JP7104194B2 - 第viii因子キメラタンパク質及びその使用 - Google Patents
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頻繁な投与と投与スケジュールが原因で生じる不都合さとに起因して、あまり頻繁ではない投与で済むFVIII製剤、すなわち、半減期の限界の1.5~2倍より長い半減期を有するFVIII製剤を開発するニーズが依然として存在する。
(a)FVIII-F1:F2-L2-X-L1-V;
(b)FVIII-F1:V-L1-X-L2-F2;
(c)F1-FVIII:F2-L2-X-L1-V;
(d)F1-FVIII:V-L1-X-L2-F2;
(e)FVIII-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(f)FVIII-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(g)FVIII(X2)-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(h)FVIII(X2)-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(i)F1-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(j)F1-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(k)V-L1-X-L2-F2-L3-FVIII-L4-F1;
(l)V-L1-X-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII;
(m)F1-L4-FVIII-L3-F2-L2-X-L1-V;
(n)FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(o)FVIII-L4-F1-L3-V-L1-X-L2-F2;
(p)FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(q)F2-L2-X-L1-V-L3-F1-L4-FVIII;
(r)F2-L2-X-L1-V-L3-FVIII-L4-F1;
(s)V-L1-X1-L2-F2-L3-FVIII(X2)-L4-F1;
(t)V-L1-X1-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII(X2);
(u)F1-L4-FVIII(X2)-L3-F2-L2-X1-L1-V;
(v)F-L4-FVIII(X2)-L3-V-L1-X1-L2-F2;
(w)FVIII(X2)-L4-F1-L3-V-L1-X1-L2-F2;
(x)FVIII(X2)-L4-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V;
(y)F2-L2-X1-L1-V-L3-F1-L4-FVIII(X2);
(z)F2-L2-X1-L1-V-L3-FVIII(X2)-L4-F1;
(aa)V-L1-X2-L2-F2-L3-FVIII-L4-X2-L5-F1;
(bb)V-L1-X2-L2-F2-L3-F1-L5-X2-L4-FVIII;
(cc)F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-F2-L2-X2-L1-V;
(dd)F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-V-L1-X2-L2-F2;
(ee)FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-V-L1-X1-L2-F1;
(ff)FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-F1-L2-X1-L1-V;
(gg)F1-L2-X1-L1-V-L3-F2-L4-X2-L5-FVIII;又は
(hh)F1-L2-X1-L1-V-L3-FVIII-L5-X2-L4-F2;
式中、VはD’ドメイン及びD3ドメインを含むVWFタンパク質であり、XまたはX1は288未満のアミノ酸を含有する第1のXTEN配列であり、X2は第2のXTEN配列であり、FVIIIはFVIIIタンパク質を含み、FVIII(X2)はFVIIIタンパク質内の1以上の挿入部位に挿入された第2のXTEN配列を有するFVIIIタンパク質を含み、F1は第1のIg定常領域またはその一部であり、F2は第2のIg定常領域またはその一部であり、L1、L2、L3、L4またはL5は任意のリンカーであり、(-)はペプチド結合であり、(:)は共有結合または非共有結合である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
キメラタンパク質であって、(i)第1の免疫グロブリン(「Ig」)定常領域またはその一部に融合された第VIII因子(「FVIII」)タンパク質を含む第1のポリペプチドと、(ii)中間のXTEN配列によって第2のIg定常領域またはその一部に融合されたフォンウィルブランド因子(「VWF」)のD’ドメインとD3ドメインを含むVWFタンパク質を含む第2のポリペプチドとを含み、その際前記XTEN配列が288未満のアミノ酸残基を含有し、第1のポリペプチドが第2のポリペプチドに連結されるまたは会合される、前記キメラタンパク質。
(項目2)
第2のポリペプチドにおけるXTEN配列が12アミノ酸~287アミノ酸の間の長さを有するアミノ酸配列から成る項目1に記載のキメラタンパク質。
(項目3)
融合タンパク質の第2のポリペプチドが少なくとも288のアミノ酸を含有するXTEN配列を含む第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとを含む相当する前記融合タンパク質と比べて、キメラタンパク質が長い半減期を示す項目1または2に記載のキメラタンパク質。
(項目4)
少なくとも288のアミノ酸を含有するXTEN配列がAE288である項目3に記載のキメラタンパク質。
(項目5)
AE288が配列番号8である項目4に記載のキメラタンパク質。
(項目6)
第2のポリペプチドのXTEN配列が約36、約42、約72、または約144のアミノ酸を含有する項目1~5のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目7)
第2のポリペプチドのXTEN配列が、AE42、AE72、AE144、AG42、AG72、またはAG144から選択される項目6に記載のキメラタンパク質。
(項目8)
第2のポリペプチドのXTEN配列が、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号14;配列番号60;配列番号61;配列番号62;配列番号63から選択される項目7に記載のキメラタンパク質。
(項目9)
第1のポリペプチドがさらに、FVIIIタンパク質を第1のIg定常領域またはその一部と連結する第2のXTEN配列を含む項目1~8のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目10)
第1のポリペプチドがFVIIIタンパク質内での1以上の挿入部位で挿入される第3のXTEN配列を含む項目9に記載のキメラタンパク質。
(項目11)
第1のポリペプチドがさらに、FVIIIタンパク質内での1以上の挿入部位で挿入される第2のXTEN配列を含む項目1~8のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目12)
第1のポリペプチドがFVIIIタンパク質を第1のIg定常領域またはその一部と連結する第3のXTEN配列を含む項目11に記載のキメラタンパク質。
(項目13)
第2のXTEN配列、第3のXTEN配列、または第2と第3のXTEN配列がそれぞれ独立してAE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、及びAG144から選択される項目9~12のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目14)
第2のXTEN配列、第3のXTEN配列、または第2と第3のXTEN配列がそれぞれ独立して配列番号8;配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号17;配列番号54;配列番号19;配列番号16;配列番号18;配列番号15;配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号14;配列番号60;配列番号61;配列番号62;または配列番号63から選択される項目13に記載のキメラタンパク質。
(項目15)
第2のXTEN配列、第3のXTEN配列、または第2と第3のXTEN配列双方がそれぞれ独立してAE288またはAG288である項目13または14に記載のキメラタンパク質。
(項目16)
第2のポリペプチドにおけるXTEN配列が、リンカーによって第2のIg定常領域またはその一部に融合される項目1~15のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目17)
リンカーが切断可能なリンカーである項目16に記載のキメラタンパク質。
(項目18)
リンカーが、第XIa因子、第XIIa因子、カリクレイン、第VIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、第IIa因子(トロンビン)、エラスターゼ-2、グランザイム-B、TEV、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ3C、ソルターゼA、MMP-12、MMP-13、MMP-17、及びMMP-20から選択されるプロテアーゼによって切断可能である項目17に記載のキメラタンパク質。
(項目19)
リンカーが第IIa因子(トロンビン)によって切断可能である項目18に記載のキメラタンパク質。
(項目20)
リンカーが、RRRR(配列番号102)、RKRRKR(配列番号103)、RRRRS(配列番号104)、TQSFNDFTR(配列番号2)、SVSQTSKLTR(配列番号3)、DFLAEGGGVR(配列番号4)、TTKIKPR(配列番号5)、LVPRG(配列番号6)、ALRPR(配列番号7)、KLTRAET(配列番号121)、DFTRVVG(配列番号122)、TMTRIVGG(配列番号123)、SPFRSTGG(配列番号124)、LQVRIVGG(配列番号125)、PLGRIVGG(配列番号126)、IEGRTVGG(配列番号127)、LTPRSLLV(配列番号128)、LGPVSGVP(配列番号129)、VAGDSLEE(配列番号130)、GPAGLGGA(配列番号131)、GPAGLRGA(配列番号132)、APLGLRLR(配列番号133)、PALPLVAQ(配列番号134)、ENLYFQG(配列番号135)、DDDKIVGG(配列番号:136)、LEVLFQGP(配列番号:137)、及びLPKTGSES(配列番号138)から選択されるアミノ酸配列を含む1以上の切断部位を含む項目17に記載のキメラタンパク質。
(項目21)
リンカーがTLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(配列番号146)を含む項目17に記載のキメラタンパク質。
(項目22)
切断部位がLVPRG(配列番号6)のアミノ酸配列を含む項目20に記載のキメラタンパク質。
(項目23)
第1のIg定常領域またはその一部が第1のFc領域を含み、及び/または第2のIg定常領域またはその一部が第2のFc領域を含む項目1~22のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目24)
第1のIg定常領域またはその一部及び第2のIg定常領域またはその一部がキメラタンパク質の半減期を延長する項目23に記載のキメラタンパク質。
(項目25)
第1のポリペプチドと第2のポリペプチドがリンカーによって融合される項目1~24のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目26)
第1のポリペプチドと第2のポリペプチドが処理可能なリンカーによって融合される項目25に記載のキメラタンパク質。
(項目27)
第1のIg定常領域またはその一部が第2のIg定常領域またはその一部に会合される項目1~24のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目28)
第1のIg定常領域またはその一部が共有結合によって第2のIg定常領域またはその一部に会合される項目27に記載のキメラタンパク質。
(項目29)
共有結合がジスルフィド結合である項目28に記載のキメラタンパク質。
(項目30)
キメラタンパク質であって、以下の式(a)~(hh):
(a)FVIII-F1:F2-L2-X-L1-V;
(b)FVIII-F1:V-L1-X-L2-F2;
(c)F1-FVIII:F2-L2-X-L1-V;
(d)F1-FVIII:V-L1-X-L2-F2;
(e)FVIII-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(f)FVIII-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(g)FVIII(X2)-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(h)FVIII(X2)-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(i)F1-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(j)F1-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(k)V-L1-X-L2-F2-L3-FVIII-L4-F1;
(l)V-L1-X-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII;
(m)F1-L4-FVIII-L3-F2-L2-X-L1-V;
(n)FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(o)FVIII-L4-F1-L3-V-L1-X-L2-F2;
(p)FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(q)F2-L2-X-L1-V-L3-F1-L4-FVIII;
(r)F2-L2-X-L1-V-L3-FVIII-L4-F1;
(s)V-L1-X1-L2-F2-L3-FVIII(X2)-L4-F1;
(t)V-L1-X1-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII(X2);
(u)F1-L4-FVIII(X2)-L3-F2-L2-X1-L1-V;
(v)F-L4-FVIII(X2)-L3-V-L1-X1-L2-F2;
(w)FVIII(X2)-L4-F1-L3-V-L1-X1-L2-F2;
(x)FVIII(X2)-L4-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V;
(y)F2-L2-X1-L1-V-L3-F1-L4-FVIII(X2);
(z)F2-L2-X1-L1-V-L3-FVIII(X2)-L4-F1;
(aa)V-L1-X2-L2-F2-L3-FVIII-L4-X2-L5-F1;
(bb)V-L1-X2-L2-F2-L3-F1-L5-X2-L4-FVIII;
(cc)F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-F2-L2-X2-L1-V;
(dd)F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-V-L1-X2-L2-F2;
(ee)FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-V-L1-X1-L2-F1;
(ff)FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-F1-L2-X1-L1-V;
(gg)F1-L2-X1-L1-V-L3-F2-L4-X2-L5-FVIII;又は
(hh)F1-L2-X1-L1-V-L3-FVIII-L5-X2-L4-F2;
のそれぞれを含み、式中、VはD’ドメイン及びD3ドメインを含むVWFタンパク質であり、XまたはX1は288未満のアミノ酸を含有する第1のXTEN配列であり、X2は第2のXTEN配列であり、FVIIIはFVIIIタンパク質を含み、FVIII(X2)はFVIIIタンパク質内の1以上の挿入部位に挿入された第2のXTEN配列を有するFVIIIタンパク質を含み、F1は第1のIg定常領域またはその一部であり、F2は第2のIg定常領域またはその一部であり、L1、L2、L3、L4またはL5は任意のリンカーであり、(-)はペプチド結合であり、(:)は共有結合または非共有結合である、前記キメラタンパク質。
(項目31)
XまたはX1が12アミノ酸~287アミノ酸の間の長さのアミノ酸配列から成る項目30に記載のキメラタンパク質。
(項目32)
XまたはX1がAE288であることを除いて式を含む相当するキメラタンパク質に比べて長い半減期を示す項目30または31に記載のキメラタンパク質。
(項目33)
AE288が配列番号8である項目32に記載のキメラタンパク質。
(項目34)
式におけるXまたはX1が約36、約42、約72または約144のアミノ酸を含有する項目30~33のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目35)
式におけるXまたはX1が、AE42、AE72、AE144、AG42、AG72、またはAG144から選択される請求書34に記載のキメラタンパク質。
(項目36)
式におけるXまたはX1が、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号14;配列番号60;配列番号61;配列番号62;または配列番号63から選択される請求書34に記載のキメラタンパク質。
(項目37)
X2が、少なくとも約36のアミノ酸、少なくとも約42のアミノ酸、少なくとも約144のアミノ酸、少なくとも約288のアミノ酸、少なくとも約576のアミノ酸、または少なくとも約864のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を含む項目30~36のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目38)
X2が、AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、及びAG144から選択される項目37に記載のキメラタンパク質。
(項目39)
X2が、配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号17;配列番号54;配列番号19;配列番号16;配列番号18;配列番号15;配列番号55;配列番号56;配列番号57;配列番号58;配列番号59;配列番号14;配列番号60;配列番号61;配列番号62;または配列番号63から選択される項目37に記載のキメラタンパク質。
(項目40)
X2がAE288またはAG288である項目37に記載のキメラタンパク質。
(項目41)
XまたはX1及び/またはX2を含むキメラタンパク質が、XまたはX1及び/またはX2を含まないキメラタンパク質に比べて長い半減期を示す項目30~40のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目42)
L1及び/またはL2が切断可能なリンカーである項目30~41のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目43)
L4及び/またはL5が切断可能なリンカーである項目30~41のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目44)
リンカーが、第XIa因子、第XIIa因子、カリクレイン、第VIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、第IIa因子(トロンビン)、エラスターゼ-2、グランザイム-B、TEV、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ3C、ソルターゼA、MMP-12、MMP-13、MMP-17、及びMMP-20から選択されるプロテアーゼによって切断可能である項目42または43に記載のキメラタンパク質。
(項目45)
リンカーが第IIa因子(トロンビン)によって切断可能である項目42または43に記載のキメラタンパク質。
(項目46)
リンカーが、RRRR(配列番号102)、RKRRKR(配列番号103)、RRRRS(配列番号104)、TQSFNDFTR(配列番号1)、SVSQTSKLTR(配列番号3)、DFLAEGGGVR(配列番号4)、TTKIKPR(配列番号5)、LVPRG(配列番号6)、ALRPR(配列番号7)、KLTRAET(配列番号121)、DFTRVVG(配列番号122)、TMTRIVGG(配列番号123)、SPFRSTGG(配列番号124)、LQVRIVGG(配列番号125)、PLGRIVGG(配列番号126)、IEGRTVGG(配列番号127)、LTPRSLLV(配列番号128)、LGPVSGVP(配列番号129)、VAGDSLEE(配列番号130)、GPAGLGGA(配列番号131)、GPAGLRGA(配列番号132)、APLGLRLR(配列番号133)、PALPLVAQ(配列番号134)、ENLYFQG(配列番号135)、DDDKIVGG(配列番号:136)、LEVLFQGP(配列番号:137)、及びLPKTGSES(配列番号138)から選択されるアミノ酸配列を含む1以上の切断部位を含む項目42または43に記載のキメラタンパク質。
(項目47)
リンカーがTLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(配列番号146)を含む項目42または43に記載のキメラタンパク質。
(項目48)
リンカーがLVPRG(配列番号6)のアミノ酸配列を含む項目42または43に記載のキメラタンパク質。
(項目49)
リンカーが、FVIIIのa1領域、FVIIIのa2領域、FVIIIのa3領域、またはそれらの任意の組み合わせを含む項目42または43に記載のキメラタンパク質。(項目50)
FVIIIのa2領域が、ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(配列番号106)に対して少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む項目49に記載のキメラタンパク質。
(項目51)
a1領域が、ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV(配列番号107)に対して少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む項目49に記載のキメラタンパク質。
(項目52)
a3領域が、ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ(配列番号108)に対して少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む項目49に記載のキメラタンパク質。
(項目53)
F1が第1のFc領域を含み、及び/またはF2が第2のFc領域を含む項目30~52のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目54)
F1及びF2を含むキメラタンパク質が、F1及びF2を含まないキメラタンパク質に比べて長い半減期を示す項目30~53のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目55)
L3が処理可能なリンカーである項目30~54のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目56)
VWFタンパク質が非共有結合によってFVIIIタンパク質に会合する項目1~55のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目57)
VWFタンパク質及び/またはXTEN配列を含まないFVIIIタンパク質に比べて、または野生型FVIIIに比べて、キメラタンパク質の半減期が延長される項目1~56のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目58)
キメラタンパク質の半減期が、VWFタンパク質またはXTEN配列を含まないFVIIIタンパク質よりも、または野生型FVIIIよりも少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長される項目57に記載のキメラタンパク質。
(項目59)
キメラタンパク質の半減期が、少なくとも約17時間、少なくとも約18時間、少なくとも約19時間、少なくとも約20時間、少なくとも約21時間、少なくとも約22時間、少なくとも約23時間、少なくとも約24時間、少なくとも約25時間、少なくとも約26時間、少なくとも約27時間、少なくとも約28時間、少なくとも約29時間、少なくとも約30時間、少なくとも約31時間、少なくとも約32時間、少なくとも約33時間、少なくとも約34時間、少なくとも約35時間、少なくとも約36時間、少なくとも約48時間、少なくとも約60時間、少なくとも約72時間、少なくとも約84時間、少なくとも約96時間、または少なくとも約108時間である項目57に記載のキメラタンパク質。
(項目60)
キメラタンパク質の半減期がHemAマウスにて約40時間である項目57に記載のキメラタンパク質。
(項目61)
VWFタンパク質が実質的にVWFクリアランス受容体に結合しない項目1~60のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目62)
VWFタンパク質が、1以上のプロテアーゼ切断からFVIIIタンパク質を保護することができ、活性化からFVIIIタンパク質を保護することができ、FVIIIタンパク質の重鎖及び/または軽鎖を安定化することができ、または1以上のスカベンジャー受容体によるFVIIIタンパク質のクリアランスを防ぐことができる項目1~61のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目63)
VWFタンパク質が、FVIIIタンパク質上のVWF結合部位を遮蔽するまたは遮断することによって内在性のVWFがFVIIIタンパク質に結合するのを阻害するまたは妨ぐ項目1~62のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目64)
VWF結合部位がFVIIIタンパク質のA3ドメインまたはC2ドメインまたはA3ドメインとC2ドメイン双方に位置する項目63に記載のキメラタンパク質。
(項目65)
VWF結合部位が、配列番号65のアミノ酸1669~1689及び2303~2332に相当するアミノ酸配列を含む項目63に記載のキメラタンパク質。
(項目66)
第1のIg定常領域またはその一部及び第2のIg定常領域またはその一部が同一であるまたは異なる項目1~65のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目67)
FVIIIタンパク質が、少なくとも2つのXTEN配列、少なくとも3つのXTEN配列、少なくとも4つのXTEN配列、少なくとも5つのXTEN配列または少なくとも6つのXTEN配列に連結される、及び/または挿入される項目1~66のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目68)
FVIIIタンパク質が、A1ドメイン、a1酸性領域、A2ドメイン、a2酸性領域、Bドメイン、A3ドメイン、a3酸性領域、C1ドメイン、C2ドメイン、それらの1以上の断片、及びそれらの組み合わせから選択されるFVIIIの1以上のドメインを含む項目1~67のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目69)
FVIIIタンパク質における1以上の挿入部位が、A1ドメイン、a1酸性領域、A2ドメイン、a2酸性領域、Bドメイン、a3酸性領域、C1ドメイン、C2ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるFVIIIの1以上のドメインの範囲内に、またはA1ドメインとa1酸性領域、a1酸性領域とA2ドメイン、A2ドメインとa2酸性領域、a2酸性領域とBドメイン、BドメインとA3ドメイン、A3ドメインとC1ドメイン、C1ドメインとC2ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるFVIIIタンパク質の1以上のドメインの間に、またはA1ドメインとa1酸性領域、a1酸性領域とA2ドメイン、A2ドメインとa2酸性領域、a2酸性領域とBドメイン、BドメインとA3ドメイン、A3ドメインとC1ドメイン、C1ドメインとC2ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるFVIIIタンパク質の2つのドメインに間に位置付けられる項目10~68のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目70)
FVIIIタンパク質における1以上の挿入部位が、表7、表8、表9、及び表10におけるアミノ酸残基から成る群から選択される1以上のアミノ酸である項目10~68のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目71)
FVIIIタンパク質における挿入部位が、成熟FVIIIタンパク質(配列番号65)に対応するアミノ酸745のすぐ下流に位置する項目70に記載のキメラタンパク質。(項目72)
FVIIIタンパク質における挿入部位が、成熟FVIIIタンパク質(配列番号65)に対応する残基1656及び残基1900のすぐ下流に位置する項目10~68のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目73)
FVIIIタンパク質における挿入部位が、成熟FVIIIタンパク質(配列番号65)に対応する残基26、1656及び1900のすぐ下流である項目10~68のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目74)
FVIIIタンパク質における挿入部位が、成熟FVIIIタンパク質(配列番号65)に対応する残基403及び745のすぐ下流である項目10~68のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目75)
FVIIIタンパク質における挿入部位が、成熟FVIIIタンパク質(配列番号65)に対応する残基745及び1900のすぐ下流である項目10~68のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目76)
FVIIIタンパク質における挿入部位が、成熟FVIIIタンパク質(配列番号65)に対応する残基18及び745のすぐ下流である項目10~68のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目77)
FVIIIタンパク質が二重鎖FVIIIアイソフォームである項目1~76のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目78)
FVIIIタンパク質が単鎖FVIIIアイソフォームである項目1~76のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目79)
FVIIIタンパク質がBドメインまたはその一部を含む項目1~78のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目80)
FVIIIタンパク質がSQ Bドメインを欠失させたFVIIIである項目79に記載のキメラタンパク質。
(項目81)
単鎖FVIIIアイソフォームが、完全長成熟第VIII因子ポリペプチド(配列番65)に対応する残基1648、残基1645若しくは双方の残基に相当する残基にて、またはSQ BDD第VIII因子(配列番号67)の残基754、残基751若しくは双方の残基に相当する残基にて少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する項目78または79に記載のキメラタンパク質。
(項目82)
アミノ酸置換がアルギニン以外のアミノ酸である項目81に記載のキメラタンパク質。(項目83)
二重鎖FVIIIアイソフォームが、FVIIIの重鎖を含む第1の鎖とFVIIIの軽鎖を含む第2の鎖とを含み、前記重鎖と前記軽鎖が金属結合で互いに会合する項目77に記載のキメラタンパク質。
(項目84)
D’ドメインが、配列番号21のアミノ酸764~866に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列含む項目1~83のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目85)
D3ドメインが、配列番号21のアミノ酸867~1240に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列含む項目1~84のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目86)
VWFタンパク質が単量体である項目1~85のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目87)
少なくとも2つのVWFタンパク質、少なくとも3つのVWFタンパク質、少なくとも4つのVWFタンパク質、少なくとも5つのVWFタンパク質、または少なくとも6つのVWFタンパク質を含む項目1~86のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目88)
VWFタンパク質が、配列番号21のアミノ酸764~1240に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む項目1~87のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目89)
VWFタンパク質が、配列番号21のアミノ酸764~1240から本質的に成る、またはそれから成る項目88に記載のキメラタンパク質。
(項目90)
VWFタンパク質が、配列番号21の残基1099、残基1142、または残基1099と1142の双方に相当する残基にて少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する項目1~89のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目91)
VWFタンパク質が、配列番号21の残基1099、残基1142、または残基1099と1142の双方に相当する残基にて置換されるシステイン以外のアミノ酸を含有する項目1~89のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目92)
VWFタンパク質がさらに、VWFのD1ドメイン、D2ドメインまたはD1とD2のドメインを含む項目1~91のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目93)
VWFタンパク質がさらに、A1ドメイン、A2ドメイン、A3ドメイン、D4ドメイン、B1ドメイン、B2ドメイン、B3ドメイン、C1ドメイン、C2ドメイン、CKドメイン、それらの1以上の断片、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるVWFドメインを含む項目1~92のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目94)
VWFタンパク質が、(1)VWFのD’ドメイン及びD3ドメイン若しくはその断片、(2)VWFのD1、D’及びD3のドメイン若しくはその断片、(3)VWFのD2、D’及びD3のドメイン若しくはその断片、(4)VWFのD1、D2、D’及びD3のドメイン若しくはその断片、または(5)VWFのD1、D2、D’、D3及びA1のドメイン若しくはその断片から本質的に成る、またはそれから成る項目1~92のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目95)
VWFタンパク質がさらに、VWFタンパク質に操作可能に連結されるVWFまたはFVIIIのシグナルペプチドを含む項目1~94のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目96)
リンカーの1以上が、少なくともおよそ10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800、または2000のアミノ酸残基の長さを有する項目16~95のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目97)
リンカーの1以上が、およそ1~およそ2000アミノ酸残基の長さを有する項目16~95のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目98)
リンカーの1以上が、Gly/Serペプチドを含む項目96または97に記載のキメラタンパク質。
(項目99)
Gly/Serペプチドが(Gly4Ser)n(配列番号94)またはS(Gly4Ser)n(配列番号164)の式を有し、nが1、2、3、4、5、6、7、8、9及び10から成る群から選択される正の整数である項目98に記載のキメラタンパク質。
(項目100)
(Gly4Ser)nリンカーが(Gly4Ser)3(配列番号100)または(Gly4Ser)4(配列番号165)である項目99に記載のキメラタンパク質。
(項目101)
リンカーが、20アミノ酸、35アミノ酸、48アミノ酸、73アミノ酸、または95アミノ酸を含む項目16~100のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目102)
切断可能なリンカーがSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGG(配列番号166)である項目17~29及び42~101のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目103)
ポリシアル化、PEG化またはHES化される項目1~102のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目104)
第1のポリペプチドが、FVIII161(配列番号69)、FVIII169(配列番号70)、FVIII173(配列番号72)、FVIII195(配列番号73)、FVIII196(配列番号74)、FVIII199(配列番号75)、FVIII201(配列番号76)、FVIII203(配列番号77)、FVIII204(配列番号78)、FVIII205(配列番号79)、FVIII266(配列番号80)、FVIII267(配列番号81)、FVIII268(配列番号82)、FVIII269(配列番号83)、FVIII271(配列番号84)、FVIII272(配列番号85)またはFVIII282(配列番号159)に対して少なくとも約80%、90%、95%、99%または100%同一であるものを含み、第2のポリペプチドがVWF057(配列番号152)に対して少なくとも約80%、90%、95%、99%または100%同一であるものを含む項目1~20のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目105)
第1のポリペプチドがFVIII169(配列番号70)を含み、第2のポリペプチドがVWF057(配列番号152)を含む項目104に記載のキメラタンパク質。
(項目106)
キメラタンパク質が、それを必要とする対象からの出血を防ぐ及び/または止めるのに有効である項目1~105のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目107)
項目1~106のいずれか1項に記載のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
(項目108)
PC5またはPC7をコードするポリヌクレオチド鎖をさらに含む項目107に記載のポリヌクレオチド。
(項目109)
項目107または108に記載のポリヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのセットに操作可能に連結された1以上のプロモータとを含むベクター。
(項目110)
PC5またはPC7をコードするポリヌクレオチド鎖を含む追加のベクターをさらに含む項目109に記載のベクター。
(項目111)
項目107または108に記載のポリヌクレオチド、または項目109または110に記載のベクターを含む宿主細胞。
(項目112)
哺乳類細胞である項目111に記載の宿主細胞。
(項目113)
哺乳類細胞が、HEK293細胞、CHO細胞及びBHK細胞から選択される項目112に記載の宿主細胞。
(項目114)
項目1~106のいずれか1項に記載のキメラタンパク質、項目107若しくは108に記載のポリヌクレオチド、項目109若しくは110に記載のベクター、または項目111~113のいずれか1項に記載の宿主細胞と、薬学上許容可能なキャリアとを含む医薬組成物。
(項目115)
野生型FVIIIタンパク質に比べてFVIIIタンパク質が延長された半減期を有する項目114に記載の組成物。
(項目116)
キメラタンパク質の半減期が、野生型FVIIIよりも少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長される項目114または115に記載の組成物。
(項目117)
キメラタンパク質の半減期が、少なくとも約17時間、少なくとも約18時間、少なくとも約19時間、少なくとも約20時間、少なくとも約21時間、少なくとも約22時間、少なくとも約23時間、少なくとも約24時間、少なくとも約25時間、少なくとも約26時間、少なくとも約27時間、少なくとも約28時間、少なくとも約29時間、少なくとも約30時間、少なくとも約31時間、少なくとも約32時間、少なくとも約33時間、少なくとも約34時間、少なくとも約35時間、少なくとも約36時間、少なくとも約48時間、少なくとも約60時間、少なくとも約72時間、少なくとも約84時間、少なくとも約96時間、または少なくとも約108時間である項目114または115に記載の組成物。
(項目118)
キメラタンパク質の半減期が、HemAマウスにて約40時間である項目114または115に記載の組成物。
(項目119)
局所投与、眼内投与、非経口投与、クモ膜下投与、硬膜下投与、及び経口投与から成る群から選択される経路によって投与される項目114~118のいずれか1項に記載の組成物。
(項目120)
非経口投与が、静脈内投与または皮下投与である項目119に記載の組成物。
(項目121)
それを必要とする対象にて出血性の疾患または状態を治療するのに使用される項目114~120のいずれか1項に記載の組成物。
(項目122)
出血性の疾患または状態が、出血性凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸郭内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、腸腰筋鞘における出血及びそれらの組み合わせから成る群から選択される項目121に記載の組成物。
(項目123)
対象は手術を受けることが予定されている項目121または122に記載の組成物。
(項目124)
治療が予防的なもの、または要求に応じたものである項目114~123のいずれか1項に記載の組成物。
(項目125)
キメラタンパク質の半減期の延長方法または増加方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、項目1~106のいずれか1項に記載のキメラタンパク質、項目107若しくは108に記載のポリヌクレオチド、項目109若しくは110に記載のベクター、項目111~113のいずれか1項に記載の宿主細胞、または項目114~124に記載のいずれか1項に記載の組成物の有効量を加えることを含み、その際、VWFタンパク質、XTEN配列、第1のIg定常領域またはその一部及び第2のIg定常領域またはその一部がキメラタンパク質の半減期を増加させる、前記延長方法または増加方法。
(項目126)
それを必要とする対象における出血性の疾患または障害の治療方法であって、有効量の項目1~106のいずれか1項に記載のキメラタンパク質、項目107若しくは108に記載のポリヌクレオチド、項目109若しくは110に記載のベクター、項目111~113のいずれか1項に記載の宿主細胞、または項目114~124のいずれか1項に記載の組成物を投与することを含み、前記出血性の疾患または障害が、出血性凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸郭内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、及び腸腰筋鞘における出血から成る群から選択される、前記治療方法。
(項目127)
対象が動物である項目125または126に記載の方法。
(項目128)
動物がヒトである項目127に記載の方法。
(項目129)
対象が血友病Aを患っている項目127または128に記載の方法。
(項目130)
治療が予防的なものまたは要求に応じたものである項目126~129のいずれか1項に記載の方法。
(項目131)
有効量が、約0.1μg/kg~500mg/kgである項目126~130のいずれか1項に記載の方法。
(項目132)
局所投与、眼内投与、非経口投与、クモ膜下投与、硬膜下投与、及び経口投与から成る群から選択される経路によって、項目1~106のいずれか1項に記載のキメラタンパク質、項目107若しくは108に記載のポリヌクレオチド、項目109若しくは110に記載のベクター、項目111~113のいずれか1項に記載の宿主細胞、または項目114~124のいずれか1項に記載の組成物を投与する項目125~131のいずれか1項に記載の方法。
(項目133)
非経口投与が、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、及び皮内投与から成る群から選択される項目132に記載の方法。
(項目134)
キメラタンパク質の作製方法であって、項目107若しくは108に記載のポリヌクレオチドまたは項目109若しくは110に記載のベクターによって1以上の宿主細胞に形質移入することと、宿主細胞にてキメラタンパク質を発現させることとを含む、前記作製方法。
(項目135)
キメラタンパク質を単離することをさらに含む項目134に記載の方法。
(項目136)
キメラタンパク質が対象における出血を止める及び/または妨げることに有効である項目124~135のいずれか1項に記載の方法。
(項目137)
リンカーが、FVIIIのa2領域またはその断片を含む項目19に記載のキメラタンパク質。
(項目138)
リンカーが、DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(配列番号88)に対して少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、項目137に記載のキメラタンパク質。
(項目139)
リンカーが、アミノ酸配列IEPR(配列番号200)またはIEPRSFS(配列番号194)を含む項目19に記載のキメラタンパク質。
(項目140)
リンカーがFVIIIの完全長a2領域ではない項目138または139に記載のキメラタンパク質。
(項目141)
リンカーがFVIIIのa2領域の断片を含む項目42または43に記載のキメラタンパク質。
(項目142)
リンカーが、配列番号88、139、140、141、142、143、144、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、及び200から選択されるアミノ酸配列を含む項目141に記載のキメラタンパク質。
(項目143)
リンカーがアミノ酸配列IEPR(配列番号200)またはIEPRSFS(配列番号194)を含む項目142に記載のキメラタンパク質。
(項目144)
リンカーがFVIIIの完全長のa2領域ではない項目141~143のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目145)
キメラタンパク質であって、
(i)第VIII因子(「FVIII」)タンパク質が288アミノ酸の長さのXTEN配列を含む、第1の免疫グロブリン(「Ig」)定常領域またはその一部に融合された前記FVIIIタンパク質を含む第1のポリペプチドと
(ii)中間の144アミノ酸のXTEN配列によって第2のIg定常領域またはその一部に融合されたフォンウィルブランド因子(「VWF」)のD’ドメインとD3ドメインを含むVWFタンパク質を含む第2のポリペプチドとを含み、
第1のポリペプチドが第1及び第2の定常領域を介して第2のポリペプチドに連結されるまたは会合する、前記キメラタンパク質。
(項目146)
144アミノ酸のXTEN配列と第2のIg定常領域との間で切断可能なリンカーをさらに含む項目145に記載のキメラタンパク質。
(項目147)
切断可能なリンカーがトロンビンによって切断可能である項目146に記載のキメラタンパク質。
(項目148)
切断可能なリンカーがIEPR(配列番号200)またはIEPRSFS(配列番号194)を含むアミノ酸配列を有する項目146または147に記載のキメラタンパク質。(項目149)
切断可能なリンカーがIEPR(配列番号200)またはIEPRSFS(配列番号194)を含むアミノ酸配列を有し、前記リンカーがFVIIIの完全長のa2領域ではない項目146または147に記載のキメラタンパク質。
用語「a」または「an」の実体はその実体の1以上を指すことが言及されるべきである;たとえば、「aヌクレオチド配列」は1以上のヌクレオチド配列を表すように理解される。そのようなものとして、「a」(または「an」)、「1以上」及び「少なくとも1つの」は本明細書では相互変換可能に使用することができる。
PACE(対形成塩基性アミノ酸切断酵素)としても知られるサブチリシン様の前駆タンパク質転換酵素である。フーリンは不活性な前駆体タンパク質を生物学的に活性のあるタンパク質の変換するその区分を欠失させる。その細胞内輸送の間に、VWFのプロペプチドはフーリン酵素によって成熟VWF分子から切断することができる。一部の実施形態では、フーリンはVWFのD’D3からD1D2を切断する。他の実施形態では、フーリンをコードするヌクレオチド配列は、D1D2ドメインがフーリンによって細胞内で切り離しされ得るようにVWF断片をコードするヌクレオチド配列と一緒に発現させることができる。
本発明は、FVIIIの半減期限定因子、すなわち、内在性のVWFがFVIIIタンパク質に会合するのを妨げるまたは阻害することによって、XTEN配列に融合されたVWFタンパク質を用いたキメラタンパク質の半減期を延長することを指向する。内在性のVWFは非共有結合複合体でFVIIIの約95%~約98%に会合する。内在性のVWFはFVIIIの半減期限定因子である一方で、FVIIIタンパク質に結合した内在性のVWFは様々な方法でFVIIIを保護することも知られている。たとえば、完全長のVWF(約250kDaを有する多量体としての)は、プロテアーゼ切断及びFVIIIの活性化からFVIIIを保護し、FVIIIの重鎖及び/または軽鎖を安定化し、且つスカベンジャー受容体によるFVIIIのクリアランスを防ぐことができる。しかし、同時に、内在性のVWFは、飲作用を防ぐことによって及びVWFクリアランス経路を介して系からFVIII/VWF複合体をクリアランスすることによってFVIIIの半減期を限定する。理論に束縛されない一方で、内在性のVWFは、半減期延長因子に融合されたキメラタンパク質の半減期が野生型FVIIIの半減期の約2倍より長くなるのを妨ぐ半減期限定因子であると考えられる。従って、本発明は、D’ドメインとD3ドメインを含むVWFタンパク質(たとえば、VWF断片)を用いて内在性のVWFとFVIIIタンパク質との間の相互作用を妨げることまたは阻害すること、と同時にIg定常領域またはその一部との組み合わせでXTEN配列を用いることによって得られるFVIIIタンパク質の半減期を増やすことを指向する。特に、本発明は、さらに短いXTEN配列(すなわち、288未満のアミノ酸を含有するXTEN、すなわち、288アミノ酸よりも短いXTEN)がキメラタンパク質の半減期を延長することにおいてさらに良好であることを示す。
(a)FVIII-F1:F2-L2-X-L1-V;
(b)FVIII-F1:V-L1-X-L2-F2;
(c)F1-FVIII:F2-L2-X-L1-V;
(d)F1-FVIII:V-L1-X-L2-F2;
(e)FVIII-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(f)FVIII-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(g)FVIII(X2)-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(h)FVIII(X2)-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(i)F1-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V;
(j)F1-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2;
(k)V-L1-X-L2-F2-L3-FVIII-L4-F1;
(l)V-L1-X-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII;
(m)F1-L4-FVIII-L3-F2-L2-X-L1-V;
(n)FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(o)FVIII-L4-F1-L3-V-L1-X-L2-F2;
(p)FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V;
(q)F2-L2-X-L1-V-L3-F1-L4-FVIII;
(r)F2-L2-X-L1-V-L3-FVIII-L4-F1;
(s)V-L1-X1-L2-F2-L3-FVIII(X2)-L4-F1;
(t)V-L1-X1-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII(X2);
(u)F1-L4-FVIII(X2)-L3-F2-L2-X1-L1-V;
(v)F-L4-FVIII(X2)-L3-V-L1-X1-L2-F2;
(w)FVIII(X2)-L4-F1-L3-V-L1-X1-L2-F2;
(x)FVIII(X2)-L4-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V;
(y)F2-L2-X1-L1-V-L3-F1-L4-FVIII(X2);
(z)F2-L2-X1-L1-V-L3-FVIII(X2)-L4-F1;
(aa)V-L1-X2-L2-F2-L3-FVIII-L4-X2-L5-F1;
(bb)V-L1-X2-L2-F2-L3-F1-L5-X2-L4-FVIII;
(cc)F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-F2-L2-X2-L1-V;
(dd)F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-V-L1-X2-L2-F2;
(ee)FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-V-L1-X1-L2-F1;
(ff)FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-F1-L2-X1-L1-V;
(gg)F1-L2-X1-L1-V-L3-F2-L4-X2-L5-FVIII;または
(hh)F1-L2-X1-L1-V-L3-FVIII-L5-X2-L4-F2;の1つを含み、
式中、VはD’ドメイン及びD3ドメインを含むVWFタンパク質であり、XまたはX1は288未満のアミノ酸を含有する第1のXTEN配列であり、X2は第2のXTEN配列であり、FVIIIはFVIIIタンパク質を含み、
FVIII(X2)はFVIIIタンパク質内の1以上の挿入部位で挿入される第2のXTEN配列を有するFVIIIタンパク質を含み、
F1は第1のIg定常領域またはその一部であり、
F2は第2のIg定常領域またはその一部であり、
L1、L2、L3、L4またはL5は任意のリンカーであり、
(-)はペプチド結合であり、
(:)は共有結合または非共有結合である。
VWF(F8VWFとしても知られる)は血液血漿に存在する大きな多量体糖タンパク質であり、内皮(バイベル・パラーデ小体にて)、巨核球(血小板のα顆粒)及び内皮細胞下の結合組織にて構成的に産生される。塩基性VWF単量体は2813のアミノ酸のタンパク質である。単量体はどれも皆、特定の機能を持つ多数の特定のドメイン、D’/D3ドメイン(第VIII因子に結合する)、A1ドメイン(血小板GPIb受容体、ヘパリン及び/またはおそらくコラーゲンに結合する)、A3ドメイン(コラーゲンに結合する)、C1ドメイン(これが活性化されるとRGDドメインが血小板のインテグリンαIIbβ3に結合する)、タンパク質のC末端における「システインノット」ドメイン(VWFが血小板由来増殖因子(PDGF)、形質転換増殖因子-β(TGFβ)及びβ-ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(βHCG)とともに共有する)を含有する。
本明細書で使用されるとき、「XTEN配列」は、主として小さな親水性アミノ酸で構成される、天然に存在しない、実質的に非反復の配列を持つ延長した長さのポリペプチドを指し、該配列は生理的条件下で低次の二次構造若しくは三次構造を持つ、または二次構造若しくは三次構造を持たない。キメラタンパク質の相手として、XTENは、キャリアとして役立つことができ、VWFタンパク質または本発明のFVIII配列に連結されてキメラタンパク質を創り出す場合、特定の望ましい薬物動態特性、物理化学的特性及び薬学特性を付与する。そのような望ましい特性には、高い薬物動態パラメータ及び溶解度特性が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用されるとき、「XTEN」は具体的には抗体または軽鎖若しくは重鎖の単鎖抗体若しくはFc断片のような抗体断片を排除する。
「FVIIIタンパク質」は本明細書で使用されるとき、特定されない限り、凝固における正常な役割で機能的なFVIIIポリペプチドを意味する。用語、FVIIIタンパク質には、凝固経路における完全長野生型の第VIII因子の機能を保持する、その機能的な断片、変異体、類似体または誘導体が含まれる。「FVIIIタンパク質」はFVIIIポリペプチド(またはタンパク質)またはFVIIIと相互変換可能に使用される。FVIIIの機能の例には、凝固を活性化する能力、第IX因子の補因子として作用する能力、またはCa2+とリン脂質の存在下で第IX因子とテナーゼ複合体を形成し、次いで第X因子を活性化された形態Xaに変換する能力が挙げられるが、これらに限定されない。FVIIIタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラットまたはマウスのFVIIIタンパク質であることができる。加えて、ヒト由来のFVIIIと他の種のFVIIIの比較によって、機能に必要とされる可能性がある保存された残基が特定されている(Cameronら,Thromb.Haemost.79:317-22(1998);US6,251,632)。
(60)それらの2以上の組み合わせから成る群から選択される成熟完全長FVIIIに対応する1以上のアミノ酸のすぐ下流である。
本発明のキメラタンパク質はまた、2つのIg定常領域またはその一部、任意のリンカーによってFVIIIタンパク質に融合された第1のIg定常領域またはその一部と、288未満のアミノ酸を有するXTEN配列を介してVWFタンパク質に融合された第2のIg定常領域またはその一部も含む。Ig定常領域またはその一部は、XTEN配列及びVWFタンパク質との組み合わせでキメラタンパク質の薬物動態特性または薬物力学的特性を改善することができる。特定の実施形態では、Ig定常領域またはその一部は、Ig定常領域またはその一部に融合された分子の半減期を延長する。
本発明のキメラタンパク質はさらに1以上のリンカーを含む。リンカーの種類の1つは、切断可能なリンカーであり、それは、生体内で、たとえば、凝固の部位にて対象に投与されると種々のプロテアーゼによって切断され得る。一実施形態では、切断可能なリンカーは、部分の、たとえば、VWFタンパク質のXTEN配列からの切断を可能にするので、凝固カスケードの部位でキメラタンパク質からの切断を可能にし、それによって活性化されたFVIII(FVIIIa)がそのFVIIIa活性を有するのを可能にする。リンカーの別の種類は、処理可能なリンカーであり、それは細胞内切断部位を含有するので宿主細胞における細胞内プロセッシング酵素によって切断されることができ、ポリペプチドの好都合な発現及びキメラタンパク質の形成を可能にする。
切断可能なリンカーは、別の分子から分子を1つ解放するために、化学的に(たとえば、エステル結合の加水分解)、酵素的に(たとえば、プロテアーゼ切断配列の組み入れ)、または光分解で(たとえば、3-アミノ-3-(2-ニトロフェニル)プロピオン酸(ANP)のような発色団)切断されることが可能である部分を取り込むことができる。
本発明で提供されるのはまた、本発明のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。一実施形態では、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は単一のポリヌクレオチド鎖によってコードすることができる。別の実施形態では、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は2つの異なるポリヌクレオチド、すなわち、第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列によってコードされる。別の実施形態では、第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列は2つの異なるポリヌクレオチド(たとえば、異なるベクター)上にある。
。或いは、ワクシニア7.5Kプロモータが使用されてもよい。たとえば、Mackettら.(1982),Proc.Natl.Acad.Sci.USA.79:7415;Mackettら.(1984),J.Virol.49:857;Panicaliら.(1982),Proc.Natl.Acad.Sci.USA.79:4927を参照のこと。
C.ら.(1983),Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:249
5-9.選択可能なマーカーはThilly,(1986),Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,Mass.にて概説されており、選択可能なマーカーの選択は当業者のレベルの十分に範囲内である。
J.1:841)、及びリポソーム系試薬が挙げられるが、これらに限定されない。原核細胞及び真核細胞の双方を含む種々の宿主発現ベクター系を利用して本明細書で記載されるタンパク質を発現させてもよい。これらには、適当なコーディング配列を含有する組換えのバクテリオファージDNAまたはプラスミドDNAの発現ベクターで形質転換された細菌(たとえば、大腸菌);適当なコーディング配列を含有する組換えの酵母または真菌の発現ベクターで形質転換された酵母または糸状菌のような微生物;適当なコーディング配列を含有する組換えのウイルス発現ベクター(たとえば、バキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞系;適当なコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(たとえば、カリフラワーモザイクウイルスまたはタバコモザイクウイルス)で感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター(たとえば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系;または哺乳類細胞(たとえば、HEK293、CHO、Cos、HeLa、HKB11、及びBHK細胞)を含む動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。
ER.C6(登録商標)細胞はCrucell(Leiden,オランダ)から入手可能
である。他の実施形態では、哺乳類細胞はチャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞である。CHO細胞はAmerican Type Culture Collection、Manassas、VAから入手可能である(たとえば、CHO-K1;CCL-61)。さらに他の実施形態では、哺乳類細胞は幼若ハムスター腎臓(BHK)細胞である。BHK細胞はAmerican Type Culture Collection、Manassas、VAから入手可能である(たとえば、CRL-1632)。一部の実施形態では、哺乳類細胞はHKB11細胞であり、それはHEK293細胞とヒトB細胞株のハイブリッド細胞株である。Meiら,Mol.Biotechnol.34(2):165-78(2006)。
本発明のキメラタンパク質を含有する組成物は好適な薬学上許容可能なキャリアを含有してもよい。たとえば、それらは、活性化合物を作用部位への送達のために設計された製剤に処理するのを円滑にする賦形剤及び/または補助剤を含有してもよい。
Pub.Co.,Easton,Pa.1980)を参照のこと。
ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステルのような不活性成分を含有してもよい。
本発明のそのキメラタンパク質は、哺乳類、たとえば、ヒト対象にて生体内で産生させることができ、出血性凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、出血、筋肉への出血、口腔出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸郭内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、及び腸腰筋鞘における出血から成る群から選択される出血性の疾患または障害の治療に対して遺伝子治療のアプローチを使用することは治療上有益である。一実施形態では、出血性の疾患または障害は血友病である。別の実施形態では、出血性の疾患または障害は血友病Aである。これには、好適な発現制御配列に操作可能に連結された好適なキメラタンパク質をコードする核酸の投与が関与する。特定の実施形態では、これらの配列はウイルスベクターに組み込まれる。そのような遺伝子治療に好適なウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプステインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純性ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ関連ウイルス(AAV)ベクターが挙げられる。ウイルスベクターは複製欠損のウイルスベクターであることができる。他の実施形態では、アデノウイルスベクターはそのE1遺伝子及びE3遺伝子にて欠失を有する。アデノウイルスベクターを使用する場合、哺乳類は選択可能なマーカーをコードする核酸に曝露されなくてもよい。他の実施形態では、配列は当業者に既知の非ウイルスベクターに組み込まれる。
本発明は、本明細書で記載されるキメラタンパク質を用いてFVIIIタンパク質への内在性のVWFの結合を妨げるまたは阻害する方法を指向する。本発明はまた、XTEN及びIg定常領域またはその一部に連結されたFVIIIタンパク質を有するキメラタンパク質を使用する方法を指向する。
一般に、本発明の実践は、特に指示されない限り、化学、生物物理学、分子生物学、組換えDNA技術、免疫学(特に、たとえば、抗体技術)、の従来の技法、及び電気泳動における標準の技法を採用する。たとえば、Sambrook,Fritsch及びManiatis,Molecular Cloning:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,Humana,Pr.(1996);Anti
body Engineering:A Practical Approach,(Practical Approach Series,169),McCafferty,Ed.,Irl,P.(1996);Antibodies:A Laborator
y Manual,Harlowら,CS.H.L.Press,Pub.(1999);及びCurrent Protocols in Molecular Biology,eds.Ausubelら,John Wiley & Sons(1992)を参照のこと。
本発明は、IgGのFcドメインを介してフォンウィルブランド因子(VWF)タンパク質のD’D3ドメインに結合されるキメラFVIII分子を生成することを指向する。結合されたD’D3ドメインは内在性のVWF多量体とのFVIIIの相互作用を妨げる。キメラタンパク質の薬物動態を改善するために、この分子は他の半減期の延長技術を組み入れるためのプラットフォームとして役立つ。XTEN配列はFVIIIのBドメインに、及びD’D3とFc領域の間に組み込まれてFVIII/VWFヘテロ二量体の半減期を延ばした。
FcにおけるIHH三重変異はFcRnとの相互作用を妨げるので、FcRn経路によるFc含有分子の再利用はない。Fcにおける3つの変異は、I253A、H310A、H435Aである。
オリゴ
ESC155-VWF034における144 AE XTENのためのオリゴ-逆行
CCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCGCTCGAGGCACCTTCTTCAGTGCTGGTGGGCGAGCCCGCTGGTGACCCTTCCTC
ESC156-VWF034における144 AE XTEN-GSリンカーのためのオリゴ-逆行
GGGGAAGAGGAAGACTGACGGTCCGCCCAGGAGTTCTGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGCCTCCGCTGCCCCGGGGGACCAGGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCC
ESC157-VWF031における144 AE XTENのためのオリゴ-順行
GTGAAGCCTGCCAGGAGCCGATATCGGGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCACCCCTGAAAGTGGTCCCGGGAGCGAGCCAGC
のプライマー対を用いて第1のPCR反応を行った。この反応から得られた長さ約550bpのPCR産物を第2のPCR反応の鋳型として用い、ESC157/156のプライマー対を用いて増幅した。この反応は長さ約700bpの産物を生じた。次いでこの700bpのPCR産物とVWF034プラスミドをEcoRV-HFとRsRIIで消化した。消化から得たプラスミド主鎖。
FcにおけるIHH三重変異はFcRnとの相互作用を妨げるので、FcRn経路によるFc含有分子の再利用はない。Fcにおける3つの変異はI253A、H310A、H435Aである。
FcにおけるIHH三重変異はFcRnとの相互作用を妨げるので、FcRn経路によるFc含有分子の再利用はない。Fcにおける3つの変異はI253A、H310A、H435Aである。
Bドメインにおける144AEXTENを伴ったFVIII-282-FVIII-Fcのクローニング
ESC158-Bドメインにおける144AE-XTENのためのオリゴ-順行
AAGAAGCTTCTCTCAAAACGGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCACCCCTGAAAGTGGTCCCGGGAGCGAGCCAGCCACATCTGGGTCGGAAACGCCAGGC
ESC159-Bドメインにおける144AE-XTENのためのオリゴ-逆行
GGTATCATCATAATCGATTTCCTCTTGATCTGACTGAAGAGTAGTACGAGTTATTTCAGCTTGATGGCGTTTCAAGACTGGTGGGCTCGAGGCACCTTCTTCAGTGCTGGTGGGCGAGCCCGCTGGTGACCCTTCCTCAGTGGACGTAGG
のプライマー対を用いて第1のPCR反応を行った。この反応から長さ約550bpのPCR産物が得られ、次いでFVIII169プラスミドをAscIとCla1で消化した。次いで消化したFVIII169に由来するプラスミド主鎖を用いて、FVIII282を得るために550bpのPCR産物をライゲーションした。
FcにおけるIHH三重変異はFcRnとの相互作用を妨げるので、FcRn経路によるFc含有分子の再利用はない。Fcにおける3つの変異はI253A、H310A、H435Aである。
図2.FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc構築物の発現を示す模式図。ポリエチレンイミン(PEI)を用いてHEK293細胞にて3つのプラスミドの同時形質移入を行った。第1のプラスミドはFVIII-XTEN-Fcの発現を引き出し、第2のプラスミドはD1D2D’D3-XTEN-Fcを発現し、第3のプラスミドはPACE/フーリンの発現を引き出し、それはD1D2D’D3-XTEN-Fcからプロペプチド、すなわち、D1D2ドメインを酵素的に取り外すのに必要とされる。この3つのプラスミド発現系の産物には、FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fcヘテロ二量体と、D’D3-XTEN-Fcホモ二量体と、微量のFVIII-XTEN-Fcヘミ接合様の種が含まれる。
FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fcヘテロ二量体を精製するために、タンジェンシャルフロー(TFF)工程を用いて先ず馴化培地を10倍に濃縮した。次いでアフィニティクロマトグラフィ、その後脱塩カラムを用いて濾液における生成物をさらに精製した。分子の純度はHPLC/SECによって許容可能であったが、さらにウエスタンブロットによって確認した。FVIII活性アッセイ(実施例5)及びOD280測定によって測定したとき、分子の比活性はBドメインを欠失させたFVIIIに匹敵した。
FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fcヘテロ二量体の活性は、FVIII発色アッセイ及び活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)アッセイによって測定した。SQ BDD-FVIII、rFVIII169/VWF034及びrFVIII169/VWF057の発色比活性及びaPTT比活性を表16に載せる。SQ BDD-FVIIIに比べて、我々はrFVIII169/VWF034及びrFVIII169/VWF057について匹敵する発色比活性及びaPTT比活性における60%の低下を観察した。
SysmexCA-1500凝固アナライザにてFVIIIのaPTTアッセイを以下のように行った:先ず、aPTT緩衝液(50mMのトリス、100mMのNaCl、1%のHSA、pH7.4)における手動で希釈した50μLの試料、基準及び対照を機器
によって反応キュベットに加え、その後、50μLのFVIII-欠損の血漿(George King Bio-Medical,製品#:0800)を加えた。37℃で1分間のインキュベートに続いて、50μLのaPTT試薬(Actin(登録商標)FSL活性化セファロプラスチン試薬-Dade Behring,参照#B4219-2)を反応混合物に加え、37℃で4分間インキュベートした。その後、50μLの20mMのCaCl2(Dade Behring,参照#ORFO37)を加え、反応キュベットを直ちに4つの分光光度計のチャンネル位置の1つに移し、混合物における屈折光線の量を測定し、機器のソフトウエアのアルゴリズムによってそれを凝固の開始に変換した。報告された凝固時間は、CaCl2の添加から凝固形成の開始までの時間の長さだった。WHO第8回国際FVIII基準を100mIU/mLから0.78mIU/mLまでの範囲にaPTT緩衝液で希釈することによってアッセイ基準を生成した。MSエクセルにてX軸としてのFVIII活性(mIU/mL)の対数(底10)に対してY軸としての凝固時間(秒で)として検量線をプロットし、この検量線の線形回帰直線についての式を用いて個々の試料の活性を算出した。アッセイ性能に基づいて、定量の下限(LLOQ)は7.8mIU/mLだった。
半減期の延長のためにXTENの挿入をヘテロ二量体に組み込んだ。図3におけるrFVIII169/VWF031によって実証されたように、FVIIIのBドメインでの単一の288アミノ酸(aa)AE-XTENの挿入はHemAマウスにて16.7時間のヘテロ二量体の半減期を生じた。ヘテロ二量体の半減期をさらに改善するために、144aaまたは288aaの長さの第2のXTEN挿入をそれぞれFVIIIのA1ドメインにて、またはD’D3断片のすぐ下流でFVIII169/VWF031に組み込み、ヘテロ二量体の変異体をFVIII205/VWF031及びFVIII169/VWF034と命名した。
D’D3-XTEN-Fc鎖内でのXTEN挿入の最適な長さを特定する試みにて別のヘテロ二量体FVIII169/VWF057を構築し、XTEN挿入の長さを288aaから144aaに減らした。図4で示すように、rFVIII169/VWF034に比べて、rFVIII169/VWF057の半減期は31時間から42時間に増えた。rFVIII169/VWF057についても改善されたクリアランス及びAUCが観察され、データを表18に載せた。従って、FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fcヘテロ二量体のD’D3とFcドメインの間に挿入すると144aaAE-XTENはAE-288aaXTENよりも最適である。
FcドメインはFcRnが介在する再利用経路を介してその融合タンパク質の半減期を延長する。ヘテロ二量体の半減期の延長に対するFcドメインの必要性を確認するために、野生型FcドメインをrFVIII205/VWF031における三重変異体(I253A/H310A/H435A;IHH)によって置き換えてrFVIII263/VWF050を形成し、rFVIII263/VWF050について表面プラスモン共鳴(Biacore)アッセイによってFcRn結合の完全な排除を確認した。FVIII263/VWF050の半減期をrFVIII205/VWF031と比べてHemAマウスにて評価した。図5及び表19にて示すようにrFVIII263/VWF050について上昇したクリアランス速度と同様に低下した半減期及びAUCが観察された。この結果はFVIIIとD’D3の共有結合を確保することに加えて、ヘテロ二量体の半減期の改善にはFcドメインも必要であることを実証した。
HemAマウスの尾クリップ出血モデルを用いて主要なヘテロ二量体の急性期有効性を評価した。
HemAマウスの尾静脈横切開(TVT)モデルにてFVIII169/VWF057の予防的有効性を調べた。TVTモデルはマウスの尾の外側静脈に損傷を導入することによって出血を誘導し、それは血友病出血障害の患者における自然発生的な出血症状の出現を模倣する。
尾静脈横切開手順は以下のように実施した。50mg/kgのケタミンと0.125mg/kgのデクスメデトミジンと0.1mg/kgのブプレネックスを含有するカクテルでマウスを麻酔した。適切な麻酔の深さで、尾の直径がおよそ2.7mmの領域にて真っすぐな刃の11号の外科用刃でマウスの外側尾静脈を横切開した。流れる血液を温かい生理食塩水で洗い流し、傷の明瞭な観察を確保した。次いで次の24時間、処理したマウスを白紙の寝床で清潔なケージに単独で収容した。尾の再出血及びマウスの身体活動を観察し、尾損傷の12時間後まで時間毎に記録した。瀕死のマウスを直ちに安楽死させ、尾の損傷の24時間後、最終的な観察を行った。血友病患者における出血状況を模倣し、麻酔からの動物の完全な回復を確保するために、1mg/kgのアチパメゾール溶液を与えて尾静脈横切開の開始時でのデクスメデトミジンの効果を反転させた。一晩の疼痛管理のための12時間の観察期間の終了時に0.1mg/kgのブプレネックスの追加用量を投与した。データ解析のために時間対再出血及び時間対安楽死の生存曲線を生成し、ログランク(Mantel-Cox)検定を統計的評価に用いた。
pSYN FVIII310のクローニング
N末端でBamH1部位に隣接し、C末端でCla1部位に隣接する合成DNA断片は商業的に作製された。この合成DNAを用いてpSYN FVIII169構築物(配列番号155)におけるBamH1からCla1までの領域を置き換えた。合成DNAとpSYN FVIII169DNAの双方をBamH1とCla1で二重消化し、消化した合成DNAを消化したpSYN FVIII169に挿入してpSYN FVIII310(配列番号168;表20)を創り出した。
N末端でBamH1部位に隣接し、C末端でAfe1部位に隣接する合成DNA断片は商業的に作製された。この合成DNAを用いてpSYN FVIII169構築物(配列番号155)におけるBamH1からAfe1までの領域を置き換えた。合成DNAとpSYN FVIII169DNAの双方をBamH1とAfe1で二重消化し、消化した合成DNAを消化したpSYN FVIII169に挿入してpSYN FVIII312(配列番号169;表20)を創り出した。pSYN FVIII312A(配列番号2;表20)をpSYN FVIII312から創り出してFVIIIとXTENの接合部でアミノ酸残基GAPをコードするAscI部位を取り除いた。
D’D3-XTENとFcの間で異なるリンカー領域をコードする種々の合成DNA断片を作製した。これらの合成DNA断片をN末端でAsc1部位に及びC末端でNot1部位に隣接させた。これらの合成DNAを用いてpSYN VWF057構築物(配列番号152)のAsc1からNot1の領域を置き換えた。pSYN VWF059構築物(表21)はリンカー領域(配列番号13)を含み、それはFVIIIの酸性領域2(a2)全体を含む。この部位は、トロンビンによって切断されると報告され、FVIIIの活性化の際、D’D3XTENが放出される。pSYN VWF073構築物(表21)はFVIIIの酸性領域2(a2)のトロンビン切断部位(すなわち、IEPRSFS)(配列番号23)のみを含有する。合成DNA及びpSYN VWF057のDNA双方をAsc1及びNot1によって二重消化した。消化した合成DNAを消化したpSYN
VWF057に挿入してpSYN VWF059及びpSYN VWF073を創り出した。EcoRV制限部位を取り除くことによってpSYN VWF059からpSYN
VWF059A構築物(表21)を生成した。HEK293細胞にてFVIII169とVWF057またはVWF059とを同時発現させることによってFVIII169/VWF057及びFVIII169/VWF059のヘテロ二量体のタンパク質を生成した。
トロンビン消化実験にて2つのFVIIIヘテロ二量体タンパク質を調べ、トロンビンによる切断の速度を検討した。この実験に用いた2つのヘテロ二量体はFVIIIFcと併せたFVIII169/VWF057ヘテロ二量体及びFVIII169/VWF059ヘテロ二量体だった。FVIII169/VWF057及びFVIII169/VWF059のヘテロ二量体は上述されている。3つの消化反応:(i)FVIIIFc、(ii)FVIII169/VWF057(図11)及び(iii)FVIII169/VWF059(図12)を行った。およそ22:1のFVIII:トロンビンのモル比で試験試料をヒトα-トロンビンで処理した。各反応は37℃の水槽でインキュベートした。示した各時点(t=5、15、30、45、60分)にて、22.5μLの試料を取り出し、22.5μLの非還元2×SDS負荷染料で反応を止め、3分間加熱した。次いで消化したタンパク質をSDS-PAGEゲル上で流した。LICORシステムを用い、抗FVIII重鎖(GMA012)及び抗VWF-D3(Ab96340)抗体を用いてウエスタンブロットを行った。
FVIII169/VWF059の薬物動態プロファイル及び生体内の効能をさらに評価するために、150IU/kg用量での静脈内投与を介したFVIII169/VWF059でHemAマウスを処理した。注射の5分後、24、48、72、96及び120時間後に大静脈採血を介して血漿試料を採取した。FVIII発色アッセイによって血漿におけるFVIII活性を測定し、Phoenixプログラムを用いてPKパラメータを算出した。表22にて示すように、FVIII169/VWF057と比較して観察されたFVIII169/VWF059の類似のPKプロファイルは、a2トロンビン切断リンカーがヘテロ二量体のPKプロファイルに否定的な効果を有さないことを示している。
FVIII-XTEN-Fc/D’D3-Fcヘテロ二量体のプラスミド構築物
Claims (13)
- 止血障害を有する被験体の治療において使用するための組成物であって、前記組成物はキメラタンパク質を含み、前記キメラタンパク質は、
(i)第1のポリペプチド鎖であって、N末端からC末端に向けて、
(a)N末端部分およびC末端部分を含む第VIII因子(「FVIII」)タンパク質であって、
前記FVIIIタンパク質の前記N末端部分は、全長成熟FVIII(配列番号65)のA1ドメインと、A2ドメインと、Bドメインの一部とを含み、
前記N末端部分は、配列番号65のアミノ酸745のすぐ下流に挿入された第1のXTEN配列に融合された、配列番号65の残基1~745のアミノ酸配列を含み、それによって前記第1のポリペプチド鎖は配列番号2のアミノ酸配列を含み、そして前記第1のXTEN配列は配列番号8のアミノ酸配列を含み、
前記C末端部分は、A3ドメイン、C1ドメイン、および、C2ドメインを含むことにより、配列番号65の残基1690~2332を含む、FVIIIタンパク質と;
(b)第1の免疫グロブリン(「Ig」)定常領域またはその一部と
を含む第1のポリペプチド鎖と、
(ii)第2のポリペプチド鎖であって、N末端からC末端に向けて、
(a)フォンウィルブランド因子(「VWF」)のD’ドメインおよびD3ドメインを含むVWFタンパク質であって、配列番号21の残基1099および残基1142に相当する残基にて置換されるシステイン以外の残基を含有する、VWFタンパク質と;
(b)288未満のアミノ酸残基を含有する、配列番号58のアミノ酸配列を含む第2のXTEN配列と;
(c)配列番号65に相当するGlu720~Arg740のアミノ酸配列を含む、FVIIIのa2領域を含む切断可能なリンカーであって、前記a2領域が、トロンビンによって切断可能である、切断可能なリンカーと;
(d)第2のIg定常領域またはその一部と
を含む第2のポリペプチド鎖と
を含み、前記第1のポリペプチド鎖が、前記第1のIg定常領域またはその一部と前記第2のIg定常領域またはその一部を介して前記第2のポリペプチド鎖と会合する、組成物。 - 前記第2のXTEN配列は、切断可能なリンカーに融合されており、それによって前記第2のポリペプチド鎖が配列番号22のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1のIg定常領域またはその一部は、2つのジスルフィド結合を介して、前記第2のIg定常領域またはその一部と結合している、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記第1のIg定常領域またはその一部は第1のFc領域であり、前記第2のIg定常領域またはその一部は第2のGc領域である、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記切断可能なリンカーは、20~50アミノ酸長である、請求項1~4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記切断可能なリンカーは、約30アミノ酸長である、請求項1~5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記止血障害が血友病Aである、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は、予防的な治療に適したものである、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が要求に応じた治療に適したものである、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は、手術の前、間または後の治療に適したものである、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は、急性期出血症状の出現の制御に適したものである、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は、静脈内投与または皮下投与に適したものである、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は、静脈内投与に適したものである、請求項1~12のいずれか一項に記載の組成物。
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