JP2014036665A - Jcウイルス遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、JCウイルス遺伝子(JCウイルスゲノム)の発現を抑制するための二本鎖構造のリボ核酸(dsRNA)に関し、該dsRNAは、長さが30ヌクレオチド未満、通常は長さが19〜25ヌクレオチドでJCウイルス遺伝子の少なくとも一部にほぼ相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含む。本発明はまた、該dsRNAを医薬として許容可能な担体とともに含む医薬組成物;該医薬組成物を用いてJCウイルス発現を原因とする疾患を治療する方法;ならびに細胞内におけるJCウイルス遺伝子の発現を抑制する方法にも関する。
【選択図】なし
Description
本願は、2006年4月28日に出願された米国仮特許出願第60/795,965号の利益を主張する。かかる出願の内容は、参照により全体が本願に組み込まれる。
進行性多病巣性白質脳症(PML)は、人の脳の膠細胞中に存在する潜在ポリオーマウイルスJCビールス(JCV)とその生産複製物の再活性化によって生じる中枢神経系の致命的な脱髄疾患である(非特許文献1)。PMLは、かつてはリンパ増殖性および骨髄増殖性の疾患のために免疫系に障害を受けた患者で主として見られたかなり稀な疾患であったが、AIDS患者の間では主要な神経疾患の1つとなっている(非特許文献2) 。
)。さらに、アグノプロテインは、いくつかのサイクリンおよびそれに関連するキナーゼの発現を変更することにより細胞周期を制御不全にする(非特許文献8)。
ないことが示された(なお、他の報告書では、このAIDS治験研究班の試験でAraCがうまくいかなかったのは静脈内径路および髄腔内径路によったのでAraCが十分に送達されなかったためである可能性があることが示唆されている(非特許文献10))。トポイソメラーゼ阻害剤がJCV DNAの複製を抑制できる能力を示すインビトロ研究に基づいて、トポイソメラーゼ阻害剤のトポテカンをAIDS−PML患者の治療に使用したが、その結果、トポテカンによる治療が病変サイズの減少と生存期間の延長と関係している可能性があることが示唆された(非特許文献11)。
本発明は、二本鎖構造のリボ核酸(dsRNA)、ならびにそのようなdsRNAを使用して細胞または哺乳動物のJCウイルス遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法を提供する。本発明はさらに、JCウイルス感染によるPML等の病的状態および疾患を治療するための、組成物および方法を提供する。本発明のdsRNAは、長さ30ヌクレオチド未満、通常は長さ19〜24ヌクレオチドでJCウイルス遺伝子のmRNA転写物の少なくとも一部にほぼ相補的な領域を有するRNA鎖(アンチセンス鎖)を含む。
(項目1)
細胞内のヒトJCウイルスゲノムの発現を抑制するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、上記dsRNAは互いに相補的な少なくとも2つの配列を有し、センス鎖は第1の配列を有し、アンチセンス鎖はJCウイルスをコードするmRNAの少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含む第2の配列を有し、上記相補領域の長さは30ヌクレオチド未満であり、上記dsRNAは、JCウイルスを発現している細胞と接触させると、JCウイルスゲノムの発現を抑制する、dsRNA。
(項目2)
上記第1の配列は表1aおよび1bからなる群から選択され、上記第2の配列は表1aおよび1bからなる群から選択される、項目1に記載のdsRNA。
(項目3)
少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、項目1に記載のdsRNA。
(項目4)
少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、項目2に記載のdsRNA。
(項目5)
上記修飾ヌクレオチドは、2’‐O‐メチル修飾ヌクレオチド、5’‐ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、項目3または4に記載のdsRNA。
(項目6)
上記修飾ヌクレオチドは、2’‐デオキシ‐2’‐フルオロ修飾ヌクレオチド、2’‐デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’‐アミノ修飾ヌクレオチド、2’‐O‐アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、および非天然の塩基を含むヌクレオチド、なる群から選択される、項目3または4に記載のdsRNA。
(項目7)
上記第1の配列は表1aおよび1bからなる群から選択され、上記第2の配列は表1aおよび1bからなる群から選択される、項目3または4に記載のdsRNA。
(項目8)
上記第1の配列は表1aおよび1bからなる群から選択され、上記第2の配列は表1aおよび1bからなる群から選択される、項目6または7に記載のdsRNA。
(項目9)
項目1に記載のdsRNAを含む細胞。
(項目10)
dsRNAと、薬学的に許容可能な担体とを含む、生物体におけるJCウイルス遺伝子の発現を抑制するための医薬組成物であって、上記dsRNAは互いに相補的な少なくとも2つの配列を有し、センス鎖は第1の配列を有し、アンチセンス鎖はJCウイルスをコードするmRNAの少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含む第2の配列を有し、上記相補領域の長さは30ヌクレオチド未満であり、上記dsRNAは、JCウイルスを発現している細胞と接触させると、JCウイルスゲノムの発現を抑制する、医薬組成物。
(項目11)
上記dsRNAの上記第1の配列は表1aおよび1bからなる群から選択され、上記dsRNAの上記第2の配列は表1aおよび1bからなる群から選択される、項目10に記載の医薬組成物。
(項目12)
上記dsRNAの上記第1の配列は表1aおよび1bからなる群から選択され、上記dsRNAの上記第2の配列は表1aおよび1bからなる群から選択される、項目10に記載の医薬組成物。
(項目13)
細胞内のJCウイルス遺伝子の発現を抑制する方法であって、
(a)細胞内に、二本鎖構造のリボ核酸(dsRNA)を導入する工程であって、該dsRNAは、互いに相補的な少なくとも2つの配列を有し、センス鎖は第1の配列を有し、アンチセンス鎖はJCウイルスをコードするmRNAの少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含む第2の配列を有し、該相補領域の長さは30ヌクレオチド未満であり、上記dsRNAは、JCウイルスを発現している細胞と接触させると、JCウイルスゲノムの発現を抑制する工程、および
(b)工程(a)で生成された細胞を、JCウイルス遺伝子のmRNA転写物を分解させるのに十分な時間維持することによって、細胞内のJCウイルス遺伝子の発現を抑制する工程
を含む方法。
(項目14)
JCウイルスの発現により媒介される病理過程を治療、予防、または管理する方法であって、そのような治療、予防または管理を必要とする患者に、治療上または予防上有効な量のdsRNAを投与する工程からなり、該dsRNAは、互いに相補的な少なくとも2つの配列を有し、センス鎖は第1の配列を有し、アンチセンス鎖はJCウイルスをコードするmRNAの少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含む第2の配列を有し、該相補領域の長さは30ヌクレオチド未満であり、上記dsRNAは、JCウイルスを発現している細胞と接触させると、JCウイルスゲノムの発現を抑制する、方法。
(項目15)
細胞内のJCウイルス遺伝子の発現を抑制するためのベクターであって、上記ベクターは、dsRNAの1つの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に連係して作用する調節配列を有し、上記dsRNAの鎖のうち一方は、JCウイルスをコードするmRNAの少なくとも一部にほぼ相補的であり、上記dsRNAの長さは30塩基対未満であり、上記dsRNAは、JCウイルスを発現している細胞と接触させると、JCウイルスゲノムの発現を抑制する、ベクター。
(項目16)
項目15に記載のベクターを含む細胞。
本発明は、二本鎖構造のリボ核酸(dsRNA)、ならびに該dsRNAを使用して細胞または哺乳動物のJCウイルス遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法を提供する。本発明はさらに、dsRNAを使用してJCウイルス感染を原因とする哺乳動物の病的状態および疾患を治療するための組成物および方法を提供する。dsRNAは、RNA干渉(RNAi)として知られるプロセスを通じて、mRNAの配列特異的な分解を導く。
便宜のために、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用される一定の用語および語句の意味を以下に示す。本明細書の他の部分におけるある用語の使用法と、本項に示された該用語の定義との間に明白な矛盾がある場合、本項の定義が優先されるものとする。
[(対照細胞のmRNA)−(処理細胞のmRNA)]/(対照細胞のmRNA)・100%
で表される。
1つの実施形態では、本発明は、細胞または哺乳動物においてJCウイルス遺伝子の発現を抑制するための二本鎖構造のリボ核酸(dsRNA)分子を提供し、該dsRNAはJCウイルス遺伝子の発現で形成されるmRNAの少なくとも一部に相補的な相補領域を含むアンチセンス鎖を含み、該相補領域は長さが30ヌクレオチド未満、通常は19〜24ヌクレオチドであり、前記dsRNAは、前記JCウイルス遺伝子を発現している細胞と接触すると、前記JCウイルス遺伝子の発現を少なくとも40%抑制する。該dsRNAは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分相補的な2つのRNA鎖を含む。dsRNAの一方の鎖(アンチセンス鎖)は、JCウイルス遺伝子の発現の際に形成されるmRNAの配列に由来する標的配列にほぼ相補的、好ましくは完全に相補的な相補領域を含み、他方の鎖(センス鎖)は該アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、2つの鎖が適切な条件の下で組み合わせられた時にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するようになっている。通常、二重鎖構造は長さが15〜30、より一般的には18〜25、さらにより一般的には19〜24、最も一般的には19〜21塩基対である。同様に、標的配列に相補的な領域は、長さが15〜30、より一般的には18〜25、さらにより一般的には19〜24、最も好ましくは19〜21ヌクレオチドである。本発明のdsRNAは、1または複数の一本鎖ヌクレオチド突出部をさらに含んでもよい。
ことができる。好ましい実施形態では、JCウイルス遺伝子はヒトJCウイルスゲノムである。特定の実施形態では、dsRNAのアンチセンス鎖は、表1aおよび1bのセンス配列を有し、第2の配列は、表1aおよび1bのアンチセンス配列から成る群から選択される。表1aおよび1bに与えられた標的配列を標的とする別のアンチセンス剤が、標的配列および平滑JCウイルス配列を用いれば容易に決定される。
et al.,EMBO 2001, 20:6877-6888)。しかしながら、より短いdsRNAや長いdsR
NAも同様に有効となりうることが他の研究者によって見出されている。上述の実施形態では、表1aおよび1bに提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質から、本発明のdsRNAは長さが最小21ヌクレオチドの鎖を少なくとも1つ含むことができる。表1aおよび1bの配列のうちの1つであって一端または両端からわずか数個のヌクレオチドが差し引かれたものを含む短いdsRNAが、上述のdsRNAと比較して同じように有効かもしれないことを期待するのは合理的と思われる。従って、表1aおよび1bの配列のうちの1つに由来する少なくとも15、16、17、18、19、20またはそれ以上連続したヌクレオチドである部分配列を有し、かつ、本明細書中以降に記載のようなFACS分析においてJCウイルス遺伝子の発現を抑制する能力が、完全な配列を有するdsRNAと高々5、10、15、20、25、または30%(抑制)しか違わないdsRNAが、本発明によって企図されている。表1aおよび1bに与えられた標的配列内で開裂するさらなるdsRNAが、JCウイルス配列および標的配列を用いれば容易に決定される。
City York, State NY, USAに記載のような当分野で確立された方法によって合成かつ/
または修飾されうる。本発明に有用な好ましいdRNA化合物の特定の例には、修飾バックボーンを含むか非天然のヌクレオシド間結合を有するdsRNAが含まれる。本明細書で定義されるように、修飾バックボーンを有するdsRNAには、バックボーンにリン原子を有するものと、バックボーンにリン原子を有しないものとが含まれる。本発明に関しては、糖の間のバックボーンにリン原子のない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。
254,1497-1500に見られる。
る好ましい修飾には、以下の実施例で記載される2’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちO(CH2)2ON(CH3)2基(2’−DMAOEとしても知られている)および以下の実施例で記載される2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ、すなわち2’−O−CH2−O−CH2−N(CH2)2(2’−ジメチルアミノエトキシエチルまたは2’−DMAEOEとしても知られている)がある。
。これらの核酸塩基のうちあるものは、本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるのに特に有用である。それらには、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジン、およびN−2、N−6およびO−6置換プリン、例えば2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシンが挙げられる。5−メチルシトシン置換は核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃上昇させることが示されており、(Sanghvi,
Y.S., Croke, S.T. and Lebleu, B., Edsl, DsRNA Research and Applications, CRCPress, place City Boca Raton, 1993, 276−278ページ)、また現時点で好ましい塩基置換であり、2’−メトキシエチル糖修飾と併用した場合はさらに一層好ましい。
cl. Acids Res., 1992, 20, 533-538)、脂肪鎖、例えばドデカンジオール残基またはウ
ンデシル残基(Saison-Behmoaraset al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et
al., FEBSLett.,1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-5
4)、リン脂質、例えばジヘキサデシル−rac−グリセロールまたはトリエチルアンモ
ニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホネート(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett, 1995,36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1
990, 18,3777-3783)、ポリアミン鎖またはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et a
l., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14, 969-973)、あるいはアダマンタン酢酸(Manoharanetal., Tetrahedron Lett, 1995, 36, 3651-3654)、パルミチル部分(Mishr
a et al.,Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)、あるいはオクタデシルア
ミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol.Exp. Ther., 1996,277, 923-937)がある。
et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. , 1994, 4:1053)、チオエーテル、例えば、ヘキシル−S−トリチルチオール(Manoharanet al., Ann. NY. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med.Chem. Let, 1993, 3:2765)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992,20:533)、脂肪
鎖、例えばドデカンジオール残基またはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111;Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al
., Biochimie, 1993, 75:49)、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−rac−グリセロ
ールまたはトリエチルアンモニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホネート(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl.Acids Res., 1990, 18:3777)、ポリアミン鎖またはポリエチレングリコー
ル鎖(Manoharanet al., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14:969)、あるいはア
ダマンタン酢酸(Manoharanet al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651)、パルミチル
部分(Mishraet al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229)、あるいはオクタデ
シルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分(Crooke et al., J Pharmacol. Exp. Ther.,1996, 277:923)である。そのようなdsRNAコンジ
ュゲートの調製を教示する代表的な米国特許文献は、上記に列挙されている。dRNA実施の典型的なプロトコールは、配列の1または複数の部位にアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドの合成を要する。その後、該アミノ基を、適切なカップリング剤または活性化剤を使用して、コンジュゲートさせる分子と反応させる。コンジュゲート反応は、まだ固体支持体に結合しているdsRNAを用いて実施してもよいし、溶液相中でdsRNAを切断した後に実施してもよい。HPLCによりdsRNAコンジュゲートを精製すると、通常純粋なコンジュゲートが得られる。
本発明のdsRNAは、インビボで生体内で組換えウイルスベクターから発現させることも可能である。本発明の組換えウイルスのベクターは、本発明のdsRNAをコードする配列と、かかるdsRNA配列を発現する任意のプロモータとを含む。適切なプロモータには、例えばU6またはH1 RNA pol IIIプロモータ配列およびサイトメガロウイルスプロモータが含まれる。他の適切なプロモータの選択は当該技術分野における技術である。本発明の組換えウイルスベクターは、特定の組織内や特定の細胞内環境中でdsRNAの発現を誘導または調節可能なプロモータであり得る。インビボで本発明のdsRNAを細胞へ送達するための組換えウイルスベクターの使用については、以下により詳細に説明する。
発現させるために核酸配列を挿入する方法、および対象の細胞までウイルスベクターを運ぶ方法は、当該技術分野の慣用技術である。例えば参照によりその全体が本願に組み込まれるDornburgR (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6:608-614;Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998),
Nature 392:25-30; およびRubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406を参照され
たい。
l, 70: 520-532;Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; 米国特許第5,2
52,479号; 米国特許第5,139,941号;国際特許出願第WO 94/13788号; および国際特許出願
第WO93/24641号に記載されている。
1つの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるdsRNAと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。dsRNAを含む医薬組成物は、PML等のJCウイルス遺伝子の発現または活性および/またはウイルス感染に関連した疾患または障害を治療するのに有用である。かかる医薬組成物は送達の様式に従って調製される。一つの例は、非経口送達を介して全身投与用に調製された組成物である。
リポソーム
薬物の製剤化用に研究・使用されているものには、マイクロエマルション以外にも、多くの組織化界面活性剤構造がある。そのような構造には、単分子膜、ミセル、二分子膜、およびベシクルが含まれる。例えばリポソームなどのベシクルは、薬物送達という観点から、それらが提供する特異性および作用の持続時間のために高い関心を集めている。本発明において、用語「リポソーム」とは、1つまたは複数の球状二分子膜状に配置された両親媒性脂質から構成されたベシクルを意味する。
1, p. 245〕。リポソーム製剤の製造に際して考慮すべき重要な点は、脂質の表面電荷、ベシクルのサイズおよびリポソームの含水量である。
980-985)。
。
Research, 1992,18, 259-265)。
ソームが含まれるが、この用語は、本明細書においては、1または複数種の特殊な脂質を含むリポソームを指し、こうした脂質は、リポソームに組み込まれると、そのような特殊な脂質を含まないリポソームに比べて循環血中寿命が高められる。立体的に安定化させたリポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部の一部が、(A)1または複数種の糖脂質、例えば、モノシアロガングリオシド G.sub.M1を含むか、または(B)1または複数種の親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)部分で誘導体化されているものである。特定の理論に拘束されることは意図しないが、当該技術分野においては、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはPEG誘導体化脂質を含有する立体的に安定化させたリポソームの場合、これらの立体的に安定化させたリポソームの高い循環血中半減期は、細網内皮系(RES)細胞への取り込み量の低下に由来すると考えられている(Allenet al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765)。
付与された米国特許第4,837,028号およびWO88/04924号は、(1)スフィンゴミエリンと(2)ガングリオシドG.sub.M1またはガラクトセレブロシド硫酸エステルとを含むリポソームを開示している。米国特許第5,543,152号〔ウエッブら(Webbetal.)〕は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。
1,2−sn−ジミリストイルホフファチジルコリンがWO97/13499号〔リムら(Lim etla)〕に開示されている。
剤、2C.sub.1215Gを含むリポソームを記載した。イルムら(Illum et al.)(FEBS Lett.,1984, 167, 79)は、ポリスチレン粒子をポリマーグリコールで親水性
コーティングすることにより、血中半減期が著しく向上すると指摘した。ポリアルキレングリコール(例えば、PEG)のカルボン酸基を付けて修飾した合成リン脂質がシアーズ(Sears)(米国特許第4,426,330号および同第4,534,899号)により
記載されている。クリバノフら(Klibanov et al.)(FEBS Lett., 1990, 267,235)は、PEGまたはPEGステアレートで誘導体化したホスファチジルエタノールアミン(PE)を含むリポソームが循環血中半減期を著しく増大させることを実証する実験を記載した。ブリュームら(Blumeetal.)(Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91)
は、上記のような観察結果を、他のPEG誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)とPEGとの組み合わせから形成されたDSPE−PEGにも適用した。外面に共有結合PEG部分を有するリポソームが、フィッシャー(Fisher)に付与された、欧州(EP)特許第0 445 131 B1号およびWO90/04384号に記載されている。1〜20モル%のPEG誘導体化PEを含有するリポソーム組成物およびその使用法が、ウードルら(Woodleet al.)(米国特許第5
,013,556号および同第5,356,633号)ならびにマーチンら(Martin et al.)(米国特許第5,213,804号および欧州(EP)特許第0 496 813
B1号)により記載されている。多くの他の脂質・ポリマーコンジュゲートを含むリポソームが、WO91/05545号および米国特許第5,225,212号(いずれもマーチンらに付与)ならびにWO94/20073号〔ザリプスキーら(Zalipskyet al.
)〕で開示されている。PEG修飾セラミド脂質を含むリポソームがWO96/10391号〔チョイら(Choiet al.)〕に記載されている。米国特許第5,540,935号
〔ミヤザキら(Miyazakiet al.)〕および米国特許第5,556,948号〔タガワら
(Tagawaet al.)〕は、さらに表面の官能基で誘導体化し得るBEG含有リポソームを
記載している。
5,264,221号は、タンパク質結合リポソームを開示しており、そのようなリポソームの内容物には、dsRNA、RNAが含まれると主張している。ラーマンら(Rahman
et al.)に付与された米国特許第5,665,710号は、オリゴデオキシヌクレオチ
ドをリポソームに封入するいくつかの方法を記載している。ラブら(Love et al.)に付
与されたWO97/04787号は、raf遺伝子をターゲットとするdsRNA dsRNAsを含むリポソームを開示している。
トランスフェルソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するのに用いられている。トランスフェルソームを介した血清アルブミンの送達は、血清アルブミン含有溶液の皮下注射と同じくらい有効であることが証明されている。
(Lollo et al., PCT Application WO 97/30731)などのポリカチオン分子もdsRNA
の細胞取り込みを強化することが知られている。
本発明のいくつかの組成物は、製剤中にさらに担体化合物を組み込む。本明細書において、「担体化合物」または「担体」は、核酸、またはそのアナログに関連し得、不活性ではあるが(すなわち、それ自体、生物活性を有していないが)、例えば、生物学的に活性な核酸を分解するか、核酸の循環血液中からの除去を促進することにより、生物活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを低下させる生体内プロセスによって核酸として認識される。核酸と、通常過剰量の担体化合物とを同時投与することにより、恐らく担体化合物と核酸が共通の受容体に対して競合するために、肝臓、腎臓または他の循環外貯蔵器(extracirculatoryreservoirs)に回収される核酸の量を実質的に減少させ得る。例え
ば、部分的ホスホロチオアート dsRNAと、ポリイノシン酸、デキストランスルフェート、ポリシチジン酸または4−アセトアミド−4’イソチオシアノスチルベン−2,2’−ジスルホン酸とを同時投与すると、肝組織における部分的ホスホロチオアート dsRNAの回収を減少させることができる(Miyaoet al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakuraet al., DsRNA & Nucl.Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183)。
担体化合物とは違って、「医薬担体」または「賦形剤」は、1または複数種の核酸を動物に送達するための医薬上許容される溶媒、懸濁剤または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体でも固体でもよく、考慮された計画的投与法に基づいて、核酸や所与の医薬組成物の他の成分と組み合わせたときに、所望のバルク、整合性などが得られるように選択する。典型的な医薬担体としては、結合剤(例えば、プレゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど);充填剤(例えば、ラクトースおよび他の糖類、微晶質セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど);潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど);崩壊剤(例えば、スターチ、ナトリウムスターチグリコール酸塩など);および湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が挙げられるが、それらには限定されない。
本発明の組成物は、さらに、医薬組成物中に通常見られる他の補助成分を当該技術分野で確立された使用量(art-established usage level)で含み得る。したがって、例えば
、本発明の組成物は、追加の相溶性薬理活性物質、例えば、かゆみ止め剤、収斂剤、局所麻酔剤または抗炎症剤などを含むか、または、本発明組成物のさまざまな剤形を物理的に製剤化するのに有用な追加物質、例えば、染料、香料、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤および安定剤などを含み得る。しかし、そのような物質は、添加する場合、本発明の組成物成分の生物活性に必要以上に干渉するものであってはならない。本発明の製剤は、滅菌し、必要に応じて、製剤中の核酸と有害な相互作用をしない助剤、例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を支配する塩、緩衝剤、着色剤、矯味/香味物質などと混合することができる。
学療法剤は、本発明の化合物と共に使用する際には、個別に(例えば、5−FUとオリゴヌクレオチド)、連続的に(例えば、一定時間、5−FUとオリゴヌクレオチド、続いて、MTXとオリゴヌクレオチド)、または1または複数種の他のそのような化学療法剤と組み合わせて(例えば、5−FU、MTXとオリゴヌクレオチド、または5−FU、放射線治療とオリゴヌクレオチド)用い得る。本発明の組成物では、非ステロイド性抗炎症薬およびコルチコステロイドを含むがそれらには限定されない抗炎症薬と、リビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含むがそれらには限定されない抗ウイルス薬とを組み合わせてもよい。概括的には、TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed.,Berkow et al., eds., 1987,Rahway, N.J.のそれぞれ2499-2506ページお
よび46-49ページ参照。他の非アンチセンス化学療法剤も本発明の範囲内である。2種以上の組み合わせ化合物を同時にまたは連続して用いてもよい。
本発明は、特に、JCウイルス感染、例えば、PMLに関連する病的状態を治療または予防するためのdsRNAまたはdsRNAから作られた医薬組成物の使用に関する。本発明のdsRNAまたはdsRNAから作られた医薬組成物は、JCウイルス発現に対する抑制作用のために、特に、MSの治療の一部として抗VLA4抗体で治療を受けている患者の生活の質を高めることができる。
さらに別の態様で、本発明は、哺乳動物におけるJCウイルス由来の遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。この方法は、ターゲットJCウイルスゲノムの発現がサイレンシングされるように、哺乳動物に本発明の組成物を投与するステップを含む。本発明のdsRNAは、特異性が高いために、ターゲットJCウイルス遺伝子のRNA(第一次RNAまたはプロセシング後RNA)を特異的にターゲットとする。dsRNAを用いたこれらのJCウイルスの発現を抑制する組成物および方法は、本明細書中に別記されるようにして実施することができる。
JCV siRNAの設計
2006年4月10日に利用可能なJCウイルスの全長ゲノム配列を得て、388個の配列からなるターゲットプールを調製した(アクセス番号:AB038239.1−AB038255.1;AB048545.1−AB048582.1;AB074575.1−AB074591.1;AB077855.1−AB077879.1;AB081005.1−AB081030.1;AB081600.1−AB081618.1;AB081654.1;AB092578.1−AB092587.1;AB103387.1;AB103402.1−AB103423.1;AB104487.1;AB113118.1−AB113145.1;AB118651.1−AB118659.1;AB126981.1−AB127027.1;AB127342.1;AB127344.1;AB127346.1−AB127349.1;AB127352.1−AB127353.1;AB198940.1−AB198954.1;AB220939.1−AB220943.1;AF004349.1−AF004350.1;AF015526.1−AF015537.1;AF015684.1;AF030085.1;AF281599.1−AF281626.1;AF295731.1−AF295739.1;AF300945.1−AF300967.1;AF363830.1−AF363834.1;AF396422.1−AF396435.1;AY121907.1−AY121915.1;NC 001699.1;U61771.1;U73500.1−U73502.1)。NC 001699を参照配列とした。
(2) 鎖の(5’−3’方向に数えて)10及び11位(切断部位領域)では、非シード領域よりオフターゲットの可能性が高くなり得る;
(3) オフターゲットスコアは、ヒットするたびに、siRNA配列に対する同一性およびミスマッチの位置に基づいて計算することができる;
(4)導入される内部修飾によってセンス鎖の活性が阻止され得ると仮定すれば、アンチセンス鎖のオフターゲット可能性のみが関係がある。
非シード領域中のミスマッチ数
シード領域中のミスマッチ数
切断部位領域中のミスマッチ数。
仮説1〜3を検討するためにオフターゲットスコアを以下のように計算した:
オフターゲットスコア = シード領域ミスマッチの数* 10
+ 切断部位領域ミスマッチの数 * 1.2
+ 非シード領域ミスマッチの数 * 1
入力された各19mer入力配列に最も関連性のあるオフターゲット遺伝子を最低のオフターゲットスコアを有する遺伝子と定義した。したがって、最低のオフターゲットスコアを対応siRNAに対する関連オフターゲットスコアと定義した。
すべてのsiRNAは、標準手順に従って、AB13900 DNA合成装置において、0.2μmole合成スケールで合成した。
(a)外部/内部光(EEL) − センス鎖: 2’O−メチル全ピリミジン、(5
’末端から数えて)ヌクレオチド20と21の間のPTO、3’末端のdTdT(ヌクレオチド20と21)
− アンチセンス鎖: 5’−UA−3’および5’−CA−3’モチーフ中のピリミジンにおける2’−O−メチル、(5’末端から数えて)ヌクレオチド20と21の間のPTO、3’末端におけるdTdT(ヌクレオチド20と21)
(b)アンチセンス鎖の2位におけるEELプラス2’−O−メチル(5’末端に5’−UA−3’および5’−CA−3’がない場合のみで、そうでなければ、すでにEELでカバーされている)
(c)センス鎖の2位におけるEELプラス2’−O−メチル(2位にピリミジンがない場合のみで、そうでなければ、すでにEELでカバーされている)
(d)センス鎖およびアンチセンス鎖の2位におけるEELプラス2’−O−メチル(すでにa、bおよびcでカバーされていない場合のみ)。
末端(ヌクレオチド20と21)におけるdTdT〕を有する非修飾RNAオリゴヌクレ
オチドからなっていた(表1b)。
JCV siRNAのスクリーニング
JCV転写物をコードするレポーター系の構築
初期JCV転写物(E)配列をGENEART社〔ドイツ、レーゲンスブルク(Regensburg)所在〕で合成し、GENEART標準ベクターにクローン化した。第1アプローチで後期JCV転写物の配列を、2つのフラグメント:VP1タンパク質の転写物配列を含むL1と、VP2、VP3およびアグノタンパク質の配列を含むLA23とに分割した。フラグメントLA23に係るクローニング問題のために、第2アプローチで、この配列を2つのフラグメント(LA23 1−700とLA23 701−1438)に分割した。すべての配列をGENEARTで合成し、GENEART標準ベクターにクローン化した。全フラグメント(E、L1、LA23 1−700およびLA23 701−1438)を、XhoIおよびNotI〔共に、ドイツ、フランクフルト(Frankfurt)所在の
NEB社〕を介してpsiCheck−2〔ドイツ、マンハイム(Mannheim)所在のプロメガ(Promega)社〕にサブクローン化し、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼの終止コドンとポリAシグナルとの間にJCV配列を有する構築物を得た。
L1
CTCGAGACTTTTAGGGTTGTACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCATATGAAGATGGCCCCAACAAAAAGAAAAGGAGAAAGGAAGGACCCCGTGCAAGTTCCAAAACTTCTTATAAGAGGAGGAGTAGAAGTTCTAGAAGTTAAAACTGGGGTTGACTCAATTACAGAGGTAGAATGCTTTTTAACTCCAGAAATGGGTGACCCAGATGAGCATCTTAGGGGTTTTAGTAAGTCAATTTCTATATCAGATACATTTGAAAGTGACTCCCCAAATAAGGACATGCTTCCTTGTTACAGTGTGGCCAGAATTCCACTACCCAATCTAAATGAGGATCTAACCTGTGGAAATATACTAATGTGGGAGGCTGTGACCTTAAAAACTGAGGTTCTAGGGG
TGACAACTTTGATGAATGTGCACTCTAATGGTCAAGCAACTCATGACAATGGTGCAGGAAAGCCAGTGCAGGGCACCAGCTTTCATTTTTTTTCTGTTGGCGGGGAGGCTTTAGAATTACAGGGGGTGGTTTTTAATTACAGAACAAAGTACCCAGATGGAACAATTTTTCCAAAGAATGCAACAGTGCAATCTCAAGTAATGAACACAGAGCACAAGGCGTACCTAGATAAGAACAAA
GCATATCCTGTTGAATGTTGGGTTCCTGATCCCACCAGAAATGAAAACACAAGATATTTTGGGACACTAACAGGAGGAGAAAATGTTCCTCCAGTTCTTCATATAACAAACACTGCCACAACAGTGCTGCTTGATGAATTTGGTGTTGGGCCACTTTGCAAAGGTGACAACTTGTATTTGTCAGCTGTTGATGTTTGTGGAATGTTTACTAACAGATCTGGTTCCCAGCAGTGGAGAGG
ACTGTCCAGATATTTTAAGGTTCAGCTCAGAAAAAGGAGGGTTAAAAACCCCTACCCAATTTCTTTCCTTCTTACTGATTTGATTAACAGAAGGACCCCTAGAGTTGATGGGCAACCTATGTATGGTATGGATGCTCAGGTAGAGGAGGTTAGAGTTTTTGAGGGGACAGAGGAACTTCCAGGGGACCCAGACATGATGAGATATGTTGACAGATATGGACAGTTGCAAACAAAGATGC
TGTAATCAAAATCCTTTATTGTAATATGCAGTACATTTTAATAAAGTATAACCAGCTTTACTTTACAGTTGCAGTCATGCGGCCGC(配列番号931)
E
CTCGAGCCGCCTCCAAGCTTACTCAGAAGTAGTAAGGGCGTGGAGGCTTTTTAGGAGGCCAGGGAAATTCCCTTGTTTTTCCCTTTTTTGCAGTAATTTTTTGCTGCAAAAAGCTAAAATGGACAAAGTGCTGAATAGGGAGGAATCCATGGAGCTTATGGATTTATTAGGCCTTGATAGGTCTGCATGGGGGAACATTCCTGTCATGAGAAAAGCTTATCTGAAAAAATGCAAAGAACTCCACCCTGATAAAGGTGGGGACGAAGACAAGATGAAGAGAATGAATTTTTTATATAAAAAAATGGAACAAGGTGTAAAAGTTGCTCATCAGCCTGATTTTGGTACATGGAATAGTTCAGAGGTTGGTTGTGATTTTCCTCCTAATTCTGATACCCTTTA
TTGCAAGGAATGGCCTAACTGTGCCACTAATCCTTCAGTGCATTGCCCCTGTTTAATGTGCATGCTAAAATTAAGGCATAGAAACAGAAAATTTTTAAGAAGCAGCCCACTTGTGTGGATAGATTGCTATTGCTTTGATTGCTTCAGACAATGGTTTGGGTGTGACTTAACCCAAGAAGCTCTTCATTGCTGGGAGAAAGTTCTTGGAGACACCCCCTACAGGGATCTAAAGCTTTAAG
TGCCAACCTATGGAACAGATGAATGGGAATCCTGGTGGAATACATTTAATGAGAAGTGGGATGAAGACCTGTTTTGCCATGAAGAAATGTTTGCCAGTGATGATGAAAACACAGGATCCCAACACTCTACCCCACCTAAAAAGAAAAAAAAGGTAGAAGACCCTAAAGACTTTCCTGTAGATCTGCATGCATTCCTCAGTCAAGCTGTGTTTAGTAATAGAACTGTTGCTTCTTTTGCT
GTGTATACCACTAAAGAAAAAGCTCAAATTTTATATAAGAAACTTATGGAAAAATATTCTGTAACTTTTATAAGTAGACATGGTTTTGGGGGTCATAATATTTTGTTTTTCTTAACACCACATAGACATAGAGTGTCAGCAATTAATAACTACTGTCAAAAACTATGTACCTTTAGTTTTTTAATTTGTAAAGGTGTGAATAAGGAATACTTGTTTTATAGTGCCCTGTGTAGACAGCC
ATATGCAGTAGTGGAAGAAAGTATTCAGGGGGGCCTTAAGGAGCATGACTTTAACCCAGAAGAACCAGAAGAAACTAAGCAGGTTTCATGGAAATTAGTTACACAGTATGCCTTGGAAACCAAGTGTGAGGATGTTTTTTTGCTTATGGGCATGTACTTAGACTTTCAGGAAAACCCACAGCAATGCAAAAAATGTGAAAAAAAGGATCAGCCAAATCACTTTAACCATCATGAAAAAC
ACTATTATAATGCCCAAATTTTTGCAGATAGCAAAAATCAAAAAAGCATTTGCCAGCAGGCTGTTGATACTGTAGCAGCCAAACAAAGGGTTGACAGCATCCACATGACCAGAGAAGAAATGTTAGTTGAAAGGTTTAATTTCTTGCTTGATAAAATGGACTTAATTTTTGGGGCACATGGCAATGCTGTTTTAGAGCAATATATGGCTGGGGTGGCCTGGATTCATTGCTTGCTGCCTCAAATGGACACTGTTATTTATGACTTTCTAAAATGCATTGTATTAAACATTCCAAAAAAAAGGTACTGGCTATTCAAGGG
GCCAATAGACAGTGGCAAAACTACTTTAGCTGCAGCTTTACTTGATCTCTGTGGGGGAAAGTCATTAAATGTTAATATGCCATTAGAAAGATTAAACTTTGAATTAGGAGTGGGTATAGATCAGTTTATGGTTGTATTTGAGGATGTAAAAGGCACTGGTGCAGAGTCAAGGGATTTACCTTCAGGGCATGGCATAAGCAACCTTGATTGCTTAAGAGATTACTTAGATGGAAGTGTAA
AAGTTAATTTAGAGAGAAAACACCAAAACAAAAGAACACAGGTGTTTCCACCTGGAATTGTAACCATGAATGAATATTCAGTGCCTAGAACTTTACAGGCCAGATTTGTAAGGCAGATAGATTTTAGACCAAAGGCCTACCTGAGAAAATCACTAAGCTGCTCTGAGTATTTGCTAGAAAAAAGGATTTTGCAAAGTGGTATGACTTTGCTTTTGCTTTTAATCTGGTTTAGGCCAGTT
GCTGACTTTGCAGCTGCCATTCATGAGAGGATTGTGCAGTGGAAAGAAAGGCTGGATTTAGAAATAAGCATGTATACATTTTCTACTATGAAAGCTAATGTTGGTATGGGGAGACCCATTCTTGACTTTCCTAGAGAGGAAGATTCTGAAGCAGAAGACTCTGGACATGGATCAAGCACTGAATCACAATCACAATGCTTTTCCCAGGTCTCAGAAGCCTCTGGTGCAGACACACAGGA
AAACTGCACTTTTCACATCTGTAAAGGCTTTCAATGTTTCAAAAAACCAAAGACCCCTCCCCCAAAATAACTGCAACTGTGCGGCCGC (配列番号932)
LA23 1−700
CTCGAGCAGCTAACAGCCAGTAAACAAAGCACAAGGGGAAGTGGAAAGCAGCCAAGGGAACATGTTTTGCGAGCCAGAGCTGTTTTGGCTTGTCACCAGCTGGCCATGGTTCTTCGCCAGCTGTCACGTAAGGCTTCTGTGAAAGTTAGTAAAACCTGGAGTGGAACTAAAAAAAGAGCTCAAAGGATTTTAATTTTTTTGTTAGAATTTTTGCTGGACTTTTGCACAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAAAAGACAGAGACACAGTGGTTTGACTGAGCAGACATACAGTGCTTTGCCTGAACCAAAAGCTACAT
AGGTAAGTAATGTTTTTTTTTGTGTTTTCAGGTTCATGGGTGCCGCACTTGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCTACTGTTTCTGAGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTAGCTGAAATTGCTGCTGGAGAGGCTGCTGCTACTATAGAAGTTGAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGGATTACAAGTACCTCTGAGGCTATAGCTGCTATAGGCCTTACTCCTGAAACATATGCTGTAATAACTGGAGCTCCGGGGGCTGTAGCTGGGTTTGCTGCATTGGTTCAAACTGTAACTGGTGGTAGTGCTATTGC
TCAGTTGGGATATAGATTTTTTGCTGACTGGGATCATAAAGTTTCAACAGTTGGGCTTTTTCGCGGCCGC (配列番号933)
LA23 701−1438
CTCGAGAGCAGCCAGCTATGGCTTTACAATTATTTAATCCAGAAGACTACTATGATATTTTATTTCCTGGAGTGAATGCCTTTGTTAACAATATTCACTATTTAGATCCTAGACATTGGGGCCCGTCCTTGTTCTCCACAATCTCCCAGGCTTTTTGGAATCTTGTTAGAGATGATTTGCCAGCCTTAACCTCTCAGGAAATTCAGAGAAGAACCCAAAAACTATTTGTTGAAAGTTTAGCAAGGTTTTTGGAAGAAACTACTTGGGCAATAGTTAATTCACCAGCTAACTTATATAATTATATTTCAGACTATTATTCTAGATTGTCTCCAGTTAGGCCCTCTATGGTAAGGCAAGTTGCCCAAAGGGAGGGAACCTATATTTCTTTTGGCCACTCATACACCCAAAGTATAGATGATGCAGACAGCATTCAAGAAGTTACCCAAAGGCTAGATTTAAAAACCCCAAATGTGCAATCTGGTGAATTTATAGAAAGAAGTATTGCACCAGGAGGTGCAAATCAAAGATCTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTTTAGGGTTGTACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCATATGAAGATGGCCCCAACAAAAAGAAAAGGAGAAAGGAAGGACCCCGTGCAAGTTCCAAAACTTCTTATAAGAGGAGGAGTAGAAGTTCTAGAAGTTAAAACTGGGGTTGACTCAATTACAGAGGTAGAATGCTGCGGCCGC(配列番号934)
トランスフェクト細胞中のJCV siRNAのスクリーニング
Cos−7細胞〔ドイツ、ブラウンシュバイク(Braunschweig)所在のDSMZ社、#ACC−60〕を、透明な底部を有する白い96ウエルプレート〔ドイツ、フリッケンハウゼン(Frickenhausen)所在のグライナー・バイオ・ワン社(GreinerBio-One GmbH)〕
の1ウエル当たり1.5×104細胞として75μl増殖培地中に播種した。細胞を播種した後直ぐ、ウエル当たり50ngの対応レポータープラスミドを、リポフェクタミン(Lipofectamine)TM2000〔ドイツ、カールスルーエ(Karlsruhe)所在のインビトロジェン社(InvitrogenGmbH)〕を用いてトランスフェクトし、このプラスミドを、ウエ
ル当たり12.5μlの最終容量となるようにOpti−MEMで希釈し、プレート全体用のマスターミックスとして調製した。
GmbH)〕中、37℃、5%CO2下に、24時間インキュベートした。一次スクリーニ
ングでは、すべてのsiRNAを30nMの最終濃度でスクリーニングした。選択した配列を300pMのsiRNA濃度で再スクリーニングした。各siRNAを各濃度に関して4通りに試験した。
発光を測定した。トランスフェクション効果を補正するために、レニラルシフェラーゼで得た値をホタルルシフェラーゼで得たそれぞれの値に対して標準化した。JCV遺伝子に対するsiRNAのトランスフェクション後に得たウミシイタケ/ホタルルシフェラーゼ活性を、100%に設定した非関連コントロールsiRNAのトランスフェクション後に得たレニラ/ホタルルシフェラーゼ活性に対して標準化した。表1aおよび1bは、配列を表1aに示すsiRNAを30nMの単一用量で試験した結果を示している。非関連コントロールsiRNAと比較した抑制率±標準偏差は、「残留ルシフェラーゼ活性(コントロールの%)」の欄に示されている。いくつかの30nM JCV siRNAは、Cos−7細胞におけるターゲットmRNAの量を70%以上減少させるのに有効であった(すなわち、残留ルシフェラーゼ活性は30%未満であった)。
− 3倍希釈の33nMから0.005nMまで(フラグメント1の場合)
− 4倍希釈の24nMから0.001nMまで(フラグメントEと、フラグメントLA23 1−700およびLA23 701−1438の場合)。
いたパラメータ化曲線当てはめによりIC50値を決定した。表2は、32個の選択されたJCV siRNAに関する2回の独立した実験の結果を示している。これら2回の独立実験の平均IC50が示されている。この実験パラダイムにおいて、いくつかのJCV
siRNA(AD−12622、AD−12677、AD−12709、AD−12710、AD−12722、AD−12724、AD−12728、AD−12763、AD−12767、AD−12768、AD−12769、AD−12771、AD−12774、AD−12775、AD−12777、AD−12781、AD−12784、AD−12795、AD−12813、AD−12821、AD−12823、AD−12824、AD−12825、AD−12827、AD−12829、AD−12842)は特に効力が高く、70pM〜1nMのIC50値を示した。
表2:IC50
デュプレックス 平均IC50
の名称 [nM]
AD-12599 2.37
AD-12622 0.57
AD-12666 3.7
AD-12677 0.49
AD-12709 0.19
AD-12710 0.47
AD-12712 2.33
AD-12722 0.12
AD-12724 0.26
AD-12728 0.8
AD-12761 1.2
AD-12763 0.95
AD-12767 0.09
AD-12768 0.19
AD-12769 0.35
AD-12771 0.35
AD-12774 0.13
AD-12775 0.18
AD-12777 0.17
AD-12778 12.65
AD-12781 0.18
AD-12784 0.44
AD-12795 0.65
AD-12813 0.2
AD-12818 1.88
AD-12821 0.07
AD-12823 0.46
AD-12824 0.25
AD-12825 0.52
AD-12827 0.15
AD-12829 0.14
AD-12842 0.44
SVG−A細胞における生JCウイルスに対するJCV siRNAのスクリーニング
細胞およびウイルス
ブラウン大学(Brown University)のウォルター・アトウッド(Walter Atwood)から
得たSVG-A細胞(SV40T抗原で形質転換したヒト胎児グリア細胞)を、加湿イン
キュベータ〔米国ノースカロライナ州アッシュビル(Ashville)所在のサーモ・エレクトロン社(Thermo Electron Corporation)製のHeraeus HERAcell〕中、
37℃、5%CO2雰囲気下に、10%ウシ胎児血清(FBS)〔米国カリフォルニア州タルザナ(Tarzana)所在のオメガ・サイエンティフィック(OmegaScientific)社〕、
ペニシリン100U/ml、ストレプトマイシン100μg/ml〔米国カリフォルニア州カールスバード(Carlsbad)所在のインビトロジェン社〕を加えたイーグルMEM培地(Eagle’sMinimum Essential Media)〔米国バージニア州マナサス(Manassas)所在のATCC〕中で培養した。ブラウン大学のウォルター・アトウッドから得たJCVのMad−1−SVEΔ株を全実験で用い、公開されている標準法(LiuandAtwood, Propagati
on and assay of the JC Virus, Methods Mol Biol. 2001; 165:9-17)に従い、SVG
−A細胞を用いてウイルス株を作製した。
抗生物質を除いた上述の培地中でトランスフェクトする24時間前に、SVG−A細胞を6ウエルディッシュのガラスカバースリップ上に播種した。製造業者(米国カリフォルニア州カールスバード所在のインビトロジェン社)の指示に従い、リポフェクタミンTM2000を用いて、細胞に指示濃度のsiRNA(10nM、50nM、または100nM)をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、2%FBSを含む培地で細胞を洗浄し、次いで、2%FBS培地に希釈したJCVウイルス株(Mad−1−SVEΔ株)の1:25希釈物に感染させた。カバースリップ全体に等しいウイルス結合が得られるように1時間にわたって15分毎に手で数回細胞を揺り動かし、次いで、追加の10%FBS培地を加え、72間感染を進行させた。72時間の感染後に、細胞をアセトン中で固定し、ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488二次抗体(インビトロジェン社)を含むJCV VP1(ブラウン大学のウォルター・アトウッドから取得)を認識するハイブリドーマ上清PAB597を用いて、標準免疫蛍光法により、細胞を後期ウイルスタンパク質(VP1)染色した。蛍光顕微鏡〔米国ニュージャージー州ソーンウッド(Thornwood)所在のツァイス(Zeiss)社製、Imager:Z1〕を用いてVP1免疫反応
細胞を数えて感染細胞を採点し、データを、ルシフェラーゼsiRNAをトランスフェクトしたコントロールを播種したカバースリップについて計数した感染細胞の割合として表した。表3は、異なるsiRNA濃度での予防アッセイの結果を示している。VP1 siRNAはグループとして最も効力が高く、T抗原siRNAが続き、VP2/3siRNAは最も効力が弱かった。ウイルスを減少させるのに最も有効なVP1 siRNAは、一貫して、AD−12622、AD−12728、AD−12795、およびAD−12842であった。最も強力なT抗原siRNAはAD−12813であった。
10%FBS培地中での感染の24時間前に、6ウエルディッシュのガラスカバースリップ上にSVG−A細胞を播種した。2%FBSを含有する培地で細胞を洗浄し、次いで、2%FBS培地に希釈したJCVウイルス株の1:25希釈物に感染させた。カバースリップ全体に等しいウイルス結合が得られるように1時間にわたって15分毎に手で約8〜10回揺り動かし、次いで、追加の10%FBS培地を加えた。感染24時間後および48時間後に、抗生物質を含まない10%FBS培地で細胞を洗浄し、次いで、製造業者の指示(インビトロジェン社)に従って、リポフェクタミンTM2000を用いて細胞に50nMの指示siRNAをトランスフェクトした。感染72時間後に、細胞をアセトン中で固定し、ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488二次抗体〔米国オレゴン州ユージーン(Eugene)所在のモレキュラー・プローブス(MolecularProbes)社〕を含むJ
CV VP1(ブラウン大学のウォルター・アトウッドから取得)を認識するハイブリドーマ上清PAB597を用いて、標準免疫蛍光法により、JCV 後期ウイルスタンパク質(VP1)染色した。蛍光顕微鏡(ツァイス、Imager:Z1)を用いてVP1免疫反応細
胞を数えて感染細胞を採点し、データを、ルシフェラーゼsiRNAをトランスフェクトしたコントロールカバースリップについて計数した感染細胞の割合として表した。表4は、感染後治療実験の結果を示している。治療アッセイで試験したsiRNAはいずれも、残留ウイルスがルシフェラーゼSiRNAコントロールにおけるより著しく減少したというように、JCVに対する有意な抗ウイルス活性を示した。
抗生物質を除いた上述培地中での感染の24時間前に、6ウエルディッシュにSVG−A細胞を播種した。製造業者の指示(インビトロジェン社)に従い、リポフェクタミンTM2000を用いて、細胞に10nMの指示siRNAをトランスフェクトした。トランスフェクション24時間後に、2%FBSを含む培地で細胞を洗浄し、次いで、2%FBS培地に希釈したJCVウイルス株(Mad−1−SVEΔ株)の1:25希釈物を感染させた。カバースリップ全体に等しいウイルス結合が得られるように、1時間にわたって15分毎に細胞を手で数回揺り動かし、次いで、追加の10%FBS培地を加え、6日間感染を進行させた。感染6日後に、感染細胞からオーバーレイ培地を除去するか、細胞をこそげ取って子孫ウイルスを回収し、ウイルス作製を行った。ウイルスの作製は、細胞を残さず上清培地にこそげ入れ、激しく攪拌し、再懸濁した細胞を間に攪拌を入れて2回凍結融解し、次いで、細胞破片を沈降させて、上清を取るステップからなっていた。次に、ガラスカバースリップ上に播種した新鮮なSVG-A細胞を、初期感染の場合と同じ手順
を用いていずれかの方法で回収したウイルスに二次感染させて、さまざまなsiRNAをトランスフェクトした細胞が産生した感染性ウイルスの量を測定した。カバースリップ感染72時間後に、細胞をアセトン中で固定し、ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488二次抗体(インビトロジェン社)を含むJCV VP1(ブラウン大学のウォルター・アトウッドから取得)を認識するハイブリドーマ上清PAB597を用いて、標準免疫蛍光法により後期ウイルスタンパク質(VP1)染色した。蛍光顕微鏡(ツァイス社製、Imager:Z1)を用いてVP1免疫反応細胞を数えて感染細胞を採点し、データを、ルシフ
ェラーゼsiRNAをトランスフェクトしたコントロールカバースリップについて計数した感染細胞の割合として表した。表5は、選択されたsiRNAの結果を示しており、この結果は、いずれかのウイルス回収法により活性子孫ウイルスの産生を阻害する予防siRNA治療の能力を証明している。VP1をターゲットとするsiRNA(AD−12622およびAD−12842)のトランスフェクションは、ウイルスを培地から回収するか、感染細胞調製物から回収するかに関係なく、活性子孫ウイルス産生の阻害に最も効果があった。抗原siRNA AD−12813は次に強力な阻害効果を有していたが、VP2/3siRNA AD−12824およびAD−12769も、活性子孫JCV産生の阻害に低いとは言え、いくらかの能力を示した。
11種の選択されたJCV siRNAを、ヒトCSF中および比較のためにPBS中で、5uM、37℃で48時間、安定性について試験した。96ウエルプレート中で、30μlのヒト脳脊髄液(CSF)と、3μlの50μM 二本鎖(siRNA)溶液とを混合し、蒸発を避けるためにシールし、37℃で指示時間インキュベートした。siRNAを30ulのPBS中48時間インキュベートしたものは、非特異的分解のコントロールとしての機能を果たした。4ulのプロテイナーゼK(20mg/ml)と25ulのプロテイナーゼKバッファーを加えて反応を停止し、42℃で20分(20’)インキュベートした。次いで、サンプルを0.2μmの96ウエルフィルタープレートに3000rpmで20分間通して回転ろ過した。インキュベーションウエルを50ulのミリポア水で2回洗浄し、合わせた洗浄液も回転ろ過した。
%−FLP(s/as:t=x)=(ピーク面積(s/as);t=x/ピーク面積(s/as);t=0分)*100%。
すべての値をt=0分におけるFLPに対し標準化した。表6は、ヒトCSF中37℃で48時間のインキュベート後の結果を示している。10種のJCV siRNA(AD−12622、AD−12724、AD−12767、AD−12769、AD−12795、AD−12813、AD−12818、AD−12823、AD−12824、AD−12842)のアンチセンス鎖とセンス鎖両方の少なくとも75%が回収されたが、これは、これらのsiRNAがヒトCSF中37℃で極めて安定であることを証明している。AD−12821の場合、ヒトCSF中37℃48時間のインキュベーション後に、アンチセンス鎖の59%およびセンス鎖の97%が回収されたが、これは、このsiRNAがヒトCSF中37℃下に48時間を越える半減期を有することを示している。
本発明の別の態様において、JCウイルスゲノムの発現活性を調節するJCウイルス特異的dsRNA分子は、DNAベクターまたはRNAベクターに挿入された転写ユニットから発現される(例えば、Couture,A, et al., TIG. (1996), 12:5-10;Skillern, A., et al.,International PCTPublication No. WO 00/22113、Conrad, International PCT
Publication No. WO 00/22114、およびConrad, US Pat. No. 6,054,299参照)。これら
の導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、あるいはウイルスベクターとして導入可能であり、宿主ゲノムに組み込まれ、一体化された導入遺伝子として受け継がれ得る。また、導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして受け継がれ得るように構築することもできる(Gassmann,etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292)。
dsRNAの個々の鎖は、2つの別個の発現ベクター上のプロモーターを用いて転写し、ターゲット細胞内に共トランスフェクトすることができる。あるいは、dsRNAの個々の鎖それぞれを、いずれも同じ発現プラスミド上にあるプロモーターを用いて転写してもよい。好ましい実施形態では、dsRNAは、ステム・アンド・ループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列を介して連結された逆方向反復配列として発現させる。
アデノウイルス〔例えば、Berkner, et al., Bio Techniques (1998) 6:616, Rosenfeld et al.,(1991, Science,252:431-434)およびRosenfeld et al., (1992), Cell 68:143-
155参照〕;またはアルファウイルスや当該技術分野で公知の他のウイルスをベースとし
て構築できるが、それらのウイルスには限定されない。レトロウイルスは、in vitroおよび/またはin vivoで、上皮細胞を含めた多くの異なる細胞種にさまざまな遺伝子を導入するのに用いられている〔例えば、Eglitis,et al., Science (1985) 230:1395-1398;Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1998) 85:6460-6464;
Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al.,
1990,Proc.Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al., 1991, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8
377-8381;Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al.,
1992, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-19; Kay et al., 1992, Human Gene Therap
y 3:641-647;Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et
al.,1993, J. Immunol. 150:4104-4115; U.S. Patent No. 4,868,116; U.S. Patent No
. 4,980,286;PCT Application WO 89/07136; PCT Appli cation WO 89/02468; PCT Appl
ication WO89/05345; およびPCT Application WO 92/07573参照〕。細胞のゲノムに挿入
された遺伝子を形質導入・発現し得る組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムを、PA317およびPsi−CRIPなどの適切なパッケージング細胞系にトランスフェクトすることにより作製することができる(Cometteet al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 81:6349)。組換えアデノウイルスベクターは、感受性宿主(例えばラット、ハムスター、イヌおよびチンパンジー)の多種多様な細胞および組織に感染させるのに使用できる(Hsuet al., 1992, J.Infectious Disease, 166:769)だけでなく、感染させるのに活発に有系***す
る細胞を必要とはしないという利点も有している。
et al., 1986,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515)参照〕。
可能発現系には、エクジソンによる調節、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化を誘導する化学物質、およびイソプロピル−β−D1−チオガラクトピラノシド(EPTG)による調節が含まれる。当業者であれば、dsRNA導入遺伝子の使用目的に基づいて適切な調節/プロモーター配列を選ぶことができるであろう。
。遺伝子治療用ベクター製剤は、許容される希釈剤中に遺伝子治療用ベクターを含むものであってもよいし、遺伝子導入ビヒクルが埋め込まれた遅延放出マトリックスからなるものであってもよい。あるいは、組換え細胞からそのまま完全な遺伝子導入ベクター、例えばレトロウイルスベクターが得られる場合、製剤は、この遺伝子導入系を産生する1個以上の細胞を含んでいてもよい。
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