JP6010505B2 - 画像取得装置及び画像取得装置のフォーカス方法 - Google Patents

Description

本発明は、画像取得装置及び画像取得装置のフォーカス方法に関する。

従来の画像取得装置として、例えば特許文献１に記載の装置がある。この装置では、被検物からの光をハーフプリズムで分割し、ＣＣＤエリアイメージセンサ等の２次元撮像素子からなる光電変換素子で受光する。光電変換素子の制御回路は、受光面を２次元的に走査する２つの走査領域を任意に設定可能な走査領域設定部を有している。そして、走査領域設定部によって設定された２つの走査領域で受光した光の合焦ずれ信号に基づいて合焦制御を実行する。

特開平８−３２０４３０号公報

上述した従来の装置では、ハーフプリズムを用いて被検物からの光を分割している。このため、光電変換素子での光量の確保が難しく、試料の焦点位置の検出精度が低下してしまうおそれがある。また、焦点位置の検出用の光の光量を増大させると、被検物の撮像用の光の光量が減少することとなり、撮像の際の光量の確保が困難となるおそれがある。

本発明は、上記課題の解決のためになされたものであり、撮像の際の光量を確保でき、かつ試料の焦点位置を精度良く検出できる画像取得装置及びそのフォーカス方法を提供することを目的とする。

上記課題の解決のため、本発明に係る画像取得装置は、試料が載置されるステージと、ステージを所定の速度で走査するステージ制御手段と、試料に向けて光を照射する光源と、試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御する焦点制御手段と、第２の光路に配置され、第２の撮像手段の撮像面の面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を備え、光路差生成部材は、第２の光路の光軸に直交する面に対して傾斜する第１の面及び第２の面を有し、第１の面と第２の面との間には、撮像面に到達する光を低減させる光低減部が設けられていることを特徴としている。

この画像取得装置では、光路差生成部材の配置により、焦点制御用の第２の光路での光の分岐を行わずに第２の光像の光路長差を形成できる。したがって、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路への光量が抑えられ、第１の撮像手段で撮像を行う際の光量を確保できる。また、この画像取得装置では、光路差生成部材が第１の面及び第２の面を有することで、試料の撮像視野を双方向に走査する双方向スキャンの実施が可能となる。第１の面と第２の面との境界付近では、第１の面及び第２の面で屈折した光の一部が第２の撮像手段の撮像面で重畳する場合がある。撮像面に光重畳領域が存在すると、焦点制御手段における第２の画像の解析精度が低下することが考えられる。これに対し、この画像取得装置では、第１の面と第２の面との間に、第２の撮像手段の撮像面に到達する光を低減させる光低減部が設けられている。この光低減部により、第２の撮像手段の撮像面における光重畳領域を狭めることが可能となり、試料の焦点位置の制御を精度良く実施できる。

また、光路差生成部材は、第１の面と第２の面との間に第２の光路の光軸に直交する第３の面を有し、光低減部は、第３の面に設けられていることが好ましい。この場合、第３の面によって光の屈折の発生を抑えることができる。また、第３の面に光低減部を設けることで、第２の撮像手段の撮像面における光重畳領域をより確実に狭めることが可能となる。

また、第１の面と第２の面とが隣接しており、光低減部は、第１の面と第２の面との境界部分を含むように設けられていることが好ましい。この場合、第１の面と第２の面との境界部分を含むように光低減部を設けることで、第２の撮像手段の撮像面における光の重畳領域をより確実に狭めることが可能となる。

また、光低減部は、第２の光路からの光を反射する光反射部であることが好ましい。この場合、光反射部によって第２の撮像手段の撮像面における光重畳領域をより確実に狭めることが可能となる。

また、光低減部は、第２の光路からの光を減光する光減光部であることが好ましい。この場合、光減光部によって第２の撮像手段の撮像面における光重畳領域をより確実に狭めることが可能となる。

また、光低減部は、第２の光路からの光を遮光する光遮光部であることが好ましい。この場合、光遮光部によって第２の撮像手段の撮像面における光重畳領域をより確実に狭めることが可能となる。

また、光低減部は、第２の光路からの光を吸光する光吸光部であることが好ましい。この場合、光吸光部によって第２の撮像手段の撮像面における光重畳領域をより確実に狭めることが可能となる。

また、光路差生成部材の第１の面及び第２の面で屈折した光が重畳する光重畳領域を避けるように、第２の撮像手段の撮像面に第１の撮像領域と第２の撮像領域とを設定する領域制御手段を更に備えたことが好ましい。これにより、第２の撮像手段の第１の撮像領域及び第２の撮像領域において、第１の撮像手段に入射する光像よりも前に焦点が合った光像（前ピン）と、後に焦点が合った光像（後ピン）とをそれぞれ撮像することができる。また、光低減部により、第２の撮像手段の撮像面における光の重畳領域を狭めることが可能となるので、第１の撮像領域及び第２の撮像領域を設定可能な設定領域を拡大できる。これにより、前ピンと後ピンとの間のフォーカス差を十分に広げることが可能となり、焦点位置の制御を精度良く実施できる。

また、第２の撮像手段は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を有し、ステージ制御手段によるステージの走査と同期して各画素列のローリング読み出しを行うことによって第２の画像を取得することが好ましい。この場合、各画素列からの画像データには、試料の同一部位のコントラスト情報を一度のローリング読み出しで取得できる。したがって、当該コントラスト情報に基づいて合焦点情報を迅速かつ精度良く算出できる。

また、本発明に係る画像取得装置のフォーカス方法は、試料が載置されるステージと、ステージを所定の速度で走査するステージ制御手段と、試料に向けて光を照射する光源と、試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御する焦点制御手段と、を備えた画像取得装置のフォーカス方法であって、第２の光路の光軸に直交する面に対して傾斜する第１の面及び第２の面を有し、第２の撮像手段の撮像面の面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材を第２の光路に配置し、第１の面と第２の面との間に光低減部を設け、第２の撮像手段の撮像面に到達する光を低減させることを特徴としている。

この画像取得装置のフォーカス方法では、光路差生成部材の配置により、焦点制御用の第２の光路での光の分岐を行わずに第２の光像の光路長差を形成できる。したがって、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路への光量が抑えられ、第１の撮像手段で撮像を行う際の光量を確保できる。また、この画像取得装置のフォーカス方法では、光路差生成部材が第１の面及び第２の面を有することで、試料の撮像視野を双方向に走査する双方向スキャンの実施が可能となる。第１の面と第２の面との境界付近では、第１の面及び第２の面で屈折した光の一部が第２の撮像手段の撮像面で重畳する場合がある。撮像面に光重畳領域が存在すると、焦点制御手段における第２の画像の解析精度が低下することが考えられる。これに対し、この画像取得装置のフォーカス方法では、第１の面と第２の面との間に、第２の撮像手段の撮像面に到達する光を低減させる光低減部を設けている。この光低減部により、第２の撮像手段の撮像面における光重畳領域を狭めることが可能となり、試料の焦点位置の制御を精度良く実施できる。

本発明によれば、撮像の際の光量を確保でき、かつ試料の焦点位置を精度良く検出できる。

本発明に係る画像取得装置を構成するマクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。 本発明に係る画像取得装置を構成するミクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。 第２の撮像装置の一例を示す図である。 光路差生成部材及び第２の撮像装置の組み合わせの一例を示す図である。 光路差生成部材に光低減部が設けられていない場合に、第２の光路から光が第２の撮像装置の撮像面に入射する様子を示す図である。 光路差生成部材に光低減部（光反射部）が設けられている場合に、第２の光路のからの光が第２の撮像装置の撮像面に入射する様子を示す図である。 光路差生成部材に光低減部（光減光部、光遮光部、光吸光部）が設けられている場合に、第２の光路のからの光が第２の撮像装置の撮像面に入射する様子を示す図である。 画像取得装置の機能的な構成要素を示すブロック図である。 試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離に一致している場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。 試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離よりも長い場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。 試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離よりも短い場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。 ステージの走査時間に対する対物レンズと試料の表面との距離の関係を示す図である。 ステージ制御部によるステージの走査方向の制御を示す図である。 ステージ制御部によるステージの走査速度の制御を示す図である。 画像取得装置の動作を示すフローチャートである。 光低減部（光反射部）の変形例を示す図である。 光路差生成部材及び光低減部の変形例を示す図である。 光路差生成部材及び光低減部の別の変形例を示す図である。 光路差生成部材及び光低減部の更に別の変形例を示す図である。 ローリング読み出しが可能な撮像素子を用いた第２の撮像装置を示す図である。 図２０の場合に焦点制御部で処理されるコントラスト情報の一例を示す図である。

以下、図面を参照しながら、本発明に係る画像取得装置及び画像取得装置のフォーカス方法の好適な実施形態について詳細に説明する。

図１は、本発明に係る画像取得装置を構成するマクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。また、図２は、本発明に係る画像取得装置を構成するミクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。図１及び図２に示すように、画像取得装置Ｍは、試料Ｓのマクロ画像を取得するマクロ画像取得装置Ｍ１と、試料Ｓのミクロ画像を取得するミクロ画像取得装置Ｍ２とによって構成されている。画像取得装置Ｍは、マクロ画像取得装置Ｍ１で取得したマクロ画像に対して例えばライン状の複数の分割領域４０（図１３参照）を設定し、各分割領域４０をミクロ画像取得装置Ｍ２で高倍率に取得して合成することにより、デジタル画像であるバーチャルスライド画像を生成する装置である。

マクロ画像取得装置Ｍ１は、図１に示すように、試料Ｓが載置されるステージ１を備えている。ステージ１は、例えばステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータなどのモータやアクチュエータによって水平方向に駆動するＸＹステージである。画像取得装置Ｍで観察する試料Ｓは、例えば細胞などの生体サンプルであり、スライドガラスに密封された状態でステージ１に載置される。このステージ１をＸＹ面内で駆動させることにより、試料Ｓに対する撮像位置を移動させることができる。

ステージ１は、マクロ画像取得装置Ｍ１とミクロ画像取得装置Ｍ２との間を往復可能となっており、両装置間で試料Ｓを搬送する機能を有している。なお、マクロ画像取得においては、試料Ｓの全体画像を１度の撮像で取得してもよく、試料Ｓを複数の領域に分割して撮像してもよい。また、ステージ１は、マクロ画像取得装置Ｍ１及びミクロ画像取得装置Ｍ２の双方にそれぞれ設けておいてもよい。

ステージ１の底面側には、試料Ｓに向けて光を照射する光源２と、光源２からの光を試料Ｓに集光する集光レンズ３とが配置されている。光源２は、試料Ｓに向けて斜めに光を照射するように配置されていてもよい。また、ステージ１の上面側には、試料Ｓからの光像を導光する導光光学系４と、試料Ｓの光像を撮像する撮像装置５とが配置されている。導光光学系４は、試料Ｓからの光像を撮像装置５の撮像面に結像させる結像レンズ６を有している。また、撮像装置５は、例えば２次元画像を取得可能なエリアセンサである。撮像装置５は、導光光学系４を経て撮像面に入射した試料Ｓの光像の全体画像を取得し、後述のバーチャルスライド画像格納部３９に格納する。

ミクロ画像取得装置Ｍ２は、図２に示すように、ステージ１の底面側にマクロ画像取得装置Ｍ１と同様の光源１２及び集光レンズ１３を有している。また、ステージ１の上面側には、試料Ｓからの光像を導光する導光光学系１４が配置されている。光源１２からの光を試料Ｓに照射させる光学系には、試料Ｓに励起光を照射するための励起光照射光学系や試料Ｓの暗視野画像を取得するための暗視野照明光学系を採用してもよい。

導光光学系４は、試料Ｓと対峙して配置された対物レンズ１５と、対物レンズ１５の後段に配置されたビームスプリッタ（光分岐手段）１６とを有している。対物レンズ１５には、ステージ１の載置面に直交するＺ方向に対物レンズ１５を駆動するステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータなどのモータやアクチュエータが設けられている。これらの駆動手段によって対物レンズ１５のＺ方向の位置を変えることにより、試料Ｓの画像取得における撮像の焦点位置が調整可能になっている。なお、焦点位置の調整は、ステージ１のＺ方向の位置を変えることで実施してもよく、対物レンズ１５及びステージ１の双方のＺ方向の位置を変えることによって実施してもよい。

ビームスプリッタ１６は、試料Ｓの光像を画像取得用の第１の光路Ｌ１と焦点制御用の第２の光路Ｌ２とに分岐する部分である。このビームスプリッタ１６は、光源１２からの光軸に対しておよそ４５度の角度で配置されており、図２において、ビームスプリッタ１６を通過する光路が第１の光路Ｌ１となっており、ビームスプリッタ１６で反射する光路が第２の光路となっている。

第１の光路Ｌ１には、ビームスプリッタ１６を通過した試料Ｓの光像（第１の光像）を結像させる結像レンズ１７と、結像レンズ１７の結像位置に撮像面を配置した第１の撮像装置（第１の撮像手段）１８とが配置されている。第１の撮像装置１８は、試料Ｓの第１の光像による１次元画像（第１の画像）を取得可能な装置であり、例えばＴＤＩ（Ｔｉｍｅ Ｄｅｌａｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）駆動が可能な２次元イメージＣＣＤセンサやラインセンサが用いられる。また、ステージ１を一定の速度で制御しながら、試料Ｓの画像を順次取得する方式であれば、第１の撮像装置１８は、ＣＭＯＳイメージセンサやＣＣＤイメージセンサなどの２次元画像を取得可能な装置であってもよい。第１の撮像装置１８で撮像された第１の画像は、レーンバッファなどの一時保存メモリに順次保存された後、圧縮されて後述の画像生成部３８に出力される。

一方、第２の光路Ｌ２には、ビームスプリッタ１６で反射した試料の光像（第２の光像）を縮小する視野調整レンズ１９と、第２の撮像装置（第２の撮像手段）２０とが配置されている。また、第２の撮像装置２０の前段には、第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材２１が配置されている。視野調整レンズ１９は、第２の光像が第１の光像と同程度の大きさで第２の撮像装置２０に結像するように構成されていることが好ましい。

第２の撮像装置２０は、試料Ｓの第２の光像による２次元画像（第２の画像）を取得可能な装置であり、例えばＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）イメージセンサやＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）イメージセンサなどのエリアイメージセンサが用いられる。また、ラインセンサを用いてもよい。

第２の撮像装置２０の撮像面２０ａは、第２の光路Ｌ２に直交するＸＺ面と略一致するように配置されている。この撮像面２０ａには、図３に示すように、第２の光像の一部画像を取得する第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂが設定されている。第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂは、試料Ｓの走査に伴う撮像面２０ａ上での第２の光像の移動方向（走査方向：Ｚ方向）に対して垂直となる向きに設定される。第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとは、所定の間隔をもって設定されており、いずれも第２の光像の一部をライン状に取得する。これにより、第１の撮像装置１８で取得される試料Ｓの第１の光像と同じ領域の光像を第２の光像として第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂで取得できる。なお、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとを別々のラインセンサを用いて設定してもよい。この場合、各ラインセンサを別々に制御することで、第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂの設定に要する時間を短縮させることができる。

光路差生成部材２１は、撮像面２０ａの面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせるガラス部材である。図４（ａ）に示す例では、光路差生成部材２１は、断面三角形のプリズム状をなしており、撮像面２０ａのＺ方向の中央部分に頂部２４が略一致するように配置されている。したがって、撮像面２０ａに入射する第２の光像は、撮像面２０ａにおけるＺ方向の中央部分で最も光路が長くなり、撮像面２０ａにおけるＺ方向の両端部分に向かうほど光路が短くなる。また、光路差生成部材２１は、第２の撮像装置２０との対向面２５が第２の撮像装置の撮像面２０ａと平行となるように配置されることが好ましい。これにより、第２の撮像装置２０との対向面２５での光の屈折を低減でき、第２の撮像装置２０で受光する光量を確保することができる。

この光路差生成部材２１の配置により、第２の撮像装置２０では、第１の撮像領域２２Ａの位置と第２の撮像領域２２Ｂの位置に基づいて、第１の撮像装置１８に入射する第１の光像よりも前に焦点が合った光像（前ピン）と、後に焦点が合った光像（後ピン）とを取得できる。本実施形態では、例えば第１の撮像領域２２Ａが前ピンとなり、第２の撮像領域２２Ｂが後ピンとなるように第１の撮像領域２２Ａの位置と第２の撮像領域２２Ｂの位置とが設定される。前ピンと後ピンとの間のフォーカス差は、第１の撮像領域２２Ａに入射する第２の光像が通過する光路差生成部材２１の厚さｔ１及び屈折率と、第２の撮像領域２２Ｂに入射する第２の光像が通過する光路差生成部材２１の厚さｔ２及び屈折率との差に依存する。

また、光路差生成部材２１は、図４（ａ）に示すように、第２の光路Ｌ２の光軸に直交する面（ここでは対向面２５）に対して傾斜する第１の面２６及び第２の面２７を有している。第１の面２６及び第２の面２７は、頂部２４について対称となるように対向面２５に対していずれも３０°程度傾斜している。第１の面２６及び第２の面２７により、第２の光路Ｌ２からの光は、第１の面２６及び第２の面２７で内向きに屈折して撮像面２０ａに入射する。なお、光路差生成部材２１の対向面２５における第２の光像の移動方向の長さは、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける第２の光像の移動方向の長さよりも長くなっていることが好ましい。この場合、第１の面２６の上端側、もしくは第２の面２７の下端側で屈折した光を撮像面２０ａの端部に入射させることが可能となり、撮像面２０ａの端部に位置する画素列を有効に利用できる。

光路差生成部材２１に第１の面２６及び第２の面２７を設けることにより、試料Ｓの撮像視野の双方向走査（図１３（ａ）参照）に対応することが可能となる。双方向走査を行う場合、試料Ｓの走査に伴う撮像面２０ａ上での第２の光像の移動方向に応じて、一方の走査の際には第１の面２６に対応する撮像面２０ａの上半分領域に上側から順に第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂを設定し、他方の走査の際には、第２の面２７に対応する撮像面２０ａの下半分領域に下側から順に第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂを設定すればよい（図４（ｂ）参照）。

光路差生成部材２１において、第１の面２６と第２の面２７との間には、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａに到達する光を低減させる光低減部２８が設けられている。光低減部２８は、頂部２４を中心として第１の面２６側と第２の面２７側に等幅で張り出すように、頂部２４に沿って第２の光像の移動方向（走査方向：Ｚ方向）に対して垂直となる向きに延在している。

光低減部２８は、第２の光路Ｌ２からの光を反射する光反射部とすることができる。光反射部とする場合には、例えばアルミ、金、銀、銅といった金属の箔を光路差生成部材２１に貼り付けてもよく、これらの金属の膜を光路差生成部材２１に蒸着してもよい。また、光低減部２８は、第２の光路Ｌ２からの光を減光する光減光部或いは第２の光路Ｌ２からの光を遮光する光遮光部とすることもできる。光減光部及び光遮光部とする場合には、例えば黒色の塗料を光路差生成部材２１に塗布してもよく、黒色のシール材を光路差生成部材２１に貼り付けてもよい。また、上記の金属の膜の表面に黒色の塗料を塗布してもよい。光低減部２８は、第２の光路Ｌ２からの光を吸光する光吸光部とすることもできる。光吸光部とする場合には、例えばルビーやサファイアといったコランダム等の光を吸光する吸光物質を光路差生成部材２１の内部に形成すればよい。

光路差生成部材２１に光低減部２８を設けない場合、図５（ａ）に示すように、光路差生成部材２１の頂部２４付近に入射した第２の光路Ｌ２からの光は、第１の面２６及び第２の面２７での屈折によって撮像面２０ａ上で重畳し、図５（ｂ）に示すように、撮像面２０ａに光重畳領域２９を形成する。光重畳領域２９では、光路差の異なる光が撮像面２０ａに入射するため、第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂの設定に不向きな非設定領域Ｒ１となる。撮像面２０ａに対する非設定領域Ｒ１の幅が大きい場合、第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂを設定可能な設定領域Ｒ２の幅が相対的に狭くなる。設定領域Ｒ２の幅が狭くなると、例えば第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔の設定幅が制限され、前ピンと後ピンとの間のフォーカス差の調整幅が制限されることが考えられる。

これに対し、本実施形態のように光路差生成部材２１に光反射部としての光低減部２８が設けられている場合、図６（ａ）に示すように、光路差生成部材２１の頂部２４付近に入射した第２の光路Ｌ２からの光は、光低減部２８で反射される。このため、図６（ｂ）に示すように、光路差生成部材２１に光低減部２８を設けない場合と比べて、撮像面２０ａに形成される光重畳領域２９の幅を大幅に狭くすることが可能となる。したがって、第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂを設定可能な設定領域Ｒ２の幅が相対的に広がり、前ピンと後ピンとの間のフォーカス差の調整幅を十分に確保できる。

また、本実施形態のように光路差生成部材２１に光減光部・光遮光部・光吸光部としての光低減部２８が設けられている場合、図７（ａ）に示すように、光路差生成部材２１の頂部２４付近に入射した第２の光路Ｌ２からの光は、光低減部２８で減光、遮光、或いは吸光される。この場合も、図７（ｂ）に示すように、光路差生成部材２１に光低減部２８を設けない場合と比べて、撮像面２０ａに形成される光重畳領域２９の幅、すなわち、非設定領域Ｒ１の幅を大幅に狭くすることが可能となる。したがって、第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂを設定可能な設定領域Ｒ２の幅が相対的に広がり、前ピンと後ピンとの間のフォーカス差の調整幅を十分に確保できる。

なお、光低減部２８の幅は、光路差生成部材２１の屈折率、対向面２５に対する第１の面２６及び第２の面２７の傾斜角などによって適宜設定される。例えば第１の面２６において光低減部２８との境界部分で屈折した光と、第２の面２７において光低減部２８との境界部分で屈折した光とが、いずれも撮像面２０ａの中央部分（頂部２４に対応する部分）に向かうように光低減部２８の幅を設定することが好ましい。この場合、非設定領域Ｒ１の幅を最小化できる。

図８は、画像取得装置の機能的な構成要素を示すブロック図である。同図に示すように、画像取得装置Ｍは、ＣＰＵ、メモリ、通信インタフェイス、ハードディスクといった格納部、キーボードなどの操作部３１、モニタ３２等を備えたコンピュータシステムを備えている。また、画像取得装置Ｍは、制御部３３の機能的な構成要素として、焦点制御部３４と、領域制御部３５と、対物レンズ制御部３６と、ステージ制御部３７と、画像生成部３８と、バーチャルスライド画像格納部３９とを備えている。

焦点制御部３４は、第２の撮像装置２０で取得した第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて第１の撮像装置１８による撮像の焦点位置を制御する部分である。より具体的には、焦点制御部３４は、まず、第２の撮像装置２０において、第１の撮像領域２２Ａで取得した画像のコントラスト値と、第２の撮像領域２２Ｂで取得した画像のコントラスト値との差分を求める。

ここで、図９に示すように、試料Ｓの表面に対して対物レンズ１５の焦点位置が合っている場合、第１の撮像領域２２Ａで取得した前ピンの画像コントラスト値と第２の撮像領域２２Ｂで取得した後ピンの画像コントラスト値とが略一致し、これらの差分値はほぼゼロとなる。一方、図１０に示すように、試料Ｓの表面までの距離が対物レンズ１５の焦点距離よりも長い場合、第１の撮像領域２２Ａで取得した前ピンの画像コントラスト値よりも第２の撮像領域２２Ｂで取得した後ピンの画像コントラスト値の方が大きくなり、これらの差分値はプラスとなる。この場合、焦点制御部３４は、対物レンズ制御部３６に対し、対物レンズ１５を試料Ｓに近づける向きに駆動する旨の指示情報を出力する。

また、図１１に示すように、試料Ｓの表面までの距離が対物レンズ１５の焦点距離よりも短い場合、第１の撮像領域２２Ａで取得した前ピンの画像コントラスト値よりも第２の撮像領域２２Ｂで取得した後ピンの画像コントラスト値の方が小さくなり、これらの差分値はマイナスとなる。この場合、焦点制御部３４は、対物レンズ制御部３６に対し、対物レンズ１５を試料Ｓに遠ざける向きに駆動する旨の指示情報を出力する。

領域制御部３５は、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける第１の撮像領域２２Ａの位置及び第２の撮像領域２２Ｂの位置を制御する部分である。領域制御部３５は、操作部３１からの操作に基づき、撮像面２０ａに形成される光重畳領域２９を避けるように、まず第１の撮像領域２２Ａを設定し、第１の撮像領域２２Ａでの撮像が行われた後、第１の撮像領域２２Ａの設定を解除する。次に、第１の撮像領域２２ＡからＺ方向（走査方向）に所定の間隔をもって第２の撮像領域２２Ｂを設定し、第２の撮像領域２２Ｂでの撮像が行われた後、第２の撮像領域２２Ｂの設定を解除する。

第１の撮像領域２２Ａでの撮像から第２の撮像領域２２Ｂでの撮像までの待ち時間は、例えば第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔と、ステージ１の走査速度に基づいて設定される。また、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔は、光路差生成部材２１によって生じる光路長差に基づいて設定される。ただし、この間隔は、実際には試料Ｓのスライド上の距離に対応しており、最終的には間隔を第２の撮像領域２２Ｂの画素数に変換する必要がある。

また、領域制御部３５は、操作部３１からの操作に基づき、第１の撮像領域２２Ａの位置と第２の撮像領域２２Ｂの位置の少なくとも一方を撮像面２０ａの面内の走査方向（ここではＺ方向）に沿って変更することができる。この場合、第１の撮像領域２２Ａの位置及び第２の撮像領域２２Ｂの位置のいずれか一方のみを変更してもよく、第１の撮像領域２２Ａの位置及び第２の撮像領域２２Ｂの位置の双方を変更してもよい。また、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔を維持したまま、第１の撮像領域２２Ａの位置及び第２の撮像領域２２Ｂの位置の双方を変更してもよい。

第１の撮像領域２２Ａの位置と第２の撮像領域２２Ｂの位置を変更することにより、第１の撮像領域２２Ａに入射する第２の光像が通過する光路差生成部材２１の厚さｔ１と、第２の撮像領域２２Ｂに入射する第２の光像が通過する光路差生成部材２１の厚さｔ２とを変化させることができる。これにより、前ピン及び後ピンの間隔が変わり、コントラスト値の差分を求める際の分解能を調整できる。

対物レンズ制御部３６は、対物レンズ１５の駆動を制御する部分である。対物レンズ制御部３６は、焦点制御部３４から出力される指示情報を受け取ると、指示情報の内容に従って、対物レンズ１５をＺ方向に駆動させる。これにより、試料Ｓに対する対物レンズ１５の焦点位置が調整される。

なお、対物レンズ制御部３６は、焦点制御部３４による焦点位置の解析中は対物レンズ１５の駆動は行わず、また、次の焦点位置の解析が開始されるまで、対物レンズ１５をＺ方向に沿って一方向にのみ駆動させる。図１２は、ステージの走査時間に対する対物レンズと試料の表面との距離の関係を示す図である。同図に示すように、試料Ｓの走査中は、焦点位置の解析期間Ａと、解析結果に基づく対物レンズ駆動期間Ｂとが交互に生じることとなる。このように、焦点位置の解析中に対物レンズ１５と試料Ｓとの位置関係を変化させないことで、焦点位置の解析精度を担保できる。

ステージ制御部３７は、ステージ１の駆動を制御する部分である。より具体的には、ステージ制御部３７は、操作部３１からの操作に基づき、試料Ｓが載置されたステージ１を所定の速度で走査させる。このステージ１の走査により、第１の撮像装置１８及び第２の撮像装置２０での試料Ｓの撮像視野が相対的に順次移動する。

ステージ１の走査方向としては、図１３（ａ）に示すように、一つの分割領域４０の走査が終了した後、ステージ１を走査方向と直交する方向に移動させて次の分割領域４０を反対方向に走査する双方向走査が採用される。また、図１３（ｂ）に示すように、一つの分割領域４０の走査が終了する度にステージ１の位置を走査開始位置まで戻してから次の分割領域４０を同一方向に走査する一方向走査を採用してもよい。この場合、撮像面２０ａのうち、第１の面２６に対応する設定領域Ｒ２及び第２の面２７に対応する設定領域Ｒ２のいずれか一方のみに第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂを設定すればよい。

また、画像取得の間のステージ１の走査速度は一定であるが、実際には走査の開始直後にステージ１の振動等の影響によって走査速度が不安定な期間が存在する。このため、図１４に示すように、分割領域４０よりも長い走査幅を設定し、ステージ１が加速する加速期間Ｃ、ステージ１の走査速度が安定化するまでの安定化期間Ｄ、及びステージ１が減速する減速期間Ｆのそれぞれが、分割領域４０よりも外側を走査しているときに生じるようにすることが好ましい。これにより、ステージ１の走査速度が一定となる一定速度期間Ｅに合わせて画像取得を行うことが可能となる。なお、安定化期間Ｄ中に撮像を開始し、画像取得後に安定化期間Ｄ中に取得したデータ部分を削除するようにしてもよい。このような手法は、データの空読みが必要な撮像装置を用いる場合に好適である。

画像生成部３８は、取得した画像を合成してバーチャルスライド画像を生成する部分である。画像生成部３８は、第１の撮像装置１８から出力される第１の画像、すなわち、各分割領域４０の画像を順次受け取り、これらを合成して試料Ｓの全体の画像を合成する。そして、この合成画像に基づいてこれよりも低い解像度の画像を作成し、高解像度の画像と低解像度の画像とを関連付けてバーチャルスライド画像格納部３９に格納する。バーチャルスライド画像格納部３９では、マクロ画像取得装置Ｍ１で取得した画像も更に関連付けてもよい。バーチャルスライド画像は、１枚の画像として格納してもよく、複数に分割された画像として格納してもよい。

続いて、上述した画像取得装置Ｍの動作について説明する。
図１５は、画像取得装置Ｍの動作を示すフローチャートである。同図に示すように、画像取得装置Ｍでは、まず、マクロ画像取得装置Ｍ１による試料Ｓのマクロ画像の取得がなされる（ステップＳ０１）。取得したマクロ画像は、例えば所定の閾値を用いて二値化された後、モニタ３２に表示され、所定のプログラムを用いた自動設定又は操作者による手動設定により、マクロ画像の中からミクロ画像を取得する範囲が設定される（ステップＳ０２）。

次に、試料Ｓがミクロ画像取得装置Ｍ２側に移送され、焦点取得条件の設定がなされる（ステップＳ０３）。ここでは、上述したように、ステージ１の走査速度と、第１の撮像領域２２Ａと第２の撮像領域２２Ｂとの間の間隔とに基づいて、第２の撮像領域２２Ｂでの撮像が開始されるまでの待ち時間を設定する。

焦点取得条件を設定した後、ステージ１の走査を開始し、ミクロ画像取得装置Ｍ２による試料Ｓの各分割領域４０ごとのミクロ画像の取得がなされる（ステップＳ０４）。第１の撮像装置１８でのミクロ画像の取得の際、第２の撮像装置２０では第１の撮像領域２２Ａ及び第２の撮像領域２２Ｂによって前ピンのコントラスト値と後ピンのコントラスト値の差分に基づいて試料Ｓに対する対物レンズ１５のずれ方向が解析され、対物レンズ１５の位置の調整がリアルタイムで実行される。全ての分割領域４０についてミクロ画像の取得が完了した後、取得したミクロ画像が合成され、バーチャルスライド画像が生成される（ステップＳ０５）。

以上説明したように、画像取得装置Ｍでは、光路差生成部材２１の配置により、焦点制御用の第２の光路Ｌ２での光の分岐を行わずに第２の光像の光路長差を形成できる。したがって、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路Ｌ２への光量が抑えられ、第１の撮像装置１８で撮像を行う際の光量を確保できる。また、この画像取得装置Ｍでは、光路差生成部材２１が第１の面２６及び第２の面２７を有することで、試料Ｓの撮像視野を双方向に走査する双方向スキャンの実施が可能となる。

第１の面２６と第２の面２７との境界付近では、第１の面２６及び第２の面２７で屈折した光の一部が第２の撮像装置２０の撮像面２０ａで重畳する場合がある。撮像面２０ａに光重畳領域２９が存在すると、焦点制御部３４における第２の画像の解析精度が低下することが考えられる。これに対し、この画像取得装置Ｍでは、第１の面２６と第２の面２７との間に、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａに到達する光を低減させる光低減部２８が設けられている。この光低減部２８により、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける光重畳領域２９を狭めることが可能となり、設定領域Ｒ２において前ピンと後ピンとの間のフォーカス差の調節自由度を十分に確保できる。したがって、試料Ｓの焦点位置の制御を精度良く実施できる。

上記実施形態では、光低減部２８を金属の箔などで形成して光反射部としているが、例えば図１６（ａ）に示す光低減部４８のように、第１の面２６と第２の面２７とがなす頂部近傍をフレネルレンズ形状に形成して光反射部としてもよい。フレネルレンズ形状とは、通常のレンズを同心円状の領域に分割して厚みを減らしたレンズ形状であり、鋸歯状の断面形状となっている。このような光低減部４８によっても、図１６（ｂ）に示すように、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける光重畳領域２９を狭めることが可能となり、試料Ｓの焦点位置の制御を精度良く実施できる。

また、上記実施形態では、第２の光路Ｌ２の光軸に直交する面に対して傾斜する第１の面２６及び第２の面２７を有する光路差生成部材２１を用いているが、図１７（ａ）に示すように、第１の面５６と第２の面５７との間に第２の光路Ｌ２の光軸に直交する（対向面５５と平行な）第３の面５９を有し、断面台形のプリズム状をなす光路差生成部材５１を用いてもよい。この光路差生成部材５１では、例えば第３の面５９の全面にわたって光低減部５８が設けられている。このような光低減部５８によっても、図１７（ｂ）に示すように、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける光重畳領域２９を狭めることが可能となり、試料Ｓの焦点位置の制御を精度良く実施できる。なお、図１７の例では、光低減部５８は、光反射部として図示されているが、光減光部、光遮光部、光吸光部であってもよい。

さらに、図１８（ａ）に示すように、第１の面６６を有する断面三角のプリズム状をなす第１部材６２と、第２の面６７を有する断面三角のプリズム状をなす第２部材６３とを組み合わせてなる光路差生成部材６１を用いてもよい。この光路差生成部材６１では、第１部材６２と第２部材６３とを隣接配置したときに形成される凹部６５の内壁の全面にわたって光低減部６８が設けられている。このような光低減部６８によっても、図１８（ｂ）に示すように、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける光重畳領域２９を狭めることが可能となり、試料Ｓの焦点位置の制御を精度良く実施できる。

凹部６５の内壁に光低減部６８を形成する代わりに、図１９（ａ）に示すように、凹部６５内に断面三角のプリズム状をなす光低減部７０を配置してもよい。この場合、光低減部７０の底面が第３の面６９に相当し、第３の面６９に光低減部７０が設けられることとなる。このような光低減部７０によっても、図１９（ｂ）に示すように、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける光重畳領域２９を狭めることが可能となり、試料Ｓの焦点位置の制御を精度良く実施できる。なお、図１８の例では、光低減部６８は、光反射部として図示されているが、光減光部、光遮光部、光吸光部であってもよい。同様に、図１９の例では、光低減部７０は、光吸光部として図示されているが、光反射部、光減光部、光吸光部であってもよい。

また、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用いて第２の撮像装置２０を構成し、ステージ制御部３７によるステージ１の走査と同期して各画素列のローリング読み出しを行うことによって第２の画像を取得するようにしてもよい。ローリング読み出しが可能な二次元撮像素子としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサを用いることができる。

この場合、撮像面２０ａには、図２０（ａ）に示すように、読み出し方向に垂直な方向に複数の画素が配列されてなる画素列８１が読み出し方向に複数配列されている。撮像素子６では、図２０（ｂ）に示すように、駆動クロックの駆動周期に基づいて、リセット信号、読み出し開始信号、及び読み出し終了信号が出力されることで、画素列８１毎に露光及び読み出しが制御される。一の画素列８１の露光期間は、リセット信号に伴う電荷の排出から読み出し開始信号に伴う電荷の読み出しまでの期間である。また、一の画素列８１の読み出し期間は、読み出し開始信号に伴う電荷の読み出し開始から読み出し終了信号に伴う電荷の読み出し終了までの期間である。なお、次の画素列に対する読み出し開始信号を読み出し終了信号として用いることもできる。

ローリング読み出しでは、画素列８１毎に出力する読み出し開始信号が所定の時間差で順次出力される。ローリング読み出しにおける読み出し速度は、各画素列８１を読み出すための読み出し開始信号の時間間隔によって制御される。読み出し開始信号の時間間隔を短くすると読み出し速度は早くなり、読み出し開始信号の時間間隔を長くすると読み出し速度は遅くなる。隣接する画素列８１，８１間での読み出し間隔の調整は、例えば駆動クロックの周波数の調整、読み出し期間中の遅延期間の設定、読み出し開始信号を規定するクロック数の変更といった手法によって実施できる。

ローリング読み出しとステージ制御部３７によるステージ１の走査とを同期させることにより、各画素列８１には、試料Ｓの同一部位からの光像が入射する。この光像には、第２の光路Ｌ２に配置された光路差生成部材２１等によって光路長差が生じる。このため、対物レンズ制御部３６によって対物レンズ１５を駆動させなくても、各画素列８１からの画像データには、試料Ｓの同一部位において対物レンズ１５の焦点位置が変更されたときのコントラスト情報がそれぞれ含まれることとなる。したがって、各画素列８１のうちから２つの画素列８１を前ピン及び後ピンとして選択することにより、前ピンのコントラスト値と後ピンのコントラスト値の差分に基づいて試料Ｓに対する対物レンズ１５のずれ方向を解析できる。

また、前ピン及び後ピンの選択をせずに各画素列８１に含まれるコントラスト値の分布に基づいて合焦点情報を求めることもできる。図２１に示す例では、第１列目の画素列８１から第ｎ列目の画素列８１までの画像データのコントラスト値が示されており、第ｉ列目の画素列８１における画像データのコントラスト値がピーク値となっている。この場合、焦点制御部３４は、第ｉ列目の画素列８１に入射した光の光路長に基づいて、試料Ｓに対する対物レンズ１５の合焦点情報を算出する。

このように、ローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用いて第２の撮像装置２０を構成する場合、光路差生成部材２１等を第２の光路Ｌ２に配置することで、対物レンズ１５の合焦点情報の算出の際の対物レンズ１５の駆動が不要となる。したがって、上記実施形態の作用効果に加え、焦点制御中の振動等の発生を抑えることができる。

上述した実施形態では、バーチャルスライド画像を生成する装置を例示したが、本発明に係る画像取得装置は、ステージ等によって試料を所定の速度で走査しながら画像を取得する装置であれば、種々の装置に適用することができる。

１…ステージ、１２…光源、１４…導光光学系、１５…対物レンズ、１６…ビームスプリッタ（光分岐手段）、１８…第１の撮像装置（第１の撮像手段）、２０…第２の撮像装置（第２の撮像手段）、２０ａ…撮像面、２１，５１，６１…光路差生成部材、２２Ａ…第１の撮像領域、２２Ｂ…第２の撮像領域、２６，５６，６６…第１の面、２７，５７，６７…第２の面、２８，４８，５８，６８，７０…光低減部、２９…光重畳領域、３４…焦点制御部（焦点制御手段）、３５…領域制御部（領域制御手段）、３６…対物レンズ制御部（対物レンズ制御手段）、５９，６９…第３の面、８１…画素列、Ｌ１…第１の光路、Ｌ２…第２の光路、Ｍ…画像取得装置、Ｍ１…マクロ画像取得装置、Ｍ２…ミクロ画像取得装置、Ｓ…試料。

Claims (10)

1. 試料が載置されるステージと、
   前記ステージを所定の速度で走査するステージ制御手段と、
   前記試料に向けて光を照射する光源と、
   前記試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、
   前記第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、
   前記第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、
   前記第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて前記第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御する焦点制御手段と、
   前記第２の光路に配置され、前記第２の撮像手段の撮像面の面内方向に沿って前記第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を備え、
   前記光路差生成部材は、前記第２の光路の光軸に直交する面に対して傾斜する第１の面及び第２の面を有し、
   前記第１の面と前記第２の面との間には、前記撮像面に到達する光を低減させる光低減部が設けられていることを特徴とする画像取得装置。
2. 前記光路差生成部材は、前記第１の面と前記第２の面との間に前記第２の光路の光軸に直交する第３の面を有し、前記光低減部は、前記第３の面に設けられていることを特徴とする請求項１記載の画像取得装置。
3. 前記第１の面と前記第２の面とが隣接しており、前記光低減部は、前記第１の面と前記第２の面との境界部分を含むように設けられていることを特徴とする請求項１記載の画像取得装置。
4. 前記光低減部は、前記第２の光路からの光を反射する光反射部であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の画像取得装置。
5. 前記光低減部は、前記第２の光路からの光を減光する光減光部であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の画像取得装置。
6. 前記光低減部は、前記第２の光路からの光を遮光する光遮光部であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の画像取得装置。
7. 前記光低減部は、前記第２の光路からの光を吸光する光吸光部であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の画像取得装置。
8. 前記光路差生成部材の前記第１の面及び前記第２の面で屈折した光が重畳する光重畳領域を避けるように、前記第２の撮像手段の撮像面に第１の撮像領域と第２の撮像領域とを設定する領域制御手段を更に備えたことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項記載の画像取得装置。
9. 前記第２の撮像手段は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を有し、前記ステージ制御手段による前記ステージの走査と同期して各画素列のローリング読み出しを行うことによって前記第２の画像を取得することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項記載の画像取得装置。
10. 試料が載置されるステージと、
    前記ステージを所定の速度で走査するステージ制御手段と、
    前記試料に向けて光を照射する光源と、
    前記試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、
    前記第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、
    前記第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、
    前記第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて前記第１の撮像手段による撮像の焦点位置を制御する焦点制御手段と、を備えた画像取得装置のフォーカス方法であって、
    前記第２の光路の光軸に直交する面に対して傾斜する第１の面及び第２の面を有し、前記第２の撮像手段の撮像面の面内方向に沿って前記第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材を前記第２の光路に配置し、
    前記第１の面と前記第２の面との間に光低減部を設け、前記第２の撮像手段の撮像面に到達する光を低減させることを特徴とする画像取得装置のフォーカス方法。

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