JP2003527210A

JP2003527210A - 生体材料を滅菌するための方法

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Publication number: JP2003527210A
Application number: JP2001568474A
Authority: JP
Inventors: エス．ケントランドール; エイ．ホートンエドワード
Original assignee: Clearant Inc
Current assignee: Clearant Inc
Priority date: 2000-03-23
Filing date: 2001-03-23
Publication date: 2003-09-16
Also published as: WO2001070279A1; US20030143106A1; AU5903101A; EP1299131A4; EP1299131A1; IL151881A0; AU2001259031B2; ZA200208120B; MXPA02009321A; PL358451A1; EA005977B1; CA2403834A1; EP1762251A1; NZ521392A; CN1427729A; BR0109764A; PL197667B1; EA200201012A1; KR20030011279A

Abstract

(57)【要約】生物的製品を滅菌し、ウイルス、細菌、酵母、カビ、マイコプラズマ、および寄生生物など、活性な生物的混入物のレベルを低下させるための方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 (発明の分野) 本発明は、その中のウイルス、細菌、酵母、カビ、マイコプラズマおよび/ま
たは寄生生物など、活性な生物的混入物のレベルを低下させるために、生体材料
を滅菌するための方法に関する。

【０００２】 (発明の背景) ヒト、獣医学または実験の利用から調製されるいくつかの製品は、ウイルス、
細菌、酵母、カビ、マイコプラズマおよび寄生生物など、望ましくない、また潜
在的に危険な混入物を含む可能性がある。したがって、製品を使用する前に、製
品中のどんな生物学的に活性な混入物も、不活性化することは、極めて重要であ
る。例えば輸血、臓器移植、および他の形のヒトの療法の際など、製品が直接的
に患者に与えられる場合、このことは特に重要である。このことはまた、様々な
タイプの血漿を含有し、マイコプラズマまたは他のウイルス混入物にさらされる
可能性がある培地で増殖させる様々なバイオテクノロジー製品にとって重要であ
る。

【０００３】以前、大抵の手順は、製品から混入物を除去する、あるいは不活性化するので
はなく、特定の混入物について製品を選別審査(screen)または試験する方法を使
用するものであった。混入物に対して試験結果が陽性である製品は、単に使用で
きないだけである。選別審査手順の例には、供血者からのヒト血液における特定
のウイルスに対する試験がある。しかし、こうした手順は、常に信頼できるわけ
ではなく、非常に少数の場合のウイルスの存在を検出することができない。これ
により、誤った陰性の結果に伴う諸結果のために、試験の価値または確実性が減
る。誤った陰性の結果は、ある種の場合、例えば後天性免役不全症候群(AIDS)の
場合、生命を脅かす可能性がある。さらに、ある例では、製品が汚染しているか
どうか決定するのに、数ヶ月とまではいかないが、数週間かかる可能性がある。

【０００４】より最近の研究は、製品中の混入物を除去するまたは不活性化するための方法
に、焦点を当てている。こうした方法には、熱処理、濾過、および製品への化学
的不活性化剤(inactivant)または増感剤の添加がある。熱処理は、製品をおよそ
60℃に約70時間加熱することが必要であり、これによって感受性のある製品が損
なわれる可能性がある。熱による不活性化は、製品の生物学的活性を最高で50%
破壊する可能性がある。濾過は、混入物を物理的に取り除くために製品を濾過す
るものである。あいにく、この方法では、高分子量の製品も除去されてしまう。
さらに、場合によっては、製品の分子構造がより大きいため、フィルターによっ
て小さなウイルスを除去することができない。化学増感の手順は、有害な薬剤の
添加を使用し、この有害な薬剤は、ウイルスのDNA/RNAに結合し、また、UVまた
は電離放射線によって活性化してウイルスのDNA/RNAの骨格中の化学結合を切断
する、あるいはウイルスと複合体形成する遊離基を生成して、ウイルスがもはや
複製できないようにする。この手順では、増感剤は、変異誘発性または発癌性と
まではいかないが、毒性があり、患者に与えることができないので、結合しなか
った増感剤を細胞性製品から洗浄する必要がある。

【０００５】製品をγ放射線で照射することは、製品を滅菌する別の方法である。γ放射線
は、高い総線量で与えた場合、ウイルスおよび細菌の破壊において有効である(K
eathly他.、「Is There Life After Irradiation? Part 2」、Bio Pharm July-A
ugust、1993、およびLeitman、「Use of Blood Cell Irradiation in the Preve
ntion of Post Transfusion Graft-vs-Host Disease」、Transfusion Science 1
0:219-239(1989))。しかし、この分野で刊行された文献は、γ放射線が、血液な
ど、放射線感受性の製品を損傷させる可能性があることを教示する。具体的には
、高放射線量は、赤血球、血小板、顆粒球に有害であることが示されている(Lei
tman)。米国特許第4,620,908号は、タンパク質製品の生存能力を保つために、タ
ンパク質製品を照射前に凍結する必要があることを開示する。この特許は、「タ
ンパク質材料が例えば周囲温度のとき、γ照射が適用されるならば、この材料自
体も完全に破壊され、この材料の活性は実質的に効果がない位に低下する」と結
論づけている。あいにく、血液など、多くの感受性のある生物学的物質(biologi
cal)は、照射目的で凍結し、患者への投与の前に解凍した場合、生存能力および
活性を失ってしまう。

【０００６】上で議論した問題点のために、生体材料に対する有害反応なしに活性な生物的
混入物のレベルを低下させるのに有効な、生体材料の滅菌方法が、依然として必
要である。

【０００７】 (発明の概要) したがって、本発明の一目的は、生体材料に有害な影響を与えることなく活性
な生物的混入物のレベルを低下させることによって、生体材料を滅菌する方法を
提供することである。本発明の別の目的、特徴および長所は、以下の好ましい実
施形態の詳細な説明で述べるが、一部分はこの説明から明らかになり、あるいは
本発明の実施によって知ることができるであろう。本発明のこれらの目的および
長所は、特に本明細書に記載される説明および特許請求の範囲に示される組成物
および方法によって実現し、達成されるであろう。

【０００８】これらの目的および他の目的に従って、本発明の第一の実施形態は、電離放射
線に感受性のある生体材料を滅菌する方法であって、(i)生体材料の残留溶媒量
を、生体材料を電離放射線から防護するのに有効なレベルに減少させること、お
よび(ii)生体材料を、この生体材料を滅菌するのに有効な時間、有効なレートの
放射線で照射することを含む方法を対象とする。

【０００９】本発明の第二の実施形態は、電離放射線に感受性のある生体材料を滅菌する方
法であって、(i)生体材料に、少なくとも1種の安定剤を、生体材料を電離放射線
から防護するのに有効な量加えること、および(ii)生体材料を、この生体材料を
滅菌するのに有効な時間、有効なレートの放射線で照射することを含む方法を対
象とする。

【００１０】本発明の第三の実施形態は、電離放射線に感受性のある生体材料を滅菌する方
法であって、(i)生体材料の残留溶媒量を、生体材料を電離放射線から防護する
のに有効なレベルに減少させること、および(ii)生体材料に、少なくとも1種の
安定剤を、生体材料を電離放射線から防護するのに有効な量加えること、および
(iii)生体材料を、この生体材料を滅菌するのに有効な時間、有効なレートの放
射線で照射することを含む方法を対象とする。この実施形態によれば、ステップ
(i)と(ii)は逆にしてもよい。

【００１１】 (好ましい実施形態の詳細な説明) A.定義別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術および科学用語はすべて、関
連する技術の技術者が普通に理解するのと同じ意味であると意図される。本明細
書で言及する特許および刊行物をすべて、参照によって明示的に組み込む。

【００１２】本明細書では、用語「生体材料」は、生きている生物から取り出されたまたは
得られたどんな物質も意味するものとする。生体材料の例には、それだけには限
らないが、細胞、組織、血液または血液成分、組み換え型および遺伝子組み換え
タンパク質を含めてタンパク質、植物性物質(botanicals)、食物などがある。生
体材料の好ましい例には、それだけには限らないが、靱帯;腱;神経;鉱物質除去
された(demineralized)骨基質、移植片、関節、大腿骨、大腿骨骨頭などを含め
て骨;歯;皮膚移植片;骨髄細胞懸濁液、全体または処理されたものを含めて骨髄;
心臓弁;軟骨;角膜;動脈および静脈;心臓、肺、肝臓、腎臓、腸、膵臓、肢および
指など移植用の器官;脂質;炭水化物;コラーゲン(天然、無原線維性、無テロメア
の(atelomeric)、可溶性および不溶性);キチン、ならびにキトサンおよび(NO-カ
ルボキシキトサン(NOCC)を含めて)キトサン誘導体を含めてその誘導体;幹細胞、
ランゲルハンス島細胞、および遺伝子改変細胞を含めて他の細胞性移植片;赤血
球;単球および幹細胞を含めて白血球;ならびに血小板がある。

【００１３】本明細書では、用語「滅菌する」は、本発明に従って処理される生体材料中に
見られる少なくとも1種の活性な生物的混入物のレベルの低下を意味するものと
する。

【００１４】本明細書では、用語「生物的混入物」は、生体材料に直接または間接的に接触
し、生体材料に有害な影響を与える可能性のある混入物を意味するものとする。
こうした生物的混入物には、全血または血液成分などの生体材料中に一般に見ら
れ、あるいは生体材料を感染させることが、当分野の技術者に知られている様々
なウイルス、細菌、および寄生生物がある。生物的混入物の例には、それだけに
は限らないが、ヒト免疫不全ウイルスおよび他のレトロウイルスなどのウイルス
、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、サイトメガロウイルス、(B型肝炎お
よびC型肝炎を含めて)肝炎ウイルス、ポックスウイルス、トガウイルス、伝染性
単核症(Ebstein Barr)ウイルスおよびパルボウイルス;大腸菌属(Escherichia)、
桿菌属(Bacillus)、カンピロバクター属(Campylobacter)、連鎖球菌属(Streptoc
occus)およびブドウ球菌属(Staphalococcus)などの細菌;トリパノソーマ属(Tryp
anosoma)、およびプラズモディウム種(Plasmodium species)を含めてマラリア原
虫などの寄生生物;酵母;カビ;マイコプラズマ;およびプリオンがある。本明細書
では、用語「活性な生物的混入物」は、有害な作用を引き起こす可能性のある生
物的混入物を意味するものとする。

【００１５】本明細書では、用語「血液成分」は、全血から分離することができる1種また
は複数の成分を意味するものとし、それだけには限らないが、赤血球、白血球お
よび血小板などの細胞性血液成分;血液凝固因子、酵素、アルブミン、プラスミ
ノゲン、フィブリノゲン、免疫グロブリンなどの血液タンパク質;ならびに血漿
および血漿含有組成物などの液体の血液成分が含まれる。

【００１６】本明細書では、用語「細胞性血液成分」は、赤血球、白血球または血小板など
の細胞を含む、全血の1種または複数の成分を意味するものとする。

【００１７】本明細書では、用語「血液タンパク質」は、全血中に普通に見られる1種また
は複数のタンパク質を意味するものとする。(ヒトを含めて)哺乳類に見られる血
液タンパク質の例には、それだけには限らないが、(第VII因子または第IX因子な
どビタミンK依存性の、ならびに第VIII因子およびフォンウィルブランド因子な
どビタミンK非依存性の)血液凝固タンパク質、アルブミン、リポタンパク質(高
密度リポタンパク質および/または低密度リポタンパク質)、補体系タンパク質、
(免疫グロブリンIGA、IGM、IgGおよびIGEなどの)グロブリンなどがある。血液タ
ンパク質の好ましい群には、第I因子(フィブリノゲン)、第II因子(プロトロンビ
ン)、第III因子(組織因子)、第IV因子(カルシウム)、第V因子(プロアクセレリン
)、第VI因子(アクセレリン)、第VII因子(プロコンバーチン、血清プロトロンビ
ン転化促進因子)、第VIII因子(抗血友病性因子A)、第IX因子(抗血友病性因子B)
、第X因子(スチュアート-プロワー因子)、第XI因子(血漿トロンボプラスチン前
駆物質)、第XII因子(ハーゲマン因子)、第XIII因子(プロタンスグルタミダーゼ(
Protansglutamidase))、フォンウィルブランド因子(vWF)、第Ia因子、第IIa因子
、第Va因子、第VIa因子、第VIIa因子、第VIIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、お
よび第XIIIa因子がある。

【００１８】本明細書では、用語「液体の血液成分」は、血漿(血液凝固前に見られるよう
なヒトまたは動物の血液の非細胞性流動部分)または血清(血液凝固後のヒトまた
は動物の血液の非細胞性流動部分)など、全血中の1種または複数の非細胞性流体
成分を意味するものとする。

【００１９】本明細書では、用語「生物学的に適合性のある溶液」は、例えば生体材料をそ
の中に懸濁または溶解することによって、生体材料がさらされる可能性があり、
生体材料が生存可能なままである、すなわちその本質的な生物学的および生理学
的特性が残る溶液を意味するものとする。こうした生物学的に適合性のある溶液
は、少なくとも1種の有効量の抗凝血薬を含有することが好ましい。

【００２０】本明細書では、用語「生物学的に適合性のある緩衝液」は、生体材料の完全な
状態を保つのに適したpHおよび浸透圧特性(例えば、張性、オスモル濃度、およ
び/またはコロイド浸透圧)をもつ生物学的に適合性のある溶液を意味するものと
する。生物学的に適合性のある適当な緩衝液は、通常、pHが5と8.5の間であり、
等張性、またはほどほどに低張性、または高張性である。生物学的に適合性のあ
る緩衝液は、当分野の技術者には知られており、容易に入手できる。

【００２１】本明細書では、用語「安定剤」は、この材料が安全かつ有効に使用できなくな
るのには不十分なレベルで照射された生体材料へのどんな損傷も減らす化合物ま
たは材料を意味するものとする。安定剤の例には、それだけには限らないが、ア
スコルビン酸およびトコフェロールなどの酸化防止剤、エタノールなどのフリー
ラジカルスカベンジャーがある。安定剤の好ましい例には、それだけには限らな
いが、6,8-ジメルカプト-オクタン酸(リポ酸)およびその誘導体および類似体(α
、β、ジヒドロ、ビスノル、およびテトラノルリポ酸)、チオクト酸、6,8-ジメ
ルカプト-オクタン酸、ジヒドロロポエート(dihydrolopoate)(DL-6,8-ジチオー
ルオクタン酸メチルエステル)、リポアミド、ビスノルメチルエステルおよびテ
トラノル-ジヒドロリポ酸、フラン脂肪酸、オレイン酸およびリノール酸および
パルミチン酸ならびにそれらの塩および誘導体を含めて脂肪酸;ケルセチン、ル
チンおよびその誘導体、アピゲニン、アミノフラボン、カテキン、ヘスペリジン
、ならびにナリンジンなど、フラボノイド、フェニルプロパノイド、およびフラ
ボノール;βカロチンを含めてカロチン;Co-Q 10;キサントフィル;グリセリン、
マンニトールなどの多価アルコール;キシロース、グルコース、リボース、マン
ノース、フルクトース、トレハロースなどの糖;ヒスチジン、N-アセチルシステ
イン(NAC)、グルタミン酸、トリプトファン、カプリルN-アセチルトリプトファ
ンナトリウム(sodium carpryl N-acetyl tryptophan)、およびメチオニンなどの
アミノ酸;アジ化ナトリウムなどのアジ化物;スーパーオキシドジスムターゼ(SOD
)およびカタラーゼなどの酵素;1,3-ジメチル尿酸およびジメチルチオ尿素などの
尿酸およびその誘導体;アロプリノール;グルタチオンおよびシステインなどのチ
オール;セレンなどの微量元素;ビタミンA、(その誘導体ならびにアスコルビン酸
ナトリウムおよびパルミトイルアスコルビン酸(palmitoyl ascorbic acid)など
の塩を含めて)ビタミンC、およびビタミンE(およびその誘導体ならびに酢酸トコ
フェロールおよびα-トコトリエノールなどの塩)などのビタミン;クロマノール-
α-C6;6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2カルボン酸(トロロックス
)および誘導体;ゼラチンおよびアルブミンなどの外来性タンパク質;トリス-3-メ
チル-1-フェニル-2-ピラゾリン-5-オン(MCI-I 86);シチオロン;プエルセチン(pu
ercetin);クリシン(chrysin);ジメチルスルホキシド(DMSO);ピペラジン-2-エタ
ンスルホン酸(PIPES);イミダゾール;メトキシソラレン(MOPS);1,2-ジチアン-4,5
-ジオール;ブチルヒドロキシアニソール(BHA)およびブチルヒドロキシトルエン(
BHT)などの還元物質;コレステロール;プロブコール;インドール誘導体;チメロサ
ール;ラザロイド(lazaroid)およびチリラザドメシレート(tirilazad mesylate);
プロアンセノール(proanthenol);プロアンソシアニジン;硫酸アンモニウム;Pego
rgotein(PEG-SOD);N-tert-ブチル-α-フェニルニトロン(PBN);ならびに4-ヒドロ
キシ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル(Tempol)がある。

【００２２】本明細書では、用語「残留溶媒量」は、生体材料中の自由に使用できる(freel
y-available)液体の量を意味するものとする。自由に使用できる液体は、水また
は有機溶媒(例えばエタノール、イソプロパノール、ポリエチレングリコールな
ど)など、生体材料中に存在する、生体材料(例えばタンパク質、金属イオン、ま
たは塩など)の1種または複数の非液体成分と結合または複合体形成しない液体を
意味する。自由に使用できる液体には、細胞内の水が含まれる。本明細書で引用
した残存する溶媒含有量は、米国食品医薬品局(FDA)承認の、修正カールフィッ
シャー法(Meyer and Boyd,Analytical Chem.、31、215-219,1959;May他.、J.Bio
l.Standardization,10,249-259,1982;Centers for Biologics Evaluation and R
esearch、FDA、Docket No.89D-0 140,83-93;1990)によって決定されたレベルを
指す。

【００２３】本明細書では、用語「増感剤」は、ウイルス、細菌および/または寄生生物の
混入物を選択的に標的にし、それらの放射線による不活性化に対する感受性をよ
り高め、その結果、増感剤がない場合よりも低レートの放射線および/またはよ
り短い照射時間が使用できるようにする物質を意味するものとする。適当な増感
剤の例には、それだけには限らないが、ソラレンならびにその誘導体および類似
体(3-カルボエトキシソラレンを含めて);ハロゲン置換基と、第4級アンモニウム
イオンまたはホスホニウムイオンなどの水溶化部分を含むアンゲリシン、ケリン
およびクマリン;核酸結合化合物;臭化(brominated)ヘマトポルフィリン;フタロ
シアニン;プルプリン;ポルフォリン;ジヘマトポルフィリンエステル、ヘマトポ
ルフィリン誘導体、ベンゾポルフィリン誘導体、ヒドロジベンゾポルフィリンジ
マレイミド、ヒドロジベンゾポルフィリン、ジシアノジスルホン(dicyano disul
fone)、テトラカルボエトキシヒドロジベンゾポルフィリン、およびテトラカル
ボエトキシヒドロジベンゾポルフィリンジプロピオンアミドのハロゲン化または
金属原子置換誘導体;ハロゲンまたは金属原子で修飾できるドキソルビシンおよ
びダウノマイシン;ネトロプシン(netropsin);BDペプチド、S2ペプチド;S-303(AL
E化合物);ヒペリシン、メチレンブルー、エオシン、フルオレセイン類(およびそ
れらの誘導体)、フラビン、メロシアニン540などの色素;ベルガプテンなどの光
活性化合物;ならびにSEペプチドがある。

【００２４】本明細書では、用語「タンパク様材料」は、少なくとも1種のタンパク質また
はペプチドを含む細胞性材料を意味するものとする。この材料は、主として1種
または複数のタンパク質および/または1種または複数のペプチドからなることが
好ましい。これは、天然の状態の、あるいは以下のように処理/精製および/また
は誘導体化した自然に存在する材料であってもよい。これは、化学合成によって
、または組み換え/遺伝子組み換え技術の利用によって人工的に生成してもよい
。こうした人工的に生成した材料を、処理/精製および/または誘導体化してもよ
い。タンパク様材料の例には、それだけには限らないが、組織培養物から生成し
たタンパク質/ペプチド;ミルク(乳製品);腹水;ホルモン;成長因子;動物組織から
(ヘパリンおよびインスリンなど)または植物物質から抽出あるいは分離した薬剤
(pharmaceutical)を含めて材料;(新鮮、凍結および凍結乾燥したものを含めて)
血漿;フィブリノゲン、フィブリンおよび/またはフィブリンシーラント製品;全
血;プロテインC;プロテインS;α-1抗トリプシン(α-1プロテアーゼ阻害剤);ブチ
ル-コリンエステラーゼ;クマリン薬(ワーファリン)などの抗凝血薬;ストレプト
キナーゼ;組織プラスミノゲンアクチベーター(TPA);エリトロポエチン(EPO);ウ
ロキナーゼ;ニューポジェン(neupogen);抗トロンビン-3;α-グルコシダーゼ;ウ
シ(胎児)血清/ウマ血清;肉;抗血清、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体
、および遺伝子操作した、または生成した抗体を含めて免疫グロブリン;アルブ
ミン;α-グロブリン;β-グロブリン;γ-グロブリン;血液凝固タンパク質;補体系
タンパク質;およびインターフェロンがある。

【００２５】本明細書では、用語「電離放射線」は、照射された生体材料をイオン化する(
イオンを生成する)のに十分な放射線を意味するものとする。電離放射線のタイ
プには、それだけには限らないが、(i)粒子(中性子、電子、および/または陽子
などの亜原子粒子のストリーム)、ならびに(ii)電磁気(電波、可視および不可視
光線、X放射線、およびγ線などの電磁場の変化で生じるもの)がある。

【００２６】 B.特に好ましい実施形態本発明の第一の好ましい実施形態は、電離放射線に感受性のある生体材料を滅
菌する方法であって、(i)生体材料の残留溶媒量を、この生体材料を電離放射線
から防護するのに有効なレベルに減少させること、および(ii)生体材料を、この
生体材料を滅菌するのに有効な時間、有効なレートの放射線で照射することを含
む方法を対象とする。

【００２７】本発明の第二の好ましい実施形態は、電離放射線に感受性のある生体材料を滅
菌する方法であって、(i)生体材料に、少なくとも1種の安定剤を、この生体材料
を電離放射線から防護するのに有効な量加えること、および(ii)生体材料を、こ
の生体材料を滅菌するのに有効な時間、有効なレートの放射線で照射することを
含む方法を対象とする。

【００２８】本発明の第三の好ましい実施形態は、電離放射線に感受性のある生体材料を滅
菌する方法であって、(i)生体材料の残留溶媒量を、この生体材料を前記電離放
射線から防護するのに有効なレベルに減少させること、(ii)生体材料に、少なく
とも1種の安定剤を、この生体材料を電離放射線から防護するのに有効な量加え
ること、および(iii)生体材料を、この生体材料を滅菌するのに有効な時間、有
効なレートの放射線で照射することを含む方法を対象とする。ステップ(i)と(ii
)の順序は、当然、望みに応じて逆にしてもよい。

【００２９】本発明の方法に従って滅菌される生体材料は、固体材料、あるいは液体材料、
あるいは1種または複数のいずれかの液体中の、1種または複数のいずれかの固体
の懸濁液、あるいは生物的または非生物的基質に対するいずれかの固体または液
体のコーティングを含めて、生きているまたは力を弱めた生物から得られた、あ
るいは取り出されたどんな材料でもよい。

【００３０】本発明の方法によれば、生体材料を電離放射線で照射する前に、この生体材料
の残留溶媒量を減少させる。残留溶媒量は、電離放射線から生体材料を防護する
のに有効なレベルに減少させる。残留溶媒量の適当なレベルは、照射される特定
の生体材料の性質および特性に応じて異なる可能性があり、当分野の技術者が経
験に基づいて決定することができる。溶媒が水である場合、残留溶媒量は、好ま
しくは約2.0%未満、より好ましくは約1.0%未満、さらに好ましくは約0.5%未満、
最も好ましくは約0.2%未満である。

【００３１】特定の有効な理論に拘泥するものではないが、残留溶媒量の減少により、生体
材料の自由度が低下し、その結果、生体材料が電離放射線の影響から防護される
と考えられている。したがって、同様に生体材料の自由度を低下させるために、
生体材料の温度をその共融点より低く、あるいはその凝固点より低くすることに
よって、同様の結果が得られる。これらの結果、他の場合に許容されるよりも高
レートの照射が使用できるようになる。

【００３２】生体材料の残留溶媒量は、当分野の技術者に知られた、生体材料から溶媒を除
去するためのどんな方法および技術によって減少させることもできる。生体材料
の残留溶媒量を減少させるための特に好ましい方法は、凍結乾燥である。本発明
の特に好ましい実施形態によれば、照射前に、凍結乾燥した生体材料を真空、ま
たは不活性雰囲気(好ましくはヘリウムまたはアルゴンなどの希ガス、より好ま
しくはより高分子量の希ガス、最も好ましくはアルゴン)中に保管する。

【００３３】本発明で使用する電離放射線は、処理対象となる生体材料の1種または複数の
生物的混入物の不活性化に有効などんな電離放射線でもよい。電離放射線は、電
磁放射線であることが好ましく、特に好ましい電離放射線の形は、γ放射線であ
る。

【００３４】本発明の方法によれば、生体材料を、生体材料の1種または複数の生物的混入
物の不活性化に有効なレートの電離放射線で照射する。照射の適当なレートは、
電離放射線の特定の形、ならびに照射対象となる特定の生体材料の性質および特
性、ならびに不活性化される特定の生物的混入物に応じて変化する可能性がある
。照射の適当なレートは、当分野の技術者が経験に基づいて決定することができ
る。照射のレートは、滅菌手順の持続時間の間、一定であることが好ましい。

【００３５】本発明の特に好ましい実施形態によれば、照射のレートは、約3.0kGy/時間未
満であり、より好ましくは約0.1kGy/時間と3.0kGy/時間との間、さらに好ましく
は約0.25kGy/時間と2.0kGy/時間の間、それよりさらに好ましくは約0.5kGy/時間
と約1.5kGy/時間の間、最も好ましくは約0.5kGy/時間と1.0kGy/時間の間である
。

【００３６】本発明の特に好ましい別の実施形態によれば、照射のレートは、少なくとも約
3.0kGy/時間、より好ましくは少なくとも約6kGy/時間、さらに好ましくは少なく
とも約16kGy/時間、最も好ましくは少なくとも約30kGy/時間である。

【００３７】生体材料は、生体材料の1種または複数の生物的混入物の不活性化に有効な時
間、電離放射線で照射する。適当なイオン化時間は、電離放射線の特定の形およ
びレート、ならびに照射対象となる特定の生体材料の性質および特性、ならびに
不活性化される特定の生物的混入物に応じて変化する可能性がある。適当なイオ
ン化時間は、当分野の技術者が経験に基づいて決定することができる。

【００３８】場合によっては、電離放射線で照射する前に、少なくとも1種の有効量の増感
剤を、生体材料に加える。適当な増感剤は、当分野の技術者に知られている。

【００３９】本発明の方法によれば、生体材料の照射は、処理対象となる生体材料に有害で
ないどんな温度でも行うことができる。好ましい実施形態によれば、生体材料は
、周囲温度で照射される。代替の好ましい実施形態によれば、生体材料は、低下
させた温度、好ましくはその生体材料の共融点またはそれ以下で照射される。

【００４０】 C.実施例以下の実施例は、例示的であり、本発明を限定するものではない。他の適当な
変更形態および適合は、当分野の技術者によって普通に出会う類であり、十分に
本発明の趣旨および範囲に含まれる。

【００４１】実施例1-血液の滅菌 1日前の濃厚赤血球(packed red blood cell)の200mlバッグを使用した。最終
エタノール濃度が0.01%v/vになるように、エタノールをこの細胞に加えた。この
赤血球を、pHが約6.4から6.7であり、下の組成の体積500mlの変更されたクエン
酸塩-リン酸塩-デキストロース(Citrate Phosphate Dextrose)(CPD)溶液を用い
て、10分の1に希釈した。

【００４２】クエン酸塩一水和物 0.2g クエン酸ナトリウム二水和物 27.3g リン酸二水素ナトリウム 2.2g リン酸水素ナトリウム 1.0g デキストロース 3.2g

【００４３】この細胞を、コバルト60線源のラックを含む商用サイズのγ照射装置中で照射
した。照射は保護されていない(unprotected)ボックス中で実施した。この細胞
を、24時間、約1kGy/時間のレートで照射した。照射期間後、赤血球を目で見て
検査したところ、鮮赤色であり、生存可能であることが判明した。上記のCPD溶
液で希釈していない濃厚赤血球からなる対照サンプルは、照射後、生存可能では
なかった。

【００４４】照射手順の4日後、希釈した細胞を、様々な血液成分のレベルについて試験し
た。その結果を表1に示す。対照サンプルは、テストサンプルと同じバックから
の血液からなるが、照射を行わなかったものである。表1は、ヒト血液細胞を希
釈および照射しても、白血球数はそれほど変わらなかったことを例示する。血小
板数およびヘマトクリット値は、対照よりもわずかに低下していたが、これらの
値は、正常な成人血液にみられる範囲内である。ヘモグロビンのレベルは、対照
よりも高く、これは一部の赤血球が、この手順の間溶解したことを示していた。
このことはまた、赤血球数が少ないことによっても証明される。とはいえ、以前
に発表されたこととは異なり、本発明の手順では、50kGyまでの放射線では、血
液を破壊しなかった。これらの細胞を、低線量レートである1kGy/時間で照射す
る25kGyのγ照射の後、同様にカウントしたところ、生存可能であることが判明
した。

【００４５】

【表１】

【００４６】実施例2-デキストロースの滅菌血漿増量剤として低血糖症の治療の際に、また腎臓透析の際に、また肝臓毒を
打ち消すために、炭水化物および流体の欠乏を治療する場合、デキストロース(
またはグルコース)を含有する溶液を使用する(The Merck Index、Eleventh Edit
ion、Merck & Co. Inc.(1989)、およびMartindale's Extra Pharmacopecia、p.1
、265)。デキストロースはまた、静脈栄養レジメンにおける好ましい炭水化物源
である(The Merck Index, Eleventh Edition、Merck & Co.、Inc.(1989)、およ
びMartindale's Extra Pharmacopecia, p.1、265)。上の適用例すべてにおいて
、デキストロースは、使用前に滅菌しなければならない。デキストロース含有製
品の滅菌は、一般に、熱滅菌またはオートクレーブによって行われる。あいにく
、これらの方法は、デキストロース含有溶液を品質低下またはカラメル化させ、
この溶液の色を変化させることが報告されている(Martindale's Extra Pharmaco
pecia p.1, 265)。グルコースのγ照射が、グルコース含有溶液を分解させるこ
とも報告されている(Kawakishi他.、「Radiation-Induced Degradation of D-gl
ucose in Anaerobic Contition」、Agric. Biol. Chem.、June 1977)。したがっ
て、製品自体を品質低下させずにデキストロース含有製品を滅菌することができ
る方法が必要である。これらの従来技術の問題を考慮して、デキストロース溶液
を以下のような本発明の方法に従って処理した。

【００４７】 5%デキストロース溶液を24時間、約1kGy/時間のレートで照射した。照射後、
この製品を試験したところ、照射していない対照と比較して可視光線スペクトル
の変化がないことが判明した。したがって、この方法は、デキストロースを含有
する製品の滅菌に有用でありうる。

【００４８】上の実験に加えて、5%および50%のデキストロースの新鮮な溶液を、周囲温度
で36時間、25kGyで照射した。これらの結果は、上述の結果とほぼ同じであった
。さらに、UV/VISスキャンが得られ、U.S.P.による「フルフラル」に対する283.
4nmのピークが完全にないことが実証された。対照的に、オートクレーブを用い
て滅菌したデキストロースサンプルは、283.4フルフラルピークを含む。「フル
フラル」は、発癌性がある。

【００４９】実施例3-ヒト血清アルブミンの滅菌正常ヒト血清アルブミンを、25%塩欠乏(salt-poor)溶液として、ガンマセル22
0(Gammacell 220)(この装置ではCo⁶⁰がγ線源である)を用いて総線量25kGyで36
時間にわたって照射した。照射中、温度は制御しなかったが、アルブミン溶液を
保持している容器は約23℃と推定される。HPLC分析の結果を、表2に示す。

【００５０】

【表２】

【００５１】この結果が実証するように、正常ヒト血清アルブミンは、タンパク質の本質的
特性に悪影響を与えることなく、室温で、25kGyで(約0.7kGy/時間のレートで)安
全に照射することができる。このことは、以前は実証されていなかった。血清ア
ルブミンを照射する別のすべての試みでは、凍結された段階で照射する必要があ
る。この場合、照射を行う費用と困難が加わる。

【００５２】実施例4 健康な提供者からの正常なヒト血液をヘパリン処置した(heparinized)管に入
れし、標準のCPD溶液で3回洗浄し、次いで0.01%v/vエタノールを含有するCPDで1
:20に希釈した。後者の0.01%v/vエタノールを含有するCPD溶液は、SCPDと呼ばれ
ている。次いで2mlのアリコートを10mlプラスチック試験管に入れ、室温で、36
時間over、26kGyまでの異なる線量で照射した。溶血はみられず、細胞は、多少
大きく、わずかに形がふぞろいではあるが、損傷していないと思われた。3つの
別の実験の結果を、表3に報告する。

【００５３】

【表３】

【００５４】細胞を簡単に懸濁液に入れ、新鮮な緩衝液で還元する。HIVで汚染された血液
を処理する場合の方法の有効性を決定するために、下の3つの実験(実施例5、6、
および7)を、実施した。各実施例において、細胞を同様に処理した。これらの実
験では、細胞を、照射の12、16、および24時間後に穏やかに攪拌した。さらに、
第三の実験(実施例7)では、細胞をT25フラスコに入れ、表面積をより広くして、
遠心管の底に沈殿することによる濃縮を減少させた。各場合において、細胞を、
約0.7kGy/時間の線量レートで照射した。

【００５５】実施例5-HIV含有血液の滅菌次の特定の目的をもって以下の実験に取りかかった。 1.赤血球(RBC)に対するこのプロセスの毒性を評価すること。 2.このプロセスの抗レトロウイルス活性を評価すること。

【００５６】方法最初に、血液凝固を阻止した(anticoagulated)血液2mlを、HIV血清陰性の提供
者から得た。この血液を遠心分離し、血漿を取り除いた。残った細胞ペレットを
、CPD緩衝液10mlに再懸濁させ、遠心した。この洗浄プロセスを計3回繰り返した
。最終のペレットを、SCPD緩衝液40mlに再懸濁させ、プラスチック管にアリコー
トを2mlずつ分注し、16の異なるアリコートをさらなる操作のために確保した。
これらの管のうち8本には、HTLV-IIIBのアリコートを加えた。これは、HIVウイ
ルスの実験用株であり、これの100組織培養感染量(TCID)を各管に加えて、感染
させた。残りの8本には、少量の非感染性の実験用緩衝液、リン酸緩衝生理食塩
水(PBS)を加えることによって、「膜擬(mock)」感染を実施した。感染させた管4
本と、感染させていない管4本を、このプロセスにかけた。比較のために、残り
の8本の管(感染させた管4本と、感染させていない管4本)も、このプロセスにか
けないこと以外は、同様に扱った。

【００５７】別の血液のアリコートを、研究の始めに提供者から得たことを指摘しておきた
い。これを、臨床の血液学実験室で処理し、完全な血液像を得た。これらの基準
の結果を、それぞれすべてHIV感染させていない4本の処理サンプルと4本の未処
理サンプルの評価を含めて、研究用アリコートの繰返しの試験と比較した。

【００５８】感染させた各研究サンプルの0.5mlのアリコートを、3日前に得た単核細胞(MC)
に接種した。この細胞は、1μg/mlのPHA-Pに加えて、10%ウシ胎児血清および他
の添加剤(ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、およびHEPES緩衝液)
を含有するRMPI培地に懸濁させてあった。接種と同時に、この細胞を、rIL-2(20
U/ml)を含有する新鮮な培地に再懸濁させた。これを7日間培養し続けた。ウイル
スの増殖を測定するため、週に2回、培地の一部を、HIV p24抗原レベルの測定(c
ommercial ELISA kit, Coulter Electronics, Hialeah, FL)のために採取した。

【００５９】 8本の感染させた研究サンプルの別のアリコートを、ウイルス力価測定実験の
ために使用した。簡単に、ウイルス含有流体を連続的に4倍希釈したもの(1:16か
ら1:65,536)を、3重で、96ウェル平底組織培養プレートに接種した。各ウェル(I
L-2含有培地2ml中に400万細胞)に、PHAで刺激したMCを加えた。HIV p24抗原レベ
ルの測定のために、各培養ウェルからの上清のアリコートを週2回採取した。HIV
p24抗原価>30pg/mlであった場合、そのウェルを「陽性」と記録した。

【００６０】ウイルスの力価を、Spearman-Karber法(se ACTG viroloGy protocol manual)
に従い、次の式を用いて計算した。

【００６１】 M=xk+d[0.5-(l/n)r] M:力価(log 4) xk:最大希釈量 d:希釈の間隔 n:ウェルの数/希釈 r:ウェルの数の合計

【００６２】結果基準サンプル、ならびに未処理研究サンプルおよび処理研究サンプルについて
の赤血球パラメータを、表4に示す。

【００６３】

【表４】

【００６４】表4中の略語は、表3の下で説明している。

【００６５】上で述べた通り、未処理研究サンプルおよび処理研究サンプルのアリコート0.
5mlを用いて、HIV培養株を樹立した。培養の4日目および7日目の研究サンプルか
らのP24抗原レベル(pg/ml)を、表5に示す。

【００６６】

【表５】

【００６７】最後に、培養を行わない直接的ウイルス力価測定の実施のために、未処理サン
プル1本と処理サンプル1本を選択した。結果を表6に示す。

【００６８】

【表６】

【００６９】再生可能ないくつかの大赤血球は観察されるが、このプロセスによって、赤血
球が受ける影響が最小限になった。処理サンプルの共培養(co-culturing)では生
きたウイルスが残っていると思われるが、これは直接的力価測定実験によって確
認することはできなかった。

【００７０】実施例6 この実験の目的は、赤血球に対するこのプロセスの毒性を包括的に評価するこ
とであった。

【００７１】方法この実験のために、血液凝固を阻止した血液1mlを、最初の実験と同様、同じH
IV血清陰性の提供者から得た。この血液を遠心分離し、血漿を取り除いた。残っ
た細胞ペレットを、CPD緩衝液10mlに再懸濁させ、遠心した。この洗浄プロセス
を計3回繰り返した。最終のペレットを、SCPD緩衝液20mlに再懸濁させ、プラス
チック管にアリコートを2mlずつ分注し、10のアリコートすべてをさらなる操作
のために確保した。8本の管をこのプロセスにかけ、最後の2本の管を対照、すな
わち未処理管として確保した。この処理の後、管をすべて遠心し、残ったペレッ
トを緩衝液100μlに再懸濁させた。これらの再濃縮研究サンプルについて完全な
血液像を得た。

【００７２】最初の実験と同様、血液の別のアリコートを、研究サンプルを採取したときの
提供者から得た。この基準サンプルについて完全な血液像を得た。この研究サン
プルは、もともとの状態の33-50%に再濃縮されているので、本発明者らの以前の
実験で可能であったよりも直接的に基準サンプルと比較することができた。

【００７３】結果基準サンプル、ならびに未処理研究サンプルおよび処理研究サンプルの赤血球
パラメータを、表7に示す。表7中で使用した略語は、表3中で定義してある。

【００７４】

【表７】

【００７５】細胞の大赤血球がみられ、これはすべての処理サンプル中に存在していた。未
処理サンプルおよび処理サンプルにおいて、比較可能なヘモグロビンレベルを測
定した。これらの絶対的な値は、残留物の希釈に適していた。これらの赤血球を
保存した。

【００７６】実施例7 方法この実験のために、血液凝固を阻止した血液5mlを、最初の2つの実験と同様、
同じHIV血清陰性の提供者から得た。この血液を遠心分離し、血漿を取り除いた
。残った細胞ペレットを、CPD緩衝液100mlに再懸濁させ、遠心した。この洗浄プ
ロセスを計3回繰り返した。最終のペレットを、SCPD緩衝液100mlに再懸濁させ、
T25組織培養フラスコにアリコートを25mlずつ分注し、4本のアリコートすべてを
さらなる操作のために確保した。2本のフラスコをこのプロセスにかけ、他の2本
を対照、すなわち未処理管として確保した。この処理の後、各フラスコの内容物
を観察し、酸素を吸収する細胞の能力(周囲の空気にさらされると、より鮮やか
な赤に変わる)を目で見て決定した。この後、フラスコの内容物を、吸引し、遠
心して、残ったペレットを小体積の緩衝液に再懸濁させた。これらの濃縮研究サ
ンプルについて完全な血液像を得た。

【００７７】実施例5および6と同様、血液の別のアリコートを、研究サンプルを採取したと
きの提供者から得た。この基準サンプルについて完全な血液像を得た。この研究
サンプルは、もともとの状態の33-50%に再濃縮されているので、基準サンプルを
用いて、いくつかの特定のパラメータの直接的比較が可能であった。

【００７８】結果視覚による検査では、処理研究サンプルと未処理研究サンプルの間に認識でき
る違いはなかった。具体的には、十分に懸濁した細胞が均一に分布しているよう
であった。周囲の空気にさらされると、すべてのフラスコ内の内容物は、若干、
より鮮やかな赤になった。酸素化の比量測定は行わなかった。

【００７９】基準サンプルについて、ならびに未処理研究サンプルおよび処理研究サンプル
についての赤血球のパラメータを、表8に示す。表8中で使用した略語は、表3の
下で定義してある。

【００８０】

【表８】

【００８１】この実験は、患者に輸血される血液に、より近い条件のために設計し、したが
って、より大きい体積で実施した。仮の理論では、このプロセスが、赤血球の酸
素を運ぶ能力を損なうことは明らかではないが、これはよりきちんと測定するべ
きである。興味深いことには、この実験では、処理サンプルと未処理サンプルと
の間に細胞サイズの違いがみられず、どちらも基準と比べて大きかった。研究サ
ンプルのすべてにおいて、比較可能なヘモグロビンレベルを測定した。

【００８２】実施例8 この実験では、免疫グロブリンG(IgG)を、凍結乾燥した形で照射した。

【００８３】方法 HPLC分析の結果を、表9に示す。この結果が実証するように、この製品は、約0
.7kGy/時間のレートで照射される場合、室温で25kGyの線量で照射された後も、
影響を受けていないと思われる。これは、以前には実証されていなかったことで
ある。

【００８４】

【表９】

【００８５】結果凍結乾燥したIgGを使用する、Gergely他によって示された結果では、標準の照
射線量レートで12kGyから25kGyの線量で照射した後、タンパク質の一部は不溶性
であることが示された(Gergely,J.,他.、「Studies of Gama Ray-irradiated Hu
man Immunoglobulin G.」SM-92/l2 I.A.E.A.)。対照的に、約.7kGy/時間の線量
レートでこの方法を使用すると、タンパク質は少しも不溶性でなかった。これは
、タンパク質に変化または分解がほとんど起こらなかった、あるいは起こらなか
ったことを示す。さらに、Gergely他は、ヒトIgGの液体の調合物は、照射後、そ
の活性を失うことを発見した。液体の形の静脈注射用免疫グロブリン(IVIG)につ
いてこの方法を用いた研究では、超免疫IVIG中の特異的抗体の70%以上が維持さ
れることが示された。

【００８６】実施例9 この実験では、α1プロテイナーゼインヒビターおよびフィブリノゲンを、凍
結乾燥した形で照射した。

【００８７】方法これらのサンプルをガンマセル220に入れ、このプロセスに従って、総線量25k
Gyで照射した。次いで、サンプルを分析のために実験室に戻した。線量レートは
0.72kGy/時間とした。

【００８８】結果 α1プロテイナーゼインヒビターは、処理されたものも対照もどちらも40%の標
準の正常なプール血漿サンプルであった。Manciniの放射免疫拡散技術を、この
アッセイとして使用した。

【００８９】局所用フィブリノゲン複合バイアルを、水10mlで還元した。硫酸プロタミンバ
イアルを、水10mlで還元した。10mg/mlの濃度の硫酸プロタミンを、サンプルに
加えた。3つの調製物すべての中で、即時に単量体が形成した。

【００９０】実施例10 この実験では、第VII、第VIII、および第IV因子を、凍結乾燥した形で照射し
た。

【００９１】方法これらのサンプルをガンマセル220に入れ、約1kGy/時間の線量レートで、様々
な総線量で照射した。

【００９２】結果第VII因子は、20kGyで67%の、10kGyで75%の活性を維持していた。第VIII因子
は、20kGyで77%、10kGyで88%の活性を維持していた。同様に、第IV因子は、20kG
yで70%、10kGyで80%の活性レベルを示した。

【００９３】 3つの因子について、すばらしい結果が判明した。我々の知る限りでは、これ
らの因子を周囲温度で、こうした高線量の放射線で照射することによって、活性
の損失が少ないこのような結果を今まで誰も実現したことがなかった。これは「
凍結乾燥した濃縮物の照射は、生存可能な手順ではない」ことを発見したKitche
n他、「Effect of Gamma Irradiation on the Human Immunodeficiency Virus a
nd Human Coagulation Proteins」Vox Sang 56:223-229(1989)の結果と明らかに
対照的である。同様に、Hiemstra他、「inactivation of human immunodeficien
cy virus by gamma radiation and its effect on plasma and coagulation fac
tors」Transfusion 31:32-39(1991)も、「血漿成分の生物的活性の許容できる回
復を依然としてもたらす放射線の線量ではウイルスの感染力の低下が小さいので
、γ放射線は、血漿および血漿から誘導された製品の滅菌のための方法としては
無視しなければならない」と結論づけている。

【００９４】実施例11 この実験では、細菌混入物を除去するために、赤血球を線量レート0.5kGy/時
間で、7.5から90分の範囲の時間照射した。

【００９５】方法赤血球は、EDTA中の健康な提供者から収集し、CPD溶液で3回洗浄し、DPCに再
懸濁させ、もともとの血液の体積に対して20分の1とした。次いで細胞懸濁液を
、14本の管にさらに分けた。そのうちの7本には、約1.0×10⁴の表皮ブドウ球菌(
Staphylococcus epidermidia)を加えた。照射しやすくするため、これらの細胞
を氷上に移動した。サンプルはすべて、周囲温度のチャンバーに入れ、0.5kGy/
時間で、それぞれ総線量0.625、0.125、0.250、0.375、0.500、および0.750kGy
を与える時間照射した。それぞれの時点でサンプルを取り出し、攪拌し、分析目
的の微生物学実験または血液学実験のために氷上に移動した。

【００９６】結果微生物学アッセイの結果を、表10に示す。

【００９７】

【表１０】

【００９８】このように、線量0.75kGyでは、細菌の生存数を4.5 log₁₀減少させた。これは
、血液にとってのかなりの安全率(safety factor)を意味する。さらに、D10値は
、約0.125kGyであり、これは、ブドウ球菌(staphylococcus)の同様の種について
の文献(B.A. Bridges、「the effect ofN-Ethylmaleimide on the radiation se
nsitivity of bacteria」、J. Gen. Microbiol. 26:467-472(1962)、およびJaco
bs、G.P. and Sadeh、N.、「radiosensitization of Staphyloccocus aureus by
p-hydroxyben.zoic acid」、Int. J. Radiat. Biol. 41:35 1-356(1982)で報告
された値にかなり一致する。

【００９９】これらの赤血球が照射プロセスの後も生存可能のままであることを実証するた
めに、これらの細胞、WBC、好中球、リンパ球、単球、好酸球、および好塩基球
について、次のパラメータを求めた。これらの決定は、単に細胞の存在数を数え
ただけであった。当然、核のある細胞はすべて、照射された放射線線量によって
不活性化された。赤血球の観察した他のパラメータを、表11に列挙する。メトヘ
モグロビン値は、線量0.75kGyの放射後も、対照のそれと変わらなかった。この
実験では、この方法によって、線量0.75kGyで、室温で、細胞機能を失うことな
く赤血球を安全に照射できることが実証された。

【０１００】実施例12 この実験を、実施例11の方法を用いて実施し、実施例11の結果を確認し、測定
したパラメータのいくつかを拡大した。この実験の結果を表12に示す。

【０１０１】結果 (下の表12を参照のこと) これらの結果は先の結果を確かにし、赤血球を本当に、細菌の数を4.5 log₁₀
減少させるのに十分な線量で照射できることを示す。

【０１０２】今後の実験により、血小板についての同様な結果が得られるであろうと考えら
れる。したがって、追加の操作を用いなくても、あるいはほとんど用いなくても
、また、外来性の材料を加えなくても、赤血球をこの方法によって処理し、細菌
学的に安全な製品を提供し、さらに、受血者における不都合な反応の危険性を低
下させることができる。

【０１０３】

【表１１】

【０１０４】

【表１２】

【０１０５】実施例13 この実験では、45kGyの低線量γ照射にさらされた凍結乾燥した抗インスリン
モノクローナル抗体を用いて、ある種の安定剤の防護効果を評価した。試験した
安定剤は、アスコルビン酸ナトリウム、メチオニン、およびリポ酸であった。

【０１０６】方法 2mlのガラスバイアルに、抗インスリンモノクローナル抗体50μg、ウシ血清ア
ルブミン(1%)5mg、および当該の安定剤50mM(または安定剤なし)を入れて総体積
を0.5mlとし、凍結乾燥した。このサンプルに真空中で、栓をした。サンプルを
γ放射線で照射し(総線量45kGy、線量レート1.83kGy/時間、温度4℃)、次いで水
で還元した。

【０１０７】独立の二重サンプルの抗体結合活性を、96ウェルのマイクロタイタープレート
を2.5μg/mlのインスリン抗原で終夜コートする、標準のELISAプロトコルによっ
て決定した。最初5μg/mlの抗インスリンモノクローナル抗体サンプルを連続的
に3倍希釈したものを使用した。ホスファターゼに結合させたヤギ抗マウスIGを
、50ng/mlで使用した。Sigma 104アルカリホスファターゼ基質を、DEA緩衝液の1
mg/ml溶液として使用した。結合活性を、405-620nmでの吸光度によって決定した
。

【０１０８】非照射サンプルについての最大吸光度シグナルの約50%で、非照射サンプルと
比較した照射サンプルの力価測定曲線におけるシフト(すなわち、同じ量の結合
を観察するのに必要な抗体の濃度)を推定することによって、相対的な防護を決
定した。

【０１０９】結果安定剤を含有する凍結乾燥したサンプルは、45kGyγ照射で照射した後、抗体
親和性の50%を維持していた。これは、45kGyのγ放射線が、溶液中で照射された
場合、免疫グロブリンの活性をほぼすべて破壊した以前の結果とは対照的である
。したがって、凍結乾燥によって残留含水量を減少させることによって、それ自
身のタンパク質を保護できることが明らかである。

【０１１０】アスコルビン酸ナトリウムを加えることにより、サンプルの照射後の活性が完
全に回復する。メチオニンおおよびリポ酸は、非照射サンプルと比べて、照射後
の活性のかなりの活性(76-83%)が回復する。これらの結果を図1および2に示す。

【０１１１】実施例14 この実験では、45kGyの低線量γ照射にさらした凍結乾燥した抗インスリンモ
ノクローナル抗体を使用して、ある種の安定剤の防護効果を評価した。試験した
安定剤は、アスコルビン酸ナトリウム、N-アセチルシステイン、グルタチオン、
ならびに混合物尿酸塩/トロロックスおよびアスコルビン酸塩/尿酸塩/トロロッ
クスであった。

【０１１２】方法 3mlのガラスバイアルに、抗インスリンモノクローナル抗体100μg、ウシ血清
アルブミン(1%)10mg、および当該の安定剤(または安定剤なし)を入れて総体積を
1.0mlとし、凍結乾燥した。このサンプルに、真空中で栓をした。サンプルをγ
放射線で照射し(総線量45kGy、線量レート1.83kGy/時間、温度4℃)、次いで水1.
0mlで還元した。

【０１１３】独立の二重サンプルの抗体結合活性を、Maxisorbプレートを2.5μg/mlのイン
スリン抗原で終夜コートする、標準のELISAプロトコルによって決定した。最初5
μg/mlの抗インスリンmAbサンプルを連続的に3倍希釈したものを使用した。ホス
ファターゼに結合させたヤギ抗マウスIGを、50ng/mlで使用した。結合活性を、4
05-620nmでの吸光度によって決定した。

【０１１４】平行線定量(parallel line)分析ソフトウェアパッケージ(Stegmann Systember
atungによるPLA 1.2)を使用して、相対的な防護を決定した。

【０１１５】結果安定剤を含有する凍結乾燥したサンプルは、45kGyのγ照射で照射した後、抗
体親和性の70%を維持していた。これは、45kGyのγ放射線が、溶液中で照射され
た場合、免疫グロブリンの活性をほぼすべて破壊した先の結果とは対照的である
。したがって、凍結乾燥によって残留含水量を減少させることによって、それ自
身のタンパク質を保護できることが明らかである。

【０１１６】アスコルビン酸ナトリウムの存在により、回復が20%増加する、すなわち、照
射後に回復する親和性は90%である。残りの安定剤は、親和性の77-84%の回復を
もたらす。これらの結果を、図3A-3Cに示す。

【０１１７】実施例15 この実験では、モノクローナル抗体の感受性に対する、(製品中に、比較的「
高水分」含量を残す)第一次凍結乾燥、および(比較的「低水分」の製品をもたら
す)第二次凍結乾燥の防護効果を決定した。

【０１１８】方法 3mlのガラスバイアルに、抗インスリンモノクローナル抗体100μg、ウシ血清
アルブミン(1%)10mg、およびアスコルビン酸ナトリウム100mM(または安定剤なし
)を入れて総体積を1.0mlとし、凍結乾燥した。このサンプルに、真空中で栓をし
た。サンプルをγ放射線で照射し(総線量45kGy、線量レート2.03kGyと2.13/時間
の間、温度4℃)、次いで水1.0mlで還元した。

【０１１９】独立の二重サンプルの抗体結合活性を、Maxisorbプレートを2.5μg/mlのイン
スリン抗原で終夜コートする、標準のELISAプロトコルによって決定した。最初5
μg/mlの抗インスリンmAbサンプルを連続的に3倍希釈したものを使用した。ホス
ファターゼに結合させたヤギ抗マウスIGを、50ng/mlで使用した。結合活性を、4
05-620nmでの吸光度によって決定した。

【０１２０】結果安定剤がない場合、第二次「低水分」乾燥サイクルを経たサンプルからの、照
射後の抗インスリンmAbの回復はより高かった。すなわち、安定剤がない場合の
、より低い総水分含量により、回復が増進した。

【０１２１】しかし、安定剤が存在する場合、サンプルが第一次「高水分」乾燥サイクルの
みを経たか、あるいは第二次「低水分」乾燥サイクルも経たかに関係なく、45kG
y照射後の抗体活性は非常によく回復した。

【０１２２】この実験の結果を、図4に示す。

【０１２３】実施例16 この実験では、第VIII因子活性に対する、凍結乾燥および/または添加された
安定剤の防護効果を決定した。試験した安定剤は、アスコルビン酸ナトリウム、
尿酸ナトリウム、トロロックス、アスコルビン酸塩/トロロックス混合物、アス
コルビン酸塩/尿酸塩/トロロックス混合物、尿酸塩/トロロックス混合物、アス
コルビン酸塩/尿酸塩混合物であった。

【０１２４】方法サンプルを凍結乾燥し、真空中で栓をした。サンプルをγ放射線で照射し(総
線量45kGy、線量レート1.9kGy/時間、温度4℃)、次いで水1.0mlで還元した。サ
ンプル中の第VIII因子活性の測定を、MLA Electra I 400C Automatic Coagulati
on Analyzerを使用し、一段階の凝固アッセイで決定した。

【０１２５】結果安定剤がない場合、凍結乾燥したサンプルの、照射後の第VIII因子活性の回復
は良好であった(非照射対照の69-88%)。安定剤の存在下では、照射後の第VIII因
子活性の同様に回復した。(非照射対照の69-89%)。

【０１２６】しかし、安定剤と凍結乾燥を組み合わせると、非照射対照の83-90%の間の第VI
II因子活性の回復がもたらされた(アスコルビン酸ナトリウム+凍結乾燥:90%回復
、トロロックス+凍結乾燥:84%回復、および尿酸ナトリウム+凍結乾燥:83%)。こ
れらの結果を図5に示す。

【０１２７】実施例17 この実験では、25kGyの低線量γ照射にさらした液体または凍結乾燥した抗ト
ロンビンIII(ATIII)を用いて、ある種の安定剤の防護効果を評価した。試験した
安定剤は、アスコルビン酸ナトリウム(200mM)であった。

【０１２８】方法 ATIIIを、単独で、または安定剤としてアスコルビン酸塩の存在下で照射した
。安定剤との混合は、次のどちらかによって行った。(i)ATIIIと安定剤を、液体
として混合し、次いで混合物を凍結乾燥し、真空中で栓をする、あるいは(ii)AT
IIIと安定剤を、両方とも乾燥粉末で(すなわち、それぞれを別々に凍結乾燥した
後)混合する。

【０１２９】照射(総線量25kGy、レート1.8kGy/時間)後、凍結乾燥した粉末状抗トロンビン
III(Sigma A9141,lot 113H9316)+アスコルビン酸塩を、水で40μ/mlの濃度に還
元した。次いで、照射後に、液体のATIIIサンプルと還元した乾燥粉末状ATIIIサ
ンプル(+アスコルビン酸塩)のどちらも水で20/mlに希釈した。トロンビン(1U/ml
)およびヘパリン(800U/ml)の水溶液を調製した。

【０１３０】予備冷却した96ウェルプレートアッセイにおいて、ATIIIサンプルを連続的に2
倍希釈したものを調製した。ヘパリン(800U/ml溶液の25μl)または水を各ウェル
に加え、続いて37℃でインキュベートした。トロンビン(1U/ml溶液の50μl)を加
え、続いて再び37℃でインキュベートした。

【０１３１】続いて、1600μMトロンビン基質の水溶液100μlを加え(基質の最終濃度は800
μM)、続いて周囲温度でインキュベートした。活性は、基質を添加後決められた
時間で、405-620nmの間で吸光度を測定することによって決定した。

【０１３２】結果 25kGyの低レートγ照射で照射したとき、安定剤がない場合は、液体のATIIIは
、トロンビン阻害活性をすべて失う。しかし、アスコルビン酸ナトリウムが存在
すれば、照射後も液体ATIIIの活性の55-66%が保たれる。

【０１３３】 25kGyの低レートγ照射で照射したとき、乾燥粉末状ATIIIは、乾燥粉末状安定
剤の存在下で、活性を43%しか失わない。

【０１３４】この実験の結果を図6に示す。

【０１３５】実施例18 この実験では、凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル抗体の活性に対する
、ある種の安定剤の防護効果を決定した。試験した安定剤は、アスコルビン酸ナ
トリウム、トロロックス/尿酸塩/アスコルビン酸塩混合物、N-アセチルシステイ
ン、およびグルタチオンであった。

【０１３６】方法 1%のヒト血清アルブミン(および場合によっては5%スクロース)を補足した抗イ
ンスリンモノクローナル抗体を凍結乾燥し、真空中で栓をし、照射した(総線量4
5kGy、線量レート1.83と1.88kGy/時間の間)。上述の標準のELISAプロトコルを使
用して、抗体結合活性を決定した。

【０１３７】結果 1%HSAを補足した凍結乾燥した抗インスリンmAbを、線量45kGyで照射すると、
約33%の親和性の平均損失がもたらされた。以下の安定剤を添加すると、著しく
回復が増進した。20mMアスコルビン酸ナトリウム(100%回復)、200μMトロロック
ス/l.5mM尿酸塩/20mMアスコルビン酸塩(87%)回復)、20mM N-アセチルシステイン
(82%回復)、および20mMグルタチオン(76%回復)。

【０１３８】 5%スクロースを、1%HSAを含有する凍結乾燥したmAbに加えると、線量45kGyで
照射した場合、約30%の親和性の平均損失がもたらされた。以下の安定剤を添加
すると、著しく回復が増進した。20mMアスコルビン酸ナトリウム(88%回復)、200
μMトロロックス/1.5mM尿酸塩/20mMアスコルビン酸塩(84%)回復)、20mM N-アセ
チルシステイン(72%回復)、および20mMグルタチオン(69%回復)。

【０１３９】これらの実験の結果を、図7-14に示す。

【０１４０】実施例19 この実験では、サンプルを高線量レート(30kGy/時間)で照射した場合の、凍結
乾燥した抗インスリンモノクローナル抗体の活性に対する安定剤(アスコルビン
酸塩)の防護効果を決定した。

【０１４１】方法抗インスリンモノクローナル抗体を凍結乾燥し、レート30kGy/時間(総線量45k
Gy)で照射した。上述の標準のELISAプロトコルを使用して、抗体結合活性を決定
した。

【０１４２】結果凍結乾燥した抗インスリンmAbを、線量45kGyで照射すると、約32%の親和性の
平均損失がもたらされた。20mMアスコルビン酸ナトリウムにより、非照射サンプ
ルに対する親和性の85%回復がもたらされた。この結果を図15に示す。

【０１４３】実施例20 この実験では、凍結乾燥したトロンビンを、安定剤の存在下で照射した。

【０１４４】方法低線量レートのサンプルは、周囲温度で、総線量45kGyを、線量レート0.326kG
y/時間でγ照射した。高線量レートのサンプルは、周囲温度で、総線量45kGyを
、線量レート30kGy/時間でγ照射した。

【０１４５】照射後、サンプルすべてを50%グリセリン溶液500μｌで還元して100U/mlの濃
度にし、次いで0.5U/mlに希釈した。次いで、トロンビン活性を、SAR-Pro-Arg-P
NA基質を利用した標準のクロモゲン分析(chromogenic assay)によって決定した
。

【０１４６】トロンビンのVmaxおよびKm値は、平均化した一連のデータの各々に対する単一
直角双曲線適合方程式(singular rectangular hyperbolic fit equation)を使用
し、Sigma Plot 2000によって決定した。トロンビン活性はまた、MLA 1400C分析
器で実施される凝固時間アッセイを使用して決定した。

【０１４７】結果周囲温度で30kGy/時間で照射されたトロンビンからの計算されたVmaxは、0.21
6であり、その非照射対照についてのVmax0.287と比較すると、トロンビン活性の
77%の回復が示された。周囲温度で0.326kGy/時間で照射されたトロンビンからの
計算されたVmaxは0.189であり、その非照射対照についてのVmax0.264と比較する
と、トロンビン活性の72%の回復が示されたされた。低線量のサンプルで実施し
た凝固時間アッセイでは、非照射対照と比較して74%の相対効力が得られた。

【０１４８】この実験の結果を、図16に示す。

【０１４９】実施例21 この実験では、マウスIgG₃に特異的なIGMモノクローナル抗体を、安定剤の存
在下、あるいは安定剤なしで、低線量レートで照射した。

【０１５０】方法液体のラット抗マウスIgG₃モノクローナルIGM抗体(10mMアジ化ナトリウムを加
えたPBS緩衝液に入れたもの、抗体の濃度は666ng/μｌ)を、レート1.8kGy/時間
で、総線量10kGyまたは45kGyで照射した。サンプルは、安定剤を含まない、ある
いは20mMクエン酸塩、300μM尿酸塩、および200mMアスコルビン酸塩を含有する
、安定剤の混合物を含んでいた。

【０１５１】抗体活性を、コーティング用抗原としてマウスIgG₃、およびホスファターゼが
結合した抗ラットIGM検出抗体を使用する標準のELISAプロトコルによって分析し
た。

【０１５２】結果安定剤を含まない液体サンプルは、10kGyまたは45kGyのγ照射の後、抗体のす
べての機能活性を失った。しかし、安定剤混合物の存在は、10kGyのγ放射線で
照射した後は、活性の完全な回復、45kGyのγ放射線で照射した後は、活性の88%
の回復がもたらされた。この実験の結果を、図17にグラフで表す。

【０１５３】実施例22 この実験では、アルブミンの凍結乾燥したサンプルおよび液体サンプルをγ照
射線で照射した。

【０１５４】方法サンプルを、総線量10kGyまたは40kGyのγ放射線で照射した。照射後、凍結乾
燥したサンプルを、アッセイ用緩衝液(50mM Tris、pH8.8;50mM NaCl;0.1%PEG 80
00)1.1mlで還元した。

【０１５５】 (凍結乾燥した、および液体の)サンプルを、280ｎmでのUV検出システムを使用
し、サイズ排除カラムクロマトグラフィー(TSKge1 G4000SW×1 30cm×7.8mM;溶
離緩衝液 0.1Mリン酸ナトリウムpH6.5/0.1M硫酸ナトリウム;流速1ml/分)によっ
て、分析した。

【０１５６】結果総線量10kGyのγ放射線で照射したアルブミンの液体または凍結乾燥したサン
プルにおいて、製品の分解は観察されなかった。総線量40kGyのγ放射線で照射
したアルブミンの液体サンプルでは、一部分解する製品が観察されたが、総線量
40kGyのγ放射線で照射したアルブミンの凍結乾燥サンプルでは、こうした分解
は観察されなかった。この実験のクロマトグラフィーの結果を、図18に示す。

【０１５７】実施例23 この実験では、低線量レートの電離放射線に対する、プリオン(伝染性海綿状
脳症作用因子)の感受性を測定した。

【０１５８】方法 10%ホモジェネート(スクレイピー感染症の末期のゴールデンシリアンハムスタ
ーから採取した脳)を含有するリン酸緩衝生理食塩水0.3mlを、ポリプロピレン管
中のアルブミン29.7mlに加えた。サンプルを、総線量30kGyまたは55kGyで照射し
た(対照サンプルは照射しなかった)。

【０１５９】離乳して日の浅いゴールデンシリアンハムスターに、希釈していないサンプル
50μｌを脳内接種した。次いで、動物すべてを、スクレイピー病の徴候について
評価し、よろめき歩行の外観(appearance of wobbling gait)、後ろ足で立てな
くなること(failure to rear)、および末期状態(terminal condition)(この時点
で安楽死させた)について記録した。各動物についての各徴候の接種後の日数を
、計算した。

【０１６０】結果より高い総線量(55kGy)での照射により、3つの症状の指標のどれについても、
非照射対照と比較して、潜伏時間の中央値が13から14日延長したが、これは、病
原体の力価のおよそ2 log₁₀ID₅₀の減少と同等である。より低い総線量(30kGy)で
の照射により、潜伏時間が8から13日の延長したが、これは、病原体の力価のお
よそ1 log₁₀ID₅₀の減少と同等である。これでもなお、非照射対照よりも著しく
長い。

【０１６１】このデータの線形回帰分析では、病原体のレベルの実際の低下が、病原体の力
価の3.5 log₁₀ID₅₀と同じ位高い可能性があることを示す95%信頼区間が得られた
。

【０１６２】実施例24 この実験では、45kGyのγ放射線で照射した後のトロンビン活性に対する、凍
結乾燥および/または安定剤の存在の防護効果評価した。

【０１６３】方法 1%ウシ血清アルブミンを含有するトロンビンのサンプルを、調製し、所望の水
分レベルまで凍結乾燥した。いくつかのサンプルに、アスコルビン酸ナトリウム
を安定剤として添加し、濃度を200mMとした。

【０１６４】次いで、サンプルすべてをγ放射線(総線量45kGy、レート2.03から2.13kGy/時
間、4℃)で照射し、トロンビン活性を測定した。

【０１６５】結果安定剤がない場合、第一次乾燥サイクルのみを経た照射サンプルから、トロン
ビン活性の67%が回復した。安定剤を加えた場合、回復が86%に増進した。この実
験の結果を、図19にグラフで示す。

【０１６６】実施例25 この実験では、45kGyのγ照射(1.8kGy/時間)にさらした液体IVIGポリクローナ
ル抗体を用いて、ある種の安定剤の防護高価を評価した。試験した安定剤は、ア
スコルビン酸ナトリウム、およびアスコルビン酸ナトリウムとN-アセチルシステ
インの混合物であった。

【０１６７】結果安定剤を含まない照射サンプルでは、次のような損失を示した。風疹(rubella
)については1 log、おたふく風邪(mumps)については0.5-0.75 log、およびCMVに
ついては1 logである。安定剤としてアスコルビン酸ナトリウム、またはアスコ
ルビン酸ナトリウムとN-アセチルシステインを含む、照射サンプルは、非照射対
照と比較しても、損失が示されなかった。

【０１６８】この実験の結果を、図20-26に、グラフで示す。

【０１６９】実施例26 この実験は、安定剤(アスコルビン酸ナトリウム、尿酸ナトリウムまたはそれ
らの混合物)の存在下で照射された(液体または凍結乾燥した)ウロキナーゼの回
復に対する、pHの効果を検査するために設計した。

【０１７０】方法ウロキナーゼ(1000U/ml)を、200mMアスコルビン酸ナトリウムと混合した、か
つ/または様々なpHの35mMリン酸緩衝液の存在下で混合した。試験されるサンプ
ルはすべて、総線量45kGyのγ放射線で、レート2kGy/時間で照射した。

【０１７１】結果アスコルビン酸ナトリウムを含む凍結乾燥した照射サンプルは、5.5-7.8の両
端を含むpH範囲の全域で、ウロキナーゼ活性の約88-90%の回復を示した。アスコ
ルビン酸ナトリウムを含む液体照射サンプルは、pH範囲5.5-7.8の全域で、ウロ
キナーゼ活性の約65-70%の回復を示した。この実験の結果を図26にグラフで示す
。

【０１７２】ここで本発明を完全に記述し終えたが、本発明の方法が、本発明またはそのど
んな実施形態の範囲からも逸脱することなく、広く、等価な範囲の条件、調合物
、および他のパラメータを用いて実施できることが、当分野の技術者には理解さ
れるであろう。本明細書に引用した特許および刊行物はすべて、その全体を参照
によって本明細書に完全に組み込む。

【図面の簡単な説明】

【図１】 45kGyの低線量γ照射にさらされた凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル
抗体に対する、ある種の安定剤の防護効果を示すグラフである。

【図２】 45kGyの低線量γ照射にさらされた凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル
抗体に対する、ある種の安定剤の防護効果を示すグラフである。

【図３Ａ】 45kGyの低線量γ照射にさらされた凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル
抗体に対する、ある種の安定剤の防護効果を示すグラフである。

【図３Ｂ】 45kGyの低線量γ照射にさらされた凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル
抗体に対する、ある種の安定剤の防護効果を示すグラフである。

【図３Ｃ】 45kGyの低線量γ照射にさらされた凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル
抗体に対する、ある種の安定剤の防護効果を示すグラフである。

【図４】モノクローナル抗体の感受性に対する、第一次凍結乾燥および第二次凍結乾燥
の防護効果を示すグラフである。

【図５】第VIII因子の活性に対する、凍結乾燥および/または添加された安定剤の防護
効果を示すグラフである。

【図６】 25kGyの低線量γ照射にさらされた液体または凍結乾燥した抗トロンビンIIIに
対する、ある種の安定剤の防護効果を示すグラフである。

【図７】凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル抗体の活性に対する、ある種の安定
剤の防護効果を示すグラフである。

【図８】凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル抗体の活性に対する、ある種の安定
剤の防護効果を示すグラフである。

【図９】凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル抗体の活性に対する、ある種の安定
剤の防護効果を示すグラフである。

【図１０】凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル抗体の活性に対する、ある種の安定
剤の防護効果を示すグラフである。

【図１１】凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル抗体の活性に対する、ある種の安定
剤の防護効果を示すグラフである。

【図１２】凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル抗体の活性に対する、ある種の安定
剤の防護効果を示すグラフである。

【図１３】凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル抗体の活性に対する、ある種の安定
剤の防護効果を示すグラフである。

【図１４】凍結乾燥した抗インスリンモノクローナル抗体の活性に対する、ある種の安定
剤の防護効果を示すグラフである。

【図１５】サンプルを高線量レート(30kGy/時間)で照射した場合の凍結乾燥した抗インス
リンモノクローナル抗体の活性に対する、ある種の安定剤の防護効果を示すグラ
フである。

【図１６】 γ放射線で照射した、凍結乾燥したトロンビンに対する、安定剤の効果を示す
グラフである。

【図１７】 γ放射線で照射した後のIGMの活性に対する安定剤の効果を示すグラフである
。

【図１８】アルブミンに対するγ照射の効果を示すクロマトグラムである。

【図１９】 γ放射線で照射した後のトロンビン活性に対する、凍結乾燥および/または安
定剤の存在の効果を示すグラフである。

【図２０】 45kGyのγ照射(1.8kGy/時間)にさらした液体のIVIGポリクローナル抗体に対す
る、ある種の安定剤の防護効果を示すグラフである。

【図２１】 45kGyのγ照射(1.8kGy/時間)にさらした液体のIVIGポリクローナル抗体に対す
る、ある種の安定剤の防護効果を示すグラフである。

【図２２】 45kGyのγ照射(1.8kGy/時間)にさらした液体のIVIGポリクローナル抗体に対す
る、ある種の安定剤の防護効果を示すグラフである。

【図２３】 45kGyのγ照射(1.8kGy/時間)にさらした液体のIVIGポリクローナル抗体に対す
る、ある種の安定剤の防護効果を示すグラフである。

【図２４】 45kGyのγ照射(1.8kGy/時間)にさらした液体のIVIGポリクローナル抗体に対す
る、ある種の安定剤の防護効果を示すグラフである。

【図２５】 45kGyのγ照射(1.8kGy/時間)にさらした液体のIVIGポリクローナル抗体に対す
る、ある種の安定剤の防護効果を示すグラフである。

【図２６】安定剤の存在下で照射した(液体または凍結乾燥した)ウロキナーゼの回復に対
する、pHの効果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者エドワードエイ．ホートンカナダエム４ヴィー２エイ３オンタリオトロントロートンブールバード 100 Ｆターム(参考） 4C058 AA12 AA17 BB06 DD05 DD07 DD11 DD14 EE26 KK03 KK21 KK50

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】電離放射線に感受性のある生体材料を滅菌する方法であって
、(i)生体材料の残留溶媒量を、前記生体材料を前記電離放射線から防護するの
に有効なレベルに減少させること、および(ii)前記生体材料を、前記生体材料を
滅菌するのに有効な時間、有効なレートの適当な電離放射線で照射することを含
むことを特徴とする方法。
【請求項２】電離放射線に感受性のある生体材料を滅菌する方法であって
、(i)生体材料に、少なくとも1種の安定剤を、前記生体材料を前記電離放射線か
ら防護するのに有効な量加えること、および(ii)前記生体材料を、前記生体材料
を滅菌するのに有効な時間、有効なレートの適切な電離放射線で照射することを
含むことを特徴とする方法。
【請求項３】電離放射線に感受性のある生体材料を滅菌する方法であって
、(i)生体材料に、少なくとも1種の安定剤を、前記生体材料を前記電離放射線か
ら防護するのに有効な量加えること、および(ii)前記生体材料を、前記生体材料
を滅菌するのに有効な時間、低レートの適切な電離放射線で照射することを含む
ことを特徴とする方法。
【請求項４】電離放射線に感受性のある生体材料を滅菌する方法であって
、(i)生体材料の残留溶媒量を、前記生体材料を前記電離放射線から防護するの
に有効なレベルに減少させること、および(ii)前記生体材料を、前記生体材料を
滅菌するのに有効な時間、低レートの適切な電離放射線で照射することを含むこ
とを特徴とする方法。
【請求項５】電離放射線に感受性のある生体材料を滅菌する方法であって
、(i)生体材料の残留溶媒量を、前記生体材料を前記電離放射線から防護するの
に有効なレベルに減少させること、(ii)生体材料に、少なくとも1種の安定剤を
、前記生体材料を前記電離放射線から防護するのに有効な量加えること、および
(iii)前記生体材料を、前記生体材料を滅菌するのに有効な時間、有効なレート
の適切な電離放射線で照射することを含み、ステップ(i)と(ii)を逆の順序で行
ってもよいことを特徴とする方法。
【請求項６】前記生体材料を照射する前記ステップの前に、前記生体材料
の残留溶媒量を減少させるステップをさらに含むことを特徴とする、請求項2ま
たは3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】前記溶媒が水であることを特徴とする、請求項1、4、5また
は6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】前記溶媒が有機溶媒であることを特徴とする、請求項1、4、
5または6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】前記残留含水量を有機溶媒の添加によって減少させることを
特徴とする、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】前記生体材料を有機溶媒に懸濁させ、その後前記残留溶媒
量を減少させることを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】前記生体材料が血液または血液の成分であることを特徴と
する、請求項1から10に記載の方法。
【請求項１２】前記生体材料がタンパク様材料であることを特徴とする、
請求項1から11に記載の方法。
【請求項１３】前記タンパク様材料が血液の成分であることを特徴とする
、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】前記生体材料が凝固因子であることを特徴とする、請求項
1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】前記凝固因子が、トロンビン、第II因子、第V因子、第VII
因子、第VIIa因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第XIIIa因子
、フォンウィルブランド因子、およびフィブリノゲンからなる群から選択される
ことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】前記生体材料が、アルブミン、ウロキナーゼ、多クローン
性免疫グロブリン、単一クローン性免疫グロブリン、および1種または複数の多
クローン性および/または単一クローン性免疫グロブリンの混合物からなる群か
ら選択されることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】前記免疫グロブリンが、免疫グロブリンG、免疫グロブリ
ンM、またはそれらの混合物であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】前記生体材料が、哺乳類組織または哺乳類組織の成分また
は処理を加えた哺乳類組織であることを特徴とする、請求項1から10のいずれか
一項に記載の方法。
【請求項１９】前記生体材料が、骨または骨の成分または処理を加えた骨
であることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】前記生体材料が、鉱物質を除去した骨髄であることを特徴
とする、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】前記生体材料が、組み換えにより生成された生体材料であ
ることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】前記生体材料が、遺伝子組換えした生体材料であることを
特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】前記生体材料が、食品または植物性製品であることを特徴
とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】前記生体材料が、炭水化物または多糖であることを特徴と
する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】前記生体材料が、キチン、キトサン、NOCC-キトサン、お
よびそれらの誘導体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1から1
0のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】前記生体材料が、細胞性代謝物(metabolism)の製品である
ことを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】前記有効なレートが、約3.0kGy/時間未満であることを特
徴とする、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】前記有効なレートが、約2.0kGy/時間未満であることを特
徴とする、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】前記有効なレートが、約1.0kGy/時間未満であることを特
徴とする、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】前記有効なレートが、約0.3kGy/時間未満であることを特
徴とする、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】前記有効なレートが、約3.0kGy/時間より大きいことを特
徴とする、請求項1、2、および5から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】前記有効なレートが、少なくとも約6.0kGy/時間であるこ
とを特徴とする、請求項1、2、および5から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】前記有効なレートが、少なくとも約18.0kGy/時間であるこ
とを特徴とする、請求項1、2、および5から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】前記有効なレートが、少なくとも約30.0kGy/時間であるこ
とを特徴とする、請求項1、2、および5から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】前記生体材料を低圧酸素雰囲気中に保つことを特徴とする
、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】前記生体材料をアルゴン雰囲気中に保つことを特徴とする
、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】前記残留溶媒量を凍結乾燥によって減少させることを特徴
とする、請求項1、および4から36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】前記残留溶媒量が約10.0%未満であることを特徴とする、
請求項1、および4から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】前記残留溶媒量が約5.0%未満であることを特徴とする、請
求項1、および4から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】前記残留溶媒量が約2.0%未満であることを特徴とする、請
求項1、および4から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】前記残留溶媒量が約1.0%未満であることを特徴とする、請
求項1、および4から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】前記残留溶媒量が約0.5%未満であることを特徴とする、請
求項1、および4から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】前記生体材料を照射する前記ステップの前に、前記生体材
料に、少なくとも1種の増感剤を加えることを特徴とする、請求項1から42のいず
れか一項に記載の方法。
【請求項４４】前記生体材料が、生物的混入物として少なくとも1種のプ
リオンを含有することを特徴とする、請求項1から43のいずれか一項に記載の方
法。
【請求項４５】前記生体材料が、生物的混入物として少なくとも1種のウ
イルスを含有することを特徴とする、請求項1から43のいずれか一項に記載の方
法。
【請求項４６】前記生体材料を照射する前記ステップの前に、前記生体材
料に、少なくとも1種の安定剤を加えることを特徴とする、請求項1および4に記
載の方法。
【請求項４７】前記の少なくとも1種の安定剤が酸化防止剤であることを
特徴とする、請求項2、3、および5から46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】前記の少なくとも1種の安定剤がフリーラジカルスカベンジ
ャーであることを特徴とする、請求項2、3、および5から47のいずれか一項に記
載の方法。
【請求項４９】前記の少なくとも1種の安定剤が、活性酸素種による損傷
を減らすことを特徴とする、請求項2、3、および5から47のいずれか一項に記載
の方法。
【請求項５０】前記の少なくとも1種の安定剤が、アスコルビン酸あるい
はその塩またはエステル、グルタチオン、6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチル
クロマン-2-カルボン酸、尿酸あるいはその塩またはエステル、メチオニン、ヒ
スチジン、N-アセチルシステイン、および前記安定剤の2つ以上の混合物からな
る群から選択されることを特徴とする、請求項2、3、および5から47のいずれか
一項に記載の方法。
【請求項５１】前記の、前記安定剤の2つ以上の混合物が、アスコルビン
酸あるいはその塩またはエステルと、尿酸あるいはその塩またはエステルとの混
合物、アスコルビン酸あるいはその塩またはエステルと、6-ヒドロキシ-2,5,7,8
-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸との混合物、アスコルビン酸あるいはその
塩またはエステルと、尿酸あるいはその塩またはエステルと、6-ヒドロキシ-2,5
,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸との混合物、および尿酸あるいはその
塩またはエステルと、6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン
酸との混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項50に記載の方
法。
【請求項５２】前記電離放射線が、粒子放射線または電磁放射線またはそ
れらの混合物であることを特徴とする、請求項1から51のいずれか一項に記載の
方法。
【請求項５３】前記電磁放射線が、電波、可視および不可視光線、紫外線
、X線放射線、およびγ放射線からなる群から選択されることを特徴とする、請
求項52に記載の方法。
【請求項５４】前記電離放射線がγ放射線であることを特徴とする、請求
項1から51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】前記電離放射線が電子ビーム放射線であることを特徴とす
る、請求項1から51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】前記電離放射線が可視光線であることを特徴とする、請求
項1から51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】前記電離放射線が紫外線であることを特徴とする、請求項
1から51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】前記電離放射線がX線放射線であることを特徴とする、請
求項1から51のいずれか一項に記載の方法。