JP2014195456A - 原核および真核生物に関する核酸プローブに基づく診断アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
小さい安定多コピー数RNA転写物(tmRNA)をコードするssrA遺伝子は、すべての細菌に見られ、そして最近、葉緑体および珪藻類で同定されてきている。tmRNAは、tRNAおよびmRNA分子両方としての二重の機能を有し、そして、停止コドンが欠失した一部切除(truncated)mRNAを救出し、プロテアーゼ分解前に一部切除ペプチドのトランス翻訳(trans−translation)を促進するのに関与する(Keiler, K.C.ら(1996), Science, 271, 990−993)。tmRNAの特有の機能のため、研究者は、これらの分子の二次構造とその機能の関係を解析してきた。これらの研究は、異なる微生物由来のtmRNA二次構造の保存、並びにこうした構造的保存の進化的有意性および機能的関連性に焦点を置いてきた。Matveeva, Oら(1998), Vol.16, No.13, 1374−1375により、RNA含有二次構造のモデルとしてtmRNAを用い、RNA分子に結合するオリゴヌクレオチドを調べる研究が行われた。該研究は、tmRNAにおける部位の同定を目的とせず、療法目的のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計を目的とした。
のrRNAプローブ/標的に基づく、いくつかの成功した商業的細菌診断キットが、販売されている。これらには、Gen−Probe Inc.、カリフォルニア州サンディエゴが販売する、16S rRNA遺伝子に基づく商業的プローブキット、およびInnogenetics N.V.、ベルギー・ヘントが販売する、16S/23Sスペーサー領域に基づくDNAプローブの範囲が含まれる。しかし、これらの診断キットの多くには制限があり、多くの場合において、低コピー数標的配列のための感受性の欠如および密接に関連する生物間の配列同一性のための特異性の欠如が含まれる。
本発明は、原核または真核生物に関する核酸プローブアッセイにおける標的領域としてのssrA遺伝子またはその断片の使用を提供する。
原核および真核生物の種を検出し、そして同定する標的領域として、ssrA遺伝子の領域を用いる、付随する利点を有する、他のいかなる核酸プローブアッセイも報告されてきていない。
本発明の別の態様において、DNA分子の3’端由来の高相同性領域に対応するssrA遺伝子分子の断片を、普遍的標的領域として用いてもよい。
本明細書において、以後記載されるように、異なる生物由来のssrA遺伝子配列のヌクレオチド配列並列は、これらの分子の5’および3’領域が、高い度合いの相同性を示し、そしてしたがって、普遍的標的領域として有用であることを示す。ssrA遺伝子はまた、いかなる他の細菌高コピー数RNAより、密接に関連した生物間の、より有意な度合いのヌクレオチド配列多様性も示す。これらの可変領域は、種間を区別する核酸アッ
セイの、理想的な標的である。
本発明の本側面のさらなる態様にしたがい、低相同性領域に対応するtmRNA分子の断片を、種間を区別する核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いてもよい。
本発明にしたがった核酸プローブ(DNAまたはRNA)は、典型的には、ssrA遺伝子および/またはtmRNA転写物あるいはその相補的配列の少なくとも10ヌクレオチドからなり、そして原核または真核生物に関する核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイで用いられる。その相補的配列へのプローブハイブリダイゼーションは、典型的には、放射性または非放射性(例えば、比色または蛍光)標識で核酸プローブを標識することにより、明らかにされる。
ssrA遺伝子またはtmRNA配列いずれかの5’および3’領域に向けられる普遍的オリゴヌクレオチドプライマーを用い、本発明にしたがい、非常に多様な細菌からssrA遺伝子またはそのコードtmRNAを増幅し、同時に広い範囲の生物の増幅を促進する一方、また、特異的な核酸プローブハイブリダイゼーションおよび検出を可能にしてもよい。
さらに好ましくは、tmRNA分子のcDNA転写物は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして用いられる。
本明細書に定義されるような標的領域は、生存および死亡原核または真核生物間を区別するためのアッセイの基礎として用いてもよい。
ssrA遺伝子プローブまたはtmRNA転写物プローブを、本発明にしたがい、原核または真核生物の広規模ハイスループット検出および同定のためのマイクロアレイ遺伝子
チップ系に関連させてもよい。
こうした問題の試料には、呼吸管、泌尿生殖管または胃腸管由来の組織の試料、あるいは血液および血液分画、痰または脳脊髄液などの体液試料のような生物学的試料を含んでもよい。
本発明にしたがい、ssrA遺伝子またはtmRNA転写物の断片はまた、原核または真核生物のDNAプロフィールを得て、そしてそれにより、同種の株間を区別するアッセイにおいて用いてもよい。
別の態様において、標的領域を用い、胃腸管における健康促進生物の生存度およびレベルをモニターする。
試料において生物を検出するプローブハイブリダイゼーションおよび/またはin vitro増幅を用いる際、シグナル強度に基づき、存在する生物の数を決定することが可能である。in vitro増幅のリアルタイム法もまた、試料中の生物の定量を可能にするのに用いてもよい。したがって、試料中の生物の数を定量化する能力は、治療目的の
ため、例えば、抗生物質または他の治療のため、あるいは治療有効性をモニターするため、臨床状況において、重要である可能性がある。
本発明は、ssrA遺伝子およびtmRNA配列の5’および3’相同領域、並びに可変領域のための多様なプローブを提供し、該プローブは、これらの配列またはそれに相補的な配列に由来する。代表的な配列は以下のとおりである:
アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)ssrA
9528)ssrA、内部部分的
7973)ssrA、内部部分的
hydrocarbonoclasticus)ssrA、内部部分的
ssrA
ssrA、内部部分的
10143)ssrA、内部部分的
上述の配列を用い、細菌種を同定するのに用いることが可能な、または核酸診断アッセイの生成のためのssrA遺伝子配列のデータベースを形成してもよい。
サルモネラ属:
1)属特異的プローブ:
5’−CGAATCAGGCTAGTCTGGTAG−3’ 配列番号218
マイコバクテリア:
2)結核複合体検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ
TB01 5’−ACTCCTCGGACA(A/G)CCACAGCGA−3’ 配列番号219
3)鳥型結核菌およびパラ結核菌配列検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ
プローブ1: PAV1−5’−GTTGCAAATAGATAAGCGCC−3’ 配列番号220
プローブ2: PAV2−5’−TCCGTCAGCCCGGGAACGCC−3’ 配列番号221
リステリア属:
4)細胞の熱殺処理後のtmRNA完全性(integrity)決定に用いられるオリゴヌクレオチドプローブ:
LVtm: 5’−TTTTGTTTTTCTTTGCCA−3’ 配列番号222
大腸菌:
5)細胞の熱殺処理後のtmRNA完全性決定に用いられるオリゴヌクレオチドプローブ:
Evtm: 5’−AGTTTTCGTCGTTTGCGA−3’ 配列番号223
本発明にしたがって同定されるさらなる代表的なプライマーは以下のとおりである:
マイコバクテリア:
1)すべてのマイコバクテリア配列増幅のための縮重オリゴヌクレオチドプライマー
5’プライマー
10SAAM3−5’−CAGGCAA(G/C)(A/T/C)GACCACCGTAA−3’ 配列番号224
3’プライマー
10SAAM4−5’GGATCTCC(C/T)G(A/G)TC(A/T)C(A/G)CG(A/G)AC(A/T)A−3’ 配列番号225
2)鳥型結核菌およびパラ結核菌増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー
5’プライマー: AP1for−5’−TGCCGGTGCAGGCAACTG−3’
配列番号226
3’プライマー: AP2rev−5’−CACGCGAACAAGCCAGGA−3’
配列番号227
本発明は、以下の実施例により、さらに例示されるであろう。
入手可能tmRNA配列の一次ヌクレオチド配列の検査
Clustal W核酸並列プログラムを用いた入手可能tmRNA配列の比較一次ヌクレオチド配列並列により、表1に示されるように、原核生物由来のtmRNAが、他の細菌高コピー数RNAより、より有意な度合いのヌクレオチド配列多様性および非相同性を示すことが立証された。
異なる細菌由来のRNA分子間のヌクレオチド配列相同性パーセント
コレラ菌tmRNA特異的プローブの開発
図1に示されるような、大腸菌(配列番号37)およびコレラ菌(配列番号127)ssrA配列のヌクレオチド配列並列は、これらの2つの細菌種が、系統発生的に密接に関連していることを示す。しかし、アステリスクマークの非存在により明示されるように、配列間に非相同性領域がある。図1に下線で示した、コレラ菌ssrAヌクレオチド配列の可変領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを合成した。
5’−AACGAATGGCTAACCTGAA−3’ 配列番号169
である。
レーン1:総大腸菌RNA対数中期
レーン2:総コレラ菌RNA対数中期
レーン3:総大腸菌RNA定常期
レーン4:総コレラ菌RNA定常期
その後、生じたノーザンブロットを、γP32で末端標識したコレラ菌tmRNA特異的プローブとハイブリダイズさせた。図3に示されるハイブリダイゼーション実験結果は、コレラ菌tmRNAのみが検出されたため、プローブの特異性を立証する。さらに、増殖の定常期中の培養から単離されたコレラ菌tmRNAで、より高い度合いのハイブリダイゼーションシグナル強度が観察され、この期間中、より高いコピー数のtmRNA分子がコレラ菌細胞に存在することが示された。
未知のssrA遺伝子およびtmRNA配列の性質決定のための普遍的ssrA/tmRNAオリゴヌクレオチド増幅プライマーの生成
すべての入手可能なssrA遺伝子およびtmRNA配列のClustal W並列により、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、多様な生物に関し、ssrA遺伝子およびtmRNAヌクレオチド配列を増幅することが可能であることが示された。
合成縮重オリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである:
(a)tmU5’: 5’ in vitro PCR増幅プライマー
5’−GGG(A/C)(C/T)TACGG(A/T)TTCGAC−3’ 配列番号170
(b)tmU3’: 3’ in vitro PCR増幅プライマー
5’−GGGA(A/G)TCGAACC(A/G)(C/G)GTCC−3’
配列番号171
縮重塩基位は、括弧内である。
レーンA:分子量マーカーV
レーン1:大腸菌
レーン2:サルモネラ・プーナ(Salmonella poona)
レーン3:クレブシエラ・エロゲネス
レーン4:プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)
レーン5:プロテウス・レットゲリ(Proteus rettgeri)
レーン6:エロモナス・ヒドロフィリア(Aeromonas hydrophilia)
レーン7:黄色ブドウ球菌
レーン8:エンテロコッカス・フェカリス
レーン9:乳酸杆菌
レーン10:枯草菌
レーン11:リステリア菌
レーン12:リステリア・イノキュア
レーン13:リステリア・ムライ
レーン14:リステリア・ウェルシメリ
レーン15:リステリア・グライ
レーン16:ウシ型結核菌
レーンB:分子量マーカーV
表2に示されるように、普遍的プライマーは、グラム陽性およびグラム陰性細菌両方から、ssrA遺伝子を増幅した。
普遍的増幅プライマーで試験した細菌種
以前未知であった細菌ssrA/tmRNAヌクレオチド配列の単離および性質決定
実施例2由来の、細菌のリステリア種およびウシ型結核菌細菌由来のゲノムDNAから増幅したPCR産物を、DNA配列決定の目的のためのT−テール化プラスミドベクターにサブクローニングした。各種に関し、3つの組換えクローンを選択し、そしてジデオキシ配列決定法により、配列決定した。各サブクローンに関し、両DNA鎖の配列を決定した。
リステリア種に関し得られた新規ssrA遺伝子配列(配列番号51、53、55、59および61)のclustal W並列を図5に示す。本解析により、リステリア細菌に関し、属特異的プローブおよびオリゴヌクレオチド増幅プライマーを生成することが可能であることが示された。さらに、該並列により、他のリステリア種からリステリア菌を区別するであろう、種特異的オリゴヌクレオチドプローブを生成することが可能であることもまた、示された。
リステリア細菌種に関するssrA遺伝子/tmRNA属特異的増幅プライマー、属特
異的および種特異的プローブの生成および適用
実施例4のリステリア属ssA遺伝子/tmRNAヌクレオチド配列並列を用い、ssrA遺伝子/tmRNAヌクレオチド配列の領域を解析し、属特異的増幅プライマー、並びに属特異的および種特異的オリゴヌクレオチドプローブの生成の適切性を決定した。本解析中、これらの増幅プライマーおよびプローブの設計において、枯草菌に対し、最大配列相違を示す領域を選択した。
(a)Ltml: 5’リステリア属特異的増幅プライマー
5’−AAAGCCAATAATAACTGG−3’ 配列番号172
(b)Ltm2: 3’リステリア属特異的増幅プライマー
5’−CCAGAAATATCGGCACTT−3’ 配列番号173
(c)LGtm:リステリア属特異的ハイブリダイゼーションプローブ
5’−GTGAGACCCTTACCGTAG−3’ 配列番号174
(d)LStm:リステリア菌種特異的ハイブリダイゼーションプローブ
5’−TCTATTTAACCCCAGACG−3’ 配列番号175
属特異的増幅プライマーLtm1およびLtm2を、各場合で、テンプレートとして20の異なる株由来の総ゲノムDNAを用いた、一連のPCR反応で用いた。これらのプライマーを用い、リステリア種由来のssrA遺伝子配列のみが増幅され(260塩基対産物)(図7および表3)、ssrA遺伝子/tmRNAが、細菌属の特異的in vitro増幅に適した標的であることが立証された。試験したいかなる他の細菌種に関しても、増幅産物は観察されなかったが、実施例2に記載される普遍的プライマー(tmU5’およびtmU3’)を用いると、これらの細菌種由来のDNAからPCR産物が得られた。
レーンA:分子量マーカーV
レーン1:大腸菌
レーン2:S.プーナ
レーン3:K.エロゲネス
レーン4:P.ミラビリス
レーン5:P.レットゲリ
レーン6:A.ヒドロフィリア
レーン7:黄色ブドウ球菌
レーン8:E.フェカリス
レーン9:乳酸杆菌
レーン10:枯草菌
レーン11:リステリア菌株1
レーン12:リステリア菌株2
レーン13:リステリア菌株3
レーン14:リステリア菌株4
レーン15:リステリア菌、臨床的単離体
レーン16:L.イノキュア
レーン17:L.ムライ
レーン18:L.ウェルシメリ
レーン19:L.グライ
レーン20:ウシ型結核菌
レーンB:分子量マーカーV
表3
リステリア特異的増幅プライマーで試験した細菌種
ブロットにハイブリダイズさせた。陽性ハイブリダイゼーションシグナルは、図8および表4に示されるように、リステリア種のみで観察され、特定の属を検出する際の標的としてのtmRNA配列の有用性が立証された。
レーンA:分子量マーカーV
レーン1:大腸菌
レーン2:サルモネラ・プーナ
レーン3:クレブシエラ・エロゲネス
レーン4:プロテウス・ミラビリス
レーン5:プロテウス・レットゲリ
レーン6:エロモナス・ヒドロフィリア
レーン7:黄色ブドウ球菌
レーン8:エンテロコッカス・フェカリス
レーン9:乳酸杆菌
レーン10:枯草菌
レーン11:リステリア菌
レーン12:リステリア・イノキュア
レーン13:リステリア・ムライ
レーン14:リステリア・ウェルシメリ
レーン15:リステリア・グライ
レーン16:ウシ型結核菌
レーンB:分子量マーカーV
本実施例に記載され、そして図7に示される、属特異的増幅を用いて生成されたPCR産物をサザンブロッティングし、そしてリステリア菌種特異的オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせた。図9および表4に示されるように、リステリア菌の4つの型決定株のうち3つおよび臨床単離体で、陽性ハイブリダイゼーションシグナルが観察された。
レーンA:分子量マーカーV
レーン1:大腸菌
レーン2:S.プーナ
レーン3:K.エロゲネス
レーン4:P.ミラビリス
レーン5:P.レットゲリ
レーン6:A.ヒドロフィリア
レーン7:黄色ブドウ球菌
レーン8:E.フェカリス
レーン9:乳酸杆菌
レーン10:枯草菌
レーン11:リステリア菌株1
レーン12:リステリア菌株2
レーン13:リステリア菌株3
レーン14:リステリア菌株4
レーン15:リステリア菌、臨床的単離体
レーン16:L.イノキュア
レーン17:L.ムライ
レーン18:L.ウェルシメリ
レーン19:L.グライ
レーン20:ウシ型結核菌
レーンB:分子量マーカーV
表4
リステリア属特異的プローブおよびリステリア菌種特異的プローブの特異性
リステリアssrA遺伝子配列の多比色プローブ検出
LGTm(A)、LStm(B)およびカンピロバクター・ウプサリエンシス(Campylobacter upsaliensis)16S−23S rRNAスペーサー(C−5’CATTAAACTTTAGCAAGGAAGTG
3’)配列番号228オリゴヌクレオチドプローブを、ナイロン膜片に不可逆的に結合させ、そして属特異的プライマーLtm1およびLtm2(Ltm1は5’端でビオチン標識した)を用いた、リステリア菌(1−6)、L.イノキュア(7−10)、L.イバノビ(11)、L.ムライ(12)、L.シーリゲリ(13)、L.ウェルシメリ(14)およびL.グライ(15)由来の増幅ssrA PCR産物と、ハイブリダイズさせた。tmU5’およびtmU3’(tmU5’は5’端でビオチン標識した)を用いた、グラム陽性細菌、枯草菌、乳酸杆菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、E.フェカリス、C.ペルフリンジンズ(C. perfringins)(16−21)およびグラム陰性細菌、大腸菌、腸炎菌、P.レットゲリ、K.エロゲネス(22−25)由来のssr
A増幅PCR産物もまた、ナイロン膜片にハイブリダイズさせた。図10に示されるように、ハイブリダイゼーション後、ビオチンに対する比色アッセイの現像により、以下が明らかになった:片1−6は、リステリア菌に由来するssrA増幅PCR産物と合わせ、増幅PCR産物が属リステリア由来のものであることの確認を示し−AおよびBは色検出を提供し;片7−15は、これらのPCR産物が属リステリアに由来することを示し−Aのみが色検出を提供し;そして片16−25は、PCR産物が属リステリア由来でないことを示す−色検出はない。Cは陰性オリゴヌクレオチドコントロールプローブであり、そしてDはすべての試料に関する陽性コントロール比色検出アッセイである。
生物の種間を区別するssrA/tmRNA配列の使用
図11(配列番号19および21)、12(配列番号41および43)、13(配列番号77および79)、14(配列番号83および85)、15および16(配列番号53、55および57)に示されるようなClustal W並列は、同一細菌の異なる株のssrA/tmRNA配列内にヌクレオチド相違があることを示す。これは、ssrA/tmRNA配列を用い、細菌種内の個々の株および/または株群間を区別することが潜在的に可能であることを示唆する。これは、疫学および細菌集団解析に有用な適用を有する可能性がある。
細菌細胞の中程度のおよび極端な熱処理後のtmRNA完全性解析
大腸菌およびリステリア菌培養を、一晩培養後、大腸菌の場合、80℃で20分間、そしてリステリア菌の場合、40分間、そして両方の菌を120℃で15分間(オートクレーブ)熱処理し、そして生存度に関し、熱処理の0時間、1時間、2時間、6時間、12時間、24時間および48時間後に試験した。試験した各時点で、いかなる生存度も観察されなかった。これらの時点で、また、総RNAを単離し、そして変性1.2% アガロースゲル上で電気泳動し、そしてノーザンブロッティングした。各ブロットを、大腸菌の場合(図17および18)、放射能標識オリゴヌクレオチドプローブEvtmで、そしてリステリア菌の場合(図19および20)、放射標識LVtmにハイブリダイズさせた。試験した各試料で、いかなるtmRNA転写物も検出されず、tmRNA転写物が熱処理後、分解されたことが立証された。表記+veに相当するレーンは、陽性コントロール総RNA試料である。
生存および非生存細菌間を区別する際のtmRNA転写物の使用
リステリア菌の100 ml培養を、液体培養中で一晩増殖させた。増殖後、細胞の連続希釈を行い、そして栄養寒天プレート上にスプレッドプレーティングすることにより、生存度を決定した。同時に、これらの細胞の1 mlアリコットから総RNAを単離した。細胞の残りを、65℃で20分間加熱した。その後、生存度解析および総RNA単離のため、細胞を除去した。生存度およびRNA単離のための試料は、処理後、0時間、2時間、6時間および24時間後の時点で採取した。
レーンA:分子量マーカーV;
レーン1:RNAのPCR増幅(細胞の熱処理なし)、−逆転写酵素(RT)、+Taqポリメラーゼ(TP);
レーン2:RNAのRT−PCR(細胞の熱処理なし)、+RT、+TP;
レーン3:RNAのPCR増幅(熱処理後0時間)、−RT、+TP;
レーン4:RNAのRT−PCR(熱処理後0時間)、+RT、+TP;
レーン5:RNAのPCR増幅(熱処理後1時間)、−RT、+TP;
レーン6:RNAのRT−PCR(熱処理後1時間)、+RT、+TP;
レーン7:RNAのPCR増幅(熱処理後2時間)、−RT、+TP;
レーン8:RNAのRT−PCR(熱処理後2時間)、+RT、+TP;
レーン9:RNAのPCR増幅(熱処理後6時間)、−RT、+TP;
レーン10:RNAのRT−PCR(熱処理後6時間)、+RT、+TP;
レーン11:RNAのPCR増幅(熱処理後24時間)、−RT、+TP;
レーン12:RNAのRT−PCR(熱処理後24時間)、+RT、+TP;
レーンB:分子量マーカーV。
Claims (25)
- 原核または真核生物をin vitroで検出及び同定するための核酸プローブアッセイにおける標的領域としてのssrA遺伝子または少なくとも10ヌクレオチドから成るその断片の使用であって、標的領域は配列番号1〜227の配列またはそれらの断片から成る群より選択することができる、前記使用。
- 標的配列が、配列番号13〜16、19〜222、35、36、49〜52、65〜70、73〜74、81〜86、157〜162、184〜185、200〜203、216〜217、49、50、51、52、53、54、141、142、143、144、145、146、147、148、55〜62、149、150、151、152、37、38、101、102、115、116、またはそれらの断片から成る群より選択することができる、請求項1記載の使用。
- DNA分子の5’端由来の高相同性領域に対応するssrA遺伝子分子の断片が、普遍的標的領域として用いられる、請求項1記載の使用。
- DNA分子の3’端由来の高相同性領域に対応するssrA遺伝子分子の断片が、普遍的標的領域として用いられる、請求項1記載の使用。
- 低相同性領域に対応するssrA遺伝子分子の断片が、種間を区別する核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いられる、請求項1記載の使用。
- 低相同性領域に対応するssrA遺伝子分子の断片が、属特異的プローブの生成のための標的領域として用いられる、請求項1記載の使用。
- 原核または真核生物をin vitroで検出及び同定するための核酸プローブアッセイにおける標的領域としての、ssrA遺伝子のRNA転写物であるtmRNAまたは少なくとも10ヌクレオチドから成るその断片の使用であって、標的領域は配列番号1〜227の配列またはそれらの断片から成る群より選択することができる、前記使用。
- 標的配列が、配列番号13〜16、19〜222、35、36、49〜52、65〜70、73〜74、81〜86、157〜162、184〜185、200〜203、216〜217、49、50、51、52、53、54、141、142、143、144、145、146、147、148、55〜62、149、150、151、152、37、38、101、102、115、116、またはそれらの断片から成る群より選択することができる、請求項7記載の使用。
- tmRNA分子の5’端由来の高相同性領域に対応するtmRNA分子の断片が、普遍的標的領域として用いられる、請求項7記載の使用。
- tmRNA分子の3’端由来の高相同性領域に対応するtmRNA分子の断片が、普遍的標的領域として用いられる、請求項7記載の使用。
- 低相同性領域に対応するtmRNA分子の断片が、種間を区別する核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いられる、請求項7記載の使用。
- 低相同性領域に対応するtmRNA分子の断片が、属特異的プローブの生成のための標的領域として用いられる、請求項7記載の使用。
- 前記ssrA遺伝子断片または前記tmRNA断片が、増幅法において用いようとするプライマーの基礎として用いられる、請求項1〜12のいずれか1項記載の使用。
- 増幅法の産物が、核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いられる、請求項13記載の使用。
- tmRNA分子のcDNA転写物が、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして用いられる、請求項7〜14のいずれか1項記載の使用。
- 標的領域が、生存および死亡原核または真核生物間を区別するためのアッセイの基礎として用いられる、請求項1〜15のいずれか1項記載の使用。
- 標的領域が、原核または真核生物の広規模検出および/または同定のための多プローブ形式で用いられる、請求項1〜16のいずれか1項記載の使用。
- ssrA遺伝子プローブまたはtmRNA転写物プローブを、原核または真核生物の広規模ハイスループット検出および同定のためのマイクロアレイ遺伝子チップ系に関連させる、請求項17記載の使用。
- 標的領域が、問題の試料中の原核または真核生物を検出するアッセイにおけるプローブとして用いられる、請求項1〜18のいずれか1項記載の使用。
- ssrA遺伝子またはtmRNA転写物が、原核または真核生物のDNAプロフィールを得て、そしてそれにより、同種の株間を区別するアッセイにおいて用いられる、請求項1〜15のいずれか1項記載の使用。
- ssrA遺伝子、tmRNA転写物またはそれに相補的なDNA配列、あるいはそれら断片が、感染性原核または真核生物に対する治療剤を設計するのに用いられる、請求項1〜15のいずれか1項記載の使用。
- 標的領域が、感染性病原体に対する薬剤療法の有効性をモニターするのに用いられる、請求項1〜15のいずれか1項記載の使用。
- 標的領域が、胃腸管における健康促進生物の生存度およびレベルをモニターするのに用いられる、請求項1〜15のいずれか1項記載の使用。
- アッセイが、原核または真核生物の定量化のために用いられる、請求項1〜15のいずれか1項記載の使用。
- ssrA遺伝子配列のデータベースが、原核または真核生物を同定するのに用いられる、請求項1〜6および13〜15のいずれか1項記載の使用。
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Citations (3)
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---|---|---|---|---|
JPH03130099A (ja) * | 1989-04-20 | 1991-06-03 | Thomas G Barry | 標的ヌクレオチド配列に対する特異的プローブの生成 |
JPH04258299A (ja) * | 1990-10-09 | 1992-09-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | 試料液中の細菌の属特異的および種特異的検出方法 |
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---|---|---|---|---|
US5550040A (en) * | 1993-06-23 | 1996-08-27 | Hoffman-La Roche Inc. | Method, reagents and kits for the detection of Neisseria gonorrhoeae |
CA2265895A1 (en) * | 1996-09-05 | 1998-03-12 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secre Tary, Department Of Health And Human Services | Nucleic acid assay for the detection and differentiation of three chlamydia species |
US5849497A (en) * | 1997-04-03 | 1998-12-15 | The Research Foundation Of State University Of New York | Specific inhibition of the polymerase chain reaction using a non-extendable oligonucleotide blocker |
WO1998048008A1 (en) * | 1997-04-23 | 1998-10-29 | Plueckthun Andreas | Methods for identifying nucleic acid molecules encoding (poly)peptides that interact with target molecules |
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