JP2014201565A - セレンテラジン類縁体 - Google Patents
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Abstract
Description
上記状況に下、各種ルシフェラーゼに対して公知のセレンテラジン類縁体と異なる発光特性を示すセレンテラジン類縁体などが求められていた。
[1] 下記一般式(1)
(式中、
R1は、水素;置換若しくは非置換のアリール;置換若しくは非置換のアリールアルキル;置換若しくは非置換のアリールアルケニル;脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキル;脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルケニル;脂肪族環式基;または複素環基である)。
[2] 一般式(1)において、
R1は、フェニル、p−ヒドロキシフェニル、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、p−ヒドロキシベンジル、フェニルエチル、フェニルビニル、シクロペンチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、メチル、エチル、プロピル、2−メチルプロピル、2−メチルプロペニル、アダマンチルメチルまたはチオフェン−2−イルである、上記[1]に記載の化合物。
[3] 一般式(1)において、R1はベンジル、α−ヒドロキシベンジルまたはp−ヒドロキシベンジルである、上記[2]に記載の化合物。
[4] 一般式(1)において、R1はベンジルである、上記[3]に記載の化合物。
[5] 下記一般式(1)
(式中、
R1は、水素;置換若しくは非置換のアリール;置換若しくは非置換のアリールアルキル;置換若しくは非置換のアリールアルケニル;脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキル;脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルケニル;脂肪族環式基;または複素環基である)
の製造方法であって、
下記一般式(2)
下記一般式(3)
[6] 一般式(1)において、
R1は、フェニル、p−ヒドロキシフェニル、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、p−ヒドロキシベンジル、フェニルエチル、フェニルビニル、シクロペンチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、メチル、エチル、プロピル、2−メチルプロピル、2−メチルプロペニル、アダマンチルメチルまたはチオフェン−2−イルである、上記[5]に記載の方法。
[7] 一般式(1)において、R1はベンジル、α−ヒドロキシベンジルまたはp−ヒドロキシベンジルである、上記[6]に記載の方法。
[8] 一般式(1)において、R1はベンジルである、上記[7]に記載の方法。
[9] (i) 上記[1]〜[4]のいずれか1項に記載の化合物;ならびに
(ii) ルシフェラーゼ、前記ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、および前記ポリヌクレオチドを含有する形質転換体から選択される少なくとも1つ;
を含む、キット。
[10] 前記ルシフェラーゼが、オプロフォーラス(Oplophorus sp.)ルシフェラーゼの19kDa蛋白質である、上記[9]に記載のキット。
[11] 前記ルシフェラーゼが、下記(a)〜(c)からなる群から選択される蛋白質:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜8個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質
である、上記[9]に記載のキット。
[12] 前記ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドが、以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるいずれかのポリヌクレオチド:
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜複数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
である、上記[9]に記載のキット。
[13] 上記[1]〜[4]のいずれか1項に記載の化合物とルシフェラーゼとを接触させることを含む、発光反応を行う方法。
[14] 前記ルシフェラーゼが、オプロフォーラス(Oplophorus sp.)ルシフェラーゼの19kDa蛋白質である、上記[13]に記載の方法。
[15] 前記ルシフェラーゼが、下記(a)〜(c)からなる群から選択される蛋白質:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜8個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質
である、上記[13]に記載の方法。
[16] ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、発光基質として、上記[1]〜[4]のいずれか1項に記載の化合物を用いることを含む、プロモーター制御に関与する配列の活性を測定する方法。
[17] 前記ルシフェラーゼが、オプロフォーラス(Oplophorus sp.)ルシフェラーゼの19kDa蛋白質である、上記[16]に記載の方法。
[18] 前記ルシフェラーゼが、下記(a)〜(c)からなる群から選択される蛋白質:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜8個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質
である、上記[16]に記載の方法。
[19] 前記ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドが、以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるいずれかのポリヌクレオチド:
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜複数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
である、上記[16]に記載の方法。
1.本発明のセレンテラジン類縁体
本発明は、次の下記一般式(1)で表わされる化合物(本明細書中において「本発明のセレンテラジン類縁体」という場合がある)を提供する。
R1は、水素;置換若しくは非置換のアリール;置換若しくは非置換のアリールアルキル;置換若しくは非置換のアリールアルケニル;脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキル;脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルケニル;脂肪族環式基;または複素環基である)
一般式(1)で表わされる化合物(「本発明のセレンテラジン類縁体」)は、次のようにして製造することができる。
また、本発明の一般式(1)で表わされる化合物の製造方法において、反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、0℃〜200℃で1時間〜96時間、室温〜150℃で3時間〜72時間、又は60℃〜120℃で6時間〜24時間である。
本発明の蛋白質は、天然オプロフォーラスルシフェラーゼの19kDa蛋白質の変異蛋白質であり、配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を含有する蛋白質である。
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜8個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質、および
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン;
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸;
C群:アスパラギン、グルタミン;
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸;
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン;
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン;
G群:フェニルアラニン、チロシン。
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜4個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質、および
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質。
精製のためのペプチド配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、例えば、ヒスチジン残基が4残基以上、好ましくは6残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、グルタチオン S−トランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインのアミノ酸配列、プロテインAのアミノ酸配列、およびアビジンタグ配列が挙げられる。
本発明は、前述した本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはDNAである。DNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、細胞・組織由来のcDNA、細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotalRNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(以下、RT−PCR法と略称する)によって増幅することもできる。
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜複数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜20個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜10個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して98%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、本発明のセレンテラジン類縁体と、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを接触させて、カルシウム結合型発光蛋白質を得ることにより、製造又は再生することができる。
発光による検出マーカーの発光基質としての利用
本発明のセレンテラジン類縁体は、発光による検出マーカーの発光基質として利用することができる。本発明のセレンテラジン類縁体は、検出マーカーの発光基質として、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。
用いるルシフェラーゼ等は、オプロフォーラスルシフェラーゼの19kDa蛋白質およびその変異蛋白質(例えば、本発明の蛋白質)であるのが好ましく、本発明の蛋白質であるのが特に好ましい。
ここで、オプロフォーラスルシフェラーゼのうち、Oplophorus gracilorostrisルシフェラーゼの19kDa蛋白質の塩基配列を配列番号:8に、アミノ酸配列を配列番号:9に示す。
本発明のセレンテラジン類縁体は、レポーター蛋白質の発光基質として、プロモーター制御に関与する配列の活性(転写活性)の測定に利用することもできる。ルシフェラーゼ等をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列(例えば、エンハンサー)に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、本発明のセレンテラジン類縁体と宿主細胞を接触させ、ルシフェリン等に由来する発光を検出することにより、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列の活性を測定することができる。ここで、「接触」とは、宿主細胞と本発明のセレンテラジン類縁体とを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例えば、宿主細胞の培養容器に本発明のセレンテラジン類縁体を添加すること、宿主細胞と本発明のセレンテラジン類縁体とを混合すること、宿主細胞を本発明のセレンテラジン類縁体の存在下で培養することなどが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、上述のようにして、レポーター遺伝子として好ましく利用することができる。
本発明のセレンテラジン類縁体は、アミューズメント用品の材料の発光基材としてルシフェラーゼ等を用いたときの発光基質として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、発光シャボン玉、発光アイス、発光飴、発光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
用いるルシフェラーゼ等は、オプロフォーラスルシフェラーゼの19kDa蛋白質およびその変異蛋白質(例えば、本発明の蛋白質)であるのが好ましく、本発明の蛋白質であるのが特に好ましい。
本発明のセレンテラジン類縁体は、ルシフェラーゼ等の発光基質として、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定等の分析方法に利用することができる。
BRET法による生理機能の解析は、公知の方法で行うことができ、例えば、Biochem. J. 2005, 385, 625−637、またはExpert Opin. Ther Tarets, 2007 11: 541−556に記載の方法に準じて行うことができる。また、酵素活性の測定も、公知の方法で行うことができ、例えば、Nature Methods 2006, 3:165−174、またはBiotechnol. J. 2008, 3:311−324に記載の方法に準じて行うことができる。
用いるルシフェラーゼ等は、オプロフォーラスルシフェラーゼの19kDa蛋白質およびその変異蛋白質(例えば、本発明の蛋白質)であるのが好ましく、本発明の蛋白質であるのが特に好ましい。
本発明は、(i)本発明のセレンテラジン類縁体、ならびに(ii)ルシフェラーゼ等、前記ルシフェラーゼ等をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、および前記ポリヌクレオチドを含有する形質転換体から選択される少なくとも1つを含むキットも提供する。本発明の好ましい態様は、(i)本発明のセレンテラジン類縁体、ならびに(ii)ルシフェラーゼ、前記ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、および前記ポリヌクレオチドを含有する形質転換体から選択される少なくとも1つを含むキットも提供する。
発光反応
本発明のセレンテラジン類縁体を基質とする発光反応は、本発明のセレンテラジン類縁体とルシフェラーゼとを接触させることにより行うことができる。ここで、「接触」とは、本発明のセレンテラジン類縁体とルシフェラーゼとを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、ルシフェラーゼを収容した容器に本発明のセレンテラジン類縁体を添加すること、本発明のセレンテラジン類縁体を収容した容器にルシフェラーゼを添加すること、本発明のセレンテラジン類縁体とルシフェラーゼとを混合することが含まれる。反応条件としては、オプロフォーラスルシフェラーゼを用いた発光反応に通常用いられる条件またはそれに準じた条件で行うことができる。
反応温度は、通常約4℃〜約40℃、好ましくは約4℃〜約25℃である。
反応溶液のpHは、通常約5〜約10、好ましくは約6〜約9、より好ましくは約7〜約8、特に好ましくは約7.5である。
用いるルシフェラーゼは、オプロフォーラスルシフェラーゼの19kDa蛋白質およびその変異蛋白質(例えば、本発明の蛋白質)であるのが好ましく、本発明の蛋白質であるのが特に好ましい。
本発明のセレンテラジン類縁体は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホオキシド等の極性溶媒や、メタノール、エタノール、ブタノール等のアルコールの溶液として反応系に加えてもよい。
本発明の蛋白質の、ルシフェリンを基質とする発光活性は、ハロゲン化物イオン、非イオン性界面活性剤などにより活性化される。
ハロゲン化物イオンとしては、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなどがあげられ、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンが好ましい。
非イオン性界面活性剤の濃度は、通常約0.0002%(w/v)〜約0.2%(w/v)、好ましくは約0.001%(w/v)〜約0.1%(w/v)、特に好ましくは約0.05%(w/v)〜約0.02%(w/v)である。
TLC Rf= 0.24(n−ヘキサン/酢酸エチル=20/1);
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.25 (t, 6H, J = 7.0 Hz), 3.55 (dq, 2H, J = 7.5, 9.5 Hz), 3.68 (dq, 2H, J = 7.5, 9.5 Hz), 3.86 (s, 2H), 4.62 (s, 1H), 6.97−7.02 (m, 2H), 7.15−7.19 (m, 2H)。
TLC Rf= 0.35(酢酸エチル);
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ4.29 (s, 2H), 4.58 (s, 2H), 7.05−7.09 (m, 2H), 7.24−7.28 (m, 1H), 7.31−7.34 (m, 4H), 7.42 (d, 2H, J = 7.0 Hz), 7.49−7.56 (m, 3H), 7.93 (br d, 2H, J = 7.0 Hz), 8.54 (s, 1H)。
天然型オプロフォーラスルシフェラーゼの触媒19kDaドメイン(「KAZ」と略することもある)より変異導入して創出されたプロメガ社の変異オプロフォーラスルシフェラーゼの触媒19kDaドメイン(「nanoLuc」と略することもある)のアミノ酸配列(配列番号:1)をもとに、コドン最適化オプロフォーラスルシフェラーゼの触媒変異19kDaドメイン(「nanoKAZ」と略することもある)の遺伝子設計を行った。具体的には、nanoLucのアミノ酸配列(配列番号:1)を変えることなく、ヒトにおける高頻度使用のアミノ酸コドンのみを使用し、nanoKAZの塩基配列の設計を行った(配列番号:2)。最適化設計したコドン最適化nanoKAZドメイン遺伝子を、常法により化学合成法により合成した。
コドン最適化nanoKAZドメイン蛋白質発現ベクターの構築は以下の通りである。
先ず、動物培養細胞での新規発現ベクターpcDNA3−GLspを構築した(図1)。具体的には、pcDNA3−GLucベクター(プロルミ社製)よりガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列をプライマーGLsp−1R/EcoRI (配列番号:3:5' ggc GAA TTC GGT GGG CTT GGC CTC GGC CAC 3'、アンダーラインEcoRI 配列)とT7プライマー(配列番号:4:5' TAATACG ACTCACTATAGGG 3')を用いPCR法により取得し、それをHindIII/EcoRIで消化後、得られた断片を、pcDNA3ベクター(インビトロジェン社製)の制限酵素部位であるHindIII/EcoRI部位に挿入することにより、新規発現ベクターpcDNA3−GLspを構築した。すなわち、新規発現ベクターは、CMVのプロモーターに制御され、その下流にコザック配列、ガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列、マルチクローニングサイト配列を有する。
(1)発現プラスミドの精製
実施例3にて得られたpcDNA3−GLsp−nanoKAZプラスミドを用いて以下の実験を行った。pcDNA3−GLsp−nanoKAZ プラスミドは大腸菌JM83より、プラスミド精製キット(QIAGEN社製)を用いて精製し、1μg/μLの濃度になるよう滅菌水に溶解した。
チャイニーズハムスター卵巣由来の細胞株CHO−KI株を、10%(v/v)牛胎児血清(バイオウエスト社製)を含むHam’s F−12培地(和光純薬社製)にて培養し、10%(v/v)牛胎児血清(バイオウエスト社製)を含むDMEM(和光純薬社製)で培養した。それぞれの細胞を1 x 105細胞/ウエル/2 mL培地にて6 ウエルプレートに播種し(n = 2)、インキュベーター中37 ℃、5 % CO2にて培養した。24時間後、精製pcDNA3−GLsp−nanoKAZプラスミドをFuGene HD(プロメガ社製)トランスフェクションキットを用いて、CHO細胞にトランスフェクションし、次の実験に用いた。具体的には、100μL の培地に、pcDNA3−GLsp−nanoKAZ発現ベクター1μgと、FuGene HD 3μLを加え、室温で15分間放置した。100μLのDNA−FuGene 複合体溶液を、6ウエルの細胞に添加した。48時間培養後、培養液を回収して、測定用分泌nanoKAZ酵素溶液とした。
実施例4(2)で得られた測定用酵素溶液5μLを、1μg の各種セレンテラジン類縁体を含む100μLの50mM Tris−HCl (pH 7.6)−10 mM EDTA(和光純薬)に加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)で、60秒間で測定し、最大発光強度(Imax)と60秒間の積算値を相対発光強度(rlu)で表記した。
基質特異性実験に使用したセレンテラジン類縁体は、実施例1記載のもの以外のセレンテラジン類縁体は、それぞれ論文記載の方法で合成した。具体的には、bis−セレンテラジン はNakamura et al. (1997) Tetrahedron Lett. 38:6405−6406, フリマジン(Furimazine:(論文記載化合物番号3939))およびC6d-セレンテラジン(論文記載化合物番号3840)は、Hall et al. (2012) ACS Chem. Biol. 16; 848−1857, C2−セレンテラジン類縁体は、Inouye et al (2010) Anal. Biochem. 407: 247−252に記載の方法で合成した。実施例4(2)記載の方法でnanoKAZを分泌させた培養液をセレンテラジンまたはその類縁体の酵素液として用いて、発光活性を測定した。その結果、nanoKAZによる基質特異性は表1に示す通りであった。セレンテラジン類縁体の中で、相対最大発光強度でセレンテラジンより5倍以上高い化合物は、h−、bis−、f−、C6d−f−セレンテラジンおよびフリマジンあり、1分間の相対積算発光量で5倍以上のものはh−、f−、C6d−f−セレンテラジンである。一方、それらの発光パターンを、図3に示す。図3に示されている通り、発光パターンが急激に減衰しないものは、bis−セレンテラジン、フリマジンおよびC6d−f−セレンテラジンである。その結果、発光強度および積算発光量でフリマジンより発光強度が著しく改善され、且つ発光が減衰せずに連続的発光する組合せが可能である発光基質はbis−セレンテラジンおよびC6d−f−セレンテラジンである。
各種発光酵素類の調製法および発光活性測定法は、既報を方法に従って行なった。オプロフォーラスルシフェアーゼ触媒19KDaドメインの調製法は、Inouye S. & Sasaki S. (2007) Protein Express. Purif. 56, 261−268に記載の方法、ガウシアルシフェラーゼは、Inouye S & Sahara Y. (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun. 368, 600−605に記載の方法、レニラルシフェラーゼおよびレニラルシフェラーゼ547は、Inouye S. et al. (2013) Protein Express. Purif. 88, 150−156に記載の方法、エクオリンは、Inouye S et al. (2010) Anal. Biochem. 407, 247−252に記載の方法で、それぞれ調製し使用した。測定結果を表2に示した。特に新規C6d−f−セレンテラジンは、オプロフォーラスルシフェラーゼ触媒19kDaドメインの良い基質となることが明らかとなった。
セレンテラジ類縁体の水溶液での安定性の評価は、10 μg のセレンテラジン類縁体を0.5 mLの30 mM Tris−HCl (pH7.6)緩衝液に溶解し、37 ℃で、22時間放置し、セレンテラジン類縁体の分解をHPLC分析により確認した。具体的なHPLC分析法は、Inouye S. et al. (2013) Protein Express. Purif. 88, 150−156記載の方法に準じた。
その結果を表3にまとめた。セレンテラジンおよびフリマジンは、非常に不安定で22時間後に未分解で残った量がそれぞれ2%及び3%であったのに対して、bis−セレンテラジンとC6d−f−セレンテラジンはそれぞれ38%と49%でった。すなわち、C6d−f−セレンテラジンが最も安定なセレンテラジン類縁体であり、天然型セレンテラジンに比べ、安定性が著しく改善された。
[配列番号:2]nanoKAZをコードするポリヌクレオチドの塩基配列である。
[配列番号:3]実施例3で用いたプライマーの塩基配列である。
[配列番号:4]実施例3で用いたプライマーの塩基配列である。
[配列番号:5]GLsp-nanoKAZをコードするポリヌクレオチドの塩基配列である。
[配列番号:6]GLsp-nanoKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:7]GLsp-nanoKAZの分泌後のアミノ酸配列である。
[配列番号:8]Oplophorus gracilorostrisルシフェラーゼの発光触媒機能を有する19 kDa蛋白質をコードする塩基配列である。
[配列番号:9]Oplophorus gracilorostrisルシフェラーゼの発光触媒機能を有する19 kDa蛋白質のアミノ酸配列である。
Claims (19)
- 一般式(1)において、
R1は、フェニル、p−ヒドロキシフェニル、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、p−ヒドロキシベンジル、フェニルエチル、フェニルビニル、シクロペンチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、メチル、エチル、プロピル、2−メチルプロピル、2−メチルプロペニル、アダマンチルメチルまたはチオフェン−2−イルである、請求項1に記載の化合物。 - 一般式(1)において、R1はベンジル、α−ヒドロキシベンジルまたはp−ヒドロキシベンジルである、請求項2に記載の化合物。
- 一般式(1)において、R1はベンジルである、請求項3に記載の化合物。
- 下記一般式(1)
(式中、
R1は、水素;置換若しくは非置換のアリール;置換若しくは非置換のアリールアルキル;置換若しくは非置換のアリールアルケニル;脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキル;脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルケニル;脂肪族環式基;または複素環基である)
の製造方法であって、
下記一般式(2)
下記一般式(3)
- 一般式(1)において、
R1は、フェニル、p−ヒドロキシフェニル、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、p−ヒドロキシベンジル、フェニルエチル、フェニルビニル、シクロペンチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、メチル、エチル、プロピル、2−メチルプロピル、2−メチルプロペニル、アダマンチルメチルまたはチオフェン−2−イルである、請求項5に記載の方法。 - 一般式(1)において、R1はベンジル、α−ヒドロキシベンジルまたはp−ヒドロキシベンジルである、請求項6に記載の方法。
- 一般式(1)において、R1はベンジルである、請求項7に記載の方法。
- (i) 請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物;ならびに
(ii) ルシフェラーゼ、前記ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、および前記ポリヌクレオチドを含有する形質転換体から選択される少なくとも1つ;
を含む、キット。 - 前記ルシフェラーゼが、オプロフォーラスルシフェラーゼの19kDa蛋白質である、請求項9に記載のキット。
- 前記ルシフェラーゼが、下記(a)〜(c)からなる群から選択される蛋白質:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜8個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質
である、請求項9に記載のキット。 - 前記ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドが、以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるいずれかのポリヌクレオチド:
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜複数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
である、請求項9に記載のキット。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物とルシフェラーゼとを接触させることを含む、発光反応を行う方法。
- 前記ルシフェラーゼが、オプロフォーラスルシフェラーゼの19kDa蛋白質である、請求項13に記載の方法。
- 前記ルシフェラーゼが、下記(a)〜(c)からなる群から選択される蛋白質:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜8個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質
である、請求項13に記載の方法。 - ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、発光基質として、請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物を用いることを含む、プロモーター制御に関与する配列の活性を測定する方法。
- 前記ルシフェラーゼが、オプロフォーラスルシフェラーゼの19kDa蛋白質である、請求項16に記載の方法。
- 前記ルシフェラーゼが、下記(a)〜(c)からなる群から選択される蛋白質:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有する蛋白質、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列において1〜8個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質、
(c)配列番号:1のアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質
である、請求項16に記載の方法。 - 前記ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドが、以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるいずれかのポリヌクレオチド:
(a)配列番号:2の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2の塩基配列において1〜複数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2の塩基配列に対して90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
(d)配列番号:2の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ルシフェリンを基質とする発光触媒活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
である、請求項16に記載の方法。
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