JP2013520200A - ペプチド固定化表面をγ線劣化から保護するための修飾基板 - Google Patents
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Abstract
Description
1) 共有結合により、抗酸化剤の相分離または結晶化が防がれ、これにより、均一な分布および保護の効率が保証される;
2) 結合プロセスに追加の工程が必要ない;
3) 抗酸化分子が保護対象により近い。これにより、保護効率がさらに増加する;
4) 抗酸化分子は表面に共有結合し、したがって、抽出可能物質が導入されず、細胞培養前に追加の洗浄が必要ない;
5) 一般に、様々なタイプのペプチド結合表面を、γ線滅菌中、並びにプロセスストレス中および長期の貯蔵中に保護することが可能である。
1. 抗酸化剤および安定剤は、普遍保護層として働くことができる、すなわち、ペプチドおよび組換えECM蛋白質を含む全ての生物学的リガンドを、γ線照射を含む最終滅菌から保護できる;
2. 一般に、様々なタイプのペプチド結合表面を、γ線滅菌中および長期の貯蔵中に保護することが可能である;
3. 抗酸化剤および安定剤を組み合わせて、機能および費用対効果を改善することができる;
4. 薄い被覆は、除去する必要がないかもしれない、または細胞に毒作用を与えずに、水中に溶解させることによって、容易に除去できる;
5. 総製造原価に最小の費用しか加わらない。
1. 犠牲層として使用され、細胞培養前に除去されるペプチドは、結合可能なペプチドと同じであるので、改良された(re-vamped)GMP検証は必要ない;
2. 接着性ペプチド被覆は、費用の影響を減少させるために、非常に薄い被覆中に低濃度で施される;
3. 接着性ペプチドは容易に除去される;
4. 接着性ペプチドは、γ線照射に対する万能保護剤として使用できる。
材料および方法
アクリレート被覆:メタクリル酸2−ヒドロキシエチル、アクリル酸2−カルボキシエチル、ジメタクリル酸テトラ(エチレングリコール)、Darocur1173、Irgacure819を80:20:2:2:0.1の比率で混合し、5%の総モノマー濃度でエタノール中に溶解させた。得られた配合物を、酸素プラズマ処理済みZeonor膜上にスピンコートした。エタノールを蒸発させた後、窒素パージしたボックス内でキセノンパルスUV硬化システムを使用して、(メタ)アクリレート被覆を硬化させた。次いで、被覆された膜をT−75Zeonorフラスコ中にインモールドラベル(in-mold-labeled)し、結合のために直接使用した。
アミノ酸吸収:培養の4日後の細胞計数を使用して、γ線滅菌後のペプチドアクリレート表面の生物活性への影響を示した。どのような処理も行わずには、H7は、図1に「処理なし」により示されるように、γ線照射したVN−ペプチド表面に接着できない。メチオニンエステル処理済みVN−ペプチドアクリレート表面上では、γ線照射後に生物活性が維持された。このことが、図1に示されるように、γ線照射を行わなかった表面(ETOH対照)および「Matrigel」(我々のベンチマーク表面)の細胞数に対して、メチオニン処理した表面上の匹敵する細胞数によって、実証された。メチオニン処理により、幹細胞形態も陽性対照に匹敵した。
材料および方法:
i)アクリレート被覆の調製:全てのアクリレート被覆は、方法1に先に記載したように調製した。調製後、ペプチド結合実験に使用する準備ができるまで、全てのフラスコに蓋をして室温で貯蔵した。
糖蛋白質、糖、抗酸化剤、遊離ラジカル捕捉剤、アミノ酸および多価アルコールなどの安定剤の異なる組合せを、適切な溶媒中の様々な質量パーセント組成を使用して、被覆へと計画的に配合した。フラスコ上の被覆の厚さに関する図4(A,B)に示されるように、被覆配合物に応じて、各フラスコ上にそれぞれの被覆の厚い層を形成した。異なる被覆配合物を収容する8つのフラスコの各々は、γ線照射後に被覆を除去するための洗浄中に様々な難易度を有した。
材料および方法
i)アクリレート被覆の調製:説明については先の実施例1参照。
図7において、1mMのVN被覆(エタノール中)(γ線照射後に被覆が洗い流された)および1質量%のメチオニン被覆を有する新規の抗酸化ペプチド(γ線照射後に被覆が洗い流された)が被覆された、γ線照射後の1mMのVNペプチド結合ペプチド−アクリレートフラスコ上で培養したhESC H7細胞についての結果が示されている。この研究のみについて、細胞形態を毎日評価し、細胞計数および生存率について、細胞を4日目に収穫した。未洗浄の被覆(データは示さず)について、細胞は付着しなかったが、「洗い流された」被覆については、細胞数(図7参照)および形態(図8参照)は、エタノールおよび「Matrigel」対照フラスコ上の細胞のものに匹敵した。
Claims (5)
- γ線照射による未修飾細胞培養基板の劣化から保護し、安定化させる修飾細胞培養基板であって、前記修飾細胞培養基板が、該細胞培養基板の表面に結合した保護層を含み、該保護層が、ペプチド模倣表面を前記γ線照射から保護し安定化させるのに効果的な濃度で未反応のn−ヒドロキシスクシンイミド基の抑制(ブロッキング)と考えられる後ペプチド結合のための硫黄含有アミノ酸または該硫黄含有アミノ酸のペプチド短鎖を含むことを特徴とする未修飾細胞培養基板。
- γ線照射による未修飾細胞培養基板の劣化から保護し、安定化させる修飾細胞培養基板であって、前記修飾細胞培養基板が、該細胞培養基板の表面に被覆された保護層を含み、該被覆された保護層が、単糖と複合糖、炭水化物、糖蛋白質、親水性ポリマー、蛋白質、短いメチオニンを含有するペプチド、アミノ酸に類似の小分子およびビタミンA,C,EおよびPを含む、抗酸化剤と安定剤との組合せを含むことを特徴とする未修飾細胞培養基板。
- γ線照射による未修飾細胞培養基板の劣化から保護し、安定化させる修飾細胞培養基板であって、前記修飾細胞培養基板が、該細胞培養基板の表面に被覆された保護層を含み、該被覆された保護層が、少なくとも1から5のメチオニンアミノ酸残基を含有する接着性ペプチドを含むことを特徴とする未修飾細胞培養基板。
- 前記硫黄含有アミノ酸が、ペプチド結合後に、任意の残留または未反応n−ヒドロキシスクシンイミド反応性基に結合されたメチオニンエステル塩であることを特徴とする請求項1記載の未修飾細胞培養基板。
- 前記被覆された保護層が、グルコース、スクロース、フルクトース、トレハロース、D−マンノース、D,L−ガラクトース、D−ソルビトール、サッカリンおよびD−ロイクロースを含む糖を含むことを特徴とする請求項2記載の未修飾細胞培養基板。
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