WO2014174920A1 - 画像取得装置及び画像取得装置のフォーカス方法 - Google Patents

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WO2014174920A1
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image
optical path
sample
optical
imaging
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PCT/JP2014/055988
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English (en)
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Inventor
英資 大石
岩瀬　富美雄
正利 奥河
Original Assignee
浜松ホトニクス株式会社
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Publication date
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/241—Devices for focusing
    • G02B21/245—Devices for focusing using auxiliary sources, detectors
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B7/00—Mountings, adjusting means, or light-tight connections, for optical elements
    • G02B7/28—Systems for automatic generation of focusing signals
    • G02B7/34—Systems for automatic generation of focusing signals using different areas in a pupil plane
    • G02B7/346—Systems for automatic generation of focusing signals using different areas in a pupil plane using horizontal and vertical areas in the pupil plane, i.e. wide area autofocusing
    • G—PHYSICS
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    • G02B7/00—Mountings, adjusting means, or light-tight connections, for optical elements
    • G02B7/28—Systems for automatic generation of focusing signals
    • G02B7/36—Systems for automatic generation of focusing signals using image sharpness techniques, e.g. image processing techniques for generating autofocus signals

Definitions

  • the present invention relates to an image acquisition device and a focus method of the image acquisition device.
  • Patent Document 1 As a conventional image acquisition apparatus, for example, there is an apparatus described in Patent Document 1.
  • light from a test object is divided by a half prism and received by a photoelectric conversion element formed of a two-dimensional imaging element such as a CCD area sensor.
  • the control circuit of the photoelectric conversion element has a scanning area setting unit that can arbitrarily set two scanning areas for two-dimensionally scanning the light receiving surface. Then, focusing control is executed based on the focusing error signal of the light received in the two scanning areas set by the scanning area setting unit.
  • the light from the test object is divided using a half prism. For this reason, it is difficult to ensure the amount of light in the photoelectric conversion element, and the detection accuracy of the focal position of the sample may be reduced. Further, when the light amount of the focus position detection light is increased, the light amount of the imaging light of the test object is decreased, and it may be difficult to secure the light amount at the time of imaging.
  • the present invention has been made to solve the above-described problems, and an object of the present invention is to provide an image acquisition apparatus that can secure a light amount during imaging and can accurately detect the focal position of a sample and a focusing method thereof. To do.
  • an image acquisition apparatus includes a stage on which a sample is placed, a light source that irradiates light toward the sample, and an objective lens that is disposed so as to face the sample on the stage.
  • a light guide optical system including a light branching unit that branches the optical image of the sample into the first optical path for image acquisition and the second optical path for focus control, and the first light branched into the first optical path
  • First imaging means for acquiring a first image by an image
  • second imaging means for acquiring a second image by a second optical image branched into a second optical path, and analyzing the second image
  • a focal point calculation unit that calculates focal point information of the sample based on the analysis result, and an optical path difference that causes an optical path difference in the second optical image along the in-plane direction of the imaging surface of the second imaging unit.
  • the in-focus calculation means is arranged in the second optical path so that a first incident area where the optical image is incident and a second incident area where the second optical image where no optical path difference is incident are formed.
  • One of the second image acquired in the first incident area and the second image acquired in the second incident area is selected as the second image used for the analysis. .
  • the optical path length difference of the second optical image can be formed without branching the light in the second optical path for focus control by arranging the optical path difference generating member. Therefore, the amount of light to the second optical path necessary for obtaining the focal position information can be suppressed, and the amount of light when the first imaging unit performs imaging can be ensured. Further, in this image acquisition device, due to the arrangement of the optical path difference generating member, an optical path difference is generated between the first incident area where the second optical image having the optical path difference is incident on the imaging surface of the second imaging unit. And a second incident region on which no second light image is incident.
  • the focal point calculation means it becomes possible to select which of the second image incident on the first incident area and the second image incident on the second incident area is used for the analysis. Since an optimum focal point information calculation method can be selected according to the degree of unevenness of the sample, the focal point information can be calculated with high accuracy.
  • optical path difference generating member and the second imaging unit may be arranged in the second optical path so that light from the imaging position of the first imaging unit in the sample enters the second incident region.
  • the calculation process of the focal point calculation by the focal point calculation means can be simplified.
  • the image processing apparatus further includes an image evaluation unit that evaluates the first image acquired by the first imaging unit, and the in-focus calculation unit performs the first incidence based on the evaluation result of the first image by the image evaluation unit. It is preferable to select one of the second image acquired in the region and the second image acquired in the second incident region. Depending on the calculation method of the in-focus information, there may be a case where the accuracy of calculating the in-focus information decreases due to, for example, the degree of unevenness of the sample. In such a case, which of the second image acquired in the first incident region and the second image acquired in the second incident region is used for the analysis based on the evaluation result of the first image. By selecting, the accuracy of the in-focus information can be secured.
  • the optical path difference generating member further includes a visual field driving means for moving the visual field position of the objective lens with respect to the sample, and the optical path difference generating member is a second one on the imaging surface of the second imaging means as the visual field driving means moves the visual lens position.
  • 2 has a first portion whose thickness continuously changes along the moving direction of the optical image, and a second portion having a constant thickness, and the first portion is incident on the imaging surface as a first incident.
  • the region is formed, and the second portion forms the second incident region on the imaging surface.
  • the first incident region and the second incident region can be formed on the imaging surface of the second imaging unit with a simple configuration of the optical path difference generating member.
  • the second imaging means has a two-dimensional imaging device having a plurality of pixel rows and capable of rolling readout, and rolling readout of each pixel row in synchronization with the movement of the visual field position of the objective lens by the visual field driving means. It is preferable to acquire a 2nd image by performing.
  • the image data from each pixel row includes contrast information equivalent to that when the focal position of the objective lens is changed in the same part of the sample. Is included. Therefore, the in-focus information can be calculated quickly and accurately based on the contrast information.
  • the in-focus calculation means is read out by at least two pixel columns among the pixel columns of the two-dimensional image sensor. It is preferable to calculate the focal point information of the sample based on the difference between the contrast values of the image data.
  • the in-focus calculation means create a focus map based on the calculated in-focus information.
  • the focus map can be created with high accuracy.
  • the focus method of the image acquisition apparatus includes a stage on which a sample is placed, a light source that irradiates light toward the sample, an objective lens that is disposed so as to face the sample on the stage, and
  • a light guide optical system including a light branching unit that branches a light image of a sample into a first light path for image acquisition and a second light path for focus control, and a first light image branched into the first light path
  • a focal point calculation unit that calculates focal point information of the sample based on the analysis result, and an optical path difference generation member that generates an optical path difference in the second optical image along the in-plane direction of the imaging surface of the second imaging unit.
  • a focusing method for an image acquisition device comprising: an imaging surface of a second imaging means; An optical path difference generating member is formed such that a first incident area where a second optical image in which an optical path difference has occurred enters and a second incident area in which a second optical image without an optical path difference enters. Is arranged in the second optical path, and the second image acquired in the first incident region and the second image acquired in the second incident region are used for the analysis. It is characterized by having the in-focus calculation means select it as an image.
  • the optical path length difference of the second optical image can be formed without branching the light in the second optical path for focus control by arranging the optical path difference generating member. Therefore, the amount of light to the second optical path necessary for obtaining the focal position information can be suppressed, and the amount of light when the first imaging unit performs imaging can be ensured. Further, in the focusing method of the image acquisition device, the first incident region where the second optical image in which the optical path difference has occurred is incident on the imaging surface of the second imaging unit by the arrangement of the optical path difference generating member, and the optical path And a second incident region on which a second optical image that does not cause a difference is incident.
  • the focal point calculation means it becomes possible to select which of the second image incident on the first incident area and the second image incident on the second incident area is used for the analysis. Since an optimum focal point information calculation method can be selected according to the degree of unevenness of the sample, the focal point information can be calculated with high accuracy.
  • the amount of light at the time of imaging can be secured, and the focal position of the sample can be detected with high accuracy.
  • FIG. 1 It is a figure which shows one Embodiment of the macro image acquisition apparatus which comprises the image acquisition apparatus which concerns on this invention. It is a figure which shows one Embodiment of the micro image acquisition apparatus which comprises the image acquisition apparatus which concerns on this invention. It is a figure which shows an example of a 2nd imaging device. It is a figure which shows an example of the combination of an optical path difference production
  • 3 is a flowchart showing an operation when dynamic prefocus is performed in the image acquisition apparatus shown in FIGS. 1 and 2.
  • 3 is a flowchart showing an operation when a focus map is created in the image acquisition device shown in FIGS. 1 and 2. It is a figure which shows the modification of an optical path difference production
  • FIG. 1 is a diagram showing an embodiment of a macro image acquisition device constituting an image acquisition device according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing an embodiment of a micro image acquisition device constituting the image acquisition device according to the present invention.
  • the image acquisition device M includes a macro image acquisition device M1 that acquires a macro image of the sample S and a micro image acquisition device M2 that acquires a micro image of the sample S. .
  • the image acquisition device M sets, for example, a plurality of line-shaped divided regions 40 (see FIG. 6) with respect to the macro image acquired by the macro image acquisition device M1, and each divided region 40 is subjected to high magnification by the micro image acquisition device M2. It is a device that generates a virtual slide image that is a digital image by acquiring and synthesizing.
  • the macro image acquisition apparatus M1 includes a stage 1 on which a sample S is placed as shown in FIG.
  • the stage 1 is an XY stage that is driven in the horizontal direction by a motor or actuator such as a stepping motor (pulse motor) or a piezoelectric actuator.
  • the sample S to be observed with the image acquisition device M is a biological sample such as a cell, for example, and is placed on the stage 1 in a state of being sealed with a slide glass. By driving the stage 1 in the XY plane, the imaging position with respect to the sample S can be moved.
  • the stage 1 can reciprocate between the macro image acquisition device M1 and the micro image acquisition device M2, and has a function of transporting the sample S between both devices.
  • macro image acquisition the entire image of the sample S may be acquired by one imaging, or the sample S may be divided into a plurality of regions and imaged.
  • the stage 1 may be provided in both the macro image acquisition device M1 and the micro image acquisition device M2.
  • a light source 2 that irradiates light toward the sample S and a condenser lens 3 that condenses the light from the light source 2 onto the sample S are disposed.
  • the light source 2 may be arranged so as to irradiate light obliquely toward the sample S.
  • a light guide optical system 4 that guides a light image from the sample S and an imaging device 5 that captures a light image of the sample S are disposed on the upper surface side of the stage 1.
  • the light guide optical system 4 includes an imaging lens 6 that forms an optical image from the sample S on the imaging surface of the imaging device 5.
  • the imaging device 5 is an area sensor that can acquire a two-dimensional image, for example.
  • the imaging device 5 acquires the entire image of the light image of the sample S incident on the imaging surface via the light guide optical system 4 and stores it in a virtual slide image storage unit 39 described later.
  • the micro image acquisition device M2 has a light source 12 and a condenser lens 13 similar to those of the macro image acquisition device M1 on the bottom surface side of the stage 1, as shown in FIG.
  • a light guide optical system 14 that guides a light image from the sample S is disposed on the upper surface side of the stage 1.
  • the optical system that irradiates the sample S with light from the light source 12 employs an excitation light irradiation optical system for irradiating the sample S with excitation light and a dark field illumination optical system for acquiring a dark field image of the sample S. May be.
  • the light guide optical system 4 includes an objective lens 15 disposed so as to face the sample S, and a beam splitter (light branching means) 16 disposed at a subsequent stage of the objective lens 15.
  • the objective lens 15 is provided with a motor or actuator such as a stepping motor (pulse motor) or a piezoelectric actuator that drives the objective lens 15 in the Z direction along the optical axis direction of the objective lens 15.
  • a motor or actuator such as a stepping motor (pulse motor) or a piezoelectric actuator that drives the objective lens 15 in the Z direction along the optical axis direction of the objective lens 15.
  • the beam splitter 16 is a part that branches the optical image of the sample S into a first optical path L1 for image acquisition and a second optical path L2 for focus control.
  • the beam splitter 16 is disposed at an angle of about 45 degrees with respect to the optical axis from the light source 12.
  • the optical path passing through the beam splitter 16 is the first optical path L1
  • the beam splitter 16 The optical path reflected by 16 is the second optical path.
  • an imaging lens 17 that forms an optical image (first optical image) of the sample S that has passed through the beam splitter 16, and an imaging surface is disposed at the imaging position of the imaging lens 17.
  • a first imaging device (first imaging means) 18 is arranged.
  • the first imaging device 18 is a device that can acquire a one-dimensional image (first image) based on a first light image of the sample S.
  • a two-dimensional CCD image sensor that can be driven by TDI (Time Delay Integration).
  • a line scan image sensor such as a line sensor is used.
  • the first imaging device 18 is a device that can acquire a two-dimensional image such as a CMOS sensor or a CCD sensor. There may be.
  • the first images picked up by the first image pickup device 18 are sequentially stored in a temporary storage memory such as a lane buffer, and then compressed and output to an image generation unit 38 to be described later.
  • an optical path difference generation member 21 that causes an optical path difference in the second optical image is disposed in the front stage of the second imaging device 20.
  • the field adjustment lens 19 is preferably configured so that the second light image is formed on the second imaging device 20 with the same size as the first light image.
  • the second imaging device 20 is a device that can acquire a two-dimensional image (second image) based on the second optical image of the sample S.
  • the second imaging device 20 has a two-dimensional imaging device that has a plurality of pixel columns and can perform rolling readout.
  • An example of such a two-dimensional imaging device is a CMOS image sensor.
  • the imaging surface 20a of the second imaging device 20 is disposed so as to substantially coincide with the XZ plane orthogonal to the second optical path L2.
  • a reset signal, a readout start signal, and a readout end signal are output based on the drive cycle of the drive clock, so that each pixel column 20b is output. Exposure and readout are controlled.
  • the exposure period of one pixel column 20b is a period from discharge of charge accompanying a reset signal to reading of charge accompanying a read start signal.
  • the readout period of one pixel column 20b is a period from the start of charge readout accompanying the readout start signal to the end of charge readout accompanying the readout end signal. Note that a read start signal for the next pixel column can also be used as a read end signal.
  • readout start signals output for each pixel column 20b are sequentially output with a predetermined time difference.
  • the reading speed in the rolling reading is controlled by the time interval of the reading start signal for reading each pixel column 20b. If the time interval of the read start signal is shortened, the read speed is increased, and if the time interval of the read start signal is increased, the read speed is decreased.
  • the adjustment of the reading interval between the adjacent pixel columns 20b and 20b can be performed, for example, by adjusting the frequency of the driving clock, setting the delay period during the reading period, and changing the number of clocks that define the reading start signal.
  • the optical path difference generating member 21 is a glass member that causes an optical path difference in the second optical image along the in-plane direction of the imaging surface 20a.
  • the optical path difference generating member 21 is configured by combining a first member 22 having a prism shape with a right-angled triangular section and a flat plate-like second member 23.
  • the first member 22 has a thickness continuously along the in-plane direction of the imaging surface 20a, that is, the moving direction (Z direction) of the second optical image on the imaging surface 20a accompanying the scanning of the sample S. It arrange
  • the second member 23 has a constant thickness and is disposed corresponding to the other end side region (lower half region) of the imaging surface 20a.
  • the light from the planned imaging position (position to be imaged) in the first imaging device 18 in the sample S is one end side region (upper half region) of the imaging surface 20a. ).
  • the optical path difference generating member 21 and the second imaging device 20 are configured such that light from the imaging position of the sample S in the first imaging device 18 enters the other end side region (lower half region) of the imaging surface 20a. Is arranged.
  • the first optical image in which the optical path difference occurs is incident on the imaging surface 20a of the second imaging device 20 as shown in FIG. 4B.
  • the first incident region 24A the second optical image incident on the imaging surface 20a has a longer optical path from the upper end side toward the center side.
  • the second optical image incident on the imaging surface 20a has the same optical path at any position.
  • the first member 22 and the second member 23 are preferably arranged so that the surface facing the second imaging device 20 is parallel to the imaging surface 20a of the second imaging device. Thereby, refraction of light by the surface facing the second imaging device 20 can be reduced, and the amount of light received by the second imaging device 20 can be ensured.
  • the thickness of the second member 23 is preferably equal to the thickness of the first member 22 at the position of the pixel row 20b corresponding to the focus center.
  • the optical path length of the second optical image incident on the second incident area 24B becomes equal to the optical path length of the first optical image incident on the first imaging device 18, so that the in-focus calculation unit 37 The calculation process of the in-focus information can be simplified.
  • FIG. 5 is a block diagram showing functional components of the image acquisition apparatus.
  • the image acquisition apparatus M includes a computer system including a CPU, a memory, a communication interface, a storage unit such as a hard disk, an operation unit 31 such as a keyboard, a monitor 32, and the like. Further, the image acquisition apparatus M includes, as functional components of the control unit 33, a stage driving unit 34, an objective lens driving unit 35, an operation control unit 36, a focal point calculation unit 37, and an image generation unit 38.
  • the virtual slide image storage unit 39 and the image evaluation unit 41 are provided.
  • the stage driving unit 34 is a part that functions as visual field driving means for moving the visual field position of the objective lens 15 with respect to the sample S.
  • the stage drive unit 34 is configured by a motor or actuator such as a stepping motor (pulse motor) or a piezoelectric actuator, for example.
  • the stage drive unit 34 moves the stage 1 in the XY directions with respect to a plane having a predetermined angle (for example, 90 degrees) with respect to a plane orthogonal to the optical axis of the objective lens 15 based on control by the operation control unit 36.
  • a predetermined angle for example, 90 degrees
  • the stage drive unit 34 scans the stage 1 on which the sample S is placed at a predetermined speed based on the control by the operation control unit 36.
  • the scanning of the stage 1 relatively sequentially moves the imaging field of the sample S in the first imaging device 18 and the second imaging device 20.
  • the operation control unit 36 has the objective lens 15 for the sample S in the scanning direction along the imaging line Ln (n is a natural number) composed of a plurality of divided regions 40. Control to move the visual field position.
  • a unidirectional scan in which the scanning direction is the same between the adjacent imaging lines Ln is adopted. .
  • the scanning speed of the stage 1 during image acquisition is constant, there is actually a period in which the scanning speed is unstable immediately after the start of scanning due to the influence of vibration of the stage 1 and the like. For this reason, each of the acceleration period in which the scanning width longer than that of the divided region 40 is set, the stage 1 is accelerated, the stabilization period until the scanning speed of the stage 1 is stabilized, and the deceleration period in which the stage 1 is decelerated is It is preferable that this occurs when scanning outside the divided area 40. Thereby, it is possible to acquire an image in accordance with a constant speed period in which the scanning speed of the stage 1 is constant. Note that imaging may be started during the stabilization period, and the data portion acquired during the stabilization period after image acquisition may be deleted. Such a method is suitable when using an imaging device that requires idle reading of data.
  • the objective lens drive unit 35 is configured by a motor or actuator such as a stepping motor (pulse motor) or a piezo actuator, for example, in the same manner as the stage drive unit 34.
  • the objective lens driving unit 35 moves the objective lens 15 in the Z direction along the optical axis of the objective lens 15 based on the control by the operation control unit 36. Thereby, the focal position of the objective lens 15 with respect to the sample S moves.
  • the objective lens driving unit 35 does not drive the objective lens 15 during the analysis of the focal position by the in-focus calculation unit 37, and moves the objective lens 15 in the Z direction until the analysis of the next focal position is started. It is preferable to drive only along one direction. In this case, during the scanning of the sample S, the analysis period of the focal position and the objective lens driving period based on the analysis result occur alternately. By not changing the positional relationship between the objective lens 15 and the sample S during the analysis of the focal position, the analysis accuracy of the focal position can be ensured.
  • the operation control unit 36 is a part that controls operations of the second imaging device 20 and the stage driving unit 34. More specifically, the operation control unit 36 has a visual field V of the objective lens 15 by the stage driving unit 34 so that an optical image of a predetermined part in the sample S is exposed by each pixel row 20b of the second imaging device 20. The movement of the predetermined portion of the sample S in the inside and the rolling readout of the second imaging device 20 are synchronized.
  • the operation control unit 36 moves the sample S within the visual field V of the objective lens 15 at a constant speed when the visual field V of the objective lens 15 moves in one divided region 40.
  • the stage drive unit 34 is controlled so that Further, as illustrated in FIG. 7B, the operation control unit 36 moves the imaging Sb of the optical image of the sample S on the imaging surface 20 a of the second imaging device 20 and each pixel column on the imaging surface 20 a.
  • the stage drive unit 34 and the second imaging device 20 are controlled so that the reading direction of 20b matches.
  • the operation control unit 36 changes the reading speed for rolling reading based on the moving speed of the sample S within the field of view V of the objective lens 15. May be.
  • the exposure time in each pixel row 20b is set based on at least the width of the predetermined portion Sa of the sample S in the scanning direction and the moving speed of the predetermined portion Sa of the sample S within the field of view V of the objective lens 15. More preferably, the magnifications of the objective lens 15 and the field adjustment lens 19 are also considered. Thereby, the optical image of the predetermined part Sa of the sample S can be exposed by each pixel row 20b.
  • the imaging Sb of light from the predetermined portion Sa of the sample S on the imaging surface 20a of the second imaging device 20 is the first pixel row 20b in the imaging region. Is reached, exposure of the first pixel row 20b is started.
  • the position of the predetermined portion Sa of the sample S within the field of view V of the objective lens 15 is moved.
  • the image Sb of light from the predetermined portion Sa of the sample S reaches the second pixel row 20b in the imaging region, and the second pixel row 20b. The exposure is started. Further, at the timing when the image Sb of light from the predetermined portion Sa of the sample S passes through the first pixel row 20b, reading of the first pixel row 20b is started.
  • the position of the predetermined portion Sa of the sample S in the field of view V of the objective lens 15 further moves in the scanning direction.
  • the imaging Sb of the light from the predetermined portion Sa of the sample S reaches the third pixel row 20b of the imaging region, and the third pixel row 20b.
  • the exposure is started.
  • reading of the second pixel row 20b is started at the timing when the image Sb of light from the predetermined portion Sa of the sample S passes through the second pixel row 20b.
  • the reading of the first pixel column 20b is completed simultaneously with the reading of the second pixel column 20b.
  • the image data read from each pixel row 20b is all image data for the same part of the sample S. Further, since the optical path difference generating member 21 is arranged in the second optical path L2, the image data read from each pixel row 20b is obtained when the focal position of the objective lens 15 is changed for the same part of the sample S, respectively. Contrast information equivalent to is included.
  • the image data read by each pixel row 20b is sequentially output to the in-focus calculation unit 37.
  • the operation control unit 36 determines that the optical image of the predetermined part in the sample S is the second imaging device 20.
  • the movement of a predetermined portion of the sample S within the field of view V of the objective lens 15 by the objective lens driving unit 35 and the rolling readout of the second imaging device 20 may be synchronized so that each pixel row 20b is exposed.
  • the objective lens driving unit 35 functions as a visual field driving unit that moves the visual field position of the objective lens 15 with respect to the sample S.
  • the focal point calculation unit 37 is a part that analyzes the second image acquired by the second imaging device 20 and calculates the focal point information of the sample S based on the analysis result. Based on the instruction information from the image evaluation unit 41, the in-focus calculation unit 37 belongs to the image data read from the pixel row 20b belonging to the first incident area 24A on the imaging surface 20a and the second incident area 24B. One of the image data read from the pixel row 20b is selected as a second image used for analysis.
  • the image acquisition apparatus M When image data read from the pixel row 20b belonging to the first incident area 24A is used for analysis, the image acquisition apparatus M first acquires in-focus information of the sample S in the divided area 40 to be imaged next. Dynamic prefocus performed immediately before imaging by the imaging device 18 is executed.
  • the focal point calculation unit 37 uses, for example, a front pin / rear pin method as a method for calculating the focal point information.
  • the in-focus calculation unit 37 selects at least two pixel columns 20b of the pixel columns 20b of the second imaging device 20 from among the pixel columns 20b.
  • the thickness continuously increases along the moving direction (Z direction) of the second optical image on the imaging surface 20a accompanying the scanning of the sample S.
  • the optical path difference generating member 21 is arranged, and the second light image in which the optical path difference has occurred enters the first incident area 24A of the imaging surface 20a of the second imaging device 20. Therefore, in the first incident region 24A, based on the positions of the two pixel columns 20b to be selected, a light image (front pin) focused before the first light image incident on the first imaging device 18 is selected. ) And a focused optical image (rear pin) later.
  • the focal point calculation unit 37 The difference between the contrast values of the image data read by the selected pixel row 20b is obtained.
  • the focal point calculation unit 37 outputs instruction information to the effect that the objective lens 15 is driven in a direction approaching the sample S to the objective lens driving unit 35.
  • the focal point calculation unit 37 outputs instruction information indicating that the objective lens 15 is driven in a direction away from the sample S to the objective lens driving unit 35.
  • the in-focus calculation unit 37 has a pixel column 20b corresponding to the front pin and a pixel column corresponding to the rear pin so as to be symmetrical with respect to the pixel column 20b corresponding to the focus center. 20b is selected.
  • the pixel row 20b corresponding to the focus center is a sample that passes through the second optical path L2 and the optical path difference generation member 21 with an optical path length that matches the optical path length of the optical image of the sample S imaged by the first imaging device 18. This refers to the pixel row 20b on which the S light image is incident.
  • the in-focus calculation unit 37 the (k ⁇ m) -th pixel column 20b and the (k + m) -th pixel Each of the columns 20b is selected.
  • m the degree of unevenness of the sample S
  • the image acquisition device M obtains in-focus information on a plurality of locations of the sample S before imaging the sample S. Obtain a focus map in advance.
  • the image acquisition device M sets the image acquisition region P so that the entire sample S is included based on the macro image of the sample S acquired by the macro image acquisition device M1.
  • the image acquisition area is set, for example, as shown in FIG. 13, a plurality of focus information acquisition positions Q that are spaced at equal intervals are set in the image acquisition area P in a grid pattern.
  • the interval between the image acquisition regions P is appropriately set according to the size of the sample S and the like.
  • the interval between the image acquisition regions P may not be equal and may be set at random.
  • the focus calculation unit 37 uses, for example, a contrast distribution method as a method for calculating the focus information.
  • a contrast distribution method as a method for calculating the focus information.
  • the visual field V of the objective lens 15 is set in the vicinity of the focus information acquisition position Q.
  • the stage 1 is driven by the stage drive unit 34, and the visual field V of the objective lens 15 is moved toward the focus information acquisition position Q at a constant speed.
  • the focal point calculation unit 37 acquires the contrast information of the image data from the plurality of pixel columns 20b of the second imaging device 20.
  • the contrast value of the image data from the first pixel column 20 b to the n-th pixel column 20 b in the second imaging device 20 is illustrated, and the pixel in the i-th column.
  • the contrast value of the image data in the column 20b is a peak value.
  • the in-focus calculation unit 37 generates in-focus information assuming that the focus position of the objective lens 15 is the in-focus position when the predetermined portion Sa of the sample S is exposed in the i-th pixel row 20b.
  • the contrast value may be a contrast value in a specific pixel among the pixels included in each pixel column 20b, or an average value of contrast values of all or a part of the pixels included in each pixel column 20b. May be.
  • the field of view V of the objective lens 15 may be set so as to include the focus information acquisition position Q.
  • the stage 1 is not driven by the stage driving unit 34, and the second imaging device 20 acquires the second image while the objective lens driving unit 35 moves the focal position of the objective lens 15 by the focal depth. I do.
  • the in-focus calculation unit 37 generates in-focus information assuming that the focus position of the objective lens 15 is the in-focus position when the image data having the largest contrast value is acquired among the acquired image data.
  • the image generation unit 38 is a part that combines the acquired images to generate a virtual slide image.
  • the image generation unit 38 sequentially receives the first image output from the first imaging device 18, that is, the image of each divided region 40, and synthesizes them to synthesize the entire image of the sample S. Then, an image having a lower resolution than this is created based on the composite image, and the high resolution image and the low resolution image are associated with each other and stored in the virtual slide image storage unit 39.
  • an image acquired by the macro image acquisition device M1 may be further associated.
  • the virtual slide image may be stored as a single image, or may be stored as a plurality of divided images.
  • the image evaluation unit 41 is a part that evaluates the first image acquired by the first imaging device 18.
  • the image acquisition device M calculates the focal point information using the second image acquired in the first incident area 24A
  • the image evaluation unit 41 performs the first evaluation based on the focal point information.
  • the contrast value of the first image acquired by the imaging device 18 is acquired.
  • the image evaluation unit 41 instructs the image data read from the pixel row 20b belonging to the first incident area 24A to be used for analysis.
  • the instruction information is output to the in-focus calculation unit 37.
  • the image evaluation unit 41 uses the image data read from the pixel row 20b belonging to the second incident area 24B for analysis.
  • the instruction information to be instructed is output to the in-focus calculation unit 37.
  • the focal point information is calculated using the second image acquired by the image acquisition device M in the first incident region 24A, and the sample S in the divided region 40 to be imaged next.
  • the dynamic prefocus is performed in which the in-focus information is acquired immediately before the image capturing by the first image capturing device 18.
  • the field of view V of the objective lens 15 moves along one imaging line Ln (step S11).
  • the predetermined portion Sa of the sample S in the field of view V of the objective lens 15 is formed so that the image Sb of the light image from the predetermined portion Sa in the sample S is exposed in each pixel row 20b of the second imaging device 20. Is synchronized with the rolling readout of the second imaging device 20 (step S12).
  • the focal point information in the divided region 40 is calculated based on the contrast value of the image data acquired by the pixel row 20b corresponding to the front pin and the rear pin (step S13), and the objective lens 15 is based on the calculated focal point information. Is adjusted, and the divided region 40 is imaged (step S14). Thereafter, it is determined whether or not the calculation of the focal point information has been completed for the desired imaging line Ln (step S15). If the acquisition of the focal point information has not been completed, the next imaging line Ln is determined. The field of view V of the objective lens 15 is moved (step S16), and the processes of steps S11 to S15 are repeatedly executed.
  • the image evaluation unit 41 evaluates that the contrast value of the first image captured by the first imaging device 18 is less than a predetermined threshold value
  • the second incident is performed. Processing is switched so that image data read from the pixel row 20b belonging to the region 24B is used for analysis, and a focus map of the sample S is created before the sample S is imaged.
  • the visual field V of the objective lens 15 moves along one imaging line Ln (step S21).
  • the predetermined portion Sa of the sample S in the field of view V of the objective lens 15 is formed so that the image Sb of the light image from the predetermined portion Sa in the sample S is exposed in each pixel row 20b of the second imaging device 20. Is synchronized with the rolling readout of the second imaging device 20 (step S22). Then, focus information at the focus information acquisition position Q is calculated based on the contrast value peak of the image data acquired at each pixel row 20b (step S23).
  • step S24 it is determined whether or not the calculation of the focal point information has been completed for the desired imaging line Ln (step S24), and the acquisition of the focal point information has not been completed.
  • the visual field V of the objective lens 15 moves to the next imaging line Ln (step S25), and the processes of steps S21 to S24 are repeatedly executed.
  • a focus map is created based on the in-focus information at each focus information acquisition position Q (step S26).
  • the optical path length difference of the second optical image is formed by the arrangement of the optical path difference generating member 21 without branching the light in the second optical path L2 for focus control. it can. Therefore, the amount of light to the second optical path L2 necessary for obtaining the focal position information is suppressed, and the amount of light when the first imaging device 18 performs imaging can be secured. Further, in the image acquisition device M, due to the arrangement of the optical path difference generation member 21, a first incident region 24A where the second optical image in which the optical path difference has occurred is incident on the imaging surface 20a of the second imaging device 20, and A second incident region 24B on which a second light image that does not cause an optical path difference is formed.
  • the in-focus calculation unit 37 can select which of the second image incident on the first incident area 24A and the second image incident on the second incident area 24B is used for the analysis.
  • the focal point information can be calculated with high accuracy.
  • the image acquisition device M further includes an image evaluation unit 41 that evaluates the first image acquired by the first imaging device 18.
  • the in-focus calculation unit 37 performs dynamic prefocusing by analyzing the second image acquired in the first incident region 24A when the contrast value of the first image by the image evaluation unit 41 is equal to or greater than a predetermined threshold.
  • a focus map is created by analyzing the second image acquired in the first incident area 24A. Select which of the second image acquired in the first incident area 24A and the second image acquired in the second incident area 24B is used for the analysis based on the evaluation result of the first image By doing so, the accuracy of the in-focus information can be secured.
  • the image acquisition apparatus M further includes a stage driving unit 34 that moves the visual field position of the objective lens 15 with respect to the sample S, and the optical path difference generating member 21 is accompanied by the movement of the visual field position of the objective lens 15 by the stage driving unit 34.
  • a first member 22 whose thickness continuously changes along the moving direction of the second optical image on the imaging surface 20a of the second imaging device 20, and a second member 23 having a constant thickness.
  • the first member 22 forms a first incident region 24A on the imaging surface 20a
  • the second member 23 forms a second incident region 24B on the imaging surface 20a. Accordingly, the first incident region 24A and the second incident region 24B can be formed on the imaging surface 20a of the second imaging device 20 with a simple configuration of the optical path difference generating member 21.
  • the second imaging device 20 has a plurality of pixel rows 20b and a two-dimensional imaging device capable of rolling readout, and the stage drive unit 34 moves the visual field position of the objective lens 15.
  • a second image is acquired by performing rolling readout of each pixel row 20b in synchronization. Since the optical path difference generating member 21 is arranged in the second optical path L2, the image data from each pixel row 20b is equivalent to the case where the focal position of the objective lens 15 is changed in the same part of the sample S. Contrast information is included. Therefore, the in-focus information can be calculated quickly and accurately based on the contrast information. Even when the focus map is created, it is not necessary to move the focal position of the objective lens 15, so that the in-focus information at the focal information acquisition position Q can be quickly calculated.
  • the optical path difference generating member is formed by combining the first member 22 whose thickness continuously changes along the moving direction of the second optical image and the second member 23 having a constant thickness.
  • the optical path difference generating member has a first incident area 24 ⁇ / b> A where the second optical image in which the optical path difference has occurred is incident on the imaging surface 20 a of the second imaging device 20, and the optical path difference is Other forms may be used as long as the second incident region 24B into which the second optical image that does not occur is incident is formed.
  • an optical path difference generating member 51 composed only of the first member 22 may be used.
  • the first incident region 24A corresponding to the first member 22 is formed on the imaging surface 20a of the second imaging device 20 to generate the optical path difference.
  • a second incident region 24B is formed corresponding to a portion where the member 51 is not disposed.
  • the first incident region 24A is provided in the upper half region of the imaging surface 20a along the moving direction (Z direction) of the second optical image on the imaging surface 20a accompanying the scanning of the sample S.
  • the second incident region 24B is formed in the lower half region, but the positions where the first incident region 24A and the second incident region 24B are formed on the imaging surface 20a are not limited to this.
  • a first member 62 having a prism shape with a right-angled cross section and a flat plate-like second member 63 are combined in the longitudinal direction of the pixel row 20b. May be. In this case, as shown in FIG.
  • the first incident region 24A is formed in the left half region of the imaging surface 20a
  • the second incident region 24B is formed in the right half region of the imaging surface 20a.
  • Operation control part operation control means
  • 37 In-focus calculation unit in-focus calculation means
  • 40 Image evaluation unit image evaluation means
  • L1 First optical path L2 Second optical path
  • M Image acquisition device M1 Macro image acquisition device M2 ... micro image acquisition device, S ... sample, Sa ... predetermined site, V ... view of objective lens .

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Abstract

　画像取得装置Ｍでは、光路差生成部材２１により、第２の光路Ｌ２での光の分岐を行わずに第２の光像の光路長差を形成できる。したがって、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路Ｌ２への光量が抑えられ、第１の撮像装置１８で撮像を行う際の光量を確保できる。また、画像取得装置Ｍでは、光路差生成部材２１により、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａに、光路差が生じた第２の光像が入射する第１の入射領域２４Ａと、光路差が生じない第２の光像が入射する第２の入射領域２４Ｂとが形成される。これにより、合焦点算出部３７において、合焦点情報の解析に用いる第２の画像を状況に応じて選択することが可能となり、合焦点情報を精度良く算出できる。

Description

画像取得装置及び画像取得装置のフォーカス方法
　本発明は、画像取得装置及び画像取得装置のフォーカス方法に関する。
　従来の画像取得装置として、例えば特許文献１に記載の装置がある。この装置では、被検物からの光をハーフプリズムで分割し、ＣＣＤエリアセンサ等の２次元撮像素子からなる光電変換素子で受光する。光電変換素子の制御回路は、受光面を２次元的に走査する２つの走査領域を任意に設定可能な走査領域設定部を有している。そして、走査領域設定部によって設定された２つの走査領域で受光した光の合焦ずれ信号に基づいて合焦制御を実行する。
特開平８－３２０４３０号公報
　上述した従来の装置では、ハーフプリズムを用いて被検物からの光を分割している。このため、光電変換素子での光量の確保が難しく、試料の焦点位置の検出精度が低下してしまうおそれがある。また、焦点位置の検出用の光の光量を増大させると、被検物の撮像用の光の光量が減少することとなり、撮像の際の光量の確保が困難となるおそれがある。
　本発明は、上記課題の解決のためになされたものであり、撮像の際の光量を確保でき、かつ試料の焦点位置を精度良く検出できる画像取得装置及びそのフォーカス方法を提供することを目的とする。
　上記課題の解決のため、本発明に係る画像取得装置は、試料が載置されるステージと、試料に向けて光を照射する光源と、ステージ上の試料と対峙するように配置された対物レンズ、及び試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて試料の合焦点情報を算出する合焦点算出手段と、第２の撮像手段の撮像面の面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を備え、光路差生成部材は、第２の撮像手段の撮像面に、光路差が生じた第２の光像が入射する第１の入射領域と、光路差が生じない第２の光像が入射する第２の入射領域とが形成されるように第２の光路に配置され、合焦点算出手段は、第１の入射領域で取得された第２の画像、及び第２の入射領域で取得された第２の画像のいずれか一方を、解析に用いる第２の画像として選択することを特徴としている。
　この画像取得装置では、光路差生成部材の配置により、焦点制御用の第２の光路での光の分岐を行わずに第２の光像の光路長差を形成できる。したがって、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路への光量が抑えられ、第１の撮像手段で撮像を行う際の光量を確保できる。また、この画像取得装置では、光路差生成部材の配置により、第２の撮像手段の撮像面に、光路差が生じた第２の光像が入射する第１の入射領域と、光路差が生じない第２の光像が入射する第２の入射領域とが形成される。これにより、合焦点算出手段において、第１の入射領域に入射した第２の画像及び第２の入射領域に入射した第２の画像のいずれを解析に用いるかを選択することが可能となり、例えば試料の凹凸の程度等に応じて最適な合焦点情報の算出方式を選択できるので、合焦点情報を精度良く算出できる。
　また、光路差生成部材及び第２の撮像手段は、試料における第１の撮像手段での撮像位置からの光が第２の入射領域に入射するように第２の光路に配置されていることが好ましい。この場合、合焦点算出手段による合焦点算出の算出処理を簡単化できる。
　また、第１の撮像手段で取得された第１の画像を評価する画像評価手段を更に備え、合焦点算出手段は、画像評価手段による第１の画像の評価結果に基づいて、第１の入射領域で取得された第２の画像、及び第２の入射領域で取得された第２の画像のいずれか一方を選択することが好ましい。合焦点情報の算出方式によっては、例えば試料の凹凸の程度等に起因して合焦点情報の算出の精度が低下する場合が考えられる。こうした場合に、第１の画像の評価結果に基づいて、第１の入射領域で取得された第２の画像、及び第２の入射領域で取得された第２の画像のいずれを解析に用いるかを選択することで、合焦点情報の精度を担保できる。
　また、試料に対する対物レンズの視野位置を移動させる視野駆動手段を更に備え、光路差生成部材は、視野駆動手段による対物レンズの視野位置の移動に伴う第２の撮像手段の撮像面上での第２の光像の移動方向に沿って連続的に厚さが変化する第１の部分と、厚さが一定の第２の部分とを有し、第１の部分が撮像面に第１の入射領域を形成し、第２の部分が撮像面に第２の入射領域を形成することが好ましい。この場合、簡単な光路差生成部材の構成で、第２の撮像手段の撮像面に第１の入射領域及び第２の入射領域を形成できる。
　また、第２の撮像手段は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を有し、視野駆動手段による対物レンズの視野位置の移動と同期して各画素列のローリング読み出しを行うことによって第２の画像を取得することが好ましい。この場合、第２の光路に光路差生成部材が配置されていることにより、各画素列からの画像データには、試料の同一部位において対物レンズの焦点位置が変更されたときと等価のコントラスト情報が含まれる。したがって、当該コントラスト情報に基づいて合焦点情報を迅速かつ精度良く算出できる。
　また、合焦点算出手段は、第１の入射領域で取得された第２の画像を解析に用いる場合には、二次元撮像素子の各画素列のうち、少なくとも２つの画素列で読み出された画像データのコントラスト値の差分に基づいて、試料の合焦点情報を算出することが好ましい。
　また、合焦点算出手段は、第２の入射領域で取得された第２の画像を解析に用いる場合には、算出した合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成することが好ましい。この場合、フォーカスマップを精度良く作成することができる。
　また、本発明に係る画像取得装置のフォーカス方法は、試料が載置されるステージと、試料に向けて光を照射する光源と、ステージ上の試料と対峙するように配置された対物レンズ、及び試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて試料の合焦点情報を算出する合焦点算出手段と、第２の撮像手段の撮像面の面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を備えた画像取得装置のフォーカス方法であって、第２の撮像手段の撮像面に、光路差が生じた第２の光像が入射する第１の入射領域と、光路差が生じない第２の光像が入射する第２の入射領域とが形成されるように、光路差生成部材を第２の光路に配置し、第１の入射領域で取得された第２の画像、及び第２の入射領域で取得された前記第２の画像のいずれか一方を、解析に用いる第２の画像として合焦点算出手段に選択させることを特徴としている。
　この画像取得装置のフォーカス方法では、光路差生成部材の配置により、焦点制御用の第２の光路での光の分岐を行わずに第２の光像の光路長差を形成できる。したがって、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路への光量が抑えられ、第１の撮像手段で撮像を行う際の光量を確保できる。また、この画像取得装置のフォーカス方法では、光路差生成部材の配置により、第２の撮像手段の撮像面に、光路差が生じた第２の光像が入射する第１の入射領域と、光路差が生じない第２の光像が入射する第２の入射領域とを形成する。これにより、合焦点算出手段において、第１の入射領域に入射した第２の画像及び第２の入射領域に入射した第２の画像のいずれを解析に用いるかを選択することが可能となり、例えば試料の凹凸の程度等に応じて最適な合焦点情報の算出方式を選択できるので、合焦点情報を精度良く算出できる。
　本発明によれば、撮像の際の光量を確保でき、かつ試料の焦点位置を精度良く検出できる。
本発明に係る画像取得装置を構成するマクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。 本発明に係る画像取得装置を構成するミクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。 第２の撮像装置の一例を示す図である。 光路差生成部材及び第２の撮像装置の組み合わせの一例を示す図である。 画像取得装置の機能的な構成要素を示すブロック図である。 試料に対する対物レンズの視野のスキャンの一例を示す図である。 対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動と第２の撮像装置のローリング読み出しとの同期の様子を示す図であり、（ａ）は対物レンズの視野と分割領域との位置関係、（ｂ）各画素列に対する試料の所定部位と撮像素子の露光及び読み出しのタイミングを示す。 図７の後続の状態を示す図である。 図８の後続の状態を示す図である。 試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離に一致している場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。 試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離よりも長い場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。 試料の表面までの距離が対物レンズの焦点距離よりも短い場合のコントラスト値の解析結果を示す図である。 フォーカスマップの一例を示す図である。 対物レンズの視野と焦点情報取得位置との関係の一例を示す図である。 合焦点算出部で処理されるコントラスト情報の一例を示す図である。 対物レンズの視野と焦点情報取得位置との関係の他の例を示す図である。 図１及び図２に示した画像取得装置において、ダイナミックプレフォーカスを行う場合の動作を示すフローチャートである。 図１及び図２に示した画像取得装置において、フォーカスマップを作成する場合の動作を示すフローチャートである。 光路差生成部材の変形例を示す図である。 光路差生成部材の別の変形例を示す図である。
　以下、図面を参照しながら、本発明に係る画像取得装置及び画像取得装置のフォーカス方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
　図１は、本発明に係る画像取得装置を構成するマクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。また、図２は、本発明に係る画像取得装置を構成するミクロ画像取得装置の一実施形態を示す図である。図１及び図２に示すように、画像取得装置Ｍは、試料Ｓのマクロ画像を取得するマクロ画像取得装置Ｍ１と、試料Ｓのミクロ画像を取得するミクロ画像取得装置Ｍ２とによって構成されている。画像取得装置Ｍは、マクロ画像取得装置Ｍ１で取得したマクロ画像に対して例えばライン状の複数の分割領域４０（図６参照）を設定し、各分割領域４０をミクロ画像取得装置Ｍ２で高倍率に取得して合成することにより、デジタル画像であるバーチャルスライド画像を生成する装置である。
　マクロ画像取得装置Ｍ１は、図１に示すように、試料Ｓが載置されるステージ１を備えている。ステージ１は、例えばステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータなどのモータやアクチュエータによって水平方向に駆動するＸＹステージである。画像取得装置Ｍで観察する試料Ｓは、例えば細胞などの生体サンプルであり、スライドガラスに密封された状態でステージ１に載置される。このステージ１をＸＹ面内で駆動させることにより、試料Ｓに対する撮像位置を移動させることができる。
　ステージ１は、マクロ画像取得装置Ｍ１とミクロ画像取得装置Ｍ２との間を往復可能となっており、両装置間で試料Ｓを搬送する機能を有している。なお、マクロ画像取得においては、試料Ｓの全体画像を１度の撮像で取得してもよく、試料Ｓを複数の領域に分割して撮像してもよい。また、ステージ１は、マクロ画像取得装置Ｍ１及びミクロ画像取得装置Ｍ２の双方にそれぞれ設けておいてもよい。
　ステージ１の底面側には、試料Ｓに向けて光を照射する光源２と、光源２からの光を試料Ｓに集光する集光レンズ３とが配置されている。光源２は、試料Ｓに向けて斜めに光を照射するように配置されていてもよい。また、ステージ１の上面側には、試料Ｓからの光像を導光する導光光学系４と、試料Ｓの光像を撮像する撮像装置５とが配置されている。導光光学系４は、試料Ｓからの光像を撮像装置５の撮像面に結像させる結像レンズ６を有している。また、撮像装置５は、例えば２次元画像を取得可能なエリアセンサである。撮像装置５は、導光光学系４を経て撮像面に入射した試料Ｓの光像の全体画像を取得し、後述のバーチャルスライド画像格納部３９に格納する。
　ミクロ画像取得装置Ｍ２は、図２に示すように、ステージ１の底面側にマクロ画像取得装置Ｍ１と同様の光源１２及び集光レンズ１３を有している。また、ステージ１の上面側には、試料Ｓからの光像を導光する導光光学系１４が配置されている。光源１２からの光を試料Ｓに照射させる光学系には、試料Ｓに励起光を照射するための励起光照射光学系や試料Ｓの暗視野画像を取得するための暗視野照明光学系を採用してもよい。
　導光光学系４は、試料Ｓと対峙して配置された対物レンズ１５と、対物レンズ１５の後段に配置されたビームスプリッタ（光分岐手段）１６とを有している。対物レンズ１５には、対物レンズ１５の光軸方向に沿ったＺ方向に対物レンズ１５を駆動するステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータなどのモータやアクチュエータが設けられている。これらの駆動手段によって対物レンズ１５のＺ方向の位置を変えることにより、試料Ｓの画像取得における撮像の焦点位置が調整可能になっている。なお、焦点位置の調整は、ステージ１のＺ方向の位置を変えることで実施してもよく、対物レンズ１５及びステージ１の双方のＺ方向の位置を変えることによって実施してもよい。いずれの形態においても、対物レンズ１５とステージ１との間隔を調整できる。
　ビームスプリッタ１６は、試料Ｓの光像を画像取得用の第１の光路Ｌ１と焦点制御用の第２の光路Ｌ２とに分岐する部分である。このビームスプリッタ１６は、光源１２からの光軸に対しておよそ４５度の角度で配置されており、図２において、ビームスプリッタ１６を通過する光路が第１の光路Ｌ１となっており、ビームスプリッタ１６で反射する光路が第２の光路となっている。
　第１の光路Ｌ１には、ビームスプリッタ１６を通過した試料Ｓの光像（第１の光像）を結像させる結像レンズ１７と、結像レンズ１７の結像位置に撮像面を配置した第１の撮像装置（第１の撮像手段）１８とが配置されている。第１の撮像装置１８は、試料Ｓの第１の光像による１次元画像（第１の画像）を取得可能な装置であり、例えばＴＤＩ（Ｔｉｍｅ　Ｄｅｌａｙ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）駆動が可能な２次元ＣＣＤイメージセンサやラインセンサなどのラインスキャンイメージセンサが用いられる。また、ステージ１を一定の速度で制御しながら、試料Ｓの画像を順次取得する方式であれば、第１の撮像装置１８は、ＣＭＯＳセンサやＣＣＤセンサなどの２次元画像を取得可能な装置であってもよい。第１の撮像装置１８で撮像された第１の画像は、レーンバッファなどの一時保存メモリに順次保存された後、圧縮されて後述の画像生成部３８に出力される。
　一方、第２の光路Ｌ２には、ビームスプリッタ１６で反射した試料の光像（第２の光像）を縮小する視野調整レンズ１９と、第２の撮像装置（第２の撮像手段）２０とが配置されている。また、第２の撮像装置２０の前段には、第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材２１が配置されている。視野調整レンズ１９は、第２の光像が第１の光像と同程度の大きさで第２の撮像装置２０に結像するように構成されていることが好ましい。
　第２の撮像装置２０は、試料Ｓの第２の光像による２次元画像（第２の画像）を取得可能な装置である。第２の撮像装置２０は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を有している。このような二次元撮像素子としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサが挙げられる。第２の撮像装置２０の撮像面２０ａは、第２の光路Ｌ２に直交するＸＺ面と略一致するように配置されている。第２の撮像装置２０の撮像面２０ａには、図３（ａ）に示すように、読み出し方向に垂直な方向に複数の画素が配列されてなる画素列２０ｂが読み出し方向に複数配列されている。
　第２の撮像装置２０では、図３（ｂ）に示すように、駆動クロックの駆動周期に基づいて、リセット信号、読み出し開始信号、及び読み出し終了信号が出力されることで、画素列２０ｂ毎に露光及び読み出しが制御される。一の画素列２０ｂの露光期間は、リセット信号に伴う電荷の排出から読み出し開始信号に伴う電荷の読み出しまでの期間である。また、一の画素列２０ｂの読み出し期間は、読み出し開始信号に伴う電荷の読み出し開始から読み出し終了信号に伴う電荷の読み出し終了までの期間である。なお、次の画素列に対する読み出し開始信号を読み出し終了信号として用いることもできる。
　ローリング読み出しでは、画素列２０ｂ毎に出力する読み出し開始信号が所定の時間差で順次出力される。ローリング読み出しにおける読み出し速度は、各画素列２０ｂを読み出すための読み出し開始信号の時間間隔によって制御される。読み出し開始信号の時間間隔を短くすると読み出し速度は早くなり、読み出し開始信号の時間間隔を長くすると読み出し速度は遅くなる。隣接する画素列２０ｂ，２０ｂ間での読み出し間隔の調整は、例えば駆動クロックの周波数の調整、読み出し期間中の遅延期間の設定、読み出し開始信号を規定するクロック数の変更といった手法によって実施できる。
　光路差生成部材２１は、撮像面２０ａの面内方向に沿って第２の光像に光路差を生じさせるガラス部材である。図４（ａ）に示す例では、光路差生成部材２１は、断面直角三角形のプリズム状をなす第１の部材２２と、平板状の第２の部材２３とを組み合わせて構成されている。第１の部材２２は、撮像面２０ａの面内方向、すなわち、試料Ｓの走査に伴う撮像面２０ａ上での第２の光像の移動方向（Ｚ方向）に沿って連続的に厚さが増加するように、撮像面２０ａの一端側領域（上半分領域）に対応して配置されている。また、第２の部材２３、厚さが一定となっており、撮像面２０ａの他端側領域（下半分領域）に対応して配置されている。
　光路差生成部材２１及び第２の撮像装置２０は、試料Ｓにおける第１の撮像装置１８での撮像予定位置（これから撮像される位置）からの光が撮像面２０ａの一端側領域（上半分領域）に入射するように配置されている。また、光路差生成部材２１及び第２の撮像装置２０は、試料Ｓにおける第１の撮像装置１８での撮像位置からの光が撮像面２０ａの他端側領域（下半分領域）に入射するように配置されている。
　このような光路差生成部材２１の配置により、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａには、図４（ｂ）に示すように、光路差が生じた第２の光像が入射する第１の入射領域２４Ａと、光路差が生じない第２の光像が入射する第２の入射領域２４Ｂとが形成される。第１の入射領域２４Ａでは、撮像面２０ａに入射する第２の光像は、上端側から中央側に向かうほど光路が長くなる。第２の入射領域２４Ｂでは、撮像面２０ａに入射する第２の光像は、いずれの位置においても光路が同一となる。なお、第１の部材２２及び第２の部材２３は、第２の撮像装置２０と対向する面が第２の撮像装置の撮像面２０ａと平行となるように配置されることが好ましい。これにより、第２の撮像装置２０と対向する面による光の屈折を低減でき、第２の撮像装置２０で受光する光量を確保することができる。
　光路差生成部材２１において、第２の部材２３の厚みは、フォーカス中心に対応する画素列２０ｂの位置での第１の部材２２の厚みと等しくなっていることが好適である。これにより、第２の入射領域２４Ｂに入射する第２の光像の光路長が、第１の撮像装置１８に入射する第１の光像の光路長と等しくなるので、合焦点算出部３７での合焦点情報の算出処理を簡単化できる。
　図５は、画像取得装置の機能的な構成要素を示すブロック図である。同図に示すように、画像取得装置Ｍは、ＣＰＵ、メモリ、通信インタフェイス、ハードディスクといった格納部、キーボードなどの操作部３１、モニタ３２等を備えたコンピュータシステムを備えている。また、画像取得装置Ｍは、制御部３３の機能的な構成要素として、ステージ駆動部３４と、対物レンズ駆動部３５と、動作制御部３６と、合焦点算出部３７と、画像生成部３８と、バーチャルスライド画像格納部３９と、画像評価部４１と、とを備えている。
　ステージ駆動部３４は、試料Ｓに対する対物レンズ１５の視野位置を移動させる視野駆動手段として機能する部分である。ステージ駆動部３４は、例えばステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータといったモータやアクチュエータによって構成されている。ステージ駆動部３４は、動作制御部３６による制御に基づいて、ステージ１を対物レンズ１５の光軸の直交面に対して所定の角度（例えば９０度）を有する面についてＸＹ方向に移動させる。これにより、ステージ２に固定された試料Ｓが対物レンズ１５の光軸に対して移動し、試料Ｓに対する対物レンズ１５の視野位置が移動する。
　より具体的には、ステージ駆動部３４は、動作制御部３６による制御に基づき、試料Ｓが載置されたステージ１を所定の速度で走査させる。このステージ１の走査により、第１の撮像装置１８及び第２の撮像装置２０での試料Ｓの撮像視野が相対的に順次移動する。試料Ｓの全体を撮像するために、画像取得装置Ｍでは、動作制御部３６が複数の分割領域４０から構成される撮像ラインＬｎ（ｎは自然数）に沿ったスキャン方向に試料Ｓに対する対物レンズ１５の視野位置を移動させるように制御する。隣接する撮像ラインＬｎ間での試料Ｓに対する対物レンズ１５の視野位置の移動は、例えば図６に示すように、隣り合う撮像ラインＬｎ間でスキャン方向が同方向となる一方向スキャンが採用される。
　また、画像取得の間のステージ１の走査速度は一定であるが、実際には走査の開始直後にステージ１の振動等の影響によって走査速度が不安定な期間が存在する。このため、分割領域４０よりも長い走査幅を設定し、ステージ１が加速する加速期間、ステージ１の走査速度が安定化するまでの安定化期間、及びステージ１が減速する減速期間のそれぞれが、分割領域４０よりも外側を走査しているときに生じるようにすることが好ましい。これにより、ステージ１の走査速度が一定となる一定速度期間に合わせて画像取得を行うことが可能となる。なお、安定化期間中に撮像を開始し、画像取得後に安定化期間中に取得したデータ部分を削除するようにしてもよい。このような手法は、データの空読みが必要な撮像装置を用いる場合に好適である。
　対物レンズ駆動部３５は、ステージ駆動部３４と同様に、例えばステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータといったモータやアクチュエータによって構成されている。対物レンズ駆動部３５は、動作制御部３６による制御に基づいて、対物レンズ１５の光軸に沿ったＺ方向に対物レンズ１５を移動させる。これにより、試料Ｓに対する対物レンズ１５の焦点位置が移動する。
　なお、対物レンズ駆動部３５は、合焦点算出部３７による焦点位置の解析中は対物レンズ１５の駆動は行わず、また、次の焦点位置の解析が開始されるまで、対物レンズ１５をＺ方向に沿って一方向にのみ駆動させることが好ましい。この場合、試料Ｓの走査中は、焦点位置の解析期間と、解析結果に基づく対物レンズ駆動期間とが交互に生じることとなる。焦点位置の解析中に対物レンズ１５と試料Ｓとの位置関係を変化させないことで、焦点位置の解析精度を担保できる。
　動作制御部３６は、第２の撮像装置２０及びステージ駆動部３４の動作を制御する部分である。より具体的には、動作制御部３６は、試料Ｓにおける所定部位の光像が第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂで露光されるように、ステージ駆動部３４による対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位の移動と第２の撮像装置２０のローリング読み出しとを同期させる。
　動作制御部３６は、図７（ａ）に示すように、対物レンズ１５の視野Ｖが一の分割領域４０を移動する際、対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの移動が一定速度となるようにステージ駆動部３４を制御する。また、動作制御部３６は、図７（ｂ）に示すように、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける試料Ｓの光像の結像Ｓｂの移動方向と、撮像面２０ａの各画素列２０ｂの読み出し方向とが一致するようにステージ駆動部３４及び第２の撮像装置２０を制御する。なお、ローリング読出しの読出し速度を可変に設定できる撮像素子を用いる場合、動作制御部３６は、対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの移動速度に基づいて、ローリング読出しの読出し速度を変更してもよい。
　また、各画素列２０ｂにおける露光時間は、少なくとも試料Ｓの所定部位Ｓａのスキャン方向における幅及び対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動速度に基づいて設定される。より好ましくは、対物レンズ１５及び視野調整レンズ１９の倍率も考慮する。これにより、各画素列２０ｂにより、試料Ｓの所定部位Ｓａの光像を露光することができる。
　時間Ｔ１において、図７（ｂ）に示すように、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａにおける試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが撮像領域の第１列目の画素列２０ｂに到達すると、この第１列目の画素列２０ｂの露光が開始される。時間Ｔ２に移ると、図８（ａ）に示すように、対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの位置が移動する。このとき、図８（ｂ）に示すように、試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが撮像領域の第２列目の画素列２０ｂに到達し、第２列目の画素列２０ｂの露光が開始される。また、試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが第１列目の画素列２０ｂを通過するタイミングで、第１列目の画素列２０ｂの読み出しが開始される。
　さらに、時間Ｔ３に移ると、図９（ａ）に示すように、対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの位置がスキャン方向に更に移動する。このとき、図９（ｂ）に示すように、試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが撮像領域の第３列目の画素列２０ｂに到達し、第３列目の画素列２０ｂの露光が開始される。また、試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが第２列目の画素列２０ｂを通過するタイミングで、第２列目の画素列２０ｂの読み出しが開始される。さらに、第２列目の画素列２０ｂの読み出しと同時に第１列目の画素列２０ｂの読み出しが終了する。
　以下、所定の画素列数に到達するまで、同様の手順で対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と、画素列２０ｂでのローリング読み出しとが実施される。各画素列２０ｂから読み出される画像データは、いずれも試料Ｓの同一部位についての画像データとなる。また、第２の光路Ｌ２に光路差生成部材２１が配置されていることにより、各画素列２０ｂから読み出される画像データは、それぞれ試料Ｓの同一部位について対物レンズ１５の焦点位置が変更されたときと等価のコントラスト情報が含まれる。各画素列２０ｂで読み出された画像データは、合焦点算出部３７に順次出力される。
　対物レンズ駆動部３５が対物レンズ１５を含む導光光学系１４をＸＹ方向に移動させることが可能な場合、動作制御部３６は、試料Ｓにおける所定部位の光像が第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂで露光されるように、対物レンズ駆動部３５による対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位の移動と第２の撮像装置２０のローリング読み出しとを同期させてもよい。この場合、対物レンズ駆動部３５は、試料Ｓに対する対物レンズ１５の視野位置を移動させる視野駆動手段として機能する。
　合焦点算出部３７は、第２の撮像装置２０で取得された第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて試料Ｓの合焦点情報を算出する部分である。合焦点算出部３７は、画像評価部４１からの指示情報に基づき、撮像面２０ａにおける第１の入射領域２４Ａに属する画素列２０ｂから読み出された画像データ、及び第２の入射領域２４Ｂに属する画素列２０ｂから読み出された画像データのいずれか一方を、解析に用いる第２の画像として選択する。
　第１の入射領域２４Ａに属する画素列２０ｂから読み出された画像データを解析に用いる場合、画像取得装置Ｍでは、次に撮像される分割領域４０における試料Ｓの合焦点情報の取得を第１の撮像装置１８による撮像の直前に行うダイナミックプレフォーカスを実行する。この場合、合焦点算出部３７では、合焦点情報の算出方式として例えば前ピン・後ピン方式が用いられる。
　前ピン・後ピン方式を用いる場合、合焦点算出部３７は、第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂのうち、少なくとも２つの画素列２０ｂの画素列２０ｂを選択する。上述したように、第２の光路Ｌ２には、試料Ｓの走査に伴う撮像面２０ａ上での第２の光像の移動方向（Ｚ方向）に沿って連続的に厚さが増加するように光路差生成部材２１が配置されており、第２の撮像装置２０における撮像面２０ａの第１の入射領域２４Ａには、光路差が生じた第２の光像が入射する。したがって、第１の入射領域２４Ａでは、選択する２つの画素列２０ｂの位置に基づいて、第１の撮像装置１８に入射する第１の光像よりも前に焦点が合った光像（前ピン）と、後に焦点が合った光像（後ピン）とを取得できる。合焦点算出部３７は。選択された画素列２０ｂで読み出された画像データのコントラスト値同士の差分を求める。
　図１０に示すように、試料Ｓの表面に対して対物レンズ１５の焦点位置が合っている場合、前ピンの画像コントラスト値と後ピンの画像コントラスト値とが略一致し、これらの差分値はほぼゼロとなる。一方、図１１に示すように、試料Ｓの表面までの距離が対物レンズ１５の焦点距離よりも長い場合、前ピンの画像コントラスト値よりも後ピンの画像コントラスト値の方が大きくなり、これらの差分値はプラスとなる。この場合、合焦点算出部３７は、対物レンズ駆動部３５に対し、対物レンズ１５を試料Ｓに近づける向きに駆動する旨の指示情報を出力する。また、図１２に示すように、試料Ｓの表面までの距離が対物レンズ１５の焦点距離よりも短い場合、前ピンの画像コントラスト値よりも後ピンの画像コントラスト値の方が小さくなり、これらの差分値はマイナスとなる。この場合、合焦点算出部３７は、対物レンズ駆動部３５に対し、対物レンズ１５を試料Ｓに遠ざける向きに駆動する旨の指示情報を出力する。
　前ピン・後ピン方式を用いる場合、合焦点算出部３７では、フォーカス中心に対応する画素列２０ｂを挟んで対称となるように、前ピンに相当する画素列２０ｂと後ピンに相当する画素列２０ｂとを選択する。フォーカス中心に対応する画素列２０ｂとは、第１の撮像装置１８で撮像される試料Ｓの光像の光路長と一致する光路長で第２の光路Ｌ２及び光路差生成部材２１を通った試料Ｓの光像が入射する画素列２０ｂを指す。合焦点算出部３７は、例えばフォーカス中心に対応する画素列２０ｂが第ｋ列目の画素列２０ｂである場合、第（ｋ－ｍ）列目の画素列２０ｂと第（ｋ＋ｍ）列目の画素列２０ｂとをそれぞれ選択する。試料Ｓの凹凸の度合いに応じてｍを設定することで、合焦点情報の精度を向上できる。
　第２の入射領域２４Ｂに属する画素列２０ｂから読み出された画像データを解析に用いる場合、画像取得装置Ｍでは、試料Ｓの撮像を行う前に、試料Ｓの複数個所についての合焦点情報を予め取得し、フォーカスマップを作成する。この場合、画像取得装置Ｍでは、マクロ画像取得装置Ｍ１によって取得された試料Ｓのマクロ画像に基づき、試料Ｓの全体が含まれるように画像取得領域Ｐを設定する。画像取得領域の設定後、例えば図１３に示すように、等間隔で離間する複数の焦点情報取得位置Ｑを格子状に画像取得領域Ｐ内に設定する。画像取得領域Ｐの間隔は、試料Ｓの寸法等に応じて適宜設定される。画像取得領域Ｐの間隔は、等間隔でなくともよく、ランダムに設定してもよい。
　フォーカスマップの作成にあたって、合焦点算出部３７では、合焦点情報の算出方式として例えばコントラスト分布方式が用いられる。この場合、例えば図１４に示すように、焦点情報取得位置Ｑの近傍に対物レンズ１５の視野Ｖを設定する。次に、ステージ駆動部３４によってステージ１を駆動させ、対物レンズ１５の視野Ｖを焦点情報取得位置Ｑに向かって一定速度で移動させる。
　コントラスト分布方式を用いる場合、合焦点算出部３７は、第２の撮像装置２０の複数の画素列２０ｂからの画像データのコントラスト情報を取得する。図１５に示す例では、第２の撮像装置２０における第１列目の画素列２０ｂから第ｎ列目の画素列２０ｂまでの画像データのコントラスト値が示されており、第ｉ列目の画素列２０ｂにおける画像データのコントラスト値がピーク値となっている。この場合、合焦点算出部３７は、第ｉ列目の画素列２０ｂで試料Ｓの所定部位Ｓａの露光を行ったときの対物レンズ１５の焦点位置が合焦点位置であるとして合焦点情報を生成する。なお、コントラスト値は、各画素列２０ｂに含まれる画素のうちの特定の画素におけるコントラスト値を用いてもよく、各画素列２０ｂに含まれる画素の全体又は一部のコントラスト値の平均値を用いてもよい。
　フォーカスマップの作成にあたって、例えば図１６に示すように、焦点情報取得位置Ｑを含むように対物レンズ１５の視野Ｖを設定してもよい。この場合、ステージ駆動部３４によるステージ１の駆動は行わず、対物レンズ駆動部３５によって対物レンズ１５の焦点位置を焦点深度分だけ移動させながら、第２の撮像装置２０による第２の画像の取得を行う。この場合、合焦点算出部３７は、取得した各画像データのうち、最もコントラスト値が大きい画像データを取得したときの対物レンズ１５の焦点位置が合焦点位置であるとして合焦点情報を生成する。
　画像生成部３８は、取得した画像を合成してバーチャルスライド画像を生成する部分である。画像生成部３８は、第１の撮像装置１８から出力される第１の画像、すなわち、各分割領域４０の画像を順次受け取り、これらを合成して試料Ｓの全体の画像を合成する。そして、この合成画像に基づいてこれよりも低い解像度の画像を作成し、高解像度の画像と低解像度の画像とを関連付けてバーチャルスライド画像格納部３９に格納する。バーチャルスライド画像格納部３９では、マクロ画像取得装置Ｍ１で取得した画像も更に関連付けてもよい。バーチャルスライド画像は、１枚の画像として格納してもよく、複数に分割された画像として格納してもよい。
　画像評価部４１は、第１の撮像装置１８で取得された第１の画像を評価する部分である。画像評価部４１は、画像取得装置Ｍが第１の入射領域２４Ａで取得された第２の画像を用いて合焦点情報の算出を行っている場合に、当該合焦点情報に基づいて第１の撮像装置１８で取得された第１の画像のコントラスト値を取得する。画像評価部４１は、第１の画像のコントラスト値が所定の閾値以上である場合には、第１の入射領域２４Ａに属する画素列２０ｂから読み出された画像データを解析に用いるように指示する指示情報を合焦点算出部３７に出力する。また、画像評価部４１は、第１の画像のコントラスト値が所定の閾値未満である場合には、第２の入射領域２４Ｂに属する画素列２０ｂから読み出された画像データを解析に用いるように指示する指示情報を合焦点算出部３７に出力する。
　続いて、上述した画像取得装置Ｍにおけるフォーカシング動作について説明する。
　画像取得装置Ｍでは、通常、画像取得装置Ｍが第１の入射領域２４Ａで取得された第２の画像を用いて合焦点情報の算出が行われ、次に撮像される分割領域４０における試料Ｓの合焦点情報の取得を第１の撮像装置１８による撮像の直前に行うダイナミックプレフォーカスが実行される。この場合、図１７に示すように、ステージ駆動部３４によるステージ１の移動が開始すると、一の撮像ラインＬｎに沿って対物レンズ１５の視野Ｖが移動する（ステップＳ１１）。また、試料Ｓにおける所定部位Ｓａからの光像の結像Ｓｂが第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂで露光されるように、対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と第２の撮像装置２０のローリング読み出しとが同期する（ステップＳ１２）。
　そして、前ピン・後ピンに対応する画素列２０ｂで取得した画像データのコントラスト値に基づいて分割領域４０における合焦点情報を算出し（ステップＳ１３）、算出した合焦点情報に基づいて対物レンズ１５の焦点位置が調整され、分割領域４０の撮像が行われる（ステップＳ１４）。その後、所望の撮像ラインＬｎについて合焦点情報の算出の取得が完了したか否かが判断され（ステップＳ１５）、合焦点情報の算出の取得が完了していない場合には、次の撮像ラインＬｎに対物レンズ１５の視野Ｖが移動し（ステップＳ１６）、ステップＳ１１～Ｓ１５の処理が繰り返し実行される。
　また、画像取得装置Ｍでは、画像評価部４１によって、第１の撮像装置１８で撮像された第１の画像のコントラスト値が所定の閾値未満であると評価された場合には、第２の入射領域２４Ｂに属する画素列２０ｂから読み出された画像データを解析に用いるように処理の切り替えが行われ、試料Ｓの撮像を行う前に試料Ｓのフォーカスマップが作成される。この場合、図１８に示すように、ステージ駆動部３４によるステージ１の移動が開始すると、一の撮像ラインＬｎに沿って対物レンズ１５の視野Ｖが移動する（ステップＳ２１）。また、試料Ｓにおける所定部位Ｓａからの光像の結像Ｓｂが第２の撮像装置２０の各画素列２０ｂで露光されるように、対物レンズ１５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と第２の撮像装置２０のローリング読み出しとが同期する（ステップＳ２２）。そして、各画素列２０ｂで取得した画像データのコントラスト値のピークに基づいて焦点情報取得位置Ｑにおける合焦点情報が算出される（ステップＳ２３）。
　合焦点情報の算出がなされた後、所望の撮像ラインＬｎについて合焦点情報の算出の取得が完了したか否かが判断され（ステップＳ２４）、合焦点情報の算出の取得が完了していない場合には、次の撮像ラインＬｎに対物レンズ１５の視野Ｖが移動し（ステップＳ２５）、ステップＳ２１～Ｓ２４の処理が繰り返し実行される。合焦点情報の算出の取得が完了した場合には、各焦点情報取得位置Ｑにおける合焦点情報に基づき、フォーカスマップが作成される（ステップＳ２６）。
　以上説明したように、画像取得装置Ｍでは、光路差生成部材２１の配置により、焦点制御用の第２の光路Ｌ２での光の分岐を行わずに第２の光像の光路長差を形成できる。したがって、焦点位置の情報を得るために必要な第２の光路Ｌ２への光量が抑えられ、第１の撮像装置１８で撮像を行う際の光量を確保できる。また、画像取得装置Ｍでは、光路差生成部材２１の配置により、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａに、光路差が生じた第２の光像が入射する第１の入射領域２４Ａと、光路差が生じない第２の光像が入射する第２の入射領域２４Ｂとが形成される。これにより、合焦点算出部３７において、第１の入射領域２４Ａに入射した第２の画像及び第２の入射領域２４Ｂに入射した第２の画像のいずれを解析に用いるかを選択することが可能となり、例えば試料Ｓの凹凸の程度等に応じて最適な合焦点情報の算出方式を選択できるので、合焦点情報を精度良く算出できる。
　画像取得装置Ｍは、第１の撮像装置１８で取得された第１の画像を評価する画像評価部４１を更に備えている。合焦点算出部３７では、画像評価部４１による第１の画像のコントラスト値が所定の閾値以上である場合に、第１の入射領域２４Ａで取得された第２の画像の解析によってダイナミックプレフォーカスを実行し、画像評価部４１による第１の画像のコントラスト値が所定の閾値未満である場合に、第１の入射領域２４Ａで取得された第２の画像の解析によってフォーカスマップの作成を行う。第１の画像の評価結果に基づいて、第１の入射領域２４Ａで取得された第２の画像、及び第２の入射領域２４Ｂで取得された第２の画像のいずれを解析に用いるかを選択することで、合焦点情報の精度を担保できる。
　また、画像取得装置Ｍでは、試料Ｓに対する対物レンズ１５の視野位置を移動させるステージ駆動部３４を更に備え、光路差生成部材２１は、ステージ駆動部３４による対物レンズ１５の視野位置の移動に伴う第２の撮像装置２０の撮像面２０ａ上での第２の光像の移動方向に沿って連続的に厚さが変化する第１の部材２２と、厚さが一定の第２の部材２３とを有し、第１の部材２２が撮像面２０ａに第１の入射領域２４Ａを形成し、第２の部材２３が撮像面２０ａに第２の入射領域２４Ｂを形成している。これにより、簡単な光路差生成部材２１の構成で、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａに第１の入射領域２４Ａ及び第２の入射領域２４Ｂを形成できる。
　また、画像取得装置Ｍでは、第２の撮像装置２０が複数の画素列２０ｂを有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を有し、ステージ駆動部３４による対物レンズ１５の視野位置の移動と同期して各画素列２０ｂのローリング読み出しを行うことによって第２の画像を取得する。第２の光路Ｌ２に光路差生成部材２１が配置されていることにより、各画素列２０ｂからの画像データには、試料Ｓの同一部位において対物レンズ１５の焦点位置が変更されたときと等価のコントラスト情報が含まれる。したがって、当該コントラスト情報に基づいて合焦点情報を迅速かつ精度良く算出できる。フォーカスマップを作成する場合においても、対物レンズ１５の焦点位置を移動させる必要がないので、焦点情報取得位置Ｑでの合焦点情報の迅速な算出が可能となる。
　本発明は、上記実施形態に限られるものではない。例えば上記実施形態では、第２の光像の移動方向に沿って連続的に厚さが変化する第１の部材２２と、厚さが一定の第２の部材２３とを組み合わせて光路差生成部材２１を構成しているが、光路差生成部材は、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａに、光路差が生じた第２の光像が入射する第１の入射領域２４Ａと、光路差が生じない第２の光像が入射する第２の入射領域２４Ｂとが形成されるのであれば、他の態様であってもよい。例えば図１９（ａ）に示すように、第１の部材２２のみからなる光路差生成部材５１を用いてもよい。この場合においても、第２の撮像装置２０の撮像面２０ａには、図１９（ｂ）に示すように、第１の部材２２に対応して第１の入射領域２４Ａが形成され、光路差生成部材５１の配置されない部分に対応して第２の入射領域２４Ｂが形成される。
　また、上記実施形態では、試料Ｓの走査に伴う撮像面２０ａ上での第２の光像の移動方向（Ｚ方向）に沿って、撮像面２０ａの上半分領域に第１の入射領域２４Ａが形成され、下半分領域に第２の入射領域２４Ｂが形成されているが、撮像面２０ａにおける第１の入射領域２４Ａ及び第２の入射領域２４Ｂの形成位置はこれに限られない。例えば図２０（ａ）に示す光路差生成部材６１のように、断面直角三角形のプリズム状をなす第１の部材６２と、平板状の第２の部材６３とを画素列２０ｂの長手方向に組み合わせてもよい。この場合、図２０（ｂ）に示すように、第１の入射領域２４Ａが撮像面２０ａの左半分領域に形成され、第２の入射領域２４Ｂが撮像面２０ａの右半分領域に形成される。このような構成においても、上記実施形態と同様の作用効果が得られる。
　１…ステージ、１２…光源、１４…導光光学系、１５…対物レンズ、１６…ビームスプリッタ（光分岐手段）、１８…第１の撮像装置（第１の撮像手段）、２０…第２の撮像装置（第２の撮像手段）、２０ａ…撮像面、２０ｂ…画素列、２１，５１，６１…光路差生成部材、２２，６２…第１の部材（第１の部分）、２３，６３…第２の部材（第２の部分）、２４Ａ…第１の入射領域、２４Ｂ…第２の入射領域、３４…ステージ駆動部（視野駆動手段）、３６…動作制御部（動作制御手段）、３７…合焦点算出部（合焦点算出手段）、４０…画像評価部（画像評価手段）、Ｌ１…第１の光路、Ｌ２…第２の光路、Ｍ…画像取得装置、Ｍ１…マクロ画像取得装置、Ｍ２…ミクロ画像取得装置、Ｓ…試料、Ｓａ…所定部位、Ｖ…対物レンズの視野。

Claims (8)

  1. 　試料が載置されるステージと、
    　前記試料に向けて光を照射する光源と、
    　前記ステージ上の前記試料と対峙するように配置された対物レンズ、及び前記試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、
    　前記第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、
    　前記第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、
    　前記第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて前記試料の合焦点情報を算出する合焦点算出手段と、
    　前記第２の撮像手段の撮像面の面内方向に沿って前記第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を備え、
    　前記光路差生成部材は、前記第２の撮像手段の撮像面に、光路差が生じた前記第２の光像が入射する第１の入射領域と、光路差が生じない前記第２の光像が入射する第２の入射領域とが形成されるように前記第２の光路に配置され、
    　前記合焦点算出手段は、前記第１の入射領域で取得された前記第２の画像、及び前記第２の入射領域で取得された前記第２の画像のいずれか一方を、解析に用いる前記第２の画像として選択することを特徴とする画像取得装置。
  2. 　前記光路差生成部材及び前記第２の撮像手段は、前記試料における前記第１の撮像手段での撮像位置からの光が前記第２の入射領域に入射するように前記第２の光路に配置されていることを特徴とする請求項１記載の画像取得装置。
  3. 　前記第１の撮像手段で取得された前記第１の画像を評価する画像評価手段を更に備え、
    　前記合焦点算出手段は、前記画像評価手段による前記第１の画像の評価結果に基づいて、前記第１の入射領域で取得された前記第２の画像、及び前記第２の入射領域で取得された前記第２の画像のいずれか一方を選択することを特徴とする請求項１又は２記載の画像取得装置。
  4. 　前記試料に対する前記対物レンズの視野位置を移動させる視野駆動手段を更に備え、
    　前記光路差生成部材は、前記視野駆動手段による前記対物レンズの視野位置の移動に伴う前記第２の撮像手段の撮像面上での前記第２の光像の移動方向に沿って連続的に厚さが変化する第１の部分と、厚さが一定の第２の部分とを有し、
    　前記第１の部分が前記撮像面に前記第１の入射領域を形成し、前記第２の部分が前記撮像面に前記第２の入射領域を形成することを特徴とする請求項１～３のいずれか一項記載の画像取得装置。
  5. 　前記第２の撮像手段は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を有し、前記視野駆動手段による前記対物レンズの視野位置の移動と同期して各画素列のローリング読み出しを行うことによって前記第２の画像を取得する請求項４記載の画像取得装置。
  6. 　前記合焦点算出手段は、前記第１の入射領域で取得された前記第２の画像を解析に用いる場合には、前記二次元撮像素子の各画素列のうち、少なくとも２つの画素列で読み出された画像データのコントラスト値の差分に基づいて、前記試料の合焦点情報を算出することを特徴とする請求項５記載の画像取得装置。
  7. 　前記合焦点算出手段は、前記第２の入射領域で取得された前記第２の画像を解析に用いる場合には、算出した合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成することを特徴とする請求項５記載の画像取得装置。
  8. 　試料が載置されるステージと、
    　前記試料に向けて光を照射する光源と、
    　前記ステージ上の前記試料と対峙するように配置された対物レンズ、及び前記試料の光像を画像取得用の第１の光路及び焦点制御用の第２の光路に分岐する光分岐手段を含む導光光学系と、
    　前記第１の光路に分岐された第１の光像による第１の画像を取得する第１の撮像手段と、
    　前記第２の光路に分岐された第２の光像による第２の画像を取得する第２の撮像手段と、
    　前記第２の画像を解析し、その解析結果に基づいて前記試料の合焦点情報を算出する合焦点算出手段と、
    　前記第２の撮像手段の撮像面の面内方向に沿って前記第２の光像に光路差を生じさせる光路差生成部材と、を備えた画像取得装置のフォーカス方法であって、
    　前記第２の撮像手段の撮像面に、光路差が生じた前記第２の光像が入射する第１の入射領域と、光路差が生じない前記第２の光像が入射する第２の入射領域とが形成されるように、前記光路差生成部材を前記第２の光路に配置し、
    　前記第１の入射領域で取得された前記第２の画像、及び前記第２の入射領域で取得された前記第２の画像のいずれか一方を、解析に用いる前記第２の画像として前記合焦点算出手段に選択させることを特徴とする画像取得装置のフォーカス方法。
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