ES2380577T3 - Ensayos de diagnóstico a base de sondas de ácido nucleico para organismos procariotas y eucariotas - Google Patents

Ensayos de diagnóstico a base de sondas de ácido nucleico para organismos procariotas y eucariotas Download PDF

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Abstract

Uso del gen ssrA o un fragmento del mismo que consiste al menos en nucleótidos como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para la detección e identificación de Chlamydia trachomatis in vitro, en el que la secuencia del gen ssrA está seleccionada del grupo que consta de SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 21.

Description

Ensayos de diagnóstico a base de sondas de ácido nucleico para organismos procariotas y eucariotas
Campo técnico
La presente invención se refiere a la identificación de secuencias diana para su uso en ensayos de ácido nucleico para la detección e identificación de organismos procariotas y/o eucariotas.
Antecedentes en la técnica
El gen ssrA, que codifica un transcrito de ARN (ARNtm) pequeño, estable de alto número de copias, se encuentra en todas las bacterias y recientemente se ha identificado en cloroplastos y diatomeas. Tiene una doble función como una molécula de ARNt y de ARNm y está implicado en el rescate de los ARNm truncados que han perdido codones de terminación, facilitando la trans-traducción de péptidos truncados antes de la degradación de proteasa (Keiler,
K.C. y col. (1996), Science, 271, 990-993). La exclusiva función de los ARNtm ha llevado a los investigadores a analizar la relación de la estructura secundaria de estas moléculas con su función. Estos estudios se han centrado en la conservación de la estructura secundaria de los ARNtm de diferentes microorganismos y en el significado evolutivo y la relevancia funcional de dicha conservación estructural. Se han llevado a cabo estudios por Matveeva, O y col (1998), vol. 16, Nº. 13, 1374-1375 para investigar la unión de los oligonucleótidos a las moléculas de ARN usando ARNtm como un modelo de ARN que contiene la estructura secundaria. Los estudios no tenían como objetivo la identificación de los sitios del ARNtm con el objetivo de diseñar oligonucleótidos antisentido con fines terapéuticos.
El número de dianas/sondas de ácidos nucleicos para diagnósticos bacterianos está actualmente limitado. Como tal, la necesidad de identificar y caracterizar nuevas dianas de ADN y ARN con fines de diagnóstico ahora se ve como una prioridad. Secuencias diana de ácido nucleico para el desarrollo de sondas pueden ser por ejemplo, plásmidos, genes de ARN ribosomal, regiones intergénicas, genes que codifican los factores de virulencia o fragmentos de ADN genómicos aleatorios. Además, se han descrito varias moléculas de ARN que se usan como dianas para la detección basada en ARN por ejemplo, ARN ribosomal y RNasa P.
La base de cualquier ensayo de sondas basado en ácido nucleico es el requisito para secuencias bien caracterizadas de ácido nucleico que están presentes en todos los procariotas y eucariotas en estudio. Para la detección fiable de un organismo procariota o eucariota, las sondas de ácido nucleico usadas deben ser altamente específicas (es decir, no reaccionar en cruzado con ácidos nucleicos de otros organismos) y altamente sensibles (es decir, la mayoría o todas las cepas del organismo a detectar deben reaccionar con la sonda). Por lo tanto, las secuencias diana preferentes estarían presentes en todas las cepas del organismo de que se trate. Estas secuencias tendrían variabilidad significativa de secuencia para permitir la diferenciación de la especie de que se trate de otra especie estrechamente relacionada pero, por otra parte, tendría suficiente conservación de secuencia para permitir la detección de todas las cepas de la especie en cuestión. En general, la identificación exacta de una secuencia de ácido nucleico, que podría constituir la base de un ensayo de sonda específico de ácido nucleico, es tediosa, difícil e incierta. Hasta la fecha existen escasas estrategias generales que facilitarían el desarrollo de sondas de ácido nucleico para una amplia diversidad de microorganismos. Las secuencias de ácido nucleico que se han identificado como dianas potencialmente útiles para el desarrollo de sondas son, por ejemplo, los genes de ARNr yARN y la región intergénica 16S/23S del ARNr
La mayoría de los ensayos de sonda/diana de ácido nucleico se centran en el elevado número de copias de los ARN ribosomales (ARNr) y regiones espaciadoras 16S 23S del ARNr (patente europea Nº: 0 395 292) de la célula bacteriana con fines de detección e identificación. Se han comercializado varios kits de diagnóstico bacteriano de éxito comercial basándose en estas sondas/dianas de ARNr para la detección de una diversidad demicroorganismos. Estos incluyen una amplia variedad de kits de sonda comerciales basados en el gen 16S del ARNr comercializados por Genprobe Inc. San Diego California y en sondas de ADN basadas en la región espaciadora 16S/23S comercializados por Innogenetics N.V. Gante, Bélgica. Sin embargo, muchos de estos kits de diagnóstico tienen limitaciones, incluyendo la falta de sensibilidad debido al reducido número de copias de las secuencias diana ya la falta de especificidad debido a la identidad de secuencia entre organismos estrechamente relacionados en muchos casos.
Los procedimientos basados en ácido nucleico que podrían aplicarse directamente a muestras para dar unaindicación de la viabilidad de cualquier microbio presente en ellas serían de enorme trascendencia para aplicaciones en la alimentación, industriales, ambientales y médicas.
Una desventaja de los procedimientos basados en el ADN, es que no diferencian entre organismos vivos y muertos. Algunos estudios se han centrado sobre el uso del ARNr y ARNm como indicadores de viabilidad celular (Sheridan,
G.E.C. y col (1998) Applied and Environmental Microbiology, 64, 1313-1318) Sin embargo, estas secuencias no son dianas satisfactorias ya que el ARNr y el ARNm pueden estar presentes en las células bacterianas hasta 48 horas después de la muerte de las células. Los documentos EP 0915170 y WO 9810101 describen ensayos para la detección de chlamydia usando un plásmido críptico y una región de 165 ARN.
Con la llegada del formato de tipo micromatriz basado en ácido nucleico, que incorpora el control simultáneo de múltiples dianas de ácido nucleico, actualmente existe una clara necesidad para identificar y caracterizar nuevas secuencias de ácido nucleico para su uso como regiones de sondas y/o dianas para detectar e identificar células procariotas y eucariotas viables.
Divulgación de la invención
La invención está limitada únicamente por las reivindicaciones
La invención proporciona el uso del gen ssrA o un fragmento del mismo como una región diana en un ensayo de sonda de ácido nucleico para un organismo procariota o eucariota.
Por lo tanto, la invención tiene aplicación en relación con todos los organismos distintos a virus.
No se ha descrito ningún otro ensayo de sonda de ácido nucleico que use regiones del gen ssrA como una región diana para detectar e identificar especies de procariotas y eucariotas con las consiguientes ventajas.
De acuerdo con una realización de la invención, como una región diana universal puede usarse un fragmento de la molécula del gen de ssrA correspondiente a una región de alta homología desde el extremo 5' de la molécula de ADN.
En una realización alternativa de la invención, un fragmento de la molécula de gen de ssrA correspondiente a una región de alta homología desde el extremo 3' de la molécula de ADN puede usarse como una región diana universal.
En una realización adicional de la invención, un fragmento de la molécula de gen de ssrA correspondiente a una región de baja homología puede usarse como una región diana en un ensayo de sonda de ácido nucleico para diferenciar entre especies.
En otra realización más de la invención, un fragmento de la molécula del gen ssrA correspondiente a una región de baja homología puede usarse como una región diana para la generación de una sonda específica de género.
Como se describe en lo sucesivo en el presente documento las alineaciones de las secuencias de nucleótidos de las secuencias del gen ssrA de diferentes organismos muestran que las regiones 5 ' y 3 ' de estas moléculas demuestran un alto grado de homología y por lo tanto, son útiles como regiones diana universales. Los genes ssrA también demuestran un grado más significativo de variabilidad de secuencia de nucleótidos entre organismos estrechamente relacionados que cualquier otro ARN bacteriano de número de copias elevado. Estas regiones variables son dianas ideales en ensayos de ácido nucleico para diferenciar entre especies.
La invención también proporciona el uso del ARNtm, un transcrito del ARN del gen ssrA, o un fragmento del mismo como una región diana en un ensayo de sonda de ácido nucleico para un organismo procariota o eucariota.
De acuerdo con una realización de este aspecto de la invención, como una región diana universal puede usarse un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de alta homología desde el extremo 5' de la molécula de ARNtm.
De manera alternativa, como una región diana universal puede usarse un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de alta homología desde el extremo 3 ' de la molécula de ARNtm.
De acuerdo con una realización adicional de este aspecto de la invención, como una región diana puede usarse unfragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de baja homología en un ensayo de sonda de ácido nucleico para diferenciar entre especies.
De acuerdo con otra realización más de la invención, como una región diana puede usarse un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de baja homología para la generación de una sonda específica de género.
La sonda de ácido nucleico (ADN o ARN) de acuerdo con la invención típicamente que consiste en al menos por 10 nucleótidos del transcrito del gen ssrA y/o ARNtm o su secuencia complementaria y se usa en un ensayo de hibridación de sonda de ácido nucleico para un organismo procariota o eucariota. La hibridación de la sonda con su secuencia complementaria se revela típicamente marcando la sonda de ácido nucleico con un marcador radiactivo o no radiactivo (p. ej. colorimétrico o fluorimétrico).
En realizaciones preferidas dicho fragmento del gen ssrA o dicho fragmento del ARNtm puede usarse como base de un cebador a usar en un procedimiento de amplificación.
De acuerdo con la invención, pueden usarse cebadores oligonucleotídicos universales dirigidos a las regiones 5 ' y 3 ' del gen de ssrA o a la secuencia de ARNtm para amplificar el gen ssrA o su ARNtm codificante a partir de una amplia diversidad de bacterias, facilitando la amplificación de un amplia variedad de organismos simultáneamente, al mismo tiempo que también permite la hibridación y la detección específica de la sonda de ácido nucleico.
Preferentemente, el producto del procedimiento de amplificación se usa como una región diana en un ensayo de sonda de ácido nucleico.
Además, preferentemente, como una sonda en un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos se usa un transcrito de ADNc o una molécula de ARNtm.
Estos ensayos pueden llevarse a cabo in situ o in vitro.
La región diana tal como se define en el presente documento puede utilizarse como base de un ensayo para diferenciar entre organismos procariotas o eucariotas, vivos y muertos.
A diferencia del ARNr y del ARNm, que pueden estar presentes en las células bacterianas después de la muerte de las células, el ARNtm se degrada rápidamente en organismos muertos. Por lo tanto, el ARNtm puede ser una diana útil para diferenciar entre organismos procariotas o eucariotas, vivos y muertos, directamente por hibridación de sonda del ácido nucleico con ARN bacteriano aislado, o combinando la amplificación del ARN y la hibridación de sonda del ácido nucleico con el producto amplificado.
Preferiblemente, la región diana se usa en un formato de sonda múltiple para la detección a amplia escala y/o la identificación de organismos procariotas o eucariotas.
Una sonda del gen ssrA o una sonda del transcrito de ARNtm de acuerdo con la invención pueden unirse a un sistema de chip génico de micromatriz para la detección de alto rendimiento a gran escala y la identificación de organismos procariotas o eucariotas.
También puede usarse una región diana de acuerdo con la invención como una sonda en un ensayo para detectar organismos procariotas o eucariotas en una muestra de materia.
Dicha muestra de materia puede incluir muestras biológicas tales como muestras de tejido de las vías respiratorias, del tracto uro-genital o del tracto gastrointestinal, o fluidos corporales tales como sangre y fracciones de sangre, esputo o líquido cefalorraquídeo.
De acuerdo con la invención, también puede realizarse un ensayo en muestras de alimentos, muestras ambientales, incluyendo muestras de aire, agua, muestras marinas y procedentes de suelo y muestras procedentes de animales yplantas.
De acuerdo con la invención también puede usarse un fragmento del gen ssrA o del transcrito de ARNtm en un ensayo para obtener un perfil de ADN de un organismo procariota o eucariota y, por lo tanto, diferenciar entre cepas de la misma especie.
Los alineamientos de la secuencia de ácido nucleico han demostrado que la variación de la secuencia se produce en el gen ssrA y en el transcrito del ARNtm dentro de las especies individuales. Esta variación de secuencia intraespecies puede usarse para diferenciar entre cepas de la misma especie para epidemiología, seguimiento de agentes infecciosos por ejemplo, en brotes, o para estudios de población.
Otras aplicaciones de la invención incluyen el uso del gen ssrA, el transcrito de ARNtm o una secuencia de ADN complementaria correspondiente, o un fragmento de éstos, para diseñar un agente dirigido contra organismos infecciosos de procariotas o eucariotas con fines terapéuticos.
Estos agentes pueden incluir un ARNm antisentido u oligonucleótidos, ribozimas y péptidos antagónicos y son adecuados para su uso en cualquier tipo de afección médica.
Por lo tanto, la invención puede usarse para la detección de microorganismos viables sólo en muestras biológicas usando el ARNtm diana. Por lo tanto, durante y después de cualquier tratamiento con fármacos de agentes antiinfecciosos, el ARNtm diana puede usarse para controlar la eficacia de la terapia sobre esos agentes infecciosos específicos (por ejemplo, tratamientos antimicrobianos y/o antiparasitarios).
En una realización, la región diana se usa para controlar la eficacia de las terapias con fármacos contra agentes infecciosos.
En otra realización, la región diana se usa para controlar la viabilidad y el nivel de organismos que son beneficiosos para la salud en el tracto gastrointestinal.
Este aspecto de la invención se refiere, por ejemplo, a la introducción, en la flora intestinal, de organismos que son beneficiosos para la salud (probióticos) contenidos, por ejemplo, en el yogur u otros alimentos para mejorar la salud. Existe un interés y una necesidad de controlar continuamente la presencia y los niveles de estos organismos para garantizar su función continua en beneficio de la salud. La región del ARNtm puede usarse como una diana para detectar organismos viables, por ejemplo en las heces, con objeto de controlar la presencia de organismos que son beneficiosos para la salud.
En una realización adicional, el ensayo se usa para la cuantificación de organismos procariotas o eucariotas.
Cuando se usa la hibridación de sonda y/o la amplificación in vitro para detectar organismos en una muestra es posible determinar el número de organismos presentes, basándose en la intensidad de la señal. También pueden usarse procedimientos en tiempo real de amplificación in vitro para permitir la cuantificación de los organismos en una muestra. Por lo tanto, la capacidad para cuantificar el número de organismos en una muestra puede ser importante en situaciones clínicas para fines de tratamiento, por ejemplo para los tratamientos con antibióticos u otros o para controlar la eficacia del tratamiento.
Una aplicación aún más de la invención es el uso de una base de datos de secuencias de genes ssrA para identificar un organismo procariota o eucariota.
La invención proporciona una diversidad de sondas para las regiones homólogas 5' y 3’ y las regiones variables de las secuencias del gen ssrA y del ARNtm, derivándose las sondas de estas secuencias o de secuencias complementarias de estas. Las secuencias representativas son las siguientes:
ssrA de Actinobacillus actinomycetemcomitans
ARNtm de Actinobacillus actinomycetemcomitans
Parcial, interna de ssrA de Aeromonas salmonicida Parcial, interna de ARNtm de Aeromonas salmonicida
ssrA de Alcaligenes eutrophus
ARNtm de Alcaligenes eutrophus
ssrA de Aquifex aeolicus
ARNtm de Aquifex aeolicus
Parcial, interna de ssrA de Bacillus megaterium
Parcial, interna de ARNtm de Bacillus megaterium
ssrA de Bacillus subtilis
ARNtm de Bacillus subtilis
ssrA de Bordetella pertussis ARNtm de Bordetella pertussis
ssrA de Borrelia burgdorferi ARNtm de Borrelia burgdorferi
ssrA de Campylobacter jejuni ARNtm de Campylobacter jejuni
ssrA de Chlamydia trachomatis (D/UW-3/CX) ARNtm de Chlamydia trachomatis (D/UW-3/CX)
ssrA de Chlamydia trachomatis (neumonitis murina)
ARNtm de Chlamydia trachomatis (neumonitis murina)
ssrA de Chlorobium tepidum ARNtm de Chlorobium tepidum
ssrA de Cyanophora paradoxa (alga) ARNtm de Cyanophora paradoxa (alga)
Parcial 3’ de ssrA de Clostridium acetobutylicuml
Parcial 3’ de ARNtm de Clostridium acetobutylicum
ssrA de Deinococcus radiodurans
ARNtm de Deinococcus radiodurans
Parcial, interna de ssrA de Desulfovibrio desulfuricansl Parcial, interna de ARNtm de Desulfovibrio desulfuricans
Parcial 3’ de ssrA de Dichelobacter nodosus
10 Parcial 3’ de ARNtm de Dichelobacter nodosusl
ssrA de Enterococcus faecalis
ARNtm de Enterococcus faecalis
ssrA de Escherichia coli
ARNtm de Escherichia coli ssrA de Haemophilus influenzae
ARNtm de Haemophilus influenzae Parcial, interna de ssrA de Helicobacter pylori (ATCC 43504)
Parcial, interna de ARNtm de Helicobacter pylori (ATCC 43504) ssrA de Helicobacter pylori (cepa 26695)
ARNtm de Helicobacter pylori (cepa 26695) Parcial, interna de ssrA de Klebsiella aerogenes (NCTC 9528)
Parcial, interna de ARNtm de Klebsiella aerogenes (NCTC 9528)
Parcial, interna de ssrA de Lactobacillus lactis (NCTC 662)
Parcial, interna de ARNtm de Lactobacillus lactis (NCTC 662)
Parcial, interna de ssrA de Legionella pneumophila
Parcial, interna de ARNtm de Legionella pneumophila
Parcial, interna de ssrA de Listeria grayi l
Parcial, interna de ARNtm de Listeria grayi Parcial, interna de ssrA de Listeria innocua
Parcial, interna de ARNtm de Listeria innocua Parcial, interna de ssrA de Listeria monocytogenes (NCTC 7973)
Parcial, interna de ARNtm de Listeria monocytogenes (NCTC 7973)
Parcial, interna de ssrA de Listeria monocytogenes (NCTC 11994)
Parcial, interna de ARNtm de Listeria monocytogenes (NCTC 11994)
Parcial, interna de ssrA de Listeria murrayi
10 Parcial, interna de ARNtm de Listeria murrayi Parcial, interna de ssrA de Listeria welshimeri
Parcial, interna de ARNtm de Listeria welshimeril
Parcial, interna de ssrA de Marinobacter hydrocarbonoclasticus
Parcial, interna de ARNtm de Marinobacter hydrocarbonoclasticus
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium avium
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium avium
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium bovis
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium bovis
ssrA de Mycobacterium leprae
ARNtm de Mycobacterium leprae Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium paratuberculosis
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium paratuberculosis
ssrA de Mycobacterium tuberculosis
ARNtm de Mycobacterium tuberculosis
ssrA de Mycoplasma capricolum
ARNtm de Mycoplasma capricolum
ssrA de Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº:1)
ARNtm de Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº:1) Parcial, interna de ARNtm de Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº: 2)
Parcial, interna de ARNtm de Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº: 2)
ssrA de Mycoplasma pneumophila
ARNtm de Mycoplasma pneumophila
Parcial, interna de ssrA de Neisseria gonorrhoeae (ATCC 19424)
Parcial, interna de ARNtm de Neisseria gonorrhoeae (ATCC 19424)
ssrA de Neisseria gonorrhoeae (FA 1090)
ARNtm de Neisseria gonorrhoeae (FA 1090)
ssrA de Neisseria meningitidis ARNtm de Neisseria meningitides
ssrA de Nostoc muscorum PCC7120 ARNtm de Nostoc muscorum PCC7120
ssrA de cloroplasto de Odontella sinensis (diatomea) ARNtm de cloroplasto de Odontella sinensis (diatomea)
ssrA de cloroplasto de Porphyra purpureum (alga roja)
ARNtm de cloroplasto de Porphyra purpureum (alga roja)
ssrA de Porphyromonas gingivalis
ARNtm de Porphyromonas gingivalis
Parcial, interna de ssrA de Proteus rettgeri (NCTC 10975)
Parcial, interna de ARNtm de Proteus rettgeri (NCTC 10975)
Parcial, interna de ssrA de Pseudoalteromonas haloplanktoni
Parcial, interna de ARNtm de Pseudoalteromonas haloplanktoni
ssrA de Pseudomonas aeruginosa
ARNtm de Pseudomonas aeruginosa
ssrA de Salmonella typhimurium ARNtm de Salmonella typhimurium
ssrA de Shewanella putrefaciens ARNtm de Shewanella putrefaciens
ssrA de Staphylococcus aureus ARNtm de Staphylococcus aureus
ssrA de Streptococcus gordonii
ARNtm de Streptococcus gordonii
ssrA de Streptococcus mutans
ARNtm de Streptococcus mutans ssrA de Streptococcus pneumoniae
ARNtm de Streptococcus pneumoniae ssrA de Streptococcus pyogenes
ARNtm de Streptococcus pyogenes ssrA de Synechococcus sp. PCC6301
ARNtm de Synechococcus sp. PCC6301
ssrA de Synechocystis sp. PCC6803
ARNtm de Synechocystis sp. PCC6803
ssrA de Thermotoga maritima ARNtm de Thermotoga maritima
ssrA de Thermus thermophilus ARNtm de Thermus thermophilus
ssrA de Treponema pallidum ARNtm de Treponema pallidum
ssrA de Vibrio cholerae ARNtm de Vibrio cholerae
ssrA de Yersinia pestis
ARNtm de Yersinia pestis
Parcial, interna de ssrA de Campylobacter fetus
Parcial, interna de ARNtm de Campylobacter fetus Parcial, interna de ssrA de Campylobacter coli (BM2509)
Parcial, interna de ARNtm de Campylobacter coli (BM2509)
Parcial, interna de ssrA de Camplyobacterl de aislado de pollo
Parcial, interna de ARNtm de Camplyobacter de aislado de pollo
Parcial, interna de ssrA de Clostridium perfringens Parcial, interna de ARNtm de Clostridium perfringensl
Parcial, interna de de ssrA de Haemophilus ducreyi (NCTC 10945)
10 Parcial, interna de ARNtm de Haemophilus ducreyi (NCTC 10945) Parcial, interna de ssrA de Listeria innocua (aislado alimenticio Nº:1)
Parcial, interna de ARNtm de Listeria innocua (aislado alimenticio Nº: 1)
10 Parcial, interna de ssrA de Listeria innocua (aislado alimenticio Nº: 2) Parcial, interna de ARNtm de Listeria innocua (aislado alimenticio Nº: 2)
Parcial, interna de ssrA de Listeria innocua (aislado alimenticio Nº: 3)
Parcial, interna de ARNtm de Listeria innocua (aislado alimenticio Nº: 3)
Parcial, interna de ssrA de Listeria innocua (ATCC 12210)
Parcial, interna de ARNtm de Listeria innocua (ATCC 12210)
10 Parcial, interna de ssrA de Listeria ivanovii (NCTC 11846) Parcial, interna de ARNtm de Listeria ivanovii (NCTC 11846)
Parcial, interna de ssrA de Listeria seeligeri (NCTC 11856) Parcial, interna de ARNtm de Listeria seeligeri (NCTC 11856)
Parcial, interna de ssrA de Salmonella enteritidis Parcial, interna de ARNtm de Salmonella enteritidis
Parcial, interna de ssrA de Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047)
10 Parcial, interna de ARNtm de Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047) Parcial, interna de ssrA de Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
Parcial, interna de ARNtm de Streptococcus agalactiae (NCTC 8181) ssrA de Bordetella bronchiseptica
ARNtm de Bordetella bronchiseptica
ssrA de Chlamydia pneumoniae (CWL029)
ARNtm de Chlamydia pneumoniae (C WL029) ssrA de Francisella tularensis
ARNtm de Francisella tularensis ssrA de Guillardia theta (plastidial)
ARNtm de Guillardia theta (plastidial) ssrA de Thalassiosira Weissflogii (plastidial)
ARNtm de Thalassiosira Weissflogii (plastidial)
Parcial, interna de ssrA de Helicobacter pylori (aislado clínico 1)
Parcial, interna de ARNtm de Helicobacter pylori (aislado clínico 1)
Parcial, interna de ssrA de Helicobacter pylori (aislado clínico 2)
Parcial, interna de ARNtm de Helicobacter pylori (aislado clínico 2) Parcial, interna de ssrA de Listeria seeligeri (NCTC 11856)
Parcial, interna de ARNtm de Listeria seeligeri (NCTC 11856) Parcial, interna de ssrA de Listeria ivanovii (NCTC 11846)
Parcial, interna de ARNtm de Listeria ivanovii (NCTC 11846)
10 Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium africanum (aislado clínico) Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium africanum (aislado clínico)
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium gordonae (aislado clínico)
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium gordonae (aislado clínico)
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium kansasii (aislado clínico)
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium kansasii (aislado clínico)
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium chelonae
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium chelonae
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium szulgai (ATCC 35 799)
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium szulgai (ATCC 35 799)
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium malmoense (aislado clínico)
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium malmoense (aislado clínico)
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium flavescens Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium flavescens
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium marinum
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium marinum
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium microti (aislado ambiental)
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium microti (aislado ambiental) Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium smegmatis (ATCC 10143)
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium smegmatis (ATCC 10143)
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium xenopi (aislado clínico)
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium xenopi (aislado clínico)
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium intracellulare (NCTC 10425) Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium intracellulare (NCTC 10425)
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium scrofulaceum (NCTC 10803)
Parcial, interna de ssrA de Nocardia asteroides
Parcial, interna de ARNtm de Nocardia asteroides
10 Parcial, interna de ssrA de Salmonella enteritidis
Parcial, interna de ARNtm de Salmonella enteritidis
Parcial, interna de ssrA de Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047)
Parcial, interna de ARNtm de Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047)
Parcial, interna de ssrA de Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
10 Parcial, interna de ARNtm de Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
De las secuencias anteriores, las SEC ID Nº: 47 a 62, 65 a 68, 71 y 72, 98 y 99, 159 a 168 y 176-217 son secuencias
nuevas. Las secuencias anteriormente mencionadas pueden usarse para formar una base de datos de secuencias del gen ssrA que pueden usarse para identificar una especie bacteriana, o para la generación de ensayos de diagnóstico de ácido nucleico.
Las sondas representativas identificadas de acuerdo con la invención son las siguientes:
Salmonella:
1) sonda específica de género:
5’-CGAATCAGGCTAGTCTGGTAG-3’ SEC ID Nº: 218
Micobacteria:
2) Sonda oligonucleotídica para la detección del complejo de la tuberculosis
TB01 5’-ACTCCTCGGACA (A/G) CCACAGCGA-3’ SEC ID Nº: 219
3) Sondas oligonucleotídicas para la detección de secuencias de M. avium y M. paratuberculosis
Sonda 1: PAV1 - 5’ - GTTGCAAATAGATAAGCGCC-3’ SEC ID Nº: 220
Sonda 2: PAV2 - 5’ - TCCGTCAGCCCGGGAACGCC-3’ SEC ID Nº: 221
Listeria:
4) Sonda oligonucleotídica usada en la determinación de la integridad del ARNtm después del tratamiento de
exterminio térmico de las células: LVtm: 5’ - TTTTGTTTTTCTTTGCCA - 3’ SEC ID Nº: 222 Escherichia coli: 5) Sonda oligonucleotídica usada en la determinación de la integridad del ARNtm después del tratamiento de
exterminio térmico de las células:
Evtm: 5’ - AGTTTTCGTCGTTTGCGA - 3’ SEC ID Nº: 223 Otros cebadores representativos de acuerdo con la invención son los siguientes: Micobacteria:
1) Cebadores oligonucleotídicos degenerativos para la amplificación de todas las secuencias micobacterianas
Cebador 5’
10SAAM3 - 5’ - CAGGCAA (G/C) (A/T/C) GACCACCGTAA-3’ SEC ID Nº: 224
Cebador 3’
10SAAM4 - 5’ GGATCTCC(C/T)G(A/G)TC(A/T)C(A/G)CG(A/G)AC (A/T)A-3’ SEC ID Nº: 225
2) Cebadores oligonucleotídicos para la amplificación de M. avium y M. paratuberculosis
Cebador 5’: directoAP1-5’-TGCCGGTGCAGGCAACTG-3’ SEC ID Nº: 226 Cebador 3’: inversoAP2 -5’ - CACGCGAACAAGCCAGGA-3’ SEC ID Nº: 227
Breve descripción de las figuras
En las figuras adjuntas:
La figura 1 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de E. coli y V. cholerae ;
La figura 2 es una fotografía de un gel de agarosa del ARN celular total, preparado de células de E. coli y V.
cholerae.
La fig. 3 es una fotografía de un autorradiograma de hibridación de una sonda oligonucleotídica de V. cholerae con transcritos de ARNtm de E. coli y V. cholerae; La fig. 4 es una fotografía de un gel de agarosa de los productos amplificados de cebadores universales de
amplificación del gen ssrA universal procedente de un panel de organismos; La fig. 5 es un alineamiento de clustal de las secuencias del gen ssrA de las especies de Listeria; La fig. 6 es un alineamiento de clustal de las secuencias del gen ssrA/ARNtm de B. subtilus; La fig. 7 es una fotografía de un gel de agarosa de los productos amplificados de cebadores de amplificación por
PCR específicos del género Listeria procedente de un panel de organismos;
La fig. 8 es una fotografía de un autorradiograma de una sonda oligonucleotídica específica del género Listeria hibridada con un panel de organismos como se prepara en el Ejemplo 4; La figura 9 es una fotografía de un autorradiograma de una sonda oligonucleotídica específica de la especie L.
monocytogenes hibridada con un panel de organismos como se prepara en el Ejemplo 7;
La fig. 10 es una imagen escaneada por ordenador de una tira de membrana de nylon usada en la detección múltiple
de sonda colorimétrica de secuencias deL gen ssrA de Listeria como se describe en Ejemplo 6.
La figura 11 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de cepas de C. trachomatis;
La fig. 12 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de cepas de H. pylori;
La fig. 13 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de cepas de M. genitalium;
La fig. 14 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de cepas de Neisseria gonorrhoeae;
La fig. 15 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de cepas de L. monocytogenes;
La fig. 16 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de cepas de L. monocytogenes y de la cepa L.
innocua;
La fig. 17 es una fotografía de un autorradiograma de una sonda oligonucleotídica de Listeria (Evtm) hibridada con muestras de ARN total aislado después del tratamiento térmico del medio de células de E. coli; La fig. 18 es una fotografía de un autorradiograma de una sonda oligonucleotídica de Listeria (Evtm) hibridada con
muestras de ARN total aislado después del tratamiento térmico extremo de células de E. coli;
La fig. 19 es una fotografía de un autorradiograma de una sonda oligonucleotídica de Listeria (Lvtm) hibridada con muestras de ARN total aislado después del tratamiento térmico medio de células de L. monocytogenes; La fig. 20 es una fotografía de un autorradiograma de una sonda oligonucleotídica de Listeria (Lvtm) hibridada con
muestras de ARN total aislado después del tratamiento térmico extremo de células de L. monocytogenes; y
La figura 21 es una fotografía de un gel de agarosa de productos de ARNtm generados por RT-PCR a diversos
momentos después del tratamiento térmico
La invención se ilustrará adicionalmente por los siguientes ejemplos.
Modos para llevar a cabo la Invención
Ejemplo 1
Examen de las secuencias primarias de nucleótidos de secuencias disponibles de ARNtm.
Un alineamiento comparativo de las secuencias primarias de nucleótidos de secuencias disponibles de ARNtm
usando el programa de alineamiento de ácido nucleico Clustal W demostró que las secuencias de ARNtm de
procariotas muestran un grado más significativo de variabilidad y no homología de secuencias de nucleótidos que
otros ARN bacterianos de alto número de copias, como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1
Porcentaje de homología de secuencias de nucleótidos entre moléculas de ARN de diferentes bacterias.
Escherichia coli frente Vibrio cholerae
Bacillus subtilus frente Mycobacteriumtuberculosis
% de homología del ARNr
88 66
% de homología del ARNtm
68 25
Estas regiones de no homología entre secuencias de ARNtm de diferentes bacterias se localizan en el centro de la molécula y el grado de no-homología de la secuencia de nucleótidos dentro de la molécula de ARNtm indica que 5 podrían generarse sondas específicas de género así como de especie para diferenciar entre y/o detectar bacterias.
Los alineamientos de secuencias de nucleótidos habían demostrado previamente que las regiones flanqueantes 5’ y3’ de las moléculas de ARNtm comparten un alto grado de homología tanto dentro de la especie como dentro del género. Esta observación indicó que podrían generarse cebadores oligonucleotídicos universales para amplificar el gen ssrA o su ARNtm codificante a partir de una amplia diversidad de bacterias.
10 Ahora los inventores han demostrado que estas regiones de homología y no homología dentro de la secuencia de nucleótidos de las moléculas de ARNtm de diferentes organismos pueden usarse como base para la identificación ydetección de organismos a nivel molecular.
Ejemplo 2
Desarrollo de una sonda específica de ARNtm de V. cholerae
15 Como se representa en la Figura 1, un alineamiento de las secuencias de nucleótidos de las secuencias de ssrA de
E. coli (SEC ID Nº: 37) y V. cholerae (SEC ID Nº: 127), muestra que estas dos especies bacterianas están filogenéticamente muy relacionadas. Sin embargo, son regiones de no homología entre las secuencias como se pone de manifiesto por la ausencia de asteriscos (en la figura). Se sintetizó una sonda oligonucleotídica, complementaria con la región variable de la secuencia de nucleótidos de ssrA de V. cholerae, subrayada en la figura
20 1.
La secuencia de la sonda específica del ARNtm de V. cholerae es
5’- AACGAATGGCTAACCTGAA-3’ SEC ID Nº. 169
Se aisló ARN total de cultivos líquidos de E. coli y V. cholerae en la fase media exponencial y en la fase estacionaria del crecimiento. Se realizó la electroforesis de cantidades equivalentes del ARN total aislado en un gel de agarosa
25 desnaturalizado con formaldehído y se realizó la transferencia sobre una membrana de nylon HYBOND-N como se muestra en la Figura 2, en la que los carriles 1-4 representan lo siguiente:
Carril 1: ARN total de E. coli en la fase med-log
Carril 2: ARN total de V. cholerae en la fase med-log
Carril 3: ARN total de E. coli en la fase estacionaria
30 Carril 4: ARN Total de V. cholerae en la fase estacionaria
Después, la transferencia de Northern resultante, se hibridó con la sonda específica del ARNtm de V. cholerae marcada en el extremo con yP32. Los resultados del experimento de hibridación mostrados en la Figura 3 demuestran la especificidad de la sonda ya que solo se detectaron los ARNtm de V. cholerae. Por otra parte, se observó un mayor grado de intensidad de la señal de hibridación con el aislado del ARNtm de V. cholerae procedente de cultivos
35 durante la fase estacionaria del crecimiento, lo que indica que durante esta fase, está presente un mayor número de copias de la molécula de ARNtm en células de V. cholerae.
Ejemplo 3
Generación de cebadores oligonucleotídicos universales de amplificación de ssrA/ARNtn para la caracterización de secuencias desconocidas del gen ssrA y del ARNtm
40 El alineamiento mediante Clustal W de todas las secuencias disponibles del gen ssrA y del ARNtm indicó que podrían diseñarse cebadores oligonucleotídicos degenerados para amplificar secuencias de nucleótidos del gen ssrA y del ARNtm para una amplia diversidad de organismos.
Se sintetizaron cebadores oligonucleotídicos degenerados para amplificar por PCR secuencias del gen ssrA procedentes de preparaciones de ADN genómico total de una amplia variedad de bacterias.
45 Las secuencias de los oligonucleótidos degenerados sintetizados son las siguientes:
(a)
tmU5’: cebador para ampliación por PCR in vitro 5’
5’- GGG(A/C)(C/T)TACGG(A/T)TTCGAC- 3’ SEC ID Nº: 170
(b)
tmU3’: cebador para ampliación por PCR in vitro 3’
5’- GGGA(A/G)TCGAACC(A/G)(C/G)GTCC- 3’ SEC ID Nº: 171 Las posiciones de las bases degeneradas se indican entre paréntesis. En un gel de agarosa, se realizó la electroforesis de los productos de las reacciones de PCR y en todos los casos se
amplificó un producto PCR de 350 pares de bases (aprox.), como se muestra en la Figura 4, lo que demuestra la 5 "universalidad" de los cebadores degenerados del ARNtm. En la Figura 4 los carriles representan lo siguiente:
Carril A: Marcador de peso molecular V Carril 1: Escherichia coli Carril 2: Salmonella poona Carril 3: Klebsiella aerogenes Carril 4: Proteus mirabilis Carril 5: Proteus rettgeri Carril 6: Aeromonas hydrophilia Carril 7: Staphyloccus aureus Carril 8: Enterococcus faecalis Carril 9: Lactobacillus lactis Carril 10: Bacillus subtilus Carril 11: Listeria monocytogenes Carril 12: Listeria innocua Carril 13: Listeria murrayi Carril 14: Listeria welshimeri Carril 15: Listeria grayi Carril 16: Mycobacterium bovis Carril B: Marcador de peso molecular V
Los cebadores universales amplifican el gen ssrA de bacterias Gram-positivas y Gram negativas, como se muestra 10 en la Tabla 2.
Tabla 2
Especies bacterianas ensayadas con cebadores de amplificación universales
Productos PCR
Bacterias Gram negativas
Escherichia coli +
Salmonella poona
+
Klebsiella aerogenes
+
Proteus mirabilis
+
Proteus rettgeri
+
Aeromonas hydrophilia
+
Bacterias Gram positivas
Staphyloccus aureus +
Enterococcus faecalis
+
Lactobacillus lactis
+
Bacillus subtilus
+
Listeria monocytogenes
+
Listeria innocua
+
Listeria murrayi
+
Listeria welshimeri
+
Listeria grayi
+
Mycobacterium bovis
+
Ejemplo 4
Aislamiento y caracterización de secuencias de nucleótidos bacterianas previamente desconocidas de ssrA/ARNtm
5 Se subclonaron los productos PCR amplificados procedentes de ADN genómico de especies de la bacteria Listeria yde la bacteria M. bovis, de la tabla 2, en un vector plasmidial de cola T con objeto de realizar la secuenciación del ADN. Para cada especie se seleccionaron tres clones recombinantes y se secuenciaron por el procedimiento de secuenciación di-desoxi. Para cada subclon, se determinó la secuencia de las dos hebras del ADN.
La secuencia de nucleótidos determinada para el gen ssrA M. bovis comparte homología del 100% con la secuencia 10 del gen ssrA de Mycobacterium tuberculosis
En la Fig. 5 se muestra un alineamiento mediante clustal W de las nuevas secuencias génicas de ssrA obtenidas para las especies de Listeria (SEC ID Nº: 51, 53, 55, 59 y 61). Este análisis indicó que para la bacteria Listeria pueden generarse sondas específicas de género y cebadores de amplificación oligonucleotídicos. Además, el alineamiento indicó también que puede generarse una sonda oligonucleotídica específica de especie que
15 diferenciará L. monocytogenes de las otras especies de Listeria.
En la Figura 5 los cebadores oligonucleotídicos específicos de género propuestos, Ltm 1 y 2 de Ltm, están enmarcados, así como la sonda oligonucleotídica específica del género Listeria, LGtm. La secuencia de la sonda oligonucleotídica específica de la especie L. monocytogenes, LStm, está subrayada y en cursiva.
Para ilustrar adicionalmente que la diana del ácido nucleico del gen ssrA/ARNtm es una diana adecuada para
20 diagnósticos bacterianos, se llevó a cabo un alineamiento comparativo de la secuencia de nucleótidos del gen ssrA de L. monocytogenes (SEC ID Nº. 55) con la secuencia de nucleótidos del gen ssrA disponible de B. subtilis (SEC IDNº. 11) (una bacteria filogenéticamente estrechamente relacionada con Listeria) como se muestra en la Figura 6. El análisis del alineamiento de secuencia mostró un porcentaje de homología de secuencia de nucleótidos del 41%, mientras que el alineamiento correspondiente del ARNr 16S presentó un porcentaje de homología de secuencia de
25 nucleótidos del 87%, (datos no mostrados).
Ejemplo 5
Generación y aplicación de cebadores de amplificación específicos de género del gen ssrA/ARNtm, sondas específicas de género y específicas de especie para la especie bacteriana Listeria
Usando el alineamiento de secuencias de nucleótidos del gen ssrA/ARNtm del género Listeria del Ejemplo 4, se
30 analizaron las regiones de la secuencia de nucleótidos del gen ssrA/ARNtm para determinar su idoneidad para la generación de cebadores de amplificación específicos de género, y sondas oligonucleotídicas específicas de género y específicas de especie. En este análisis, las regiones que demostraron las mayores diferencias de secuencia para
B. subtilis, se seleccionaron en el diseño de estas sondas y cebadores de amplificación. Las secuencias de los oligonucleótidos sintetizados son las siguientes:
(a) Ltm1: cebador de amplificación específico del género Listeria 5’
5’ -AAAGCCAATAATAACTGG- 3’ 5 SEC ID Nº: 172
(b)
Ltm2: cebador de amplificación específico del género Listeria 3’
5’ -CCAGAAATATCGGCACTT- 3’ SEC ID Nº: 173
(c)
LGtm: sonda de hibridación específica del género Listeria
10 5’ -GTGAGACCCTTACCGTAG- 3’ SEC ID Nº: 174
(d) LStm: sonda de hibridación específica de la especie L.
5’ -TCTATTTAACCCCAGACG- 3’
SEC ID Nº: 175
15 Los cebadores de amplificación específicos de género Ltm 1 y Ltm2 se usaron, en cada caso, como molde en una
serie de reacciones de PCR con ADN genómico total de veinte cepas diferentes. Con estos cebadores, únicamente
se amplificaron las secuencias del gen ssrA de las especies de Listeria (producto de 260 pares de bases) (Fig. 7 y
Tabla 3) lo que demuestra que el gen ssrA / ARNtm es una diana adecuada para la amplificación in vitro específica
de un género de bacteria. En ninguna otra especie bacteriana ensayada se observaron productos de amplificación, 20 aunque se obtuvieron productos PCR del ADN de estas especies bacterianas usando los cebadores universales
(tmU5 'y tmU3') descritos en el ejemplo 2.
En la Fig. 7 los carriles representan lo siguiente:
Carril A: Marcador de peso molecular V Carril 1: E. coli Carril 2: S. poona Carril 3: K. aerogenes Carril 4: P. mirabilis Carril 5: P. rettgeri Carril 6: A. hydrophilia Carril 7: S. aureus Carril 8: E. faecalis Carril 9: L. lactis Carril 10: B. subtilus Carril 11: L. monocytogenes cepa 1 Carril 12: L. monocytogenes cepa 2 Carril 13: L. monocytogenes cepa 3 Carril 14: L. monocytogenes cepa 4 Carril 15: L. monocytogenes aislado clínico Carril 16: L. innocua Carril 17: L. murrayi Carril 18: L. welshimeri Carril 19: L. grayi
Carril 20:
M. bovis
Carril B:
Marcador de peso molecular V
Tabla 3
Especies bacterianas ensayadas con cebadores de amplificación específicos de Listeria
Productos PCR
Bacterias Gram negativas
Escherichia coli -
Salmonella poona
-
Klebsiella aerogenes
-
Proteus mirabilis
-
Proteus rettgeri
-
Aeromonas hydrophilia
-
Bacterias Gram positivas
Staphyloccus aureus -
Entrococcus faecalis
-
Lactobacillus lactis
-
Bacillus subtilus
-
Listeria monocytogenes cepa 1
+
Listeria monocytogenes cepa 2
+
Listeria monocytogenes cepa 3
+
Listeria monocytogenes cepa 4
+
Aislado clínico de Listeria monocytogenes
+
Listeria innocua
+
Listeria murrayi
+
Listeria welshimeri
+
Listeria grayi
+
Mycobacterium bovis
-
La sonda oligonucleotídica específica del género Listeria, LGtm, se hibridó con la transferencia de Southernrepresentada en la figura 4. Se observaron señales positivas de hibridación sólo con especies de Listeria, como se muestra en la Fig. 8 y en la Tabla 4, lo que demuestra la utilidad de la secuencia de ARNtm como una diana en la detección de un género específico.
En la Fig. 8 los carriles representan lo siguiente:
Carril A Marcador de peso molecular V Carril 1: Escherichia coli Carril 2: Salmonella poona Carril 3: Klebsiella aerogenes Carril 4: Proteus mirabilis Carril 5: Proteus rettgeri Carril 6: Aeromonas hydrophilia Carril 7: Staphyloccus aureus Carril 8: Enterococcus faecalis
Gane 9: Lactobacillus lactis
Carril 10: Bacillus subtilus
Carril 11: Listeria monocytogenes
Carril 12: Listeria innocua
Carril 13: Listeria murrayi
Carril 14: Listeria welshimeri
Carril 15: Listeria grayi
Carril 16: Mycobacterium bovis
Carril B: Marcador de peso molecular V
Se realizó la transferencia de Southern de los productos PCR generados usando la amplificación específica de género descrita en este ejemplo y se muestra en la Figura 7 y se hibridaron con la sonda oligonucleotídica específica de la especie L. monocytogenes. Se observó una señal de hibridación positiva con tres de las cuatro cepas tipificadas y el aislado clínico de L. monocytogenes como se muestra en la Figura 9 y en la Tabla 4
En la Fig. 9 los carriles representan lo siguiente:
Carril A: Marcador de peso molecular V Carril 1: E. coli Carril 2: S. poona Carril 3: K. aerogenes Carril 4: P. mirabilis Carril 5: P. rettgeri Carril 6: A. hydrophilia Carril 7: S. aureus Carril 8: E. faecalis Carril 9: L. lactis Carril 10: B. subtilus Carril 11: L. monocytogenes cepa 1 Carril 12: L. monocytogenes cepa 2 Carril 13: L. monocytogenes cepa 3 Carril 14: L. monocytogenes cepa 4 Carril 15: Aislado clínico de L. monocytogenes Carril 16: L. innocua Carril 17: L. murrayi Carril 18: L. welshimeri Carril 19: L. grayi Carril 20: M. bovis Carril B: Marcador de peso molecular V
Tabla 4
Especificidad de la sonda específica del género Listeria y de la sonda específica de la especie L. monocytogenes
Sonda LGtm específica degénero
Sonda LStm específica deespecie
Bacterias Gram negativas
Escherichia coli - -
Salmonella poona
- -
Klebsiella aerogenes
- -
Proteus mirabilis
- -
Proteus rettgeri
- -
Aeromonas hydrophilia
- -
Bacterias Gram positivas
Staphyloccus aureus - -
Entrococcus faecalis
- -
Lactobacillus lactis
- -
Bacillus subtilus
- -
Listeria monocytogenescepa 1
+ +
Listeria monocytogenescepa 2
+ +
Listeria monocytogenescepa 3
+ +
Listeria monocytogenescepa 4
+ -
Listeria monocytogenesaislado clínico
+ +
Listeria innocua
+ -
Listeria murrayi
+ -
Listeria welshimeri
+ -
Listeria grayi
+ -
Mycobacterium bovis
- -
La cepa 4, una de las cepas tipificadas de L. monocytogenes, no pudo generar una señal positiva con esta sonda. La secuenciación de ADN del gen ssrA amplificado por PCR de esta cepa demostró que este contenía una región diana
5 de sonda idéntica a L. innocua. Sin embargo, cabe señalar, que el gen ssrA de esta cepa contiene otras regiones en las que la secuencia es idéntica a la de la cepa de L. monocytogenes anteriormente caracterizada y que estas secuencias son diferentes a las secuencias de L. innocua., como se muestra en la Figura 15. Por lo tanto, puede sintetizarse un oligonucleótido específico de especie dirigido a una de estas regiones variables que reconocería cada tipo de cepa (aislada) dentro de la especie, por ejemplo L. monocytogenes.
10 Ejemplo 6
Detección por sonda colorimétrica múltiple de secuencias del gen ssrA de Listeria.
LGTm (A), LStm (B) y una sonda oligonucleotídica de la SEC ID Nº: 228 de espaciador de ARNr 16S - 23S (C - 5’ CATTAAACTTTAG-CAAGGAAGTG 3’) de Campylobacter upsaliensis se unieron de manera irreversible a tiras de membrana de nylon y se hibridaron con el producto PCR amplificado de ssrA, usando los cebadores específicos de 15 género, Ltm 1 y Ltm2 ( Ltm 1 se marcó con biotina en el extremo 5’), de L. monocytogenes (1-6), L. innocua (7-10),
L. ivanovii (11), L. murrayi (12), L. seeligeri (13), L. welshmeri (14) y L. grayii (15). También se hibridaron los productos PCR amplificados de ssrA, usando tmU5’ y tmU3’ (tmU5’ se marcó con biotina en el extremo 5’), con las tiras de la membrana de nylon de las bacterias Gram-positivas, B. subtilus, L. lactis, S. aureus, S. epidermis, E. faecalis, C. perfringins (16-21) y las bacterias Gram-negativas E. coli, S. enteritidis, P. Rettgeri, K. aerogenes (22
20 25). Como se muestra en la Fig. 10, después de la hibridación, el desarrollo del ensayo colorimétrico con biotina reveló lo siguiente: las Tiras 1-6 demuestran que el producto PCR amplificado de ssrA se origina de L.
monocytogenes combinado con la confirmación de que el producto PCR amplificado es del género Listeria - A y B dan detección de color; las Tiras 7 - 15 demuestran que estos productos PCR se originan del género Listeria – solo A da detección de color; y las Tiras 16 - 25 demuestran que los productos PCR no son del género Listeria - no se detecta color. C es una sonda de control oligonucleotídica negativa y D es un control positivo del ensayo de detección colorimétrico para todas las muestras
Ejemplo 7
Uso de secuencias de ssrA / ARNtm para diferenciar entre especies de organismos
Los alineamientos mediante Clustal W como se muestra en las Figs. 11 (SEC ID Nº. 19 y 21), 12 (SEC ID Nº. 41 y43), 13 (SEC ID Nº: 77 y 79), 14 (SEC ID Nº. 83 y 85), 15 y 16 (SEC ID Nº: 53, 55 y 57), indican que hay diferencias de nucleótidos dentro de las secuencias de ssrA/ARNtm de diferentes cepas de la misma bacteria. Esto sugiere que las secuencias de ssrA/ARNtm posiblemente podrían usarse para discriminar entre individuos y/o grupos de cepas dentro de una especie bacteriana. Esto puede tener aplicaciones útiles en epidemiología y análisis de población bacteriana.
Ejemplo 8
Análisis de integridad del ARNtm después del tratamiento térmico medio y extremo de células bacterianas.
Se trataron cultivos de E. coli y L. monocytogenes a 80°C, durante 20 minutos en el caso de E. coli y 40 minutos en el caso de L. monocytogenes y a 120 ° C durante 15 minutos (esterilizando en autoclave) después del crecimiento durante una noche y se ensayó su viabilidad a las 0 h, 1 h, 2 h, 6 h, 12 h, h 24 y 48 horas después del tratamiento térmico. No se observó viabilidad en ningún período de tiempo ensayado. También se aisló ARN total en estos períodos de tiempo y se realizó la electroforesis en geles de agarosa al 1,2% desnaturalizantes y la transferencia de Northern. Cada transferencia se hibridó, en el caso de E. coli (Figs 17 y 18), con una sonda oligonucleotídica marcada radiactivamente Evtm y en el caso de L. monocytogenes (Figs 19 y 20) con una Lvtm radiomarcada. Con cada muestra ensayada no se detectó ningún transcrito de ARNtm, lo que demuestra que el transcrito de ARNtm se degrada después del tratamiento térmico. Los carriles representados con la anotación +ve son una muestra de ARN total de control positivo.
Ejemplo 9
Uso del transcrito de ARNtm para diferenciar entre bacterias viables y no viables.
Un cultivo de 100 ml de L. monocytogenes creció durante una noche en un cultivo líquido. Después del crecimiento, se llevaron a cabo diluciones en serie de las células y se determinó la viabilidad sembrando en placas de propagación sobre placas de agar nutritivo. Simultáneamente, se aisló ARN total de una alícuota de 1 ml de estas células. El resto de las células se calentó a 65°C durante 20 minutos. Después, las células se eliminaron para el análisis de viabilidad y el aislamiento de ARN total. Se tomaron muestras para la viabilidad y el aislamiento de ARN en períodos de tiempo de 0 h, 2 h, h 6 y 24 horas después del tratamiento.
La siembra en placas de propagación sobre placas de agar nutritivo indicó que el tratamiento térmico exterminó células de L. monocytogenes, no observándose ninguna unidad formadora de colonias viable. Después, cada aislado de muestra de ARN se trató con DNasa para eliminar cualquier ADN contaminante y las muestras de ARN total (100 ng) se sometieron a amplificación PCR - Transcriptasa Inversa usando los cebadores oligonucleotídicos Ltm1 y Ltm2 específicos de ssrA/ARNtm del género Listeria. Las reacciones de amplificación de control negativo incluyeron cebadores, diana y Taq polimerasa, pero no transcriptasa inversa. Los resultados de las reacciones de amplificación se muestran en la Figura 12.
Sólo se observaron productos RT-PCR de ARNtm amplificados con la muestra de RNA no tratada con calor. Las muestras restantes no dieron ningún producto RT-PCR lo que indica que las moléculas de ARNtm en estas muestras pueden haberse degradado en las células tratadas con calor no viables.
En la Fig. 21 los carriles representan lo siguiente:
Carril A: Marcador de peso molecular V;
Carril 1: Amplificación del ARN por PCR (tratamiento de células sin calor) – Transcriptasa Inversa (RT), + Taq polimerasa (TP);
Carril 2: RT-PCR del ARN (tratamiento de células sin calor), + RT, +TP;
Carril 3: Amplificación del ARN por PCR (a tiempo 0 después del tratamiento térmico), -RT, +TP;
Carril 4: RT-PCR del ARN (a tiempo 0 después del tratamiento térmico), +RT, +TP;
Carril 5: Amplificación del ARN por PCR (a tiempo 1 h después del tratamiento térmico), - RT, +TP;
Carril 6: RT-PCR del ARN (a tiempo 1 h después del tratamiento térmico), +RT, +TP;
Carril 7: Amplificación del ARN por PCR (a tiempo 2 h después del tratamiento térmico), - RT, +TP;
Carril 8: RT-PCR del ARN (a tiempo 2 h después del tratamiento térmico), +RT, +TP;
Carril 9: Amplificación del ARN por PCR (a tiempo 6 h después del tratamiento térmico), -RT, +TP;
Carril 10: RT-PCR del ARN (a tiempo 6 h después del tratamiento térmico), +RT, +TP;
Carril 11: Amplificación del ARN por PCR (a tiempo 24 h después del tratamiento térmico), -RT, +TP; Carril 12: RT-PCR del ARN (a tiempo 24 h después del tratamiento térmico), +RT, +TP; Carril B: Marcador de peso molecular V;
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> ENTERPRISE IRELAND (t/a BIORESEARCH IRELAND) y col
5 <120> Ensayos de diagnóstico basados en sondas de ácidos nucleicos para organismos procariotas y eucariotas
<130> P00-37-PCT
<140> 10 <141>
<150> PCT/IE 99/00043
<151>
15 <160> 228
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 366
<212>
ADN 20 <213> Actinobacillus actinomycetemcomitans
<400> 1
<210> 3
<211> 315
<212> ADN
<213> Aeromonas salmonicida
<400> 3
<210> 4
<211> 315
<212>
ARN 15 <213> Aeromonas salmonicida
25
<210> 2
<211> 366
<212> ARN
<213> Actinobacillus actinomycetemcomitans
30
<400> 2
<400> 4
20
<210> 5
<211> 349
<212> ADN
<213> Alcaligenes eutrophus
25
<400> 5
5 <210> 6
<211> 349
<212> ARN
<213> Alcaligenes eutrophus
10 <400> 6
<210> 7 15 <211> 347
<212> ADN
<213> Aquifex aeolicus
<400> 7 20
<210> 8
<211> 347
<212> ARN
<213> Aquifex aeolicus
<400> 8
<210> 9
<211> 316 10 <212> ADN
<213> Bacillus megaterium
<400> 9
<210> 10
<211> 316
<212> ARN 20 <213> Bacillus megaterium
<400> 10
25 <210> 11
<211> 363
<212> ADN
<213> Bacillus subtilis
<400> 11
<210> 12
<211> 363 10 <212> ARN
<213> Bacillus subtilis
<400> 12
<210> 13
<211> 387
<212> ADN
<213> Bordetella pertussis
<400> 13
<210> 14
<211> 387
<212> ARN
<213> Bordetella pertussis
<400> 14
10 <210> 15
<211> 362
<212> ADN
<213> Borrelia burgdorferi
15 <400> 15
<210> 16 20 <211> 362
<212> ARN
<213> Borrelia burgdorferi
<400> 16 25
<210> 17
<211> 359
<212> ADN
<213> Campylobacter jejuni
<400> 17
<210> 18
<211> 359
<212> ARN
<213> Campylobacter jejuni
<400> 18
<210> 19 20 <211> 420
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis (D/UW-3/CX)
<400> 19 25
<210> 20
<211> 420
<212> ARN
<213> Chlamydia trachomatis (D/UW-3/CX)
<400> 20
<210> 21
<211> 421
<212> ADN
<213> Chlamydia trachomatis (neumonitis murina) 15
<400> 21
20 <210> 22
<211> 421
<212> ARN
<213> Chlamydia trachomatis (neumonitis murina)
<400> 22
<210> 23
<211> 404
<212>
ADN 10 <213> Chlorobium tepidum
<400> 23
<210> 25
<211> 294
<212> ADN
<213> Cyanophora paradoxa (alga) cyanelle
<400> 25
<210> 26
<211> 294
<212>
ARN 15 <213> Cyanophora paradoxa (alga) cyanelle
<400> 26
<210> 28
<211> 189
<212> ARN
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 28
<210> 29
<211> 349
<212>
ADN 15 <213> Deinococcus radiodurans
<400> 29
<210> 31
<211> 330
<212> ADN
<213> Desulfovibrio desulfuricans
<400> 31
<210> 32
<211> 330
<212>
ARN 15 <213> Desulfovibrio desulfuricans
15
<210> 24
<211> 404
<212> ARN
<213> Chlorobium tepidum
20
<400> 24
20
<210> 27
<211> 189
<212> ADN
<213> Clostridium acetobutylicum
25
<400> 27
20
<210> 30
<211> 349
<212> ARN
<213> Deinococcus radiodurans
25
<400> 30
<400> 32
20
<210> 33
<211> 318
<212> ADN
<213> Dichelobacter nodosus
25
<400> 33
5 <210> 34
<211> 318
<212> ARN
<213> Dichelobacter nodosus
10 <400> 34
<210> 35 15 <211> 367
<212> ADN
<213> Enterococcus faecalis
<400> 35 20
<210> 36
<211> 367
<212> ARN
<213> Enterococcus faecalis
<400> 36
<210> 37
<211> 363 10 <212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 37
<210> 38
<211> 363
<212>
ARN 20 <213> Escherichia coli
<400> 38
<210> 39
<211> 366
<212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<400> 39
<210> 40
<211> 366
<212>
ARN 15 <213> Haemophilus influenzae
<400> 40
<210> 41
<211> 340
<212> ADN
<213> Helicobacter pylori (ATC 43504)
<400> 41
<210> 42
<211> 340
<212>
ARN 10 <213> Helicobacter pylori (ATC 43504)
<400> 42
<210> 43
<211> 386
<212>
ADN 20 <213> Helicobacter pylori (cepa 26695)
<400> 43
<210> 44
<211> 386
<212> ARN
<213> Helicobacter pylori (cepa 26695)
<400> 44
10 <210> 45
<211> 312
<212> ADN
<213> Klebsiella aerogenes (NCTC 9528)
15 <400> 45
<210> 46
<211> 312 20 <212> ARN
<213> Klebsiella aerogenes (NCTC 9528)
<400> 46
<210> 47
<211> 316
<212> ADN
<213> Lactobacillus lactis (NCTC 662)
<400> 47
<210> 48
<211> 316
<212> ARN 15 <213> Lactobacillus lactis (NCTC 662)
<400> 48 <212> ARN
20
<210> 49
<211> 362
<212> ADN
<213> Legionella pneumophila
25
<400> 49
<213> Legionella pneumophila
<400> 50 10
<210> 51
<211>
322 15 <212> ADN
<213> Listeria grayi
<400> 51
<210> 52
<211> 322
<212> ARN
<213> Listeria grayi
<400> 52
<210> 53
<211>
322 10 <212> ADN
<213> Listeria innocua
<400> 53
<210> 54
<211> 322
<212> ARN 20 <213> Listeria innocua
<400> 54
25 <210> 55
<211> 322
<212> ADN
<213> Listeria monocytogenes (NCTC 7973)
<400> 55
<210> 56
<211> 322 10 <212> ARN
<213> Listeria monocytogenes (NCTC 7973)
<400> 56
<210> 57
<211> 247
<212> ADN 20 <213> Listeria monocytogenes (NCTC 11994)
<400> 57
<210> 58
<211> 247
<212> ARN
<213> Listeria monocytogenes (NCTC 11994)
<400> 58
10
<210> 59
<211> 322
<212> ADN
<213> Listeria murrayi
15
<400> 59
<210>
60 20 <211> 322
<212> ARN
<213> Listeria murrayi
<210> 61
<211> 322
<212> ADN
<213> Listeria welshimeri
<400> 61
<210>
62 10 <211> 322
<212> ARN
<213> Listeria welshimeri
<210> 63
<211> 322
<212> ADN 20 <213> Marinobacter hydrocarbonoclasticus
<400> 63
<210> 64
<211> 322
<212> ARN
<213> Marinobacter hydrocarbonoclasticus
<400> 64
<210> 65 10 <211> 338
<212> ADN
<213> Mycobacterium avium
<400> 65 15
<210> 66
<211> 338 20 <212> ARN
<213> Mycobacterium avium
<400> 66
<210> 67
<211> 318
<212> ADN
<213> Mycobacterium bovis
<400> 67
<210> 68
<211> 318
<212> ARN 15 <213> Mycobacterium bovis
<400> 68
20
<210> 69
<211> 369
<212> ADN
<213> Mycobacterium leprae
25
<400> 69
<210> 70 5 <211> 369
<212> ARN
<213> Mycobacterium leprae
<400> 70 10
<210> 71
<211> 338 15 <212> ADN
<213> Mycobacterium paratuberculosis
<400> 71
<210> 72
<211> 338
<212> ARN
<213> Mycobacterium paratuberculosis
<400> 72
<210> 73 10 <211> 368
<212> ADN
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 73 15
<210> 74
<211> 368 20 <212> ARN
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 74
<210> 75
<211> 411
<212> ADN
<213> Mycoplasma capricolum
<400> 75
<210> 76
<211> 411
<212>
ARN 15 <213> Mycoplasma capricolum
<400> 76
<210> 77
<211> 388
<212> ADN
<213> Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº: 1)
<400> 77
<210> 78
<211> 388
<212>
ARN 10 <213> Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº: 1)
<400> 78
<210> 79
<211> 243
<212> ARN
<213> Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº: 2) 20
<400> 79
<210> 80
<211> 350
<212> ARN
<213> Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº: 2)
<400> 80
10
<210> 81
<211> 387
<212> ADN
<213> Mycoplasma pneumophila
15
<400> 81
20 <210> 82
<211> 387
<212> ARN
<213> Mycoplasma pneumophila
25 <400> 82 <210> 83
<211> 318
<212> ADN
<213> Neisseria gonorrhoeae (ATCC 19424)
<400> 83
<210> 84
<211> 318
<212> ARN 15 <213> Neisseria gonorrhoeae (ATCC 19424)
<400> 84
20
<210> 85
<211> 363
<212> ADN
<213> Neisseria gonorrhoeae (FA 1090)
25
<400> 85
5 <210> 86
<211> 363
<212> ARN
<213> Neisseria gonorrhoeae (FA 1090)
10 <400> 86
<210> 87 15 <211> 363
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 87 20
<210> 88
<211> 363
<212> ARN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 88
<210> 89 10 <211> 385
<212> ADN
<213> Nostoc muscorum PCC7120
<400> 89 15
<210> 90
<211> 385 20 <212> ARN
<213> Nostoc muscorum PCC7120
<400> 90
<210> 91
<211> 371
<212> ADN
<213> Odontella sinensis (diatomea) cloroplasto
<400> 91
10
<210> 92
<211> 371
<212> ARN
<213> Odontella sinensis (diatomea) cloroplasto
15
<400> 92
<210> 93 20 <211> 323
<212> ADN
<213> Porphyra purpureum (alga roja) cloroplasto
<400> 93
5
<210> 94
<211> 323
<212> ARN
<213> Porphyra purpureum (alga roja) cloroplasto
10
<400> 94
15 <210> 95
<211> 407
<212> ADN
<213> Porphyromonas gingivalis
20 <400> 95
<210> 96 25 <211> 407
<212> ARN
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 96
<210> 97
<211> 310 10 <212> ADN
<213> Proteus rettgeri (NCTC 10975)
<400> 97
<210> 98
<211> 310
<212> ARN 20 <213> Proteus rettgeri (NCTC 10975)
<400> 98
<210> 99
<211> 241
<212> ADN
<213> Pseudoalteromonas haloplanktis
<400> 99
10 <210> 100
<211> 313
<212> ARN
<213> Pseudoalteromonas haloplanktis
15 <400> 100
<210> 101 20 <211> 353
<212> ADN
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 101 25
<210> 102
<211> 353
<212> ARN
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 102
10
<210> 103
<211> 363
<212> ADN
<213> Salmonella typhimurium
15
<400> 103
20 <210> 104
<211> 363
<212> ARN
<213> Salmonella typhimurium
25 <400> 104
<210> 105
<211> 355
<212> ADN
<213> Shewanella putrefaciens
<400> 105
<210> 106
<211> 355
<212> ARN 15 <213> Shewanella putrefaciens
<400> 106
20
<210> 107
<211> 362
<212> ADN
<213> Staphylococcus aureus
25
<400> 107
5 <210> 108
<211> 362
<212> ARN
<213> Staphylococcus aureus
10 <400> 108
<210> 109 15 <211> 349
<212> ADN
<213> Streptococcus gordonii
<400> 109 20
<210> 110
<211> 349
<212> ARN
<213> Streptococcus gordonii
<210> 111
<211> 349
<212> ADN 10 <213> Streptococcus mutans
<400> 111
15
<210> 112
<211> 349
<212> ARN
<213> Streptococcus mutans
20
<400> 112
25 <210> 113
<211> 348
<212> ADN
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 113
<210> 114 10 <211> 348
<212> ARN
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 114 15
<210> 115
<211> 348 20 <212> ADN
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 115
<210> 116
<211> 348
<212> ARN
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 116
<210> 117
<211> 394
<212> ADN 15 <213> Synechococcus sp. PCC6301
<400> 117
20
<210> 118
<211> 394
<212> ARN
<213> Synechococcus sp. PCC6301
25
<400> 118
5 <210> 119
<211> 399
<212> ADN
<213> Synechocystis PCC6803
10 <400> 119
<210> 120 15 <211> 399
<212> ARN
<213> Synechocystis PCC6803
<400> 120 20
<210> 121
<211> 356
<212> ADN
<213> Thermotoga maritima
<400> 121
<210> 122 10 <211> 356
<212> ARN
<213> Thermotoga maritima
<400> 122 15
<210> 123
<211> 349 20 <212> ADN
<213> Thermus thermophilus
<400> 123
<210> 124
<211> 349
<212> ARN
<213> Thermus thermophilus
<400> 124
<210> 125
<211> 354
<212> ADN 15 <213> Treponema pallidum
<400> 125
20
<210> 126
<211> 354
<212> ARN
<213> Treponema pallidum
25
<400> 126
5 <210> 127
<211> 367
<212> ADN
<213> Vibrio cholerae
10 <400> 127
<210> 128 15 <211> 367
<212> ARN
<213> Vibrio cholerae
<400> 128 20
<210> 129
<211> 364
<212> ADN
<213> Yersinia pestis
<400> 129
<210> 130
<211> 364 10 <212> ARN
<213> Yersinia pestis
<400> 130
<210> 131
<211> 309
<212> ADN
<213> Campylobacter fetus
<400> 131
<210> 132
<211> 309
<212> ARN
<213> Campylobacter fetus
<400> 132
<210> 133 10 <211> 309
<212> ADN
<213> Campylobacter coli (BM2509)
<400> 133 15
<210> 134
<211> 309 20 <212> ARN
<213> Campylobacter coli (BM2509)
<400> 134
<210> 135
<211> 311
<212> ADN 5 <213> Desconocido
<220>
<223> Descripción de organismo desconocido: Campylobacter aislado de pollo
10 <400> 135
<210> 136 15 <211> 311
<212> ARN
<213> Desconocido
<220> 20 <223> Descripción de organismo desconocido: Campylobacter aislado de pollo
<400> 136
<210> 137
<211> 313
<212> ADN
<213> Clostridium perfringens
<400> 137
<210> 138
<211> 313
<212>
ARN 10 <213> Clostridium perfringens
<400> 138
<210> 139
<211> 331
<212>
ADN 20 <213> Haemophilus ducreyi (NCTC 10945)
<400> 139
25 <210> 140
<211> 331
<212> ARN
<213> Haemophilus ducreyi (NCTC 10945)
<400> 140
<210> 141
<211> 232 10 <212> ADN
<213> Listeria innocua (aislado de alimento Nº:1)
<400> 141
<210> 142
<211> 232
<212> ARN 20 <213> Listeria innocua (aislado de alimento Nº:1)
<400> 142
<210> 143
<211> 232
<212> ADN
<213> Listeria innocua (aislado de alimento Nº:2)
<400> 143
<210> 144
<211> 232
<212> ARN
<213> Listeria innocua (aislado de alimento Nº:2)
<400> 144
15 <210> 145
<211> 232
<212> ADN
<213> Listeria innocua (aislado de alimento Nº:3)
20 <400> 145
<210> 146 25 <211> 232
<212> ARN
<213> Listeria innocua (aislado de alimento Nº:3)
<400> 146 30
<210> 147
<211> 232
<212> ADN
<213> Listeria innocua (ATCC 12210)
<400> 147
<210> 148
<211> 232
<212>
ARN 15 <213> Listeria innocua (ATCC 12210)
<400> 148
<210> 150
<211> 321
<212> ARN
<213> Listeria ivanovii (NCTC 11846)
<400> 150
<210> 151
<211> 322
<212>
ADN 15 <213> Listeria seeligeri (NCTC 11856)
<400> 151
<210> 152
<211> 322
<212>
ARN 25 <213> Listeria seeligeri (NCTC 11856)
20
<210> 149
<211> 322
<212> ADN
<213> Listeria ivanovii (NCTC 11846)
25
<400> 149
<400> 152
5 <210> 153
<211> 314
<212> ADN
<213> Salmonella enteritidis
10 <400> 153
<210> 154 15 <211> 314
<212> ARN
<213> Salmonella enteritidis
<400> 154 20
<210> 155
<211> 313 25 <212> ADN
<213> Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047)
<400> 155
<210> 156
<211> 313
<212> ARN
<213> Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047) 10
<400> 156
15 <210> 157
<211> 302
<212> ADN
<213> Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
20 <400> 157
<210> 158 25 <211> 302
<212> ARN
<213> Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
<400> 158
<210> 159
<211> 168
<212> ADN 10 <213> Bordetella bronchiseptica
<400> 159
15
<210> 160
<211> 168
<212> ARN
<213> Bordetella bronchiseptica
20
<400> 160
25 <210> 161
<211> 426
<212> ADN
<213> Chlamydia pneumoniae (CWL029)
30 <400> 161 <212> ARN
<213> Chlamydia pneumoniae (CWL029)
<400> 162 10
<210> 163
<211> 421 15 <212> ADN
<213> Francisella tularensis
<400> 163
<210> 164
<211> 421
<212> ARN
<213> Francisella tularensis
<400> 164
<210> 165
<211> 330
<212> ADN 15 <213> Guillardia theta (plastidial)
<400> 165
<210> 166
<211> 330
<212> ARN
<213> Guillardia theta (plastidial)
<400> 166
<210> 167
<211> 348 10 <212> ADN
<213> Thalassiosira Weissflogii (plastidial)
<400> 167
<210> 168
<211> 348
<212> ARN 20 <213> Thalassiosira Weissflogii (plastidial)
<400> 168
<210> 169
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda específica de ARNtm de V. cholerae
<400> 169 aacgaatggc taacctgaa 19
<210> 170
<211> 17
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador 5’ universal de amplificación in vitro ssrA/ARNtm
<400> 170 gggmytacgg wttcgac 17
<210> 171
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador 3’ universal de amplificación in vitro ssrA/ARNtm
<400> 171 gggartcgaa ccrsgtcc 18
<210> 172
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador 5’ de amplificación PCR específico del género Listeria
<400> 172 aaagccaata ataactgg 18
<210> 173
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador 3’ de amplificación específico del género Listeria
<400> 173 ccagaaatat cggcactt 18
<210> 174
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de hibridación específica del género Listeria
<400> 174 gtgagaccct taccgtag 18
<210> 175
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de hibridación específica para la especie Listeria monocytogenes
<400> 175 tctatttaac cccagacg 18
<210> 176
<211> 348
<212> ADN
<213> Helicobacter pylori
<400> 176
10 <210> 177
<211> 348
<212> ARN
<213> Helicobacter pylori
15 <400> 177
20 <210> 178
<211> 344
<212> ADN
<213> Helicobacter pylori
25 <400> 178
<210> 179
<211> 344
<212> ARN
<213> Helicobacter pylori
<400> 179
10
<210> 180
<211> 322
<212> ADN
<213> Listeria seeligeri (NCTC 11856)
15
<400> 180
20 <210> 181
<211> 322
<212> ARN
<213> Listeria seeligeri (NCTC 11856)
25 <400> 181
<210> 182
<211> 322
<212> ADN
<213> Listeria ivanovii (NCTC 11846)
<400> 182
<210> 183
<211> 321
<212> ARN 15 <213> Listeria ivanovii (NCTC 11846)
<400> 183
20
<210> 184
<211> 319
<212> ADN
<213> Mycobacterium africanum
25
<400> 184
5 <210> 185
<211> 319
<212> ARN
<213> Mycobacterium africanum
10 <400> 185
<210> 186 15 <211> 319
<212> ADN
<213> Mycobacterium gordonae
<400> 186 20
<210> 187
<211> 319 25 <212> ARN
<213> Mycobacterium gordonae
<400> 187
<210> 188
<211> 319
<212> ADN 10 <213> Mycobacterium kansasii
<400> 188
15
<210> 189
<211> 319
<212> ARN
<213> Mycobacterium kansasii
20
<400> 189
<210> 190
<211> 320
<212> ADN
<213> Mycobacterium chelonae
<400> 190
10
<210> 191
<211> 320
<212> ARN
<213> Mycobacterium chelonae
15
<400> 191
20 <210> 192
<211> 320
<212> ADN
<213> Mycobacterium szulgai
25 <400> 192
<210> 193
<211> 320
<212> ARN
<213> Mycobacterium szulgai
<400> 193
10
<210> 194
<211> 320
<212> ADN
<213> Mycobacterium malmoense
15
<400> 194
20 <210> 195
<211> 320
<212> ARN
<213> Mycobacterium malmoense
<400> 195
5
<210> 196
<211> 321
<212> ADN
<213> Mycobacterium flavescens
10
<400> 196
15 <210> 197
<211> 321
<212> ARN
<213> Mycobacterium flavescens
20 <400> 197
<210> 198 25 <211> 320
<212> ADN
<213> Mycobacterium marinum
<400> 198
<210> 199
<211> 320 10 <212> ARN
<213> Mycobacterium marinum
<400> 199
<210> 200
<211> 319
<212> ADN 20 <213> Mycobacterium microti
<400> 200
<210> 201
<211> 319
<212> ARN
<213> Mycobacterium microti
<400> 201
<210> 202 10 <211> 321
<212> ADN
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 202 15
<210> 203
<211> 321 20 <212> ARN
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 203
<210> 204
<211> 320
<212> ADN
<213> Mycobacterium xenopi
<400> 204
<210> 205
<211> 320
<212>
ARN 15 <213> Mycobacterium xenopi
<400> 205
<210> 206
<211> 320
<212> AND
<213> Mycobacterium intracellulare
<400> 206
<210> 207
<211> 320
<212>
ARN 10 <213> Mycobacterium intracellulare
<400> 207
15
<210> 208
<211> 320
<212> ADN
<213> Mycobacterium scrofulaceum
20
<400> 208
<210> 209
<211> 320
<212> ARN
<213> Mycobacterium scrofulaceum
<400> 209
10 <210> 210
<211> 326
<212> ADN
<213> Nocardia asteroides
15 <400> 210
<210> 211 20 <211> 325
<212> ARN
<213> Nocardia asteroides
<400> 211 25
<210> 212
<211> 314
<212> ADN
<213> Salmonella enteritidis
<400> 212
<210> 213
<211> 314
<212> ARN 15 <213> Salmonella enteritidis
<400> 213
<210> 214
<211> 313
<212> ADN
<213>
Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047) 25
<400> 214
<210> 215
<211> 313
<212> ARN
<213>
Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047) 10
<400> 215
15 <210> 216
<211> 302
<212> ADN
<213> Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
20 <400> 216
<210> 217 25 <211> 302
<212> ARN
<213> Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
<400> 217
<210> 218
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda específica del género Salmonella
<400> 218 cgaatcaggc tagtctggta g 21
<210> 219
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda oligonucleotídica para la detección del complejo de la tuberculosis
<400> 219 actcctcggg acarccacag cga 23
<210> 220
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223>
Descripción de Secuencia Artificial: sondas oligonucleotídicas para la detección de secuencias de M.avium y
M.
paratuberculosis
<400> 220 gttgcaaata gataagcgcc 20
<210> 221
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223>
Descripción de Secuencia Artificial: sondas oligonucleotídicas para la detección de secuencias de M.avium y
M.
paratuberculosis
<400> 221 tccgtcagcc cgggaacgcc 20
<210> 222
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda oligonucleotídica usada en la determinación de la integridad del ARNtm después del tratamiento de exterminio térmico de células de Listeria.
<400> 222 ttttgttttt ctttgcca 18
<210> 223
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: sonda oligonucleotídica usada en la determinación de la integridad del ARNtm después del tratamiento de exterminio térmico de células de Escherichia coli <400> 223 agttttcgtc gtttgcga 18
<210> 224
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador oligonucleotídico degenerativo para la amplificación de todas las secuencias micobacterianas.
<400> 224 caggcaashg accaccgtaa 20
<210> 225
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: Cebadores oligonucleotídicos degenerativos para la amplificación de todas las secuencias micobacterianas
<400> 225 ggatctccyg rtcwcrcgra cwa 23
<210> 226
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: cebador oligonucleotídico para la amplificación de las secuencias de M. avium y M. paratuberculosis
<400> 226 tgccggtgca ggcaactg 18
<210> 227
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: cebador oligonucleotídico para la amplificación de las secuencias de M. avium y M. paratuberculosis
<400> 227 cacgcgaaca agccagga 18
<210> 228
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: cebador oligonucleotídico para la detección de las secuencias del gen ssrA de Listeria
<400> 228 cattaaactt tagcaaggaa gtg 23

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Uso del gen ssrA o un fragmento del mismo que consiste al menos en 10 nucleótidos como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para la detección e identificación de Chlamydia trachomatis in vitro, en el que la secuencia del gen ssrA está seleccionada del grupo que consta de SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 21.
  2. 2.
    Uso de ARNtm, de un transcrito de ARN del gen ssrA o de un fragmento del mismo que consiste al menos en diez nucleótidos como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para la detección e identificación de Chlamydia trachomatis in vitro, en el que la secuencia del ARNtm está seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 20 y SEC ID Nº: 22.
  3. 3.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que un fragmento de la molécula del gen ssrA o un fragmento de una molécula de ARNtm, ambos correspondientes a una región de alta homología del extremo 5’ o a una región de alta homología del extremo 3’ de la molécula de ADN, se usa como una región diana universal.
  4. 4.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que un fragmento de la molécula del gen ssrA o un fragmento de una molécula de ARNtm, ambos correspondientes a una región de baja homología, se usa como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para diferenciar entre especies.
  5. 5.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que un fragmento de la molécula del gen ssrA o un fragmento de una molécula de ARNtm, ambos correspondientes a una región de baja homología, se usa como una región diana para la generación de una sonda específica de un género.
  6. 6.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho fragmento del gen ssrA o dicho fragmento de ARNtm se usa como base de un cebador para usar en un procedimiento de amplificación.
  7. 7.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el producto del procedimiento de amplificación se usa como región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda.
  8. 8.
    Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que un transcrito de ADNc de una molécula de ARNtm se usa como una sonda en un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos.
  9. 9.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región diana se usa como base de un ensayo para diferenciar organismos procariotas o eucariotas, vivos y muertos o en un formato de sondas múltiples para la detección y/o identificación a gran escala de organismos procariotas o eucariotas.
  10. 10.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que una sonda del gen ssrA o una sonda de un transcrito de ARNtm está unida a un sistema de microplaca de genes de micromatriz para la detección e identificación a gran escala a alto rendimiento de organismos procariotas o eucariotas.
  11. 11.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región diana se usa como una sonda en un ensayo para detectar organismos procariotas o eucariotas en una muestra de materia.
  12. 12.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que un fragmento del gen ssrA o del transcrito de ARNtm se usa en un ensayo para obtener un perfil de ADN de un organismo procariota o eucariota y, por lo tanto, diferenciar entre cepas de la misma especie.
  13. 13.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el gen ssrA, el transcrito de ARNtm o una secuencia de ADN complementaria de éste o un fragmento del mismo, se usa para diseñar un agente dirigido contra organismos infecciosos procariotas o eucariotas para propósitos terapéuticos.
  14. 14.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la región diana se usa para controlar la eficacia de las terapias con fármacos contra agentes infecciosos o para controlar la viabilidad y el nivel de organismos beneficiosos para la salud en el tracto gastrointestinal.
  15. 15.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ensayo se usa para la cuantificación de organismos procariotas o eucariotas.
ES10160953T 1999-05-14 2000-05-15 Ensayos de diagnóstico a base de sondas de ácido nucleico para organismos procariotas y eucariotas Expired - Lifetime ES2380577T3 (es)

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