JP2014115121A - 微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】微小粒子を複数の蛍光色素で修飾した場合でも、各色素から発せられる蛍光を精度よく検出することができる微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法を提供する。
【解決手段】異なる波長のレーザ光を出射する複数の光源を備え、流路内を通流する微小粒子にレーザ光を照射する光照射部を備える微小粒子分析装置に、光照射部の各光源の発光を制御する光源駆動制御部を設け、この光源駆動制御部により、各光源に第1の電流を供給すると共に、第1の電流を供給している間に第2の電流を光源毎に時分割で供給することにより、微小粒子に波長が異なる複数のレーザ光を時分割で照射する。
【選択図】図1
【解決手段】異なる波長のレーザ光を出射する複数の光源を備え、流路内を通流する微小粒子にレーザ光を照射する光照射部を備える微小粒子分析装置に、光照射部の各光源の発光を制御する光源駆動制御部を設け、この光源駆動制御部により、各光源に第1の電流を供給すると共に、第1の電流を供給している間に第2の電流を光源毎に時分割で供給することにより、微小粒子に波長が異なる複数のレーザ光を時分割で照射する。
【選択図】図1
Description
本技術は、微小粒子などの試料を光学的に検出する微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法に関する。より詳しくは、複数の光源を用いた微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法に関する。
細胞、微生物及びリポソームなどの生体関連微小粒子の識別には、フローサイトメトリー(フローサイトメーター)を用いた光学的測定方法が利用されている。このフローサイトメトリーは、流路内を1列になって通流する微小粒子に特定波長のレーザ光を照射し、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することで、複数の微小粒子を1個ずつ識別する分析手法である。
また、近年、微小粒子を複数の蛍光色素で修飾し、各色素から発せられる蛍光を分離検出することで、各微小粒子について複数の情報を得るマルチカラー分析も行われている。このマルチカラー分析に対応するため、従来、流路を通流する微小粒子に、波長が異なる複数のレーザ光を照射し、微小粒子から発せられる複数波長の蛍光を検出可能にしたフローサイトメーターが提案されている(例えば、特許文献1〜3参照。)。
図16は特許文献1に記載の従来のフローサイトメーターの構成を模式的に示す図である。図16に示すように、特許文献1に記載のフローサイトメーター101は、主に、フロー系102と、光学系103と、信号処理装置104とで構成されている。そして、蛍光色素で修飾された細胞105をフロー系102のフローセル内で1列に配列し、光学系103により各細胞105に波長の異なる複数のレーザ光を照射する。
その際、変調器を内蔵する光源106a,106b,106cから、互いに異なる波長を有する複数のレーザ光を、所定の周期及び互いに異なる位相で出射する。これら複数のレーザ光は、導光部材107により同一の入射光路上に導光され、細胞105に集光される。そして、細胞105から発せられた散乱光や蛍光は、ハーフミラーやバンドパスフィルターなどにより波長毎に分離された後、各PMT(Photo-Multiplier Tube;光電子増倍管)で検出される。
しかしながら、従来のフローサイトメーターには、各検出器に目的以外の蛍光色素からの蛍光が漏れ込むことがあるため、精度よく分析を行うためには、蛍光が重なり合った部分を差し引く蛍光補正を行う必要がある。蛍光の漏れ込みの問題は、特許文献2に記載の測定方法のように、励起スペクトラムが重複しない色素を使用することにより解消するが、そうすると、選択できる色素が限定されてしまう。
一方、特許文献1に記載のフローサイトメーターは、複数のレーザ光を所定の周期及び互いに異なる位相で出射しているが、この方法では、各レーザが点灯と消灯を交互に繰り返し行うため、発光遅れ現象や発光後の緩和振動が発生する。例えば、数百MHzの周波数で発光と消灯を繰り返すと、この発光と消灯の繰り返しにより生じる発光遅れ時間は数ns程度に達することがあり、必要なタイミングでレーザを発光させることができなくなる。特に、点灯と消灯を高速で切り替える場合には、波形制御が極めて難しくなる。また、レーザ緩和振動現象が生じると、波高値が一定でなくなるため、変動した値を検出する可能性があり、その場合、測定値の精度が低下する。
そこで、本開示は、微小粒子を複数の蛍光色素で修飾した場合でも、各色素から発せられる蛍光を精度よく検出することができる微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法を提供することを主目的とする。
本開示に係る微小粒子分析装置は、異なる波長のレーザ光を出射する複数の光源を備え、流路内を通流する微小粒子に前記レーザ光を照射する光照射部と、前記光照射部の各光源の発光を制御する光源駆動制御部と、を有し、前記光源駆動制御部は、各光源に第1の電流を供給すると共に、前記第1の電流を供給している間に第2の電流を光源毎に時分割で供給する。
この微小粒子分析装置では、前記第1の電流を、前記第2の電流よりも大きくすることができる。
また、前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、前記第1の電流の供給を制御する第1電流制御部と、前記第2の電流の供給を制御する第2電流制御部が設けられていてもよい。
更に、前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、オートパワーコントロール回路と、駆動回路とが設けられていてもよい。
一方、本開示の微小粒子分析装置は、少なくとも、前記微小粒子から発せられた光を波長分離する分光光学系と、前記分光光学系により分離された光を検出する複数の光検出器とを備え、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する光検出部を有していてもよい。
この光検出部には、前記光検出器毎に、検出信号の取得を制御する検出回路が設けられていてもよい。
その場合、検出回路は、補正モードと測定モードとを切り替えるスイッチを備えていてもよい。
また、前記光源駆動制御部に設けられた複数のオートパワーコントロール回路と、前記光検出部に設けられた複数の検出回路に、タイミング信号を出力するタイミング発生回路を設けることもできる。
この微小粒子分析装置では、前記第1の電流を、前記第2の電流よりも大きくすることができる。
また、前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、前記第1の電流の供給を制御する第1電流制御部と、前記第2の電流の供給を制御する第2電流制御部が設けられていてもよい。
更に、前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、オートパワーコントロール回路と、駆動回路とが設けられていてもよい。
一方、本開示の微小粒子分析装置は、少なくとも、前記微小粒子から発せられた光を波長分離する分光光学系と、前記分光光学系により分離された光を検出する複数の光検出器とを備え、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する光検出部を有していてもよい。
この光検出部には、前記光検出器毎に、検出信号の取得を制御する検出回路が設けられていてもよい。
その場合、検出回路は、補正モードと測定モードとを切り替えるスイッチを備えていてもよい。
また、前記光源駆動制御部に設けられた複数のオートパワーコントロール回路と、前記光検出部に設けられた複数の検出回路に、タイミング信号を出力するタイミング発生回路を設けることもできる。
本開示に係る微小粒子分析方法は、複数の光源からそれぞれ異なる波長のレーザ光を出射し、各レーザ光を流路内を通流する微小粒子に照射する光照射工程を有し、各光源に第1の電流を供給すると共に、前記第1の電流を供給している間に第2の電流を光源毎に時分割で供給することにより、前記微小粒子に、波長が異なる複数のレーザ光を時分割で照射する。
この微小粒子分析方法では、前記第1の電流を、前記第2の電流よりも大きくしてもよい。
また、前記第1の電流の供給と、前記第2の電流の供給を、個別に独立して制御することもできる。
更に、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を波長分離する分光工程と、複数の光検出器により前記分光工程により分離された光を検出する検出工程と、を有していてもよい。
その場合、前記光源の発光と前記光検出器の検出を同期させることができる。
また、検出工程により検出された蛍光データを、予め検出されたオフセットデータに基づいて補正を行ってもよい。
この微小粒子分析方法では、前記第1の電流を、前記第2の電流よりも大きくしてもよい。
また、前記第1の電流の供給と、前記第2の電流の供給を、個別に独立して制御することもできる。
更に、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を波長分離する分光工程と、複数の光検出器により前記分光工程により分離された光を検出する検出工程と、を有していてもよい。
その場合、前記光源の発光と前記光検出器の検出を同期させることができる。
また、検出工程により検出された蛍光データを、予め検出されたオフセットデータに基づいて補正を行ってもよい。
本開示によれば、緩和振動や発光遅れを防止しつつ、検出光の相互干渉を抑制することができるため、各色素から発せられる蛍光を精度よく検出することが可能となる。
以下、本開示を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本開示は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。また、説明は、以下の順序で行う。
1.第1の実施の形態
(レーザ光を時分割照射する微小粒子分析装置の例)
2.第1の実施の形態の変形例
(蛍光用の対物レンズユニットを備える微小粒子分析装置の例)
3.第2の実施の形態
(補正機能を備える微小粒子分析装置の例)
1.第1の実施の形態
(レーザ光を時分割照射する微小粒子分析装置の例)
2.第1の実施の形態の変形例
(蛍光用の対物レンズユニットを備える微小粒子分析装置の例)
3.第2の実施の形態
(補正機能を備える微小粒子分析装置の例)
<1.第1の実施の形態>
[全体構成]
先ず、本開示の第1の実施形態の微小粒子分析装置について説明する。図1は本実施形態の微小粒子分析装置の構成を示すブロック図であり、図2はその全体回路図である。図1に示すように、本実施形態の微小粒子分析装置1には、サンプル流内を1列になって通流する微小粒子10に、レーザ光を照射する光照射部2と、光照射部2の各光源の発光を制御する光源駆動制御部3とが設けられている。
[全体構成]
先ず、本開示の第1の実施形態の微小粒子分析装置について説明する。図1は本実施形態の微小粒子分析装置の構成を示すブロック図であり、図2はその全体回路図である。図1に示すように、本実施形態の微小粒子分析装置1には、サンプル流内を1列になって通流する微小粒子10に、レーザ光を照射する光照射部2と、光照射部2の各光源の発光を制御する光源駆動制御部3とが設けられている。
この微小粒子分析装置1は、レーザ光が照射された微小粒子10から発せられた蛍光を検出する蛍光検出部4を備えており、また、必要に応じて散乱光を検出する散乱光検出部5など蛍光以外の光を検出するその他の光検出部が設けられていてもよい。
[光照射部2]
光照射部2には、例えば、励起光となるレーザ光を発生する光源ユニット21と、光源ユニット21で発生したレーザ光を微小粒子10に向けて集光する対物レンズユニット23とが設けられている。光源ユニット21には、それぞれ異なる波長のレーザ光を発生する複数の光源が設けられており、各光源から出射されたレーザ光は、ミラーやレンズなどを用いて集光され、光ファイバ22により対物レンズユニット23に導光される。
光照射部2には、例えば、励起光となるレーザ光を発生する光源ユニット21と、光源ユニット21で発生したレーザ光を微小粒子10に向けて集光する対物レンズユニット23とが設けられている。光源ユニット21には、それぞれ異なる波長のレーザ光を発生する複数の光源が設けられており、各光源から出射されたレーザ光は、ミラーやレンズなどを用いて集光され、光ファイバ22により対物レンズユニット23に導光される。
[光源駆動制御部3]
光源駆動制御部3は、光源ユニット21に設けられた各光源の発光を制御するものであり、例えば、光源毎に、オートパワーコントロール(APC)回路部APC1〜APC4と駆動回路部D1〜D4とが設けられている。
光源駆動制御部3は、光源ユニット21に設けられた各光源の発光を制御するものであり、例えば、光源毎に、オートパワーコントロール(APC)回路部APC1〜APC4と駆動回路部D1〜D4とが設けられている。
図3はAPC回路部の構成を示すブロック図である。図3に示すように、各APC回路部APC1〜APC4には、ピーク信号及び振幅信号それぞれについて、検波回路、差動増幅回路、サンプルホールド(S/H)回路及びローパスフィルター(LPF)回路が設けられている。また、各APC回路部APC1〜APC4は、ピーク電流及びボトム電流を独立して制御可能な構成となっている。
一方、図4は駆動回路部の構成を示すブロック図であり、図5は回路図である。図4に示すように、各駆動回路部D1〜D4には、電圧電流変換回路と、電流スイッチと、レーザ駆動回路とが設けられている。そして、図5に示すように、レーザ駆動回路の電流スイッチは、エミッタ結合回路の片方のトランジスタをカスコード接続し、このコレクタに、トランジスタQ4のコレクタを接続した構成となっている。
なお、図1にはAPC回路部及び駆動回路部を4個ずつ設けた場合の構成を示しているが、本開示はこれに限定されるものではなく、APC回路部及び駆動回路部の数は、光源の数に応じて適宜変更することができる。
[光検出部]
蛍光検出部4は、微小粒子10から発せられた蛍光を波長分離する分光ユニット41と、分光ユニット41により分離された蛍光を検出する複数の光検出器(図示せず)などを備えている。この蛍光検出部4の分光ユニット41は、波長フィルタやミラーなどを備えており、検出対象の波長のみが光検出器に入射する構成となっている。
蛍光検出部4は、微小粒子10から発せられた蛍光を波長分離する分光ユニット41と、分光ユニット41により分離された蛍光を検出する複数の光検出器(図示せず)などを備えている。この蛍光検出部4の分光ユニット41は、波長フィルタやミラーなどを備えており、検出対象の波長のみが光検出器に入射する構成となっている。
一方、散乱光検出部5は、微小粒子10から発せられた散乱光を集光する集光レンズユニット51と、集光された散乱光を検出する光検出器(図示せず)などを備えている。この散乱光検出部5の集光レンズユニット51は、例えば集光レンズやミラーなどで構成されており、微小粒子10からの散乱光を光検出器に向けて集光する。
ここで、蛍光検出部4及び散乱光検出部5に設ける光検出器は、例えば、CCD(Charge Coupled Device;電荷結合素子)やPMT(Photo-Multiplier Tube;光電子増倍管)などを使用することができる。
更に、蛍光検出部4及び散乱光検出部5には、光検出器毎に検出信号の取得を制御する検出回路部S1〜S6が設けられている。図6は検出回路部の構成を示すブロック図である。図6に示すように、各検出回路部S1〜S6には、電流電圧変換アンプと、サンプルホールド(S/H)回路と、ローパスフィルタ回路と、アナログ−デジタル変換回路(ADC)がこの順に配置されている。
また、サンプルホールド(S/H)回路には、検出する蛍光(励起光を出射するレーザ)を選択する切り替えスイッチ(MPX)が接続されており、アナログ−デジタル変換回路(ADC)には、サンプルクロックが入力される。そして、本実施形態の微小粒子分析装置1では、ユーザが、検出対象の蛍光体と、使用する検出回路部S1〜S6のチャネルとの組合せを自由に変更できるように、光源選択信号は、情報処理装置などによって制御可能となっている。
[タイミング発生回路6]
本実施形態の微小粒子分析装置1には、光源駆動制御部3に設けられたAPC回路部APC1〜APC4と、光検出部4に設けられた検出回路部S1〜S6に、タイミング信号を出力するタイミング発生回路が設けられていてもよい。
本実施形態の微小粒子分析装置1には、光源駆動制御部3に設けられたAPC回路部APC1〜APC4と、光検出部4に設けられた検出回路部S1〜S6に、タイミング信号を出力するタイミング発生回路が設けられていてもよい。
タイミングが必要な信号は、光源のON/OFFと、検出回路部S1〜S6のサンプルホールド(S/H)回路を制御する信号の2種類である。そこで、タイミング発生回路6では、各光源を順次間欠的に点灯させるためのタイミング信号と、検出信号を取得させるためのタイミング信号とを生成する。
[動作]
次に、微小粒子分析装置1の動作、即ち、本実施形態の微小粒子分析装置1を使用して微小粒子10を分析する方法について説明する。本実施形態の微小粒子分析方法では、複数の光源からそれぞれ異なる波長のレーザ光を出射し、各レーザ光を流路内を通流する微小粒子に照射する。その際、各光源に第1の電流を供給すると共に、前記第1の電流を供給している間に第2の電流を光源毎に時分割で供給することにより、微小粒子10に、波長が異なる複数のレーザ光を時分割で照射する。
次に、微小粒子分析装置1の動作、即ち、本実施形態の微小粒子分析装置1を使用して微小粒子10を分析する方法について説明する。本実施形態の微小粒子分析方法では、複数の光源からそれぞれ異なる波長のレーザ光を出射し、各レーザ光を流路内を通流する微小粒子に照射する。その際、各光源に第1の電流を供給すると共に、前記第1の電流を供給している間に第2の電流を光源毎に時分割で供給することにより、微小粒子10に、波長が異なる複数のレーザ光を時分割で照射する。
ここで、本実施形態の微小粒子分析方法において測定される「微小粒子10」には、細胞、微生物及びリボゾームなどの生体関連微小粒子、又はラテックス粒子、ゲル粒子及び工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれる。
そして、生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リボゾーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。また、細胞には、植物細胞、動物細胞及び血球系細胞などが含まれる。更に、微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。この生体関連微小粒子には、核酸や蛋白質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。
一方、工業用粒子としては、例えば有機高分子材料、無機材料又は金属材料などで形成されたものが挙げられる。有機高分子材料としては、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどを使用することができる。また、無機材料としては、ガラス、シリカ及び磁性材料などを使用することができる。金属材料としては、例えば金コロイド及びアルミニウムなどを使用することができる。なお、これら微小粒子の形状は、一般には球形であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
本実施形態の微小粒子測定装置1においては、タイミング発生回路6によって各光源の発光タイミングを制御する。そして、流路を通流する微小粒子10が、レーザ光照射領域に入ると、光の拡散及び蛍光体によるレーザ光の波長変換を起こす。蛍光体は、特定の波長の光が照射されると蛍光体特有の波長スペクトルを持った光を放つ。
このとき、検出回路部S1〜S6は、特定の光源が発光しているときにのみ検出信号を取得し、検出対象外の光源が発光している際には、それまでに取得した信号レベルを維持する。この信号は、ローパスフィルタ(LPF)回路を介すことによって、サンプリング周波数成分が除去され、その後アナログ−デジタル変換回路により、デジタルデータ化される。
以下、本実施形態の微小粒子分析装置1に設けられた各回路の動作について説明する。図7は各光源の発光パターンを示す図であり、図8はタイミング信号のパターンを示す図である。また、図9は検出信号とサンプルホールドのタイムチャートである。
光源駆動制御部3の各APC回路部APC1〜APC4には、レーザ光出力モニタ信号として、光検出器において光電変換された電気信号(微小電流)が入力される。そして、このレーザ光出力モニタ信号は、電流電圧変換アンプ(I/V)を介して、2つの検波回路に入力される。
ピーク値用検波回路では、レーザ光出力モニタ信号のピーク値を検出し、差動増幅回路において、設定したピークの値と比較してその差を取り、非常に大きなゲインで増幅する(誤差信号増幅)。差動増幅回路では、設定値と光検出した信号(レーザ光出力モニタ信号)との比較信号を増幅することで、レーザの発光パワーの制御を行う。具体的には、設定値に対して帰還されたレーザ光出力モニタ信号の方が大きい場合は光出力を小さく、一方帰還された光検出信号レーザ光出力モニタ信号のほう方が小さい場合は光出力を大きくするよう制御する。
そして、この増幅された信号を一度サンプルホールド(S/H)回路で正確なピーク値を取り込み、ホールドする。その後、サンプルホールド(S/H)回路の出力を、gmアンプ(駆動回路部のトランジスタQ4)に入力して、ピーク電流を得る。
一方、振幅用検波回路では、レーザ光出力モニタ信号の振幅値を検出し、差動増幅回路において、検出したボトムの電圧値はピークの設定値とボトムの設定値の差分と比較してその差を取ることによって、パルスの振幅値の誤差信号とする。そして、この振幅値の誤差信号は、ピーク値と同様に、非常に大きなゲインで増幅される(誤差信号増幅)。この増幅された信号を一度サンプルホールド(S/H)回路で正確な振幅値を取り込み、ホールドする。その後、サンプルホールド(S/H)回路の出力を、gmアンプ(駆動回路部のトランジスタQ3)に入力して、振幅電流を得る。
各光源に供給されるパルス電流は、ピーク値とボトム値で規定する。ピーク電流(第1の電流)は定電流源により制御し、ボトム電流(第2の電流)はトランジスタQ3を介して供給され、その値は、前述した定電流源により供給される直流電流と、トランジスタQ3の電流との差として制御する。これにより、レーザ特有の緩和振動や発光遅れを抑えることができる。また、本実施形態の微小粒子分析方法では、ピーク電流とボトム電流とを、独立制御しているため、温度ドリフトを抑えることもできる。
なお、ピーク電流及びボトム電流の値は、特に限定されるものではないが、光源の発光遅延と緩和振動の抑制の観点から、連続して供給される第1の電流は、光源(レーザ)が発振する閾値電流以上とすることが好ましい。この場合、時分割で供給される第2の電流は、連続して供給される第1の電流よりも小さい値とする。
また、トランジスタQ1とトランジスタQ2をスイッチングすることにより、トランジスタQ3で生成した直流電流をパルス形状とする。駆動回路部D1〜D4では、トランジスタQ3と出力端子との間にエミッタ結合回路が結合されているため、トランジスタQ3で決定した電流値(前述した直流電流と同じ値)を、トランジスタQ1とトランジスタQ2に交互に流すことにより、パルス状の電流を得ることができる。
トランジスタQ1,Q2のスイッチング動作は、それぞれのトランジスタの各ベース端子間に電位差を持たせることで実現することができる。例えば、トランジスタQ1,Q2は、HFアンプを介して、パルス信号源(タイミングジェネレータ)によりスイッチング制御することができる。そして、各光源の発光タイミングの制御は、このタイミングジェネレータにより行う。
これにより、各光源がパルス発光し、微小粒子10には、波長が異なる複数のレーザ光が時分割で照射される。その際、図7に示すように、各光源は、非常に低い出力(バイアスパワー:例えば1〜2mW)で常時点灯しており、バイアスパワーよりも十分に大きい出力(ピークパワー:例えば10mW以上)でパルス発光する。このとき、ピークパワーの値は、バイアスパワーの2倍以上であればよく、好ましくは10倍以上、更に好ましくは50〜100倍である。これにより、蛍光検出時のクロストークを低減することができる。
微小粒子10から発せられた散乱光や蛍光は、CCDやPMTなどの光検出器により検出され、電流信号として出力される。この電流信号は、電流電圧変換(I/V)アンプにより電圧信号に変換され、サンプルホールド(S/H)回路に入力される。このサンプルホールド(S/H)回路において、検出対象の蛍光を励起する光源が点灯している間に信号レベルを取得し、それ以外の光源が点灯している間はレベルを保持する。これにより、図9に示す蛍光信号が得られる。
そして、本実施形態の微小粒子の検出方法では、タイミング発生回路6において、タイミング信号を生成することで、光源の発光と光検出器の検出とを同期させる。タイミング発生回路6は、光源駆動制御部3に、各光源を順次間欠的に点灯させるタイミング信号を出力する(図8参照)。また、蛍光検出部4には、特定の光源が点灯している間のみ検出信号を通過させ、それ以外は信号レベルを保持し、かつ光源が点灯してから検出回路部の各光検出器に光が到達するまでの間の伝播遅延時間を考慮したタイミング信号を出力する(図8参照)。
図10Aは本実施形態の微小粒子分析方法により得た蛍光スペクトルであり、図10Bは従来の方法で得た蛍光スペクトルである。検出回路部S2で対象とする蛍光について、図10Bに示す従来法により得た蛍光スペクトルでは、破線で囲んだ部分の光は不要である。しかし、同軸光学系で全光源を同時発光させる従来の方法では、光学フィルタを使用しても、この部分の光を除去することができなかった。
これに対して、図10Aに示す本実施形態の方法で得た蛍光スペクトルでは、検出回路部S3で検出する波長帯域と検出回路部S5で検出する波長帯域の光を除去することが可能となる。その結果、本実施形態の微小粒子分析装置1では、検出回路部S2で対象とする蛍光を精度良く検出することが可能となる。
本実施形態の微小粒子分析装置1では、微小粒子に波長が異なる複数のレーザ光を、時分割で照射しているため、検出光の相互干渉を抑制することができる。また、時分割照射を行うと、全体として照射光量が低減されるため、微小粒子やプラスチック製マイクロ流路に与えるダメージを軽減することもできる。
更に、本実施形態の微小粒子分析装置1では、第1の電流を供給している間にパルス発光用の第2の電流を供給するため、各光源は、前述した特許文献1に記載の装置のように完全に消灯することはなく、常に発振状態になっている。図11Aは本実施形態の微小粒子分析装置におけるレーザ発光波形を示す図であり、図11Bは従来の装置におけるレーザの発光波形を示す図である。
図11Bに示すように、従来の装置で時分割照射を行う場合、光源が消灯と点灯を繰り返すため、レーザの発光波形はパルス幅が保存されず、波形もひずんでしまう。このため、流路を通流する微小粒子の分析には不向きであった。これに対して、本実施形態の微小粒子分析装置1では、光源は消灯せず、発振状態にあるため、電流波形のパルス幅がそのまま発光波形のパルス幅となる。これにより、緩和振動や発光遅れに起因する種々の問題を解決することが可能であり、流路内を通流する微小粒子を、高精度に分析することができる。
<2.第1の実施の形態の変形例>
[微小粒子分析装置の全体構成]
次に、本開示の第1の実施形態の変形例に係る微小粒子分析装置について説明する。図12は本変形例の微小粒子分析装置の構成を示すブロック図である。なお、図12においては、図1に示す微小粒子分析装置1の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。
[微小粒子分析装置の全体構成]
次に、本開示の第1の実施形態の変形例に係る微小粒子分析装置について説明する。図12は本変形例の微小粒子分析装置の構成を示すブロック図である。なお、図12においては、図1に示す微小粒子分析装置1の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。
図1に示す微小粒子分析装置1では、光照射部2に設けられた対物レンズユニット23により、微小粒子10からの蛍光を集光しているが、本変形例の微小粒子分析装置11では、図12に示すように、蛍光検出部14に別途対物レンズユニット42を設けている。そして、対物レンズユニット42で集光された蛍光は、光ファイバなどを介して分光ユニット41に導光される。
このような構成にすることにより、細胞の複雑さを検出する横方向拡散光(Side Scatter)成分を検出することが可能となる。横方向散乱光は、後方散乱光よりも検出される光量が大きいため、より高品質な拡散成分の信号を検出することができる。なお、本変形例の微小粒子分析装置11における上記以外の構成及び効果は、前述した第1の実施形態と同様である。
<3.第2の実施の形態>
次に、本開示の第2の実施形態に係る微小粒子分析装置について説明する。前述したように、各光源をパルス発光させる際に、そのピークパワーをバイアスパワーよりも十分に大きくすれば、時分割照射を行っても、検出される蛍光のクロストークを低減することができる。しかしながら、ピークパワーを十分に大きくすることができない場合は、検出される蛍光にクロストークが発生することがあり、また、パルス発光時以外にも、光源が低出力で発光していることによりオフセットが発生することもある。
次に、本開示の第2の実施形態に係る微小粒子分析装置について説明する。前述したように、各光源をパルス発光させる際に、そのピークパワーをバイアスパワーよりも十分に大きくすれば、時分割照射を行っても、検出される蛍光のクロストークを低減することができる。しかしながら、ピークパワーを十分に大きくすることができない場合は、検出される蛍光にクロストークが発生することがあり、また、パルス発光時以外にも、光源が低出力で発光していることによりオフセットが発生することもある。
そこで、本実施形態の微小粒子分析装置では、光検出部において補正を行い、クロストークやオフセットの影響を抑制する。例えば、特定の光源LDiがピークパワーで発光しているとき、他の光源は低出力のバイアスパワーで発光している。オフセットは、検出対象の蛍光を励起する光源以外の光源も発光していることによって発生する。従って、光源LDi以外の光源をバイアスパワーで点灯させたときの蛍光信号を取得することで、オフセットを補正することができる。
[検出回路部]
図13は本実施形態の微小粒子分析装置における検出回路部の構成を示すブロック図である。図13に示すように、本実施形態の微小粒子分析装置の回路検出部は、電流電圧変換アンプに、サンプルホールド(S/H)回路とアナログスイッチが接続されている。そして、サンプルホールド(S/H)回路も、アナログスイッチに接続されており、アナログスイッチはローパスフィルタ回路を介して、アナログ−デジタル変換回路に接続されている。
図13は本実施形態の微小粒子分析装置における検出回路部の構成を示すブロック図である。図13に示すように、本実施形態の微小粒子分析装置の回路検出部は、電流電圧変換アンプに、サンプルホールド(S/H)回路とアナログスイッチが接続されている。そして、サンプルホールド(S/H)回路も、アナログスイッチに接続されており、アナログスイッチはローパスフィルタ回路を介して、アナログ−デジタル変換回路に接続されている。
また、サンプルホールド(S/H)回路には、検出する蛍光(励起光を出射するレーザ)を選択する切り替えスイッチ(MPX1)が接続されている。一方、アナログスイッチには、有効にするレーザを選択する切り替えスイッチ(MPX2)と、補正モード(Compensation Mode)入力端子が接続されている。そして、これら2種類の切り替えスイッチ(MPX1,MPX2)のいずれを動作させるかは、測定と補正とで切り替えられるようになっている。
具体的には、通常測定モードのときは、アナログスイッチはサンプルホールド(S/H)回路側を選択し、サンプルホールド(S/H)回路の出力をローパスフィルター(LPF)回路に伝達する。一方、補正モードのときは、アナログスイッチは、電流電圧変換アンプ(I/V)側を選択し、電流電圧変換アンプ(I/V)の出力をローパスフィルター(LPF)回路に伝達する。
[動作]
図14は通常測定時の光源の発光パターン及び蛍光スペクトルであり、図15は補正値取得時の光源の発光状態及び蛍光スペクトルである。図14Aに示す発光パターンで通常測定を行った場合、検出される蛍光スペクトルは、図14Bに示すようになる。そして、例えば光源LD2により励起される蛍光を、光検出器PD2で検出する場合、光検出器PD2で検出される合成信号レベル(Itotal-PD2)は、下記数式1により表される。
図14は通常測定時の光源の発光パターン及び蛍光スペクトルであり、図15は補正値取得時の光源の発光状態及び蛍光スペクトルである。図14Aに示す発光パターンで通常測定を行った場合、検出される蛍光スペクトルは、図14Bに示すようになる。そして、例えば光源LD2により励起される蛍光を、光検出器PD2で検出する場合、光検出器PD2で検出される合成信号レベル(Itotal-PD2)は、下記数式1により表される。
なお、上記数式1におけるI2-peakは光源LD2から発せられるレーザ光により励起された蛍光であり、Ix-biasは光源LDxから発せられるレーザ光に起因する光である。また、e1〜e4は各蛍光の光検出器PD2における通過波長帯域内の蛍光変換効率(波長平均値)である。
ここで、光源LD2以外の光源に由来する光がオフセット成分である(図14B参照)。そこで、補正を行う際には、図15Aに示すように、光源LD2のみを消灯し、それ以外の光源を点灯させた状態で、光検出器PD2で検出を行う。これにより、オフセット成分を示す図15Bに示すスペクトラムが得られる。なお、補正時に検出される合成信号レベル(Itotal-PD2)は、下記数式2により表される。
そして、下記数式3に示すように、上記数式1と数式2との差を求めることにより、オフセット成分を除いた必要な信号のみを取り出すことができる。
ここで、検出回路部は、補正モード(Compensation Mode)が「L」のときは、通常測定を行い、「H」のときに前述したオフセット補正を行う。オフセット補正時には、アナログスイッチは電流電圧変換アンプに直結される。そして、この状態でアナログ−デジタル変換回路にデータ(オフセットデータ値)を取り込み、記憶する。この動作を、他の光源についても順次実行する。一方、通常測定時は、アナログスイッチをサンプルホールド(S/H)回路に直結し、前述したオフセットデータ値を用いて演算処理し、得られたデータを補正する。下記表1に各光源の動作を示す。なお、補正モード(Compensation Mode)が「H」のときに各光源(LD)は点灯する。
本実施形態の微小粒子分析装置は、オフセット機能を備えているため、蛍光の検出精度を更に向上させることができる。なお、本実施形態の微小粒子分析装置における上記以外の構成、動作及び効果は、前述した第1の実施形態及びその変形例と同様である。
また、本開示は、以下のような構成をとることもできる。
(1)
異なる波長のレーザ光を出射する複数の光源を備え、流路内を通流する微小粒子に前記レーザ光を照射する光照射部と、
前記光照射部の各光源の発光を制御する光源駆動制御部と、を有し、
前記光源駆動制御部は、各光源に第1の電流を供給すると共に、前記第1の電流を供給している間に第2の電流を光源毎に時分割で供給する微小粒子分析装置。
(2)
前記第1の電流は、前記第2の電流よりも大きい(1)に記載の微小粒子分析装置。
(3)
前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、前記第1の電流の供給を制御する第1電流制御部と、前記第2の電流の供給を制御する第2電流制御部が設けられている(1)又は(2)に記載の微小粒子分析装置。
(4)
前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、オートパワーコントロール回路と、駆動回路とが設けられている(1)〜(3)のいずれかに記載の微小粒子分析装置。
(5)
更に、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する光検出部を有し、
該光検出部は、少なくとも、
前記微小粒子から発せられた光を波長分離する分光光学系と、
前記分光光学系により分離された光を検出する複数の光検出器と
を備える(1)〜(4)のいずれかに記載の微小粒子分析装置。
(6)
前記光検出部には、前記光検出器毎に、検出信号の取得を制御する検出回路が設けられている(5)に記載の微小粒子分析装置。
(7)
前記検出回路は、補正モードと測定モードとを切り替えるスイッチを備える(6)に記載の微小粒子分析装置。
(8)
前記光源駆動制御部に設けられた複数のオートパワーコントロール回路と、前記光検出部に設けられた複数の検出回路に、タイミング信号を出力するタイミング発生回路を備える(6)又は(7)に記載の微小粒子分析装置。
(9)
複数の光源からそれぞれ異なる波長のレーザ光を出射し、各レーザ光を流路内を通流する微小粒子に照射する光照射工程を有し、
各光源に第1の電流を供給すると共に、前記第1の電流を供給している間に第2の電流を光源毎に時分割で供給することにより、前記微小粒子に、波長が異なる複数のレーザ光を時分割で照射する微小粒子分析方法。
(10)
前記第1の電流を、前記第2の電流よりも大きくする(9)に記載の微小粒子分析方法。
(11)
前記第1の電流の供給と、前記第2の電流の供給を、個別に独立して制御する(9)又は(10)に記載の微小粒子分析方法。
(12)
前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を波長分離する分光工程と、
複数の光検出器により前記分光工程により分離された光を検出する検出工程と、
を有する(9)〜(11)のいずれかに記載の微小粒子分析方法。
(13)
前記光源の発光と前記光検出器の検出を同期させる(12)に記載の微小粒子分析方法。
(14)
前記検出工程により検出された蛍光データを、予め検出されたオフセットデータに基づいて補正を行う(12)又は(13)に記載の微小粒子分析方法。
(1)
異なる波長のレーザ光を出射する複数の光源を備え、流路内を通流する微小粒子に前記レーザ光を照射する光照射部と、
前記光照射部の各光源の発光を制御する光源駆動制御部と、を有し、
前記光源駆動制御部は、各光源に第1の電流を供給すると共に、前記第1の電流を供給している間に第2の電流を光源毎に時分割で供給する微小粒子分析装置。
(2)
前記第1の電流は、前記第2の電流よりも大きい(1)に記載の微小粒子分析装置。
(3)
前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、前記第1の電流の供給を制御する第1電流制御部と、前記第2の電流の供給を制御する第2電流制御部が設けられている(1)又は(2)に記載の微小粒子分析装置。
(4)
前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、オートパワーコントロール回路と、駆動回路とが設けられている(1)〜(3)のいずれかに記載の微小粒子分析装置。
(5)
更に、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する光検出部を有し、
該光検出部は、少なくとも、
前記微小粒子から発せられた光を波長分離する分光光学系と、
前記分光光学系により分離された光を検出する複数の光検出器と
を備える(1)〜(4)のいずれかに記載の微小粒子分析装置。
(6)
前記光検出部には、前記光検出器毎に、検出信号の取得を制御する検出回路が設けられている(5)に記載の微小粒子分析装置。
(7)
前記検出回路は、補正モードと測定モードとを切り替えるスイッチを備える(6)に記載の微小粒子分析装置。
(8)
前記光源駆動制御部に設けられた複数のオートパワーコントロール回路と、前記光検出部に設けられた複数の検出回路に、タイミング信号を出力するタイミング発生回路を備える(6)又は(7)に記載の微小粒子分析装置。
(9)
複数の光源からそれぞれ異なる波長のレーザ光を出射し、各レーザ光を流路内を通流する微小粒子に照射する光照射工程を有し、
各光源に第1の電流を供給すると共に、前記第1の電流を供給している間に第2の電流を光源毎に時分割で供給することにより、前記微小粒子に、波長が異なる複数のレーザ光を時分割で照射する微小粒子分析方法。
(10)
前記第1の電流を、前記第2の電流よりも大きくする(9)に記載の微小粒子分析方法。
(11)
前記第1の電流の供給と、前記第2の電流の供給を、個別に独立して制御する(9)又は(10)に記載の微小粒子分析方法。
(12)
前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を波長分離する分光工程と、
複数の光検出器により前記分光工程により分離された光を検出する検出工程と、
を有する(9)〜(11)のいずれかに記載の微小粒子分析方法。
(13)
前記光源の発光と前記光検出器の検出を同期させる(12)に記載の微小粒子分析方法。
(14)
前記検出工程により検出された蛍光データを、予め検出されたオフセットデータに基づいて補正を行う(12)又は(13)に記載の微小粒子分析方法。
1、11 微小粒子分析装置
2 光照射部
3 光源駆動制御部
4、14 蛍光光検出部
5 散乱光検出部
6 タイミング発生回路部
10 微小粒子
21 光源ユニット
22 光ファイバ
23、42 対物レンズユニット
41 分光ユニット
51 集光レンズユニット
101 フローサイトメーター
102 フロー系
103 光学系
104 信号処理装置
105 細胞
106a,106b,106c 光源
107 導光部材
2 光照射部
3 光源駆動制御部
4、14 蛍光光検出部
5 散乱光検出部
6 タイミング発生回路部
10 微小粒子
21 光源ユニット
22 光ファイバ
23、42 対物レンズユニット
41 分光ユニット
51 集光レンズユニット
101 フローサイトメーター
102 フロー系
103 光学系
104 信号処理装置
105 細胞
106a,106b,106c 光源
107 導光部材
Claims (14)
- 異なる波長のレーザ光を出射する複数の光源を備え、流路内を通流する微小粒子に前記レーザ光を照射する光照射部と、
前記光照射部の各光源の発光を制御する光源駆動制御部と、を有し、
前記光源駆動制御部は、各光源に第1の電流を供給すると共に、前記第1の電流を供給している間に第2の電流を光源毎に時分割で供給する微小粒子分析装置。 - 前記第1の電流は、前記第2の電流よりも大きい請求項1に記載の微小粒子分析装置。
- 前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、前記第1の電流の供給を制御する第1電流制御部と、前記第2の電流の供給を制御する第2電流制御部が設けられている請求項1に記載の微小粒子分析装置。
- 前記光源駆動制御部には、前記光源毎に、オートパワーコントロール回路と、駆動回路とが設けられている請求項1に記載の微小粒子分析装置。
- 更に、前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を検出する光検出部を有し、
該光検出部は、少なくとも、
前記微小粒子から発せられた光を波長分離する分光光学系と、
前記分光光学系により分離された光を検出する複数の光検出器と
を備える請求項1に記載の微小粒子分析装置。 - 前記光検出部には、前記光検出器毎に、検出信号の取得を制御する検出回路が設けられている請求項5に記載の微小粒子分析装置。
- 前記検出回路は、補正モードと測定モードとを切り替えるスイッチを備える請求項6に記載の微小粒子分析装置。
- 前記光源駆動制御部に設けられた複数のオートパワーコントロール回路と、前記光検出部に設けられた複数の検出回路に、タイミング信号を出力するタイミング発生回路を備える請求項5に記載の微小粒子分析装置。
- 複数の光源からそれぞれ異なる波長のレーザ光を出射し、各レーザ光を流路内を通流する微小粒子に照射する光照射工程を有し、
各光源に第1の電流を供給すると共に、前記第1の電流を供給している間に第2の電流を光源毎に時分割で供給することにより、前記微小粒子に、波長が異なる複数のレーザ光を時分割で照射する微小粒子分析方法。 - 前記第1の電流を、前記第2の電流よりも大きくする請求項9に記載の微小粒子分析方法。
- 前記第1の電流の供給と、前記第2の電流の供給を、個別に独立して制御する請求項9に記載の微小粒子分析方法。
- 前記レーザ光が照射された微小粒子から発せられた光を波長分離する分光工程と、
複数の光検出器により前記分光工程により分離された光を検出する検出工程と、
を有する請求項9に記載の微小粒子分析方法。 - 前記光源の発光と前記光検出器の検出を同期させる請求項12に記載の微小粒子分析方法。
- 前記検出工程により検出された蛍光データを、予め検出されたオフセットデータに基づいて補正を行う請求項12に記載の微小粒子分析方法。
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