JP2020204604A - 粒子分析装置及び粒子分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】複数の異常な細胞に由来するエクソソームを効率良く分析できるようにする。【解決手段】エクソソームに存在する互いに異なる複数の表面分子に互いに異なる複数の蛍光マーカを修飾したサンプルに対して、複数の蛍光マーカそれぞれに対応した励起波長の光を照射する光照射部２と、複数の蛍光マーカそれぞれの発光を検出する光検出部３と、光検出部３の検出信号に基づいて、各蛍光マーカが修飾されたエクソソームを分析する分析部４とを備え、光検出部３は、検出信号として動画像データを出力するものであり、分析部４は、動画像データを用いて、各蛍光マーカが修飾されたエクソソームのブラウン運動を追跡し、その拡散速度から各蛍光マーカが修飾されたエクソソームの粒子径分布を算出するものである。【選択図】図１
Description
本発明は、粒子を分析する粒子分析装置及び粒子分析方法に関するものである。
例えばがん細胞等の異常な細胞から分泌されるエクソソームは、他の正常な細胞に働きかけてがん化させるなどの機能を有していると考えられている。また、エクソソームは、異常な細胞の特徴を反映していると考えられており、その内部には、異常な細胞に由来する核酸（マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ＤＮＡなど）やタンパク質等を含んでいる。
そして、特許文献１に示すように、このエクソソームの内部に存在するマイクロＲＮＡを分析することによって、異常な細胞の有無、つまり、病気の診断を行う診断装置が考えられている。
一方で、本願発明者は、エクソソームの内部に含まれる核酸やタンパク質等ではなく、エクソソームの表面に存在するテトラスパニン（ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９等）、膜貫通タンパク質（ＣＤ１３等）、膜輸送・結合タンパク質（Ａｎｎｅｘｉｎ等）、細胞接着分子（ＭＦＧ−Ｅ８等）、糖鎖又は脂質ラフト（コレステロール等）といった表面分子に着目して、エクソソーム自体をバイオマーカとして、異常な細胞の有無を検出することを考えている。
ここで、エクソソームの表面分子は、当該エクソソームが分泌された異常な細胞によって異なることから、診断したい病気に応じて表面分子の状態を検査する必要がある。ところが、エクソソームの表面分子には、特定の異常な細胞にのみ現れるものもあれば、複数の異常な細胞に共通のものもあると考えられる。そうすると、エクソソームの１つの表面分子のみを検査するものでは、当該表面分子に特徴付けられる異常な細胞の有無を検出できるとは限らず、また、別の異常な細胞の有無を誤検出してしまう恐れがある。
そこで、本発明は、複数の異常な細胞に由来するエクソソーム等の粒子を効率良く分析できるようにすることをその主たる課題とするものである。
すなわち、本発明に係る粒子分析装置は、粒子に存在する互いに異なる複数の表面分子に互いに異なる複数の蛍光マーカを修飾したサンプルに対して、前記複数の蛍光マーカそれぞれに対応した励起波長の光を照射する光照射部と、前記複数の蛍光マーカそれぞれの発光を検出する光検出部と、前記光検出部により得られた検出信号を用いて前記各蛍光マーカが修飾された粒子を分析する分析部とを備え、前記光検出部は、前記検出信号として動画像データを出力するものであり、前記分析部は、前記動画像データを用いて、各蛍光マーカが修飾された粒子のブラウン運動を追跡し、その拡散速度から前記各蛍光マーカが修飾された粒子の粒子径分布を算出することを特徴とする。
この粒子分析装置であれば、粒子の表面分子に複数の蛍光マーカを修飾したサンプルに対して、複数の蛍光マーカそれぞれに対応した励起波長の光を照射するので、各蛍光マーカが修飾された粒子をそれぞれ別個に分析することができる。例えば粒子がエクソソームの場合には、各エクソソームを分泌した異常な細胞を解析することができ、その解析結果から病気を診断することができる。例えば、特定の異常な細胞にのみ現れる表面分子に蛍光マーカをつければ、その特定の異常な細胞の有無を検出できる。また、複数の異常な細胞に共通で現れる表面分子に蛍光マーカをつければ、複数の蛍光マーカそれぞれの検出結果の組み合わせにより、特定の異常な細胞の有無を検出できるようになる。特に本発明では、粒子トラッキング解析法（particle tracking analysis;ＰＴＡ又はnano tracking analysis;ＮＴＡ）を用いたものであり、分析部は、動画像データを用いて、各蛍光マーカが修飾されたエクソソームのブラウン運動を追跡し、その拡散速度から前記各蛍光マーカが修飾されたエクソソームの粒子径分布を算出するので、各蛍光マーカが修飾されたエクソソームについて個別に粒子径分布を測定することができるので、各エクソソームを分泌した異常な細胞を解析しやすくできる。
ここで、前記複数の蛍光マーカが、前記エクソソームにおけるガン由来の表面分子に修飾されているものであれば、ガンの診断やモニタリングに用いることができる。その他、蛍光マーカとしてガン以外の疾患マーカや未病診断マーカなどを用いることにより、ガン以外の疾患の診断やモニタリング、或いは、未病診断を行うことができる。
各蛍光マーカが修飾された粒子を精度良く分析するためには、前記光照射部は、各蛍光マーカに対応する励起波長の光を順番に照射するものであることが望ましい。
前記光検出部は、前記励起波長の光を遮断するフィルタを有することが望ましい。
この構成であれば、前記励起波長の光の散乱光を除去することができるので、各蛍光マーカが修飾された粒子を精度良く分析することができる。
この構成であれば、前記励起波長の光の散乱光を除去することができるので、各蛍光マーカが修飾された粒子を精度良く分析することができる。
また、本発明に係る粒子分析方法は、粒子に存在する互いに異なる複数の表面分子に、互いに異なる複数の蛍光マーカを修飾する修飾工程と、前記修飾工程により得られたサンプルに対して、前記複数の蛍光マーカそれぞれに対応した励起波長の光を照射して、前記複数の蛍光マーカそれぞれの発光を検出して動画像データを取得し、前記動画像データを用いて、各蛍光マーカが修飾された粒子のブラウン運動を追跡し、その拡散速度から前記各蛍光マーカが修飾された粒子の粒子径分布を算出する分析工程とを備えることを特徴とする。
前記粒子としてエクソソームを含む生体試料中の夾雑物を除去してサンプルを生成するためには、生体試料を遠心分離する分離工程と、前記修飾工程は、前記分離工程により得られた上清に対して前記複数の蛍光マーカを添加することより行われることが望ましい。
分離工程によりエクソソーム等の粒子が分離されているか否かを判断して粒子の分析を効率良く行うためには、粒子分析方法は、前記分離工程により得られた上清に対して粒径分布測定を行い、前記上清が所定の粒子径の粒子を含むか否かを判断する判断工程を更に備えることが望ましい。
エクソソームの分離回収率を向上させるためには、前記分離工程は、前記生体試料を遠心分離する第１分離工程と、前記第１分離工程により得られた上清を前記第１分離工程よりも高回転で遠心分離する第２分離工程とを含むことが望ましい。
以上に述べた本発明によれば、複数の異常な細胞に由来するエクソソーム等の粒子を効率良く分析できるようになる。
以下、本発明の一実施形態に係る粒子分析装置の一態様であるエクソソーム分析装置１００について、図面を参照しながら説明する。
本実施形態のエクソソーム分析装置１００は、例えば血液や尿等の体液試料に含まれるエクソソームを分析するものであり、エクソソームに存在する互いに異なる複数の表面分子に互いに異なる複数の蛍光マーカを修飾したサンプルに光を照射し、複数の蛍光マーカそれぞれの発光を検出して、エクソソームを分析するものである。
ここで、エクソソームに存在する表面分子は、テトラスパニン（ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９等）、膜貫通タンパク質（ＣＤ１３等）、膜輸送・結合タンパク質（Ａｎｎｅｘｉｎ等）、細胞接着分子（ＭＦＧ−Ｅ８等）、糖鎖又は脂質ラフト（コレステロール等）などである。また、蛍光マーカは、エクソソームの表面分子において例えばガン由来のものに結合するものであり、抗体によってエクソソームの表面分子に蛍光標識を修飾するものである。
具体的にエクソソーム分析装置１００は、図１に示すように、複数の蛍光マーカそれぞれに対応した励起波長の光を照射する光照射部２と、複数の蛍光マーカそれぞれの発光を検出する光検出部３と、光検出部３により得られた検出信号を用いて各蛍光マーカが修飾されたエクソソームを分析する分析部４とを備える。
また、エクソソーム分析装置１００は、前記サンプルが収容されたバッチ測定用のキュベットセル５が着脱可能に設置されるセル設置部（不図示）が設けられている。光照射部２及び光検出部３は、図１では、光照射部２の光照射方向と光検出部３の光検出方向とが互いに直交して設けられているが、これに限られない。
光照射部２は、複数の蛍光マーカそれぞれに対応した励起波長の光を照射する複数の光源２１、２２、２３を有している。光源２１、２２、２３は、例えばレーザ光源である。本実施形態は、３つの蛍光マーカを用いていることから、３つの光源２１、２２、２３を有している。なお、１つの光源において、３つの励起波長を含む光を照射するものであっても良い。また、光源の数は３つ以上有していても良い。
第１の光源２１は、第１の蛍光マーカの励起波長λ１の光を照射するものであり、第２の光源２２は、第２の蛍光マーカの励起波長λ２の光を照射するものであり、第３の光源２３は、第３の蛍光マーカの励起波長λ３の光を照射するものである。ここで、励起波長λ１、λ２、λ３は、３つの蛍光マーカが発光して生じる蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’とは異なる。また、これら各光源２１、２２、２３から射出された光は、反射ミラ２４１、２４２、ハーフミラ２４３、２４４、集光レンズ２４５等の照射光学系２４を介して、キュベットセル５に導光される。
これら光源２１、２２、２３は、図示しない制御部によって、各蛍光マーカに対応する励起波長λ１、λ２、λ３の光を順番に照射するように制御される。なお、これら光源２１、２２、２３は、同時に光を照射するように制御することもできる。
光検出部３は、前記キュベットセル５から出る複数の蛍光マーカそれぞれの発光を検出するものであり、本実施形態では、例えばＣＣＤカメラ等の撮像カメラ３１であり、検出信号として動画像データを出力する。また、光検出部３は、励起波長λ１、λ２、λ３の光を遮断して、蛍光波長λ１’、λ２’、λ３’の光を透過するフィルタ３３を有する。このフィルタ３３により、各蛍光マーカの発光を選択的に検出できるように構成してある。
分析部４は、動画像データを用いて、各蛍光マーカが修飾されたエクソソームのブラウン運動を追跡し、その拡散速度からストークス−アインシュタイン（Stokes-Einstein）の式に基づいてエクソソームの粒子径及び個数を算出する。そして、分析部４は、その算出結果から、各蛍光マーカが修飾されたエクソソームの粒子径分布を算出する（図２参照）。分析部４は、例えば、第１の蛍光マーカからの発光を撮像した動画像データを用いて、第１の蛍光マーカが修飾されたエクソソームの拡散速度を求め、その拡散速度から、当該エクソソームの粒子径分布を算出する。その他の蛍光マーカについても同様である。
次に、本実施形態のエクソソーム分析方法について図３を参照して説明する。
（Ｓ１）分離工程
まず、血液や尿などの体液である生体試料を遠心分離して、エクソソームを分離する。具体的には、生体試料を遠心分離する第１分離工程（Ｓ１−１）と、当該第１分離工程により得られた上清を第１分離工程よりも高回転で遠心分離する第２分離工程（Ｓ１−２）とを行う。なお、第２分離工程は、超遠心分離を行うものであっても良い。また、分離工程はカラム、フィルタ、マイクロ流路を使用した方法であっても良い。
まず、血液や尿などの体液である生体試料を遠心分離して、エクソソームを分離する。具体的には、生体試料を遠心分離する第１分離工程（Ｓ１−１）と、当該第１分離工程により得られた上清を第１分離工程よりも高回転で遠心分離する第２分離工程（Ｓ１−２）とを行う。なお、第２分離工程は、超遠心分離を行うものであっても良い。また、分離工程はカラム、フィルタ、マイクロ流路を使用した方法であっても良い。
（Ｓ２）判断工程
上記の分離工程（第２分離工程）により得られた上清に対して粒径分布測定を行い、上清が所定の粒子径の粒子を含むか否かを判断する。ここで、粒径分布測定に用いる装置は、上述したナノトラッキング法を用いたものであってもよいし、レーザ回折／散乱式のものや動的光散乱式のものであってもよい。
上記の分離工程（第２分離工程）により得られた上清に対して粒径分布測定を行い、上清が所定の粒子径の粒子を含むか否かを判断する。ここで、粒径分布測定に用いる装置は、上述したナノトラッキング法を用いたものであってもよいし、レーザ回折／散乱式のものや動的光散乱式のものであってもよい。
この判断工程により、所定の粒子径の粒子が含まれている場合には、次の検出工程に移る。一方、所定の粒子径の粒子が含まれていない場合には、当該上清をもう一度、第２分離工程にかけるか、廃棄する。
（Ｓ３）修飾工程
分離工程により得られた上清に対して複数の蛍光マーカを添加する。ここで、複数の蛍光マーカは、エクソソームにおけるガン由来の表面分子に結合するものである。これにより、エクソソームに存在する互いに異なる複数の表面分子に、互いに異なる複数の蛍光マーカが修飾される。
分離工程により得られた上清に対して複数の蛍光マーカを添加する。ここで、複数の蛍光マーカは、エクソソームにおけるガン由来の表面分子に結合するものである。これにより、エクソソームに存在する互いに異なる複数の表面分子に、互いに異なる複数の蛍光マーカが修飾される。
（Ｓ４）分析工程
修飾工程により得られたサンプルをキュベットセル５に収容し、当該キュベットセル５をエクソソーム分析装置１００のセル設置部に設置する。その後、エクソソーム分析装置１００において、キュベットセル５に複数の蛍光マーカそれぞれに対応した励起波長の光を照射して、複数の蛍光マーカそれぞれの発光を検出する。これにより、分析部４が、光検出部３により得られた検出信号（動画像データ）に基づいて、各蛍光マーカが修飾されたエクソソームの粒子径分布を算出する。算出された各エクソソームの粒子径分布（図２参照）は、エクソソーム分析装置１００のディスプレイ等に表示される。
修飾工程により得られたサンプルをキュベットセル５に収容し、当該キュベットセル５をエクソソーム分析装置１００のセル設置部に設置する。その後、エクソソーム分析装置１００において、キュベットセル５に複数の蛍光マーカそれぞれに対応した励起波長の光を照射して、複数の蛍光マーカそれぞれの発光を検出する。これにより、分析部４が、光検出部３により得られた検出信号（動画像データ）に基づいて、各蛍光マーカが修飾されたエクソソームの粒子径分布を算出する。算出された各エクソソームの粒子径分布（図２参照）は、エクソソーム分析装置１００のディスプレイ等に表示される。
なお、遠心分離によってある程度エクソソームを分離することができるが、同じ物性を持つ粒子（例えば、ウイルスや破壊された細胞片等）も上清（分離層）に含まれてしまう（図４参照）。しかし、本実施形態では特定のエクソソームの表面分子に対する抗体に蛍光マーカをつけているので、特定のエクソソームだけを、抗原抗体反応、受容体結合により特異的に検出することができる。
＜本実施形態の効果＞
このように構成した本実施形態のエクソソーム分析装置１００によれば、エクソソームの表面分子に複数の蛍光マーカを修飾したサンプルに対して、複数の蛍光マーカそれぞれに対応した励起波長の光を照射するので、各蛍光マーカが修飾されたエクソソームをそれぞれ別個に分析することができる。したがって、各エクソソームを分泌した異常な細胞を解析することができ、その解析結果から病気を診断することができる。例えば、特定の異常な細胞にのみ現れる表面分子に蛍光マーカをつければ、その特定の異常な細胞の有無を検出できる。また、複数の異常な細胞に共通で現れる表面分子に蛍光マーカをつければ、複数の蛍光マーカそれぞれの検出結果の組み合わせにより、特定の異常な細胞の有無を検出できるようになる。
このように構成した本実施形態のエクソソーム分析装置１００によれば、エクソソームの表面分子に複数の蛍光マーカを修飾したサンプルに対して、複数の蛍光マーカそれぞれに対応した励起波長の光を照射するので、各蛍光マーカが修飾されたエクソソームをそれぞれ別個に分析することができる。したがって、各エクソソームを分泌した異常な細胞を解析することができ、その解析結果から病気を診断することができる。例えば、特定の異常な細胞にのみ現れる表面分子に蛍光マーカをつければ、その特定の異常な細胞の有無を検出できる。また、複数の異常な細胞に共通で現れる表面分子に蛍光マーカをつければ、複数の蛍光マーカそれぞれの検出結果の組み合わせにより、特定の異常な細胞の有無を検出できるようになる。
＜その他の変形実施形態＞
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
例えば、前記実施形態のエクソソーム分析装置１００は、ナノトラッキング法（ＮＴＡ）を用いたものであったが、エクソソームのブラウン運動に伴う発光強度の揺らぎに基づいて粒子径分布を算出する動的散乱法を用いたものであっても良い。また、その他の光学分析方法についても適用することができる。
また、エクソソーム分析装置は、分析部４により得られた各蛍光マーカが修飾されたエクソソームの粒子径分布、粒子数、濃度等の粒子情報に基づいて、病気を診断する診断部を有するものであっても良い。この診断部は、例えば、メモリに記憶された粒子情報と病気との対応関係を示す関係データを用いて、病気を診断することができる。
前記実施形態の光検出部３は、ＣＣＤカメラなどの撮像カメラであったが、光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いたものであっても良い。ＰＭＴを用いた場合には、ＣＣＤカメラを用いた場合に比べて感度を向上させることができ、少量の発光でも検出することができる。その結果、例えば、初期段階のがんを診断できるようになる。
前記実施形態では、エクソソームの分離を遠心分離により行っているが、その他、磁気ビーズ（磁性粒子）を用いてエクソソームを分離しても良い。磁気ビーズを用いたエクソソームの分離方法としては、ビオチン標識抗エクソソーム抗体を結合した磁気ビーズをエクソソームに修飾して、エクソソームを単離する。そして、単離したエクソソームから磁気ビーズを切り離すことにより、エクソソームが分離される。
また、分析部４は、エクソソームの粒子径及び個数（濃度）の他に、ゼータ電位を測定する構成としても良い。この場合、複数の蛍光マーカが修飾されたエクソソーム全体の平均的なゼータ電位が測定される。また、エクソソーム分析装置１００のディスプレイ等の表示装置には、エクソソームの粒子径、個数（濃度）及びゼータ電位を例えば３次元グラフ上に表示する等、一画面上に表示することが望ましい。これにより、各エクソソームを分泌した異常な細胞の解析をより正確に行うことができる。また、ゼータ電位を測定することにより、エクソソームと抗体との反応具合いを調べることができる。
ここで、ゼータ電位を測定する構成としては、前記キュベットセル５にゼータ電位測定用の電極を設ける構成が考えられる。また、キュベットセル５の他に、連続測定用のフローセルを用いても良い。そして、当該フローセルにゼータ電位測定用の電極を設ける構成とする。フローセルを用いる場合には、ゼータ電位を測定する際に、サンプルのセルへの流入及び流出を停止して行い、ゼータ電位の測定終了後にサンプルを流すようにする。
前記実施形態は、粒子としてエクソソームを分析する例を示しているが、本発明は、エクソソーム以外の粒子、例えば、微生物、細胞、細胞内小器官（微小小胞体、核、ゴルジ体、ミトコンドリア、葉緑体等）、アポトーシス小体、細胞外小胞体（ＥＶ）、受容体、リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、核酸、抗体、タンパク質、ペプチド、アミン、その他生体物質、ウイルス、無機系粒子、ポリスチレンビーズ等の有機系粒子にも適用することができる。
その他、本発明の趣旨に反しない限りにおいて様々な実施形態の変形や組み合わせを行っても構わない。
１００・・・エクソソーム分析装置（粒子分析装置）
２ ・・・光照射部
２１ ・・・第１の光源
２２ ・・・第２の光源
２３ ・・・第３の光源
３ ・・・光検出部
３１ ・・・撮像カメラ
３２ ・・・フィルタ
４ ・・・分析部
２ ・・・光照射部
２１ ・・・第１の光源
２２ ・・・第２の光源
２３ ・・・第３の光源
３ ・・・光検出部
３１ ・・・撮像カメラ
３２ ・・・フィルタ
４ ・・・分析部
Claims (9)
- 粒子に存在する互いに異なる複数の表面分子に互いに異なる複数の蛍光マーカを修飾したサンプルに対して、前記複数の蛍光マーカそれぞれに対応した励起波長の光を照射する光照射部と、
前記複数の蛍光マーカそれぞれの発光を検出する光検出部と、
前記光検出部により得られた検出信号を用いて前記各蛍光マーカが修飾された粒子を分析する分析部とを備え、
前記光検出部は、前記検出信号として動画像データを出力するものであり、
前記分析部は、前記動画像データを用いて、各蛍光マーカが修飾された粒子のブラウン運動を追跡し、その拡散速度から前記各蛍光マーカが修飾された粒子の粒子径分布を算出するものである、粒子分析装置。 - 前記粒子は、エクソソームである、請求項１の記載の粒子分析装置。
- 前記複数の蛍光マーカは、前記エクソソームにおけるガン由来の表面分子に修飾されている、請求項２記載の粒子分析装置。
- 前記光照射部は、各蛍光マーカに対応する励起波長の光を順番に照射するものである、請求項１乃至３の何れか一項に記載の粒子分析装置。
- 前記光検出部は、前記励起波長の光を遮断するフィルタを有する、請求項１乃至４の何れか一項に記載の粒子分析装置。
- 粒子に存在する互いに異なる複数の表面分子に、互いに異なる複数の蛍光マーカを修飾する修飾工程と、
前記修飾工程により得られたサンプルに対して、前記複数の蛍光マーカそれぞれに対応した励起波長の光を照射して、前記複数の蛍光マーカそれぞれの発光を検出して動画像データを取得し、前記動画像データを用いて、各蛍光マーカが修飾された粒子のブラウン運動を追跡し、その拡散速度から前記各蛍光マーカが修飾された粒子の粒子径分布を算出する分析工程とを備える粒子分析方法。 - 前記粒子としてエクソソームを含む生体試料を遠心分離する分離工程と、
前記修飾工程は、前記分離工程により得られた上清に対して前記複数の蛍光マーカを添加することより行われる、請求項６記載の粒子分析方法。 - 前記分離工程により得られた上清に対して粒径分布測定を行い、前記上清が所定の粒子径の粒子を含むか否かを判断する判断工程を更に備える、請求項７記載の粒子分析方法。
- 前記分離工程は、前記生体試料を遠心分離する第１分離工程と、前記第１分離工程により得られた上清を前記第１分離工程よりも高回転で遠心分離する第２分離工程とを含む、請求項７又は８記載の粒子分析方法。
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