したように、画像取得装置Ｍでは、光路差生成部材２１の配置により、焦点制御用の第２の光路Ｌ２での光の分岐を行わずに第２の光像の光路長差を形成できる。したがって、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路Ｌ２への光量が抑えられ、第１の撮像装置１８で撮像を行う際の光量を確保できる。また、この画像取得装置Ｍでは、ローリング読み出しにおける各画素列２０ｂでの画像データの読み出しタイミングの遅延を利用し、試料Ｓにおける所定部位（同一部位）の光像が第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂで露光されるように、対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位の移動とローリング読み出しとを同期させている。第２の光路Ｌ２に光路差生成部材２１が配置されていることにより、各画素列２０ｂからの画像データには、試料Ｓの同一部位において対物レンズ１５の焦点位置が変更されたときと等価のコントラスト情報が含まれることとなり、当該情報に基づいて合焦点情報を迅速かつ精度良く算出できる。

また、画像取得装置Ｍでは、ローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用いて第２の撮像装置２０を構成しているので、光路差生成部材２１を第２の光路Ｌ２に配置することで、対物レンズ１５の合焦点情報の算出の際の対物レンズ１５の駆動が不要となる。したがって、焦点制御中の振動等の発生を抑えることができる。

画像取得装置Ｍでは、合焦点算出部３７により、第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂのうち、少なくとも２つの画素列２０ｂで読み出された画像データのコントラスト値の差分に基づいて、試料Ｓの合焦点情報が算出される。この手法では、第２の撮像装置２０において、第１の撮像装置１８に入射する光像よりも前に焦点が合った光像（前ピン）と、後に焦点が合った光像（後ピン）とをそれぞれ取得できる。これらの画像データのコントラスト値の差分を用いることで、試料Ｓの合焦点情報を精度良く算出できる。また、画像取得装置Ｍでは、合焦点算出部３７により、第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂで読み出された画像データのコントラスト値の分布に基づいて、試料Ｓの合焦点情報が算出される。この手法では、画像データのコントラスト値の分布に基づいて、試料の合焦点情報を精度良く算出できる。

なお、合焦点算出部３７で試料Ｓの合焦点情報の算出に前ピン・後ピン方式を用いる場合において対物レンズ１５の視野位置のスキャンを双方向スキャンとする場合（図６参照）には、図４に示した光路差生成部材２１に代えて、図１５に示すように、試料Ｓの走査に伴う撮像面２０ａ上での第２の光像の移動方向（Ｚ方向）について、厚さが連続的に厚くなる部分及び厚さが連続的に薄くなる部分が対称的に設けられた光路差生成部材を用いることが必要となる。

図１５（ａ）に示す例では、光路差生成部材４１Ａは、断面三角形のプリズム状をなし、撮像面２０ａのＺ方向の中央部分に頂部が略一致するように配置されている。この例では、撮像面２０ａに入射する第２の光像は、撮像面２０ａにおけるＺ方向の中央部分で最も光路が長くなり、撮像面２０ａにおけるＺ方向の両端部分に向かうほど光路が短くなる。図１５（ｂ）に示す例では、光路差生成部材４１Ｂは、断面直角三角形のプリズム状をなす２つのガラス部材を組み合わせて構成され、各ガラス部材が撮像面２０ａにおけるＺ方向の一方の半分領域と他方の半分領域とに重なるようにそれぞれ配置されている。この例では、撮像面２０ａにおけるＺ方向の端部で最も光路が長くなり、撮像面２０ａのＺ方向の端部側から中央側に向かうほど光路が短くなる。図１５（ｃ）に示す例では、光路差生成部材４１Ｃは、断面等脚台形状をなし、その斜面が撮像面２０ａにおけるＺ方向の一方の端部領域と他方の端部領域とに重なるように配置されている。この例では、撮像面２０ａにおけるＺ方向の中央部分では光路長に変化が生じず、Ｚ方向の端部においてのみＺ方向の両端部分に向かうほど光路が短くなる。

合焦点算出部３７で試料Ｓの合焦点情報の算出に前ピン・後ピン方式を用いる場合において対物レンズ１５の視野位置のスキャンを一方向スキャンとする場合、及び合焦点算出部３７で試料Ｓの合焦点情報の算出にコントラスト分布方式を用いる場合には、光路差生成部材２１，３１Ａ〜３１Ｃを用いることができるほか、例えば図１６に示す光路差生成部材を用いることができる。

図１６（ａ）に示す例では、光路差生成部材４１Ｄは、断面直角三角形のプリズム状をなし、その斜面が撮像面２０ａにおけるＺ方向の一方の半分領域のみに重なるように配置されている。この例では、光路差生成部材４１Ｄが配置されている領域において、Ｚ方向の中央部分に向かうほど光路が短くなる。図１６（ｂ）に示す例では、光路差生成部材４１Ｅは、断面台形状をなし、その斜面が撮像面２０ａの全体に重なるように配置されている。この例では、撮像面２０ａのＺ方向の一方の端部側から他方の端部側に向かって一様に光路が短くなる。

また、光路差生成部材２１，４１Ａ〜４１Ｅでは、いずれも連続的に厚みが増減しているが、図１７に示すように、Ｚ方向に寸法の異なるガラス部材を寸法順に複数枚組み合わせ、厚みが段階的に変化する光路差生成部材５１を用いてもよい。このような光路差生成部材５１を用いても、上述した実施形態と同様の作用効果を得ることができる。なお、この場合、各ガラス部材におけるＺ方向の寸法差は、第２の撮像装置２０における各画素列２０ｂのＺ方向の寸法の整数倍とすることが好ましい。また、各ガラス部材のＺ方向の縁部の位置と、各画素列２０ｂのＺ方向の縁部の位置とを一致させることが好ましい。

上述した実施形態では、バーチャルスライド画像を生成する装置を例示したが、本発明に係る画像取得装置は、ステージ等によって試料を所定の速度で走査しながら画像を取得する装置であれば、種々の装置に適用することができる。

１…ステージ、１２…光源、１４…導光光学系、１５…対物レンズ、１６…ビームスプリッタ（光分岐手段）、１８…第１の撮像装置（第１の撮像手段）、２０…第２の撮像装置（第２の撮像手段）、２０ａ…撮像面、２０ｂ…画素列、２１，４１Ａ〜４１Ｅ，５１…光路差生成部材、３４…ステージ駆動部（視野駆動手段）、３６…動作制御部（動作制御手段）、３７…合焦点算出部（合焦点算出手段）、Ｌ１…第１の光路、Ｌ２…第２の光路、Ｍ…画像取得装置、Ｍ１…マクロ画像取得装置、Ｍ２…ミクロ画像取得装置、Ｓ…試料、Ｓａ…所定部位、Ｖ…対物レンズの視野。

Claims (5)

1. 試料が載置されるステージと、
   前記試料に向けて光を照射する光源と、
   前記ステージ上の前記試料と対峙するように配置された対物レンズ、及び前記試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、
   前記試料に対する前記対物レンズの視野位置を移動させる視野駆動手段と、
   前記第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、
   前記第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、
   前記第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて前記試料の合焦点情報を算出する合焦点算出手段と、
   前記視野駆動手段及び前記第２の撮像手段の動作を制御する動作制御手段と、
   前記第２の光路に配置され、前記第２の撮像手段の撮像面の面内方向に沿って前記第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を備え、
   前記第２の撮像手段は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を有し、
   前記動作制御手段は、前記試料における所定部位の光像が前記二次元撮像素子の各画素列で露光されるように、前記視野駆動手段による前記対物レンズの視野内での前記試料の所定部位の移動と前記二次元撮像素子のローリング読み出しとを同期させることを特徴とする画像取得装置。
2. 前記光路差生成部材は、前記第２の光路の光軸に直交する面に対して傾斜する平面を有していることを特徴とする請求項１記載の画像取得装置。
3. 前記合焦点算出手段は、前記二次元撮像素子の各画素列のうち、少なくとも２つの画素列で読み出された画像データのコントラスト値の差分に基づいて、前記試料の合焦点情報を算出することを特徴とする請求項１又は２記載の画像取得装置。
4. 前記合焦点算出手段は、前記二次元撮像素子の各画素列で読み出された画像データのコントラスト値の分布に基づいて、前記試料の合焦点情報を算出することを特徴とする請求項１又は２記載の画像取得装置。
5. 試料が載置されるステージと、
   前記試料に向けて光を照射する光源と、
   前記ステージ上の前記試料と対峙するように配置された対物レンズ、及び前記試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、
   前記試料に対する前記対物レンズの視野位置を移動させる視野駆動手段と、
   前記第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、
   前記第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、
   前記第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて前記試料の合焦点情報を算出する合焦点算出手段と、
   前記視野駆動手段及び前記第２の撮像手段の動作を制御する動作制御手段と、を備えた画像取得装置のフォーカス方法であって、
   前記第２の撮像手段の撮像面の面内方向に沿って前記第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材を前記第２の光路に配置し、
   前記第２の撮像手段として、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用い、
   前記動作制御手段により、前記試料における所定部位の光像が前記二次元撮像素子の各画素列で露光されるように、前記視野駆動手段による前記対物レンズの視野内での前記試料の所定部位の移動と前記二次元撮像素子のローリング読み出しとを同期させることを特徴とする画像取得装置のフォーカス方法。

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