JP5614179B2 - Polymer compound for medical material and biochip substrate using the polymer compound - Google Patents
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Description
本発明は、生理活性物質を固定化する機能を有する医療材料用高分子化合物、該高分子材料を含む表面コーティング材料、該高分子化合物を用いたバイオチップ基板に関する。 The present invention relates to a polymer compound for medical materials having a function of immobilizing a physiologically active substance, a surface coating material containing the polymer material, and a biochip substrate using the polymer compound.
遺伝子活性の評価や疾患プロセス、薬物効果の生物学的プロセスを含む生物学的プロセスを解読するための試みにおいては、伝統的にゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供することができる。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、タンパク質レベルでの発現を検出し、定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究をも含む。 While attempts to decipher biological processes, including assessment of gene activity, disease processes, and biological processes of drug effects, have traditionally focused on genomics, proteomics Can provide more detailed information about functional functions. Proteomics involves qualitative and quantitative measurement of gene activity by detecting and quantifying expression at the protein level rather than at the gene level. It also includes studies of non-gene-encoded events such as post-translational modification of proteins and protein-protein interactions.
膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます迅速高効率化（ハイスループット化）が求められている。この目的の分子アレイとしてＤＮＡチップが実用化されてきた。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高いタンパク質の検出に関しては、プロテインチップが提唱され、最近研究が進められている。プロテインチップとは、タンパク質またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基板や粒子）表面に固定化したものの総称である。 Now that a large amount of genome information is available, proteomics research is increasingly required to be quick and efficient (high throughput). A DNA chip has been put into practical use as a molecular array for this purpose. On the other hand, regarding the detection of the most complex and highly diverse protein in biological functions, a protein chip has been proposed and recently researched. A protein chip is a general term for a protein or a molecule that captures it immobilized on the surface of a chip (a minute substrate or particle).
しかし、現状の生理活性物質固定化用チップは、一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされているため、ガラス基板や粒子において、タンパク質またはそれを捕捉する分子を表面に固定化する検討がなされている（例えば、特許文献１参照）。 However, the current chip for immobilizing physiologically active substances is generally developed on the extension line of the DNA chip, so it is considered to immobilize the protein or the molecule that captures it on the surface of the glass substrate or particle. (For example, refer to Patent Document 1).
これらのバイオチップを用いた被検物質の検出または定量のために、しばしば蛍光標識が用いられている。しかしながら、蛍光標識の多くは、ガラスやプラスチックの基板に非特異吸着されやすいという問題がある。また、タンパク質も基板に非特異吸着されやすい。蛍光標識やタンパク質が非特異的に基板に吸着すると、検出を目的として基板を使用した場合におけるバックグランドが上がり、検出感度が低下してしまう。定量を目的として基板を使用した場合には、大きな誤差の原因となり、正確な定量ができなくなってしまう。したがって、非特異吸着を抑制することが生理活性物質固定化用チップの開発において重要な要素となる。 In order to detect or quantify a test substance using these biochips, a fluorescent label is often used. However, many fluorescent labels have a problem that they are easily non-specifically adsorbed on a glass or plastic substrate. Proteins are also easily non-specifically adsorbed on the substrate. When a fluorescent label or protein is adsorbed nonspecifically on a substrate, the background when the substrate is used for detection increases, and the detection sensitivity decreases. When a substrate is used for the purpose of quantification, it causes a large error and accurate quantification cannot be performed. Therefore, suppressing nonspecific adsorption is an important factor in the development of a chip for immobilizing a physiologically active substance.
例えば、特許文献１や２の発明においては、生理活性物質固定のためのアミノ基含有ポリマーと親水性ポリマーを組み合わせることで、この目的を達成しようとした。基材の親水性を高めることで非特異吸着を抑制することが可能になった。 For example, in the inventions of Patent Documents 1 and 2, an attempt was made to achieve this object by combining an amino group-containing polymer for immobilizing a physiologically active substance and a hydrophilic polymer. It has become possible to suppress non-specific adsorption by increasing the hydrophilicity of the substrate.
しかしながら、親水性を高めることは、基材表面に水を落とした時の前進接触角を低くすることでもあり、その結果、生理活性物質を含む水溶液を基材表面にスポットした場合に、スポット面積が広がり、さらにスポット外周部がにじんで真円のスポットにならないなどの問題が生じた。 However, increasing the hydrophilicity also lowers the advancing contact angle when water is dropped on the substrate surface. As a result, when an aqueous solution containing a physiologically active substance is spotted on the substrate surface, the spot area is increased. As a result, the outer periphery of the spot bleeds and the spot does not become a perfect circle.
本発明の課題は、基板をコーティングした場合に、生理活性物質の固定化能力に優れ、タンパク質に対して非特異吸着が少なく、かつ、スポット面積が広がらずに高密度で生理活性物質をスポットすることを可能とする医療用高分子化合物を提供すること、および該高分子化合物を用いたバイオチップ用基板を提供することである。 The problem of the present invention is that when a substrate is coated, it has excellent ability to immobilize a physiologically active substance, has little nonspecific adsorption to proteins, and spots the physiologically active substance at a high density without increasing the spot area. An object of the present invention is to provide a high molecular compound for medical use that makes it possible to provide a biochip substrate using the high molecular compound.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）およびアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を共重合して得られる医療材料用高分子化合物であって、共重合体において、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の組成比が高められた医療材料用高分子化合物でコーティングされた基材が、生理活性物質の固定化能力に優れ、タンパク質に対して非特異吸着が少なく、かつ、生理活性物質を含む水溶液を滴下した場合においてスポット面積が広がらず、高密度で生理活性物質を基材に固定化しうることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having a functional group for immobilizing a physiologically active substance and an ethylenically unsaturated polymerization having an alkyl group. Polymeric compound for medical materials obtained by copolymerization of an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having a functional monomer (b) and an alkylene glycol residue, wherein the copolymer is an ethylene-based polymer having an alkyl group The base material coated with the polymer compound for medical materials in which the composition ratio of the unsaturated polymerizable monomer (b) is increased is excellent in the ability to immobilize a physiologically active substance, has less non-specific adsorption to proteins, and And found that when an aqueous solution containing a physiologically active substance is dropped, the spot area does not widen, and the physiologically active substance can be immobilized on the substrate at a high density, and the present invention is completed. It came to that.
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。 More specifically, the present invention provides the following inventions.
（１） 生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）およびアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を共重合して得られる医療材料用高分子化合物であって、共重合体において、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の組成比が７３〜８０ｍｏｌ％である医療材料用高分子化合物。 (1) An ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having a functional group for immobilizing a physiologically active substance, an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) having an alkyl group, and an ethylene unsaturated having an alkylene glycol residue A polymer compound for medical materials obtained by copolymerizing a polymerizable monomer (c), wherein the composition ratio of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) having an alkyl group in the copolymer is 73 to 80 mol%. A high molecular compound for medical materials.
（２） 生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ），アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）および架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）を共重合して得られる医療材料用高分子化合物であって、共重合体において、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の組成比が７３〜８０ｍｏｌ％である医療材料用高分子化合物。
(2) Ethylene unsaturated polymerizable monomer (a) having a functional group for immobilizing a physiologically active substance, ethylene unsaturated polymerizable monomer (b) having an alkyl group, ethylene unsaturated having an alkylene glycol residue A high molecular compound for medical materials obtained by copolymerizing a polymerizable monomer (c) and an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (d) having a crosslinkable functional group, the copolymer having an alkyl group A polymer compound for medical materials, wherein the composition ratio of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) is 73 to 80 mol%.
（３） 生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）の官能基がアルデヒド基、活性エステル、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチン、およびビオチンと特異的に反応する分子から選ばれる少なくとも一つの官能基である、（１）または（２）に記載の医療材料用高分子化合物。 (3) The functional group of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having a functional group for immobilizing a physiologically active substance specifically reacts with an aldehyde group, active ester, epoxy group, vinyl sulfone group, biotin, and biotin. The polymer compound for medical materials according to (1) or (2), which is at least one functional group selected from molecules to be used.
（４） 生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式［１］で表される活性エステルを有するモノマーである、（１）〜（３）のいずれか記載の医療材料用高分子化合物。 (4) The ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having a functional group for immobilizing a physiologically active substance is a monomer having an active ester represented by the following general formula [1] (1) to (3 The high molecular compound for medical materials in any one of).
（式中Ｒ２は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキル基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、または異なるアルキレングリコール残基の連鎖であってもよい。）
（５） 前記活性エステルがｐ−ニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、（３）または（４）に記載の医療材料用高分子化合物。
(In the formula, R 2 represents a hydrogen atom or a methyl group, Y represents an alkylene glycol residue or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, W represents an active ester group, and q represents an integer of 1 to 20.) When q is an integer of 2 or more and 20 or less, each repeated Y may be the same or a chain of different alkylene glycol residues.
(5) The polymer compound for medical materials according to (3) or (4), wherein the active ester is p-nitrophenyl ester or N-hydroxysuccinimide ester.
（６） アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）がｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、およびシクロヘキシルメタクリレートから選ばれる少なくとも一つのモノマーである、（１）〜（５）のいずれか記載の医療材料用高分子化合物。 (6) The ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) having an alkyl group is at least one monomer selected from n-butyl methacrylate, n-dodecyl methacrylate, n-octyl methacrylate, and cyclohexyl methacrylate, (1) to The polymer compound for medical materials according to any one of (5).
（７） アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）が下記の一般式［２］で表されるモノマーである、（１）〜（５）のいずれか記載の医療材料用高分子化合物。 (7) The medical material according to any one of (1) to (5), wherein the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having an alkylene glycol residue is a monomer represented by the following general formula [2] High molecular compound.
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。繰り返されるＸは、同一であっても、または異なるアルキレングリコール残基の連鎖であってもよい。）
（８） アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）がメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートである、（１）〜（７）のいずれか記載の医療材料用高分子化合物。
(Wherein R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group, R 2 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, X represents an alkylene glycol residue having 1 to 10 carbon atoms, p represents 1 to 1) Represents an integer of 100. Repeated Xs may be the same or a chain of different alkylene glycol residues.
(8) The polymer compound for medical materials according to any one of (1) to (7), wherein the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having an alkylene glycol residue is methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate.
（９） 前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコールの平均連鎖が３〜１００である、（８）に記載の医療材料用高分子化合物。 (9) The polymer compound for medical materials according to (8), wherein the average chain of ethylene glycol in the methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate is 3 to 100.
（１０） 架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）の架橋可能な官能基がアルコキシシリル、エポキシ、および（メタ）アクリルから選ばれる少なくとも一つの官能基である、（１）〜（９）のいずれか記載の医療材料用高分子化合物。 (10) The crosslinkable functional group of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (d) having a crosslinkable functional group is at least one functional group selected from alkoxysilyl, epoxy, and (meth) acryl. ) -Polymer compound for medical material according to any one of (9) to (9).
（１１） 架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）が下記の一般式［３］で表されるアルコキシシリルを有するモノマーである、（１）〜（１０）のいずれか記載の医療材料用高分子化合物。 (11) Any of (1) to (10), wherein the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (d) having a crosslinkable functional group is a monomer having alkoxysilyl represented by the following general formula [3] The high molecular compound for medical materials as described.
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ａ１、Ａ２、Ａ３のうち、少なくとも１個は加水分解可能なアルコキシ基であり、その他はアルキル基を示す。）
（１２） （１）〜（１１）のいずれか記載の医療材料用高分子化合物を含む医療材料用表面コーティング材料。
(In the formula, R 3 represents a hydrogen atom or a methyl group, and Z represents an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms. At least one of A 1 , A 2 , and A 3 is a hydrolyzable alkoxy group. And others represent alkyl groups.)
(12) A surface coating material for medical material comprising the polymer compound for medical material according to any one of (1) to (11).
（１３） （１）〜（１１）のいずれか記載の医療材料用高分子化合物を含む層を基板表面に形成したバイオチップ用基板。 (13) A biochip substrate in which a layer containing the polymer compound for medical materials according to any one of (1) to (11) is formed on a substrate surface.
（１４） 前記基板がプラスチック製である、（１３）に記載のバイオチップ用基板。 (14) The biochip substrate according to (13), wherein the substrate is made of plastic.
（１５） 前記バイオチップ用基板が、スライド、９６穴プレート、マイクロフルイディクス、ビーズ担体である基板。 (15) The substrate in which the biochip substrate is a slide, a 96-well plate, microfluidics, or a bead carrier.
（１６） 前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである、（１４）に記載のバイオチップ用基板。 (16) The biochip substrate as set forth in (14), wherein the plastic is a saturated cyclic polyolefin.
（１７） （１）〜（１１）のいずれか記載の医療材料用高分子化合物を含む溶液を基板表面に塗布した後、該高分子化合物を架橋させる、（１３）〜（１６）のいずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法。 (17) Any one of (13) to (16), wherein a solution containing the polymer compound for medical materials according to any one of (1) to (11) is applied to the substrate surface, and then the polymer compound is crosslinked. The manufacturing method of the board | substrate for biochips of description.
（１８） （１３）〜（１６）のいずれか記載のバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化したバイオチップ。 (18) A biochip in which a physiologically active substance is immobilized on the biochip substrate according to any one of (13) to (16).
（１９） 前記生理活性物質が核酸、ビオチンと特異的に反応する分子、アプタマー、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質から選ばれる少なくとも一つの生理活性物質である、（１８）に記載のバイオチップ。 (19) The physiologically active substance according to (18), wherein the physiologically active substance is at least one physiologically active substance selected from nucleic acids, molecules that specifically react with biotin, aptamers, proteins, oligopeptides, sugar chains, and glycoproteins. Biochip.
（２０） 前記ビオチンと特異的に反応する分子が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンである、（１９）に記載のバイオチップ。 (20) The biochip according to (19), wherein the molecule that specifically reacts with biotin is avidin, streptavidin, or neutravidin.
本発明によれば、基材表面をコーティングした場合に、生理活性物質の固定化能力に優れ、タンパク質に対して非特異吸着が少なく、高密度で生理活性物質をスポットすることが可能な医療用高分子化合物を提供できる。さらに該高分子化合物を用いたバイオチップ用基板を提供することができる。 According to the present invention, when a substrate surface is coated, the medically active substance has excellent ability to immobilize a physiologically active substance, has less non-specific adsorption to proteins, and can spot the physiologically active substance at high density. A polymer compound can be provided. Furthermore, a biochip substrate using the polymer compound can be provided.
本発明の高分子化合物は、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）およびアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を共重合して得られることを特徴とする。 The polymer compound of the present invention comprises an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having a functional group for immobilizing a physiologically active substance, an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) having an alkyl group, and an alkylene glycol residue. It is obtained by copolymerizing the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c).
この高分子化合物は、生理活性物質を固定化する性質、高い疎水性という性質、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質を併せ持つポリマーで、生理活性物質を固定化する官能基が生理活性物質を固定化する役割を果たし、アルキル基が高い疎水性をもたらす役割を果たし、アルキレングリコール残基が生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たす。 This high molecular compound is a polymer that has both the property of immobilizing physiologically active substances, the property of high hydrophobicity, and the property of suppressing nonspecific adsorption of physiologically active substances, and the functional group that immobilizes the physiologically active substance is physiologically active. It plays a role of immobilizing a substance, an alkyl group plays a role of providing high hydrophobicity, and an alkylene glycol residue plays a role of suppressing nonspecific adsorption of a physiologically active substance.
本発明に用いる生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）の官能基としては、化学的に活性な基、受容体基、リガンド基などがあるが、これらに限定されない。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチン（その誘導体を含む。以下、同様）、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基、ビオチンと特異的に反応する分子（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンなど）、金属キレートなどがあるがこれらに限定されない。これらの中でも生理活性物質に多く含まれるアミノ基との反応性の点からアルデヒド基、活性エステル、エポキシ基、ビニルスルホン基が好ましく、また生理活性物質と結合定数が高いビオチンや、ビオチンと特異的に反応する分子が好ましい。 Examples of the functional group of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having a functional group for immobilizing the physiologically active substance used in the present invention include a chemically active group, a receptor group, and a ligand group. It is not limited to. Specific examples include aldehyde groups, active esters, epoxy groups, vinyl sulfone groups, biotin (including derivatives thereof, the same applies hereinafter), thiol groups, amino groups, isocyanate groups, isothiocyanate groups, hydroxyl groups, and acrylate groups. , Maleimide groups, hydrazide groups, azide groups, amide groups, sulfonate groups, molecules that specifically react with biotin (such as avidin, streptavidin, neutravidin), metal chelates, and the like, but are not limited thereto. Of these, aldehyde groups, active esters, epoxy groups, and vinyl sulfone groups are preferred from the viewpoint of reactivity with amino groups that are abundantly contained in bioactive substances, and biotin that has a high binding constant with bioactive substances or biotin specific. Molecules that react with are preferred.
本発明に使用する生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）は、特に構造を限定しないが、下記の一般式［２］で表される（メタ）アクリル基と活性エステル基が炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基の連鎖またはアルキル基を介して結合した化合物であることが好ましい。 The ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having a functional group for immobilizing a physiologically active substance used in the present invention is not particularly limited in structure, but (meth) acrylic represented by the following general formula [2] A group in which a group and an active ester group are bonded via a chain of an alkylene glycol residue having 1 to 10 carbon atoms or an alkyl group is preferable.
式［１］で、アルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、さらに好ましくは２〜４であり、よりさらに好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Yの繰り返し数ｑは１〜２０の整数であり、より好ましくは２〜１８の整数であり、さらに好ましくは３〜１６の整数であり、最も好ましくは４〜１４の整数である。繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。 In the formula [1], the alkylene glycol residue Y has 1 to 10 carbon atoms, more preferably 1 to 6, more preferably 2 to 4, still more preferably 2 to 3, most preferably Preferably it is 2. The repeating number q of the alkylene glycol residue Y is an integer of 1 to 20, more preferably an integer of 2 to 18, still more preferably an integer of 3 to 16, and most preferably an integer of 4 to 14. . When the number of repetitions is 2 or more and 20 or less, the carbon number of the alkylene glycol residue to be repeated may be the same or different.
本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成などの分野で慣用されているものである。実際に、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類などがアルキルエステルなどに比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。 The “active ester group” used in the present invention is an ester group having a highly acidic electron-withdrawing group in one of the substituents of the ester group and activated for nucleophilic reaction, ie, the reaction activity. As meaning a high ester group, it is commonly used in various chemical synthesis fields such as polymer chemistry and peptide synthesis. In practice, phenol esters, thiophenol esters, N-hydroxyamine esters, esters of heterocyclic hydroxy compounds, and the like are known as active ester groups having much higher activity than alkyl esters and the like.
このような活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、コハク酸イミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、5−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基などが挙げられるが、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。 Examples of such active ester groups include p-nitrophenyl active ester groups, N-hydroxysuccinimide active ester groups, succinimide active ester groups, phthalimide active ester groups, 5-norbornene-2, and 3-dicarboxyl. Although an imide active ester group etc. are mentioned, a p-nitrophenyl active ester group or an N-hydroxysuccinimide active ester group is preferable, and a p-nitrophenyl active ester group is most preferable.
本発明に使用する「ビオチンと特異的に反応する分子」としては、特にアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンが好ましい。ビオチンとアビジンとの相互作用は非常に強く、特異性も高い。また、低分子であるビオチンを生理活性物質へ導入することも容易なため、物質固定化のための強力なツールとなる。 The “molecule specifically reacting with biotin” used in the present invention is particularly preferably avidin, streptavidin, or neutravidin. The interaction between biotin and avidin is very strong and highly specific. In addition, biotin, which is a low molecule, can be easily introduced into a physiologically active substance, which makes it a powerful tool for substance immobilization.
ビオチンと特異的に反応する分子は、上記の活性エステル基に固定化することもできる。この場合、反応性のしやすさを考慮すると、活性エステルは、ｐ-ニトロフェニルエステルまたはＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステルであることが好ましい。 Molecules that react specifically with biotin can also be immobilized on the active ester group. In this case, considering the ease of reactivity, the active ester is preferably p-nitrophenyl ester or N-hydroxysuccinimide ester.
本発明に使用する生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）の好ましい組成比は１〜５０ｍｏｌ％であり、より好ましくは１〜３０ｍｏｌ％、最も好ましくは１〜２０ｍｏｌ％である。 The preferred composition ratio of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having a functional group for immobilizing the physiologically active substance used in the present invention is 1 to 50 mol%, more preferably 1 to 30 mol%, and most preferably 1. ˜20 mol%.
本発明に使用するアルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）としては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、iso−ブチル（メタ）アクリレート、sec−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、sec−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、iso−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、iso−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、iso−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、iso−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、iso−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、iso−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、iso−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、iso−オクタデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレートなどが挙げられるが、ｎ―ブチルメタクリレートもしくはｎ−ドデシルメタクリレートもしくはｎ−オクチルメタクリレートが好ましい。共重合体において、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の好ましい組成比は５０〜８０ｍｏｌ％であり、より好ましくは６０〜８０ｍｏｌ％である。 Examples of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) having an alkyl group used in the present invention include n-butyl (meth) acrylate, iso-butyl (meth) acrylate, sec-butyl (meth) acrylate, t-butyl ( (Meth) acrylate, n-neopentyl (meth) acrylate, iso-neopentyl (meth) acrylate, sec-neopentyl (meth) acrylate, neopentyl (meth) acrylate, n-hexyl (meth) acrylate, iso-hexyl (meth) acrylate, Heptyl (meth) acrylate, n-octyl (meth) acrylate, iso-octyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, n-nonyl (meth) acrylate, iso-nonyl (meth) acrylate, n-decyl ( (Meth) acrylate, iso-decyl (Meth) acrylate, n-dodecyl (meth) acrylate, iso-dodecyl (meth) acrylate, n-tridecyl (meth) acrylate, iso-tridecyl (meth) acrylate, n-tetradecyl (meth) acrylate, iso-tetradecyl (meta ) Acrylate, n-pentadecyl (meth) acrylate, iso-pentadecyl (meth) acrylate, n-hexadecyl (meth) acrylate, iso-hexadecyl (meth) acrylate, n-octadecyl (meth) acrylate, iso-octadecyl (meth) acrylate Cyclohexyl (meth) acrylate, isobornyl (meth) acrylate and the like, and n-butyl methacrylate, n-dodecyl methacrylate or n-octyl methacrylate is preferable. In the copolymer, the preferred composition ratio of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) having an alkyl group is 50 to 80 mol%, more preferably 60 to 80 mol%.
このような組成比とすることにより、共重合体の疎水性を高めることができる。これにより基材表面に水溶液を落とした時の前進接触角を高くすることができるため、基材表面に生理活性物質を含む水溶液をスポットした場合に、スポット面積が広がらず、高密度で生理活性物質をスポットすることが可能となる。 By setting it as such a composition ratio, the hydrophobicity of a copolymer can be improved. This makes it possible to increase the advancing contact angle when the aqueous solution is dropped on the substrate surface, so that when spotting an aqueous solution containing a physiologically active substance on the substrate surface, the spot area does not widen and the physiological activity is high. It becomes possible to spot substances.
本発明に使用するアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）は、特に構造を限定しないが、一般式［２］で表される（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｘの連鎖からなる化合物であることが好ましい。 The ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having an alkylene glycol residue used in the present invention is not particularly limited in structure, but is a (meth) acryl group represented by the general formula [2] and a carbon number of 1 to 10 It is preferable that it is a compound which consists of the chain | strand of the alkylene glycol residue X.
式中のアルキレングリコール残基Ｘの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、さらに好ましくは２〜４であり、よりさらに好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｘの繰り返し数ｐは、１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、さらに好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。繰り返し数２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｘの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。 The alkylene glycol residue X in the formula has 1 to 10 carbon atoms, more preferably 1 to 6, more preferably 2 to 4, still more preferably 2 to 3, and most preferably 2. It is. The repeating number p of the alkylene glycol residue X is an integer of 1 to 100, more preferably an integer of 2 to 100, still more preferably an integer of 2 to 95, and most preferably an integer of 20 to 90. is there. When the number of repeats is 2 or more and 100 or less, the carbon number of the alkylene glycol residue X to be repeated may be the same or different.
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）としては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートなどの水酸基の一置換エステルの（メタ）アクリレート類、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール
（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートなどが挙げられるが、入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
Examples of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having an alkylene glycol residue include methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, 2-hydroxypropyl (meth) acrylate, and 2-hydroxybutyl. (Meth) acrylates of monosubstituted esters of hydroxyl groups such as (meth) acrylate, glycerol mono (meth) acrylate, (meth) acrylate having polypropylene glycol as a side chain, 2-methoxyethyl (meth) acrylate, 2-ethoxyethyl (Meth) acrylate, methoxydiethylene glycol (meth) acrylate, ethoxydiethylene glycol (meth) acrylate, ethoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, and the like are available. Methoxy polyethylene glycol methacrylate is preferably from.
本発明に使用するアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）の好ましい組成比は１０〜４０ｍｏｌ％であり、より好ましくは１０〜３０ｍｏｌ％である。 The preferable composition ratio of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having an alkylene glycol residue used in the present invention is 10 to 40 mol%, more preferably 10 to 30 mol%.
本発明に使用する高分子化合物は、上記モノマー以外に、架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）を含んでもよい。 The polymer compound used in the present invention may contain an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (d) having a crosslinkable functional group in addition to the above monomer.
本発明に使用する架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）は、架橋可能な官能基の反応が高分子化合物合成中に進行しないものであれば特に制限されるものではない。 The ethylenically unsaturated polymerizable monomer (d) having a crosslinkable functional group used in the present invention is not particularly limited as long as the reaction of the crosslinkable functional group does not proceed during the synthesis of the polymer compound. Absent.
架橋可能な官能基としては、例えば加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、(メタ)アクリル基、グリシジル基などが用いられるが、架橋処理が容易なことから加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、グリシジル基が好ましく、より低温で架橋できることから加水分解によりシラノール基を生成する官能基が好ましい。 Examples of functional groups that can be cross-linked include functional groups that generate silanol groups by hydrolysis, epoxy groups, (meth) acryl groups, glycidyl groups, and the like. A functional group, an epoxy group, or a glycidyl group is preferable, and a functional group that generates a silanol group by hydrolysis is preferable because it can be cross-linked at a lower temperature.
加水分解によりシラノール基を生成する官能基とは、水と接触すると容易に加水分解を受けシラノール基を生成する基であり、例えば、ハロゲン化シリル基、アルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基などを挙げることができる。ハロゲンを含まないことからアルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基が好ましく、なかでもシラノール基を生成し易い点からアルコキシシリル基が最も好ましい。 The functional group that generates a silanol group by hydrolysis is a group that readily undergoes hydrolysis and forms a silanol group when contacted with water. For example, a halogenated silyl group, an alkoxysilyl group, a phenoxysilyl group, an acetoxysilyl group And so on. An alkoxysilyl group, a phenoxysilyl group, and an acetoxysilyl group are preferable because they do not contain a halogen. Among them, an alkoxysilyl group is most preferable because a silanol group is easily generated.
加水分解によりシラノール基を生成する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、（メタ）アクリル基とアルコキシシリル基が炭素数１〜２０のアルキル鎖を介して、または直接結合した一般式［３］で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーであることが好ましい。 The ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group that generates a silanol group by hydrolysis has a general formula in which a (meth) acryl group and an alkoxysilyl group are bonded directly or via an alkyl chain having 1 to 20 carbon atoms. It is preferable that it is an ethylenically unsaturated polymerizable monomer represented by 3].
アルコキシシリル基を含有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、例えば、３−（メタ）アクリロキシプロペニルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルビス（トリメチルシロキシ）メチルシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、８−（メタ）アクリロキシオクタニルトリメトキシシラン、１１−（メタ）アクリロキシウンデニルトリメトキシシランなどの（メタ）アクリロキシアルキルシラン化合物などを挙げることができる。なかでも３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシランがアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとの共重合性が優れている点、入手が容易である点などから好ましい。これらのアルコキシシリル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。 Examples of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer containing an alkoxysilyl group include 3- (meth) acryloxypropenyltrimethoxysilane, 3- (meth) acryloxypropylbis (trimethylsiloxy) methylsilane, and 3- (meth). Acryloxypropyldimethylmethoxysilane, 3- (meth) acryloxypropyldimethylethoxysilane, 3- (meth) acryloxypropylmethyldimethoxysilane, 3- (meth) acryloxypropylmethyldiethoxysilane, 3- (meth) acryl Roxypropyltrimethoxysilane, 3- (meth) acryloxypropyltriethoxysilane, 3- (meth) acryloxypropyltris (methoxyethoxy) silane, 8- (meth) acryloxyoctanyltrimethoxysilane, 11- (meth) A And the like Lilo alkoxy, such as undecane sulfonyl trimethoxysilane (meth) acryloxy alkyl silane compound. Of these, 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane, 3-methacryloxypropyltriethoxysilane, 3-methacryloxypropyldimethylmethoxysilane, and 3-methacryloxypropyldimethylethoxysilane have an alkylene glycol residue. It is preferable from the viewpoints of excellent copolymerizability with monomers and easy availability. These ethylenically unsaturated polymerizable monomers having an alkoxysilyl group are used alone or in combination of two or more.
本発明に使用する架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）の好ましい組成比は１〜２０ｍｏｌ％であり、より好ましくは２〜１５ｍｏｌ％、最も好ましくは２〜１０ｍｏｌ％である。 The preferred composition ratio of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (d) having a crosslinkable functional group used in the present invention is 1 to 20 mol%, more preferably 2 to 15 mol%, most preferably 2 to 10 mol%. is there.
本発明の高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）およびアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。混合物は、さらに、架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）を含むことが好ましい。 The method for synthesizing the polymer compound of the present invention is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of synthesis, at least an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having a functional group for immobilizing a physiologically active substance, alkyl It is preferable to radically polymerize a mixture containing an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) having a group and an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having an alkylene glycol residue in a solvent in the presence of a polymerization initiator. . It is preferable that the mixture further contains an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (d) having a crosslinkable functional group.
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、２−ブタノン、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基材に該高分子化合物を塗布する場合は、エタノール、メタノールが基材を変性させないため好ましい。 Any solvent may be used as long as each ethylenically unsaturated polymerizable monomer can be dissolved. Examples thereof include 2-butanone, methanol, ethanol, t-butyl alcohol, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, and chloroform. be able to. These solvents are used alone or in combination of two or more. When the polymer compound is applied to a plastic substrate, ethanol and methanol are preferable because they do not denature the substrate.
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１
−カルボニトリル）などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリルなどの有機過酸化物などを挙げることができる。
As the polymerization initiator, any normal radical initiator may be used. For example, 2,2′-azobisisobutylnitrile (hereinafter referred to as “AIBN”), 1,1′-azobis (cyclohexane-1)
Azo compounds such as (carbonitrile), organic peroxides such as benzoyl peroxide and lauryl peroxide.
本発明の高分子化合物の化学構造は、その結合方式がランダム、ブロック、グラフトなどいずれの形態をなしていてもよい。 The chemical structure of the polymer compound of the present invention may be in any form such as random, block or graft.
本発明の高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応のエチレン系不飽和重合性モノマーとの分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。 The molecular weight of the polymer compound of the present invention is preferably 5,000 or more, more preferably 10,000 or more, because separation and purification of the polymer compound and unreacted ethylenically unsaturated polymerizable monomer are facilitated.
本発明の高分子化合物は、基材表面を該高分子化合物でコーティングすることにより、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、高い疎水性という性質、特定の生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。さらに、高分子主鎖同士を架橋させる性質を併せ持つことから、基材表面をコーティングした後に、架橋させることが可能である。これにより、基材上の高分子に不溶性を付与することができ、基材洗浄による信号低下を低減することができる。 The polymer compound of the present invention immobilizes a specific physiologically active substance by coating the substrate surface with the polymer compound, thereby suppressing nonspecific adsorption of the physiologically active substance, high hydrophobicity, and the like. It is possible to easily impart properties. Furthermore, since it has the property of cross-linking polymer main chains, it is possible to cross-link after coating the substrate surface. Thereby, insolubility can be imparted to the polymer on the base material, and signal degradation due to base material cleaning can be reduced.
基材表面への高分子化合物のコーティングは、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜１０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけなどの公知の方法で基材表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。 The coating of the polymer compound on the surface of the substrate is, for example, a known method such as preparing a polymer solution in which the polymer compound is dissolved in an organic solvent so as to have a concentration of 0.05 to 10% by weight, and dipping or spraying. After coating on the surface of the substrate, drying is performed at room temperature or under heating.
その後、架橋可能な官能基に応じた任意の方法で高分子の主鎖同士を架橋させることができる。架橋可能な官能基が加水分解によりシラノール基を生成する官能基の場合の高分子化合物のコーティングについては、有機溶剤中に水を含有させた混合溶液を用いてもよい。含有される水により加水分解が生じ、該合成高分子中にシラノール基が生成し、さらに加熱することにより主鎖同士が結合され、高分子化合物が不溶になる。 Thereafter, the main chains of the polymer can be cross-linked by any method according to the cross-linkable functional group. When the crosslinkable functional group is a functional group that generates a silanol group by hydrolysis, a mixed solution containing water in an organic solvent may be used. Hydrolysis occurs due to water contained therein, silanol groups are generated in the synthetic polymer, and the main chains are bonded to each other by heating to render the polymer compound insoluble.
含水量が少ないとシラノール基の生成が不十分で、架橋結合が弱くなる。一方、含水量が多くなると高分子化合物が溶媒に不溶となるおそれがある。理論上加水分解によりシラノール基を生成するのに必要な水が含有されていれば十分であるが、溶液の調製の容易さを考えると、含水量が約０．０１〜１５重量％程度のものが好ましい。 When the water content is low, silanol groups are not sufficiently generated and the cross-linking is weakened. On the other hand, when the water content increases, the polymer compound may become insoluble in the solvent. Theoretically, it is sufficient if the water necessary for generating silanol groups by hydrolysis is contained, but considering the ease of preparing the solution, the water content is about 0.01 to 15% by weight. Is preferred.
有機溶剤としては、２−ブタノン、エタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトンなどの単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、エタノール、メタノールがプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。また、溶液中で高分子化合物を加水分解させる場合にも、水と任意の割合で混ざるので好ましい。 As the organic solvent, a single solvent such as 2-butanone, ethanol, methanol, t-butyl alcohol, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, chloroform, acetone, methyl ethyl ketone, or a mixed solvent thereof is used. Of these, ethanol and methanol are preferable because they do not denature the plastic substrate and are easy to dry. Moreover, also when hydrolyzing a high molecular compound in a solution, since it mixes with water in arbitrary ratios, it is preferable.
本発明の高分子化合物を溶解した溶液を基材表面に塗布した後、乾燥させる工程において、高分子化合物中のシラノール基は、他の高分子化合物中のシラノール基、水酸基、アミノ基などと脱水縮合して架橋を形成する。さらに基材表面に水酸基、カルボニル基、アミノ基などがある場合も同様に脱水縮合し、基材表面と化学的に結合することができる。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるので、基材表面にコーティングされた高分子化合物は容易に溶解したり、基材から脱離してしまうことはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。高分子化合物が熱により変成されない温度範囲内、例えば、６０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理することが好ましい。 In the step of applying the solution in which the polymer compound of the present invention is dissolved to the substrate surface and then drying, silanol groups in the polymer compound are dehydrated with silanol groups, hydroxyl groups, amino groups, etc. in other polymer compounds. Condensate to form a crosslink. Further, when there is a hydroxyl group, a carbonyl group, an amino group or the like on the surface of the substrate, it can be similarly dehydrated and condensed and chemically bonded to the surface of the substrate. Since the covalent bond formed by the dehydration condensation of the silanol group has the property of being hardly hydrolyzed, the polymer compound coated on the surface of the substrate is not easily dissolved or detached from the substrate. The dehydration condensation of silanol groups is promoted by heat treatment. Heat treatment is preferably performed at a temperature in which the polymer compound is not denatured by heat, for example, 60 to 120 ° C. for 5 minutes to 24 hours.
本発明に使用するバイオチップ用基板の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。バイオチップ用基板の形状としては、例えば、スライド、９６穴プレート、マイクロフルイディクス、ビーズ担体などが挙げられる。 The material for the biochip substrate used in the present invention may be glass, plastic, metal, or the like, but from the viewpoint of ease of surface treatment and mass productivity, plastic is preferable, and thermoplastic resin is more preferable. Examples of the shape of the biochip substrate include a slide, a 96-well plate, microfluidics, and a bead carrier.
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、たとえばポリエチレン、ポリプロピレンなどの直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂などを用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。 As the thermoplastic resin, those that generate a small amount of fluorescence are preferable. For example, linear polyolefins such as polyethylene and polypropylene, cyclic polyolefins, fluorine-containing resins, and the like are preferably used. Heat resistance, chemical resistance, low fluorescence, It is more preferable to use a saturated cyclic polyolefin that is particularly excellent in moldability. Here, the saturated cyclic polyolefin refers to a saturated polymer obtained by hydrogenating a polymer having a cyclic olefin structure or a copolymer of a cyclic olefin and an α-olefin.
基材表面と表面にコーティングされる高分子化合物との密着性を高めるために、基材表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、ＡｒＦ、ＫｒＦなどのエキシマレーザーで処理する方法があるが、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。 In order to improve the adhesion between the substrate surface and the polymer compound coated on the surface, it is preferable to activate the substrate surface. As a means for activation, there are a plasma treatment method under conditions such as an oxygen atmosphere, an argon atmosphere, a nitrogen atmosphere, and an air atmosphere, and a treatment method using an excimer laser such as ArF or KrF. A plasma treatment method is preferred.
本発明の高分子化合物を基材に塗布することで容易に基材に生理活性物質の非特異的吸着を抑制されたバイオチップ基板を作製できる。さらに該高分子化合物を架橋することで、基材上の高分子化合物に不溶性を付与することができる。これらのことより、該高分子化合物を塗布した基材はバイオチップに好適に用いることができる。 By applying the polymer compound of the present invention to a substrate, a biochip substrate in which nonspecific adsorption of a physiologically active substance on the substrate can be easily produced. Furthermore, the polymer compound on the substrate can be rendered insoluble by crosslinking the polymer compound. From these things, the base material which apply | coated this high molecular compound can be used suitably for a biochip.
本発明のバイオチップ基板を使用して各種の生理活性物質を固定化することができる。固定化する生理活性物質は核酸、アプタマー、ビオチンと特異的に反応する分子、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質などがある。例えば核酸を固定化する場合は、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入することが好ましい。アミノ基の導入位置は分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端にアミノ基が導入されていることが好ましい。 Various bioactive substances can be immobilized using the biochip substrate of the present invention. Examples of physiologically active substances to be immobilized include nucleic acids, aptamers, molecules that react specifically with biotin, proteins, oligopeptides, sugar chains, glycoproteins, and the like. For example, when immobilizing a nucleic acid, it is preferable to introduce an amino group in order to increase the reactivity with the active ester group. The amino group may be introduced at the end of the molecular chain or at the side chain, but the amino group is preferably introduced at the end of the molecular chain.
固定化する生理活性物質にビオチンを、一般的な方法で導入することで、基材表面に固定化されたビオチンと特異的に反応する分子によって、効果的に目的の生理活性物質を固定化することが可能となる。より反応性を高めるために、ビオチンの導入位置は生理活性物質の末端や外側であることが望ましい。生理活性物質の合成法が進歩してきた事で、任意の位置にビオチンを導入できるようになってきており、生理活性を発現するために重要な部位に影響を及ぼさないような位置で生理活性物質を担体表面に固定化することが可能である。 By introducing biotin into the bioactive substance to be immobilized by a general method, the target bioactive substance is effectively immobilized by a molecule that specifically reacts with biotin immobilized on the substrate surface. It becomes possible. In order to enhance the reactivity, it is desirable that the biotin introduction site is at the end or outside of the physiologically active substance. Advances in the synthesis of bioactive substances have made it possible to introduce biotin at any position, and bioactive substances at positions that do not affect important sites for the expression of bioactivity. Can be immobilized on the surface of the carrier.
本発明において生理活性物質をバイオチップ基板上に固定化する際には、生理活性物質を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。生理活性物質を溶解または分散した液体のｐＨは６．０〜８．０であることが好ましく、ｐＨ６．５〜７．５がより好ましい。この範囲外のｐＨの場合には、生理活性物質や生理活性物質を固定化する分子が変性・分解するおそれがある。 In the present invention, when the physiologically active substance is immobilized on the biochip substrate, a method of spotting a liquid in which the physiologically active substance is dissolved or dispersed is preferable. The pH of the liquid in which the physiologically active substance is dissolved or dispersed is preferably 6.0 to 8.0, more preferably 6.5 to 7.5. If the pH is outside this range, the physiologically active substance or the molecule that immobilizes the physiologically active substance may be denatured or decomposed.
点着後、静置することにより、生理活性物質が表面に固定化される。例えばアミノ化された核酸を用いた場合は室温から８０℃において１時間静置することにより、固定化が可能である。処理温度は高いほうが好ましい。生理活性物質を溶解または分散させる液体としてはアルカリ性であることが好ましい。 The physiologically active substance is immobilized on the surface by standing after spotting. For example, when an aminated nucleic acid is used, it can be immobilized by allowing it to stand at room temperature to 80 ° C. for 1 hour. A higher processing temperature is preferred. The liquid in which the physiologically active substance is dissolved or dispersed is preferably alkaline.
洗浄後は生理活性物質を固定化した以外の基板表面の官能基を不活性化処理する。活性エステルやアルデヒド基の場合はアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。 After cleaning, the functional groups on the substrate surface other than those on which the physiologically active substance is immobilized are inactivated. In the case of an active ester or an aldehyde group, it is preferable to use an alkali compound or a compound having a primary amino group.
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを好ましく用いることができる。 As the alkali compound, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, disodium hydrogen phosphate, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, sodium borate, lithium hydroxide, potassium phosphate, etc. are preferably used. Can do.
一級アミノ基を有する化合物としては、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを好ましく用いることができ、アミノエタノール、グリシンが最も好ましい。 Examples of the compound having a primary amino group include methylamine, ethylamine, butylamine, glycine, 9-aminoacazine, aminobutanol, 4-aminobutyric acid, aminocaprylic acid, aminoethanol, 5-amino2,3-dihydro-1,4 -Pentanol, aminoethanethiol hydrochloride, aminoethanethiolsulfuric acid, 2- (2-aminoethylamino) ethanol, 2-aminoethyl dihydrogen phosphate, aminoethyl hydrogensulfate, 4- (2-aminoethyl) morpholine, 5-aminofluorescein, 6-aminohexanoic acid, aminohexylcellulose, p-aminohippuric acid, 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, 5-aminoisophthalic acid, aminomethane, aminophenol, 2 -Aminooctane, 2-aminooctanoic acid, 1- Amino 2-propanol, 3-amino-1-propanol, 3-aminopropene, 3-aminopropionitrile, aminopyridine, 11-aminoundecanoic acid, aminosalicylic acid, aminoquinoline, 4-aminophthalonitrile, 3-aminophthalimide , P-aminopropiophenone, aminophenylacetic acid, aminonaphthalene and the like can be preferably used, and aminoethanol and glycine are most preferable.
このように生理活性物質を固定化することによって得られたバイオチップは免疫診断、遺伝子マイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、マイクロフルイディスクデバイスを含めた多くの分析システムにおいて使用することができる。 The biochip obtained by immobilizing a physiologically active substance in this way can be used in many analysis systems including immunodiagnosis, gene microarray, protein microarray, and microfluidic device.
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（高分子化合物の合成例）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、平均Ｍｎ＝約４７５、Ａｌｄｒｉｃｈ製）、メタクリル酸ｎ−ブチル（ＢＭＡ、関東化学社製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン（ＭＰＤＭＳ、ＧＥＬＥＳＴ、ＩＮＣ.製）をそれぞれ表１の組成になるように２−ブタノン（キシダ化学製）に溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example and a comparative example, this invention is not limited to this.
(Synthesis example of polymer compound)
Polyethylene glycol methyl ether methacrylate (PEGMA, average Mn = about 475, manufactured by Aldrich), n-butyl methacrylate (BMA, manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), p-nitrophenyloxycarbonyl-polyethylene glycol methacrylate (MEONP), 3-methacryloxy Propyldimethylmethoxysilane (MPDMS, GELEST, INC.) Was dissolved in 2-butanone (Kishida Chemical Co., Ltd.) so as to have the composition shown in Table 1 to prepare a monomer mixed solution.
さらに０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬社製）を添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、１００℃で１晩反応させた後、反応溶液をアセトン／ヘキサン＝２／８（体積比）中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、３．３ｐｐｍ付近に現れるＰＥＧＭＡの末端メトキシ基に帰属されるピーク、１．４〜１．７ｐｐｍ付近に現れるＢＭＡのメチレンに帰属されるピーク、７．６および８．４ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、０．６ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＭＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、のそれぞれの積分値より、高分子化合物の組成比を算出した。表２に結果を示した。 Furthermore, 2,2-azobisisobutyronitrile (AIBN Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added so that it might become 0.01 mol / L, and it stirred until it became uniform. Then, after making it react at 100 degreeC overnight under argon gas atmosphere, the reaction solution was dripped in acetone / hexane = 2/8 (volume ratio), and precipitation was collected. The obtained polymer compound was measured by 1H-NMR in a deuterated chloroform solvent, and a peak attributed to the terminal methoxy group of PEGMA appearing in the vicinity of 3.3 ppm, belonging to methylene of BMA appearing in the vicinity of 1.4 to 1.7 ppm. From the integral values of the peak attributed to the benzene ring of MEONP appearing near 7.6 and 8.4 ppm, and the peak attributed to the methyl group bonded to Si of MPDMS appearing near 0.6 ppm The composition ratio of the polymer compound was calculated. Table 2 shows the results.
（スライド基板）
環状ポリオレフィン樹脂（日本ゼオン社製、ＺＥＯＮＥＸ480）をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工してスライド基板を作製した。酸素雰囲気化のプラズマ処理によって基板表面に酸化処理を施した。
(Slide board)
A cyclic polyolefin resin (manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd., ZEONEX 480) was processed into a slide glass shape (dimensions: 76 mm × 26 mm × 1 mm) to prepare a slide substrate. The substrate surface was oxidized by plasma treatment in an oxygen atmosphere.
この固相基板を前記各高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液に浸漬後、１００℃／１晩加熱乾燥することにより、基板表面に前記各高分子化合物を含む層を導入した
（接触角の測定）
前期各高分子化合物導入したスライド基板表面の表面接触角を測定した。
（アビジンの固定化）
１０μｇ／ｍＬ濃度のアビジン(ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ、ＰＩＥＲＣＥ社製 ３１０００) １．２Ｍリン酸水素２カリウム溶液に前記スライド基板を浸漬し、室温で２時間アビジン固定化反応を行い、反応後、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００(和光純薬工業、１９４８５４)／ ＰＢＳで３回洗浄した。
（ブロッキング）
ブロッキング液として、０．０２Ｍドデシルアミン（和光純薬工業、５８５-１３４１１）０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液（８Ｎ ＮａＯＨでｐＨ９に調整）を調製した。前記アビジン固定化スライド基板に対して前記ブロッキング液を入れ１時間反応し、未反応の活性エステルを反応させた。反応後、ミリＱ水（超純水）で５回洗浄した。
（蛍光測定）
ビオチン−ＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製、Ａ８５４９−１０ＭＧ）を炭酸バッファーに溶解した。蛍光試薬Ｃｙ３−Ｄｙｅ(ＧＥヘルスケア社製、ＰＡ２３００１)を３００μｇ／ｍＬになるように前記溶液に加え反応し、ビオチン−ＢＳＡ−Ｃｙ３を合成した。合成後、精製カラム(ＧＥヘルスケア社 １７−０８５１−０１)でＢｉｏｔｉｎ−ＢＳＡ−Ｃｙ３を精製した。
This solid phase substrate was immersed in a 0.3 wt% ethanol solution of each polymer compound, and then heated and dried at 100 ° C./night to introduce a layer containing each polymer compound on the substrate surface (contact angle). Measurement)
The surface contact angle of the surface of the slide substrate into which each polymer compound was introduced in the previous period was measured.
(Immobilization of avidin)
Avidin at a concentration of 10 μg / mL (NeutrAvidin, PIERCE 31000) The slide substrate was immersed in a 1.2M dipotassium hydrogen phosphate solution, and avidin fixation reaction was performed at room temperature for 2 hours. After the reaction, 0.05% Triton X100 (Wako Pure Chemical Industries, 194854) / Washed 3 times with PBS.
(blocking)
A 0.02M dodecylamine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 585-13411) 0.1M sodium chloride solution (adjusted to pH 9 with 8N NaOH) was prepared as a blocking solution. The blocking solution was added to the avidin-immobilized slide substrate and reacted for 1 hour to react with an unreacted active ester. After the reaction, it was washed 5 times with milli-Q water (ultra pure water).
(Fluorescence measurement)
Biotin-BSA (manufactured by Sigma-Aldrich, A8549-10MG) was dissolved in a carbonate buffer. A fluorescent reagent Cy3-Dye (manufactured by GE Healthcare, PA23001) was added to the solution so as to be 300 μg / mL and reacted to synthesize biotin-BSA-Cy3. After the synthesis, Biotin-BSA-Cy3 was purified with a purification column (GE Healthcare 17-0851-1).
４００μＬの前記ビオチン−ＢＳＡ−Ｃｙ３精製溶液を０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００/ＰＢＳ３．６ｍＬに加え全部で４ｍＬに調整した。スポティング装置（ニップンテクノクラスタ社製、ｐｉｘｓｙｓ４５００）ビオチン−ＢＳＡ−Ｃｙ３精製溶液５ｎＬを前記アビジン固定化スライド基板にスポッティングした。 400 μL of the biotin-BSA-Cy3 purified solution was added to 3.6 mL of 0.05% Triton X100 / PBS to adjust the total to 4 mL. Spotting device (Pixsys 4500, manufactured by Nipple Techno Cluster Co., Ltd.) 5 nL of a biotin-BSA-Cy3 purified solution was spotted on the avidin-immobilized slide substrate.
蛍光量の測定には、マイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ」（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＣｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ 感度５０％、励起波長５４３ｎｍ、測定波長５７０ｎｍとした。 A microarray scanner “ScanArray” (manufactured by Packard BioChip Technologies) was used for the measurement of the amount of fluorescence. The measurement conditions were laser output 90%, PMT sensitivity 50%, excitation wavelength 543 nm, and measurement wavelength 570 nm.
なお、実施例１および比較例３の蛍光測定の結果は、それぞれ図１と図２に示した。 The results of fluorescence measurement in Example 1 and Comparative Example 3 are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
本発明の高分子化合物でコーティングした基材は、生理活性物質の固定化能力に優れ、タンパク質に対して非特異吸着が少なく、かつ、高密度で生理活性物質をスポットすることが可能であるため、本発明の高分子化合物は、バイオチップ用基板の作製において有用であり、医療分野などにおいて大きく貢献しうるものである。 The base material coated with the polymer compound of the present invention has excellent ability to immobilize physiologically active substances, has less non-specific adsorption to proteins, and can spot physiologically active substances at high density. The polymer compound of the present invention is useful in the production of a biochip substrate and can greatly contribute to the medical field and the like.
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