JP2013510581A - フォンウィルブランド因子(vWF)含有調製品並びにこれに関連する方法、キット及び使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本願は、2009年11月13日に出願された米国特許出願第61/261,145号の利益を主張し、当該出願は、本願にその全てが参照により援用される。
vWF含有調製品に関する方法、組成物及びキットが提供され、これらは、因子VIII(FVIII)の調製に関する方法、キット及び上記調製物の使用を含む。また、vWFポリペプチド及びこれをコードする核酸分子も提供する。
哺乳類細胞が発現するFVIIIは、しばしば、細胞表面成分(例えばプロテオグリカン)により、又は受容体が媒介する事象(例えばLRP受容体との相互作用)により、特異的に、又は非特異的に細胞表面に吸着される。また、発現したFVIIIは、培養細胞の培地中で、酵素的に切断及び/又は分解されることもある。培養期間中、発現したFVIII濃度は、分泌された材料が発現後(例えばかん流技術により)迅速に回収されない限り、培地中で減少していく。
一つの態様において、第一のアミノ酸配列は、FVIII結合ドメインを有するvWFポリペプチドの領域と特異的に結合出来るモノクローナル抗vWF抗体と反応する構造又はドメインを規定する。一つの態様において、前記モノクローナル抗体は、例えばFoster et al., JBC, 262:8443 (1987)及びFulcher et al., J. Clin. Invest., 76:117 (1985)に記載のモノクローナル抗体C3である。これらの文献はモノクローナル抗体C3、及びモノクローナル抗体、特にモノクローナル抗体C3の調製の教示のために、本明細書中に参照により援用される。
他の態様において、前記ポリペプチドの第二のアミノ酸配列は、結合パートナーに対する親和性を有する構造又はドメインを提供する。
他の側面において、本発明は、前記第一及び第二のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現する組換え発現ベクター及び当該発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。任意の適切な発現系が採用されてもよい。前記ベクターは、前記第一及び第二のアミノ酸配列をそれぞれコードする第一及び第二のDNA配列を有し、それらが、哺乳類、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子等に由来する適切な転写又は翻訳制御配列と操作可能に連結する。制御配列の例として、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、及び転写並びに翻訳の開始及び終結をコントロールする適切な配列が挙げられる。コードしているDNA配列とヌクレオチド配列が機能的に関連するとき、ヌクレオチド配列は、操作可能に連結している。故に、プロモーターヌクレオチド配列は、そのプロモーターヌクレオチド配列がコードされたDNA配列の転写をコントロールするとき、操作可能に連結しているといえる。所望の宿主細胞中で複製する能力は、通常複製起点によりもたらされ、そして形質転換体を同定するための選択遺伝子は、発現ベクター内に追加的に含まれ得る。
他の態様において、本発明は、ポリペプチド及びFVIIIを含有するタンパク質複合体を提供し、ここで、当該ポリペプチドは、vWFポリペプチド中に存在する第一のアミノ酸配列及び当該第一の配列と異種の第二のアミノ酸配列を有し、ここで当該ポリペプチドは、FVIIIと結合できる。一つの態様において、当該複合体は、ダイマー形態の別個のポリペプチド鎖を有し、FVIIIと複合体を形成する。
なおも更なる側面において、本発明は、本発明のタンパク質複合体を調製する方法を提供する。幾つかの態様において、前記第二のアミノ酸配列により規定される構造又はドメインの結合パートナーを含有するアフィニティーカラムが、前記複合体をアフィニティー精製するために採用される。例えば、前記第二のアミノ酸配列がFcポリペプチド抗体に対応する場合、タンパク質A又はGを含有するアフィニティーカラムが、前記複合体のアフィニティー精製に使用できる。幾つかの態様において、前記結合パートナーは、不動化されている。あるいは、前記アフィニティーカラムは、前記ポリペプチドのFc部分に結合する、又は前記ポリペプチドの第一のアミノ酸配列により規定される構造又はドメインに結合する抗体を含有し得る。幾つかの態様において、調製される抗体は、ジスルフィド結合により連結した可溶性融合タンパク質を2つ含むダイマーを有し、ここで、各タンパク質は、FcポリペプチドのN末端と融合した第一のアミノ酸配列を有し、ここで、当該第一のアミノ酸配列はvWFポリペプチド中に存在し、ここで、当該ダイマーは、FVIIIと結合できる。
哺乳類細胞による組換えFVIIIの発現を促進するための組成物(例えば短縮組換えvWF融合タンパク質)及び方法を提供し、これらは、FVIIIの除去及び/又は分解を防ぎ、あるいは、本発明の組換えvWFポリペプチド内に含まれる融合タンパク質ハンドル(例えば前記第二のアミノ酸配列)の使用により、得られるFVIII:vWF複合体の迅速なクロマトグラフィー精製を可能とする。
他の側面において、本発明は、FVIIIの血漿半減期を延長させる方法及び組成物を提供する。例えば、幾つかの態様において、本発明の組換えvWF融合ポリペプチドは、FVIII及び/又は組み合わせられた複合体の半減期の延長を促進し得る、組換え又は血漿由来のFVIIIへの添加物として採用され得る。本発明に従い、幾つかの態様において、前記Fc領域は、FVIIIとの結合が提供され、当該Fc領域が更に複合体に追加の半減期を提供するように、vWFの短縮した断片と融合する。例えば、一つの態様において、前記組換えFVIII:組換えvFW-Fc融合複合体は、発現した培養培地から直接精製されてもよく、その後、例えば過剰の組換えvWV-Fc融合体(即ち本発明のポリペプチド)と共に、又は非存在下で、医薬製剤として患者に注射(例えば静脈内)され得る。幾つかの態様において、過剰のvWF-Fc融合体と一緒(例えばモルベースで2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10倍)の前記複合体の添加は、血漿内での融合ポリペプチド濃度の増大に寄与し、また当該複合体が血漿中で解離した場合に、FVIIIとvWF-Fc融合タンパク質の再結合を提供する。
なおも更なる側面において、本発明のポリペプチド、核酸配列、タンパク質複合体及び/又は組成物を含有するキットが提供される。当該キットは、単一の容器を有していてもよく、又はそれぞれの所望の構成品について別個の容器を有していてもよい。前記組換えポリペプチド及び/又はそれに由来するタンパク質複合体を調製するのに必要な試薬を有するキットも想定され、例えば、試薬として、限定されないが、発現ベクター、当該発現ベクターを有する組換え宿主細胞、及び精製試薬が挙げられる。更に、当該キットの構成品が1つ以上の液体溶液である場合、当該液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液であるのが特に好ましい。しかしながら、当該キットの構成品は、乾燥した粉末として提供されてもよい。試薬又は構成品が乾燥した粉末として提供される場合、当該粉末は、適切な溶媒を添加することにより再構成される。当該キットにおいてかかる溶媒が提供されることも想定される。
短縮vWF-Fc融合ポリペプチドの発現プラスミドの構築
短縮vWF-Fc融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそれぞれ有するDNA分子が、商業的に合成された。当該DNA分子のヌクレオチド配列及び対応するコードされるアミノ酸配列を同定する配列を表1に示す。
PER.C6哺乳類細胞への発現ベクターのエレクトロポレーション
PER.C6細胞及びB−ドメイン欠失FVIII(BDD−FVIII)を発現するPER.C6細胞であるクローン株078(BDD−078細胞)をそれぞれ、PER−MAb培地(Hyclone, Logan, UT)中でルーチンで継代して、連続的な培養により維持した。エレクトロポレーションの48時間前、細胞を1 x 106 cells/mlで新鮮なPER−MAb培地に播種してリフレッシュした。エレクトロポレーションの当日、を100マイクロリットルのAmaxa Nucleofector(登録商標)Kit V Solution (Lonza Walkersville Inc., Walkersville, MD)に再懸濁した。
アッセイ
FVIII:
市販のBDD−FVIIIBDD-FVIII (a/k/a Xyntha(登録商標); Antihemophilic Factor (Recombinant)) (Wyeth (現在Pfizer Inc., New York, NYの系列会社)のタンパク質を、酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用した、ロバスト線形アッセイ(robust linear assay)の開発の標準として使用した。マイクロプレートウェルに結合した捕捉抗体は、ヒトFVIIIのA2ドメインを指向するクローンGMA-012 (R8B12) (Green Mountain Antibodies, Inc., Burlington, VT)であり;そして検出抗体は、ヒトFVIIIを認識する、市販のビオチン化羊ポリクローナル抗体SAF8C-APBIO, (Affinity Biologicals, Ontario, Canada)であった。抗体の添加の間の洗浄は、pH7.5のTris緩衝生理食塩水(TBS)の存在下で行われた。405nmでの発色は、pNpp基質のストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ媒介切断によって検出された。あるいは、FVIII単位の活性の発色は、製造者の説明に従い、内部血漿キャリブレーター対照を使用するBeckman ACL Coagulation Analyzerにより、又はBDD−FVIII標準を使用するChromogenix Coatest SP4 FVIII kit (Diapharma Group, Columbus, OH)により実施された。
研究グレードの血漿由来vWF(Haemtech, Essex Junction, VT)を、タンパク質量のELISA測定用の抗原標準として使用された。使用された捕捉抗体は、ヒトvWFタンパク質に対する市販のマウスモノクローナル抗体であり;そして検出用抗体として、ヤギ抗ヒトvWF抗体が使用された。450nmにおける発色は、酵素基質のテトラメチルベンジジンとインキュベーションすることにより検出される。
短縮vWF-Fcポリペプチドの特定
PER.C6細胞中で発現した前記短縮vWF-Fcタンパク質(即ちD’-D3-Fc, Pro-D’-D3-Fc, D’-A1-Fc, Pro-D’-A1-Fc, D’-A3-Fc, Pro-D’-A3-Fc;表1)に対応する組換えポリペプチドは、0.2〜1mlの細胞上澄を20μlのタンパク質Gビーズとインキュベーションすることにより免疫沈降された。遠心によりビーズを回収し、そしてTris緩衝液によりこれらを洗浄した。遠心分離したビーズを25マイクロリットルのLaemmli緩衝液中に懸濁し、これを95℃で10分間加熱し、続いて4〜12%濃度勾配Bis-Tris PAGEゲルにロードした。バンドの可視化は、クーマシーブリリアントブルー染色/脱染により行われた。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分離した組換えポリペプチドをPVDF膜上にブロッティングし;高速Ponceau S染色によりタンパク質バンドを可視化し、そして当該膜からの脱染をエドマン分解用調製物(AIBioTech, Richmond VA)中で実施して、N末端配列情報を取得した。取得されたアミノ末端配列は、vWFの成熟N末端またはプロセシングが不完全な代表的なvWF産物に存在すると考えられるN末端プロペプチド配列の公知の配列と比較した。
D’-D3-Fc, Pro-D’-D3-Fc, D’-A1-Fc, Pro-D’-A1-Fc, D’-A3-Fc, 及びPro-D’-A3-Fcタンパク質を発現する細胞を選択及び育苗した後、細胞上澄の試料を清澄し、活発に増殖するBDD-078細胞(B-ドメイン欠失FVIIIを発現する哺乳類細胞クローン)に添加した。BDD-078細胞は、12.5 x 106 cells/mlで播種され、短縮vWF−Fc融合タンパク質(即ちD’-D3-Fc, Pro-D’-D3-Fc, D’-A1-Fc, Pro-D’-A1-Fc, D’-A3-Fc, Pro-D’-A3-Fc)を発現させるプラスミドコンストラクトをトランスフェクションしたPER.C6細胞上澄で培養した。「BDD Ctrl」において、調整培地が置換された。細胞は、記載されているように、37℃で2日間培養した。その時点で、一部を回収し、遠心し、上澄を、FVIII活性並びにFVIII及びvWF抗原の両方について試験した。図8に、FVIII活性を示す。棒グラフは、vWF-Fcタンパク質を加えなかった対照BDD-FVIIIを基準にした増大を示す。
血漿由来vWF(pd-vWF)及び組換えポリペプチドの高分子量複合体を形成する能力を、非還元1.6又は2%高融点(HGT-P)アガロースゲルでの電気泳動により評価した(Raines et al., Thrombosis Res., 60:201-212 (1990)の変法)。血漿由来FVIII(KOATE-DVI(登録商標)が、vWF-Fcマルチマーの評価の電気泳動標準として使用された。タンパク質は、iBlot装置(Invitrogen Corp., Rockville, MD)を用いた半湿式ブロッティング法によりニトロセルロース膜に転写され、SuperBlock Solution (Pierce, Rockford, IL)でブロッキングした。試料は、ウサギ抗ヒトvWFポリクローナル抗体(Abcam cat# ab6994)、その後、アルカリホスファターゼをコンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgG F(ab′)2断片(cat# A3937; Sigma)とインキュベーションされ、そして、バンドは、Western Blue solution (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)とインキュベーションすることにより検出された。反応を終結させるために、蒸留水でリンスをし、そしてバンドをBioRad Molecular Imager ChemiDoc XRS+ Imaging System (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA)で可視化した。その結果を、図9に示す。
BDD-FVIII及びpro-D’-A3-Fcタンパク質を発現する細胞培養系の清澄した上澄を、三重の遠心分離、並びに2500xgを7分間、続いて2500xgで11分間分離することにより調製した。そして、上澄をSartobran 150デプスフィルター(0.45マイクロメートル)、続いて0.2マイクロメートルの酢酸セルロースフィルター(#5231307-H4-00) (Sartorius Stedim Stedim Biotech S.A., Aubagne, France)で濾過された。当該フィルターは、ポンプを用いてに100〜200 mlの20 mM Tris, pH 7.0より湿らせておき、そして細胞上澄をアプライし、最後に約25 mlの20 mM Tris, pH 7.0を加えた。最後の濾液は、2倍に希釈された細胞上澄であり、カラムクロマトグラフィーに使用された材料であった。濾過された上澄は、AKTA Explorer Chromatography System (GE Healthcare, Piscataway, NJ)にセットした5又は10ミリリットルのProtein A-HiTrapカラム(part 17-1403-01) (GE Healthcare, Piscataway, NJ)にアプライされた。システムのチューブは20mM Tris, pH 7.0で予め濯がれて、試料のカラムへのアプライの前のベースラインを安定させた。濾過された試料はカラムを5ミリリットル/分で移動させられ、そして溶出物は、「フロースルー」として回収された。全ての材料がロードされた後、当該Protein A-HiTrapカラムは、カラムの5倍の体積の20mM Tris, pH 7.0でベースラインが安定するまで洗浄された。この時点で、当該カラムは、0.1 M CaCl2を含有する、カラムの4倍の体積の20mM Tris, pH 7.0で洗浄され、そして溶出した材料を回収した。前記短縮したvWF-Fc融合体に結合した因子FVIIIは、当該フラクションが溶出するまで(カラム体積の約3倍)、0.3 M CaCl2を含有する20mM Tris, pH 7.0で溶出させられた。当該カラムは更にカラム体積分の20mM Tris, pH 7.0で5回洗浄された。タンパク質Aへの結合を維持している短縮vWF-Fcタンパク質は、250mM Glycine, 150mM NaCl, pH 3.9を添加することにより、カラムから剥離させられた。他の溶出方法は、例えばArakawa et al., Prot. Expr. Purif., 63:158-163 (2009)に記載されている。Protein A-HiTrapカラムから回収された全ての試料は保存され、発色及び/又は凝固アッセイ(上記)を使用して因子VIII活性が試験され、そして一部はSDS-PAGE電気泳動用に調製された。幾つかの場合、例えばFVIIIピーク活性が検出された場合、当該タンパク質は、25mlの所望のFVIII保存緩衝液で予め洗浄されたPD10カラム(GE Healthcare 45000148)にロードした。2及び1.5ミリリットルの溶出したBDD-FVIIIは、各カラムにアプライされ、そして脱塩されたBDD-FVIIIは、3.5mlのFVIII保存緩衝液で溶出させられた。そして、タンパク質は長期保存用に-80℃で保存され、そして、場合によっては、10mg/mlの血清アルブミンが添加された。
前記短縮vWF-FcポリペプチドがFVIIIに結合するか否かを判定するために、BDD-FVIII及びpro-D’-A3-Fcを共発現する細胞を、125μg/mlのネオマイシン及びゼオシンを添加したPER-MAb培地中で5日間培養した。実質的に上記のように、上澄の調製及びクロマトグラフィーを行った。溶出の過程での様々な時点で、試料を保存し、電気泳動した(図10)。図10Aにおいて、5 mlのHiTrap Protein Aカラムに10 mlのBDD-FVIII/proD’A3-Fc PER.C6細胞上澄をアプライした後、様々な緩衝液の条件で溶出したクロマトグラフィートレースのピークを示す(工程5は洗浄工程、工程6は0.1 M CaCl2による溶出物、工程7は0.3M CaCl2洗浄後のFVIII溶出物、工程8は1 M CaCl2洗浄後の溶出物、工程9は低塩濃度での洗浄、そして工程10は、pH5.5のクエン酸でカラムをストリッピングした後の溶出物)。図10Bは、当該溶出試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。レーン1〜9は、それぞれ(1)出発材料、(2)フロースルー、(3) 0.1M CaCl2溶出物、(4) 0.3M CaCl2溶出物、(5) pH 5.5クエン酸溶出物、(6)濃縮されたBDD-FVIII調製物、(7)分子量マーカー(右側に分子量表示)、(8) pro-D’-A3-Fcを発現するPER.C6細胞の上澄、(9)市販BDD-FVIII (Xyntha(登録商標))を表す。アスタリスクは、170、90及び80kdの3つのバンドを示し、これらはそれぞれ全長BDD-FVIII、重鎖及び軽鎖を表す。
強制発現したpro-D’-D3-Fcタンパク質を含有するPER.C6細胞上澄の溶液10mlを(図11、レーン2)、250単位の市販のBDD-FVIII (Xyntha(登録商標)、レーン3)に添加し、そして37℃で4時間インキュベーションした(レーン4及び5)。当該混合物を20 mM Tris-HCl, pH 7.0で2倍に希釈し、そして1 ml Protein A-HiTrapカラムにアプライした。本質的には、上記図10に記載したpro-D'-A3-Fc複合体からのFVIIIの精製と同様に行われた。未結合のタンパク質は、20 mM Tris-HCl, pH 7.0でカラムから洗い流された(レーン6)。図11のレーン6にはFVIII及び/又はvWF-Fcポリペプチドのバンドが認められない(レーン7と比較)ことから、pro-D’-D3タンパク質と複合体を形成したFVIIIの明らかな保持が認められる。その後、0.3 M CaCl2によりFVIIIは劇的に溶出した(レーン7)。これは、FVIII/pro-D’-A3-Fc複合体から溶出したFVIIIと大いに比較される(図10B、レーン4)。短縮vWF-Fcに想到する保持されたポリペプチドは、低pH緩衝液の0.1 Mグリシン、0.15 M NaCl, pH 3.9を用いて溶出される(図11、レーン8)。レーン3の3つのアスタリスクは、170、90及び80kdの3つのバンドを示し、これらはそれぞれ全長BDD-FVIII、重鎖及び軽鎖を表す。pro-D’D3-Fc/FVIII精製の結果から、pro-D’D3-FcへのFVIIIの添加は、FVIIIの捕捉、保持及びその後の特異的な溶出を実証し、この結果は、図10で示されたのと概ね同一である。
FVIIIに結合した、又は裸の精製組換えvWF-Fc融合タンパク質を、アルブミン等の安定化剤を含有するリン酸緩衝液中に添加し、これを約5マイクログラム/マウスの濃度で、マウスの尾部静脈に静脈内注射した。対照として、vWFを有する/有しないFVIIIも同様に注射し、動物内での排出を評価した。5〜8頭の動物(野生型又はFVIII若しくはvWFのいずれか、又はそれら両方の遺伝的欠損による出血疾患を有するマウス系統)を、血液損失の試験に使用した。注射後の様々な時点で(例えば0分、3分、15分、30分、1時間、2時間、4時間、8時間、16時間、24時間)動物をサクリファイスし、下大静脈を通じて抜き取り、そして血漿が調製及び凍結させられた。そして、動物の遺伝的背景に依存して、血漿試料の抗原及び/又は機能的活性を、それぞれELISA及び/又は発色若しくは凝固アッセイにより評価した。血漿からの排出は、抗原及び/又は活性と時間との間の薬物動態的解析により(例えばMordenti et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 137:75-78 (1996)及びLenting et al., J. Biol. Chem., 279:12102-12109 (2004)に記載されるように行われ、これらの文献は、薬物動態解析の教示のため、本明細書中に参照により援用される)、及び対照との比較により決定される。
Claims (25)
- vWFポリペプチド中に存在する第一のアミノ酸配列及び当該第一のアミノ酸配列と異種(heterologous)の第二のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、当該ポリペプチドがFVIIIと結合出来、但し当該ポリペプチドがvWFのA1、A2、A3、D4、B1、B2、B3、C1、C2、CK、又はそれらの組合せを欠く、前記ポリペプチド。
- 前記第一のアミノ酸配列が、配列番号1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:33、配列番号:34、又は配列番号35のいずれかに記載されたものである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号:22、配列番号:36、配列番号:38、又は配列番号:39に記載された配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- ダイマーを形成出来る、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記第二のアミノ酸配列が、イムノグロブリンFcに対応する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記第二のアミノ酸配列が、配列番号:16に記載された配列を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドを含有する組成物。
- 請求項1に記載のポリペプチド及びFVIIIを含有する、タンパク質複合体。
- 請求項8に記載のタンパク質複合体を含有する組成物。
- 請求項1に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
- 配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:37、配列番号:42、又は配列番号:43に記載されたものである、請求項10に記載のヌクレオチド配列。
- 請求項10に記載のヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- 請求項1に記載のポリペプチドを発現する細胞。
- 請求項8に記載のタンパク質複合体を発現する細胞。
- 前記ポリペプチドとFVIIIとを接触させる工程を含む、請求項8に記載のタンパク質複合体を調製する方法。
- 前記接触工程が、FVIIIを発現する細胞中で前記ポリペプチドを組換え発現させる工程を含む、請求項15に記載の方法。
- FVIIIを調製する方法であり:請求項1に記載のポリペプチドをFVIIIと接触させて、当該ポリペプチド及びFVIIIを含有するタンパク質複合体を形成する工程を含む、前記方法。
- 更に、第二のアミノ酸配列により定義されるドメインに親和性を有する結合パートナーを含有する樹脂に前記複合体を選択的に接着させる工程を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記第二のアミノ酸配列が、イムノグロブリンFcに対応する、請求項18に記載の方法。
- 前記結合パートナーがタンパク質A又はタンパク質Gである、請求項19に記載の方法。
- 対象に請求項8に記載のタンパク質複合体を含有する組成物を投与する工程を含む、FVIIIの血漿薬物動態性能を改善する方法。
- 前記性能が血漿半減期の延長である、請求項21に記載の方法。
- 請求項8に記載のタンパク質複合体及び医薬として許容される担体を含有する組成物。
- 血液の症状を処置する方法であり、請求項23に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、前記方法。
- 前記症状が血友病である、請求項24に記載の方法。
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