JP2013190212A - バイオセンサ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】金属層の腐食を抑制するカーボン電極層を備えたバイオセンサ及びその製造方法を提供する。
【解決手段】本発明によると、第１の基材と、前記第１基材の第１の面上に配置された金属層と、前記金属層の一端上に配設されたカーボン及び第１の樹脂を含む第１の電極層と、前記第１の電極層を覆うように配設されたカーボンを含む第２の電極層と、前記第２の電極層上に位置するように配設された反応部と、を備え、前記第１の電極層は前記第２の電極層よりも吸水率が低い第１の樹脂を含むバイオセンサが提供される。
【選択図】図１

Description

本発明はバイオセンサに関し、特に溶液中の物質の濃度を電気化学的に測定するバイオセンサに関する。

血液等の生体試料中の特定成分について迅速かつ簡便に濃度等を測定する方法として、電気化学的検出手段によるバイオセンサが実用化されている。バイオセンサは、一般に、作用極と対極を含む電極系、酵素及び電子受容体を基本構成として備えている。このようなバイオセンサの一例として、電気化学的に血液中のグルコースを定量化するグルコースセンサがある。

グルコースセンサにおいては、酵素は血液中のグルコースを選択的に酸化してグルコン酸を生成し、また同時に電子受容体を還元して還元体を生じる。この還元体に電極系で一定の電圧を印加することで還元体が再び酸化され、その際に電流が発生する。この電流が血液中のグルコース濃度に依存することから、血液中のグルコースを定量化することができる。

従来、銀ペーストをスクリーン印刷することでリード配線を形成し、リード配線上に導電性カーボンペーストを印刷して電極系を形成し、バイオセンサが製造されていた（特許文献１、特許文献２参照）。従来のバイオセンサの導電性カーボンで形成した電極系では、試料中の水分や電子受容体（メディエータ）がカーボン電極層に存在する空隙から電極内部に侵入し、酸化還元反応によりカーボン電極層の下に配設された金属層（または配線）を腐食して、バイオセンサの電気特性を低下させる。

特開平８−１５２２０号公報 特開平８−５６００号公報

本発明は、上述の問題を解決するものであって、金属層の腐食を抑制するカーボン電極層を備えたバイオセンサ及びその製造方法を提供することを目的とする。

本発明の一実施形態によると、第１の基材と、前記第１基材の第１の面上に配置された金属層と、前記金属層の一端上に配設されたカーボン及び第１の樹脂を含む第１の電極層と、前記第１の電極層を覆うように配設されたカーボンを含む第２の電極層と、前記第２の電極層上に位置するように配設された反応部と、を備え、前記第１の電極層は前記第２の電極層よりも吸水率が低い第１の樹脂を含むバイオセンサが提供される。

本実施形態に係るバイオセンサは、金属層の一端上に配設されたカーボンを含む第１の電極層と、第１の電極層を覆うように配設されたカーボンを含む第２の電極層と、を備え、第１の電極層が第２の電極層よりも吸水率が低い第１の樹脂を含む２層構造のカーボンを含む電極層を備えることにより、試料中の水分や反応部に含まれる電子受容体が第２の電極層内部に侵入するのを抑制し、電子受容体の酸化還元反応により第２の電極層の下に配設された金属層を腐食するのを抑制することができる。

前記バイオセンサにおいて、前記第２の電極層は前記第１の電極層よりも親水性が高い第２の樹脂を含んでもよい。

第２の電極層は第１の電極層よりも親水性が高い第２の樹脂を含む２層構造のカーボンを含む電極層を備えるため、試料中に含まれる被検出物と酵素との反応により生じた電気信号を、電子受容体を介して第１の電極層に伝達しやすくすることができる。

また、本発明の一実施形態によると、第１の基材の第１の面上に、所定のパターンを有する金属層を形成し、前記金属層の一端上に、カーボンと、第１の樹脂と、第１の溶剤とを含有する第１塗工液を塗布して、第１の電極層を形成し、前記第１の電極層上に位置するように、カーボンと、第２の樹脂と、第２の溶剤とを含有する第２塗工液を塗布して、第２の電極層を形成し、前記第２の電極層上に位置するように反応部を形成し、前記第１の樹脂は前記第２の樹脂よりも吸水率が低い樹脂であるバイオセンサの製造方法が提供される。

本実施形態に係るバイオセンサの製造方法は、金属層の一端上にカーボンと、第１の樹脂とを含む第１の塗工液を塗布して第１の電極層を形成し、第１の電極層上に位置するように、カーボンと、第２の樹脂とを含有する第２の塗工液を塗布して第２の電極層を形成し、第１の樹脂は第２の樹脂よりも吸水率が低い樹脂であることにより、試料中の水分や反応部に含まれる電子受容体が第２の電極層内部に侵入するのを抑制し、電子受容体の酸化還元反応により第２の電極層の下に配設された金属層を腐食するのを抑制することができる。

前記バイオセンサの製造方法において、前記第２の樹脂は前記第１の樹脂よりも親水性が高くてもよい。

第２の電極層は第１の電極層よりも濡れ性が高い第２の樹脂を含む２層構造のカーボンを含む電極層を備えるため、試料中に含まれる被検出物と酵素との反応により生じた電気信号を、電子受容体を介して第１の電極層に伝達しやすくすることができる。

本発明によると、金属層の腐食を抑制するカーボン電極層を備えたバイオセンサ及びその製造方法を提供することができる。

本発明の一実施形態に係るバイオセンサ１０００の模式図であり、（ａ）はバイオセンサ１０００の全体図を示し、（ｂ）はバイオセンサ１０００の分解図である。 本発明の一実施形態に係る電極系１００の模式図であり、（ａ）は電極系１００の上面の斜視図であり、（ｂ）は（ａ）におけるＡ−Ａ’断面図である。 本発明の一実施形態に係るバイオセンサ１０００の製造方法を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係るバイオセンサ１０００の製造方法を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係るバイオセンサ１０００と測定装置１００００に接続した様子を示す模式図である。 従来のバイオセンサの電極系９００を示す模式図である。

本発明者らは、上述の問題を解決すべく鋭意検討した結果、金属層の一端上にカーボンを含む第１の電極層と、第１の電極層を覆うように配設されたカーボン及び第１の樹脂を含む第２の電極層との２層構造のカーボンを含む電極層を配設し、第１の電極層が第２の電極層よりも吸水率が低い（または疎水性が高い）第１の樹脂を含むことにより、試料中の水分や反応部に含まれる電子受容体が第２の電極層内部に侵入するのを抑制し、電子受容体の酸化還元反応により第２の電極層の下に配設された金属層を腐食するのを抑制することができることを見出した。

以下、図面を参照して本発明に係るバイオセンサ及びその製造方法について説明する。但し、本発明のバイオセンサは多くの異なる態様で実施することが可能であり、以下に示す実施の形態及び実施例の記載内容に限定して解釈されるものではない。なお、本実施の形態及び実施例で参照する図面において、同一部分又は同様な機能を有する部分には同一の符号を付し、その繰り返しの説明は省略する。

（１．バイオセンサの構造）
本発明の実施形態に係るバイオセンサ１０００の電極構造について説明する。図１は本発明の実施形態に係るバイオセンサ１０００の一例を示す模式図である。図１（ａ）はバイオセンサ１０００の全体図を示し、説明の便宜上、第２の基材１１００及び第３の基材１２００を透過させた透視図としている。また、図１（ｂ）はバイオセンサ１０００の分解図である。図２は本発明の実施形態に係るバイオセンサ１０００の電極系１００について説明する図であり、図２（ａ）は電極系１００の上面の斜視図であり、図２（ｂ）は図２（ａ）におけるＡ−Ａ’断面図を示す。

本実施形態に係るバイオセンサ１０００は、第１の基材１７０と、第１基材１７０の第１の面上（上面）に配置された金属層１０１と、金属層１０１の一端上に配設されたカーボンを含む第１の電極層１０３と、第１の電極層１０３を覆うように配設されたカーボンを含む第２の電極層１０５と、第２の電極層１０５上に位置するように配設された反応部１４０とを備える。本実施形態において、第１の電極層１０３は第２の電極層１０５よりも吸水率が低い（疎水性が高い）第１の樹脂を含む。第１の樹脂を含むことにより第１の電極層の耐水性を向上させることができる。このような２層構造のカーボンを含む電極層（第１の電極層１０３と第２の電極層１０５）と、金属層１０１とにより形成される作用極１１０、対極１２０及び参照極１３０により電極系１００が構成される。

一方、図６に示す従来のバイオセンサにおける電極系９００においては、カーボンを含む電極層９０７を金属層１０１上に１層配置したのみであった。このような構造を有する従来のバイオセンサにおいては、カーボンを含む電極層９０７が十分な耐腐食性を備えていなかったため、製造してから使用するまでの期間に金属層１０１の腐食を抑制するのが困難であった。また、測定時には、試料中の水分や電子受容体（メディエータ）がカーボンを含む電極層９０７に存在する空隙から電極内部に侵入し、酸化還元反応によりカーボンを含む電極層９０７の下に配設された金属層１０１（または配線）を腐食して、バイオセンサの電気特性を低下させていた。

本実施形態に係るバイオセンサ１０００は、電極系１００及び配線部１５０の上部に、試料供給路１５１０を形成するためのスペーサである第２の基材１１００、試料供給路１５１０の上部カバーである第３の基材１２００が第２の基材を覆うように、順次に積層され、固着される。作用極１１０には第２の電極層１０５の上部表面の一部に反応部１４０がさらに形成される。

電極系１００及び配線部１５０の上部に形成された第２の基材１１００は、作用極１１０の反応部１４０、対極１２０及び参照極１３０の第２の電極層１０５の上部に、例えば第２の基材１１００の外縁に通じるＴ字状の流路を形成するように配置する。Ｔ字状の流路は、作用極１１０の反応部１４０、対極１２０及び参照極１３０の第２の電極層１０５の上部に直線上に配置された空気抜き流路１５３０と、空気抜き流路１５３０に直交し、作用極１１０の反応部１４０の上部を通過する試料供給路１５１０とにより形成される。バイオセンサ１０００は、試料供給路１５１０と、空気抜き流路１５３０とを有することで、試料供給路１５１０から毛細管現象を利用し、測定する試料を作用極１１０、対極１２０及び参照極１３０の上部を通過させ、試料の目的成分を測定することができる。

電極系１００において、金属層１０１が第１の基材１７０の第１の面上（上面）に配置される。本実施形態に係るバイオセンサの電極系１００においては、金属層１０１と配線部１５０とが一体で構成され、金属層１０１の少なくとも一部に第１の電極層１０３と第２の電極層１０５を積層して配置したことに特徴がある。吸水率が低い（疎水性を有する）第１の樹脂を含む第１の電極層１０３を配設することにより、金属層１０１の腐食を抑制することができる。なお、本実施形態において、第１の電極層１０３及び第２の電極層１０５は、金属層１０１の側面も被覆しているが、第１の電極層１０３及び第２の電極層１０５を金属層１０１の上部表面のみに形成してもよい。

（基材）
第１の基材１７０は、電極系１００を支持する基材であり、少なくとも電極系１００が配置される面は絶縁性を有する。第１の基材１７０は剛性の高い基材であることが好ましく、例えば、樹脂基材、セラミック基材、ガラス基材、少なくとも表面が絶縁された半導体基材や金属基材などを用いることができる。第１の基材１７０は、これら材料に応じて測定時の取り扱い性能に十分な強度を実現可能な充分な厚さを設定するとよい。第１の基材１７０としては、ＰＥＴ製の基材を用いることが好ましい。ＰＥＴを用いることで安価にバイオセンサを作製することができるからである。第１の基材１０の厚さは、例えば、６μｍ以上１ｍｍ以下の範囲で適宜設定するとよい。

（電極系）
電極系１００は、作用極１１０、対極１２０及び参照極１３０を含み、作用極１１０は還元体の電子受容体に電圧を印加するための一方の電極である。対極１２０は電子受容体から作用極１１０に放出された電子によって流れた電流を計測するための一方の電極である。また、参照極１３０は、作用極１１０の電位を決定する際の基準となる電極である。各電極は第１の基材１７０上に配置された金属層１０１と金属層１０１の表面に配置された第１の電極層１０３と、第１の電極層１０３を覆うように配設されたカーボンを含む第２の電極層１０５を備える。本実施形態では、反応部１４０を作用極１１０の上部表面に直接配置した態様を用いて説明しているが、反応部１４０は空間を介して作用極１１０に対向するように配置されてもよい。

（金属層）
本実施形態に係る金属層１０１は、導電性の高い金属を含む層である。金属層１０１には、例えば、アルミニウム、鉄、ニッケル、クロム、チタン、タンタルまたは銀等を用いることができる。これらの金属には、後述する電子受容体の酸化還元反応による腐食を受けやすい金属も含まれるが、本発明に係る２層構造のカーボンを含む電極層を備えることにより、十分な防食効果を得ることができる。このような防食効果を得られること、導電性や製造コストを考慮すると、本実施形態においてはアルミニウムを好適に用いることができる。

金属層１０１の厚さは０．０２μｍ以上４０μｍ以下の範囲とすることが好ましい。厚さ０．０２μｍ未満であると金属層１０１の抵抗値が十分高くなり目的とする電極が得られなくなり、また４０μｍより大きくなると第１の電極層１０３及び第２の電極層１０５との積層や、試料供給路１５１０及び空気抜き流路１５３０の形成に三次元的な高い加工精度が要求され、加工金型の使用数や加工工程・時間が飛躍的に増える。金属層１０１は上記の金属材料からなる金属層の単層であってもよく、複数の金属層を積層した態様であってもよい。本実施形態に係る金属層１０１は、金属ペーストの印刷、金属箔のエッチング、金属の蒸着やスパッタ製膜の何れの方法を用いて形成してもよい。本実施形態に係る金属層１０１は、使用する金属量を減らして製造コストを抑制する観点から、金属箔のエッチングまたは金属の蒸着により形成することが好ましい。

（第１の電極層）
本実施形態に係る第１の電極層１０３は、水、薬品などに対して耐性を発現する電極層であり、第２の電極層１０５よりも吸水率が低い第１の樹脂を含む。第１の電極層１０３の吸水率は、０．１％以下であることが好ましい。吸水率は、ＪＩＳ Ｋ７２０９（プラスチックの吸水率試験方法）に準拠して測定するとよい。第１の電極層１０３は、導電性を有する材料で形成した被覆層であり、金属層１０１の表面保護を行うとともに、電極の一部として機能するものである。第１の電極層１０３は例えば、カーボン顔料と疎水性を有する第１の樹脂の混合物により形成することができる。第１の電極層１０３に用いるカーボン顔料としては、例えば、黒鉛、アモルファスカーボン、ダイヤモンドライクカーボン、カーボンファイバー、カーボンブラック、アセチレンブラック、ケッチェンブラック（登録商標）、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、カーボンナノファイバー等を用いることができる。

上述したような吸水率が低い疎水性を有する第１の樹脂としては、塩化ビニルと酢酸ビニルの共重合体、塩化酢酸ビニル樹脂、エチレン酢酸ビニル共重合体、エチレン酢酸ビニル樹脂、エチレン酢酸ビニル塩化ビニルグラフト共重合体から選択されるいずれか１種以上を用いることができる。これらの樹脂は吸水率が低く防湿性が高いので、第１の電極層１０３に耐薬品性、耐水性を付与し、金属層１０１の防食効果を得ることができる。第１の電極層１０３における「耐薬品性」とは、後述する反応部１４０に塗布されるメディェータや、試料中の成分、または金属層１０１を酸化したり、腐食したりする化学物質等に対する耐性を意味する。

本実施形態に係る第１の電極層１０３においては、カーボン顔料、第１の樹脂はそれぞれ５重量％以上６０重量％以下、１０重量％以上４０重量％以下とすることが好ましい。カーボン顔料が５重量％未満であるとカーボン顔料同士が電気的接続を有する確率が急激に低下して電極層としての導電性が失われる。また、カーボン顔料が６０重量％より多いと顔料間の空隙が多くなり、物理的な賦型強度、接着強度、耐摩擦強度が失われて、要求される構造・機能が保持できなくなる。さらに、カーボン表面の酸化還元状態が安定せず、後工程で添加する酵素や電子受容体も空隙に不均一に吸着するようになる。また、第１の樹脂が１０重量％未満であると、第１の電極層１０３の塗工特性が低下して塗膜強度も低下することとなり、４０重量％より多いと、同様に第１の電極層１０３の塗工特性が低下して導電性も低下することとなる。なお、第１の電極層１０３には、必要に応じて他の導電性顔料、硬化剤や架橋剤のような反応試薬、加工適性改善のための助剤や添加剤等をカーボン顔料と第１の樹脂とに混合してもよい。

第１の電極層１０３の厚さは０．１μｍ以上１０μｍ以下の範囲とすることが好ましく、より好ましくは０．３μｍ以上２．０μｍ以下である。第１の電極層１０３は、導電カーボン顔料比が高く、０．１μｍ未満であると耐水性及び耐薬品性の効果が低くなる。また、導電カーボン顔料比が低く、１０μｍより厚いとカーボン層の抵抗が高くなる。本実施形態に係る第１の電極層１０３は、カーボン顔料で金属層１０１を被覆することで、金属層１０１の防錆に寄与し、酵素や電子受容体、試料中や空気中の水分と金属層１０１との直接の接触を防止することができる。

（第２の電極層）
第２の電極層１０５は、導電性を有する材料で第１の電極層１０３を覆うように配設された形成した被覆層であり、電極の一部として機能するものである。第２の電極層１０５は、酵素やメディェータを溶解した水性溶液への親和性を高め、表面を保護する電極であることが好ましい。第２の電極層１０５は例えば、カーボン顔料と第２の樹脂の混合物により形成することができる。第２の電極層１０５に用いるカーボン顔料としては、第１の電極層に用いたものと同様のものを用いることができる。

第２の樹脂には、第１の樹脂よりも疎水性が低く（または親水性が高く）、水不溶性の樹脂を好適に用いることができる例えば、アクリル樹脂、スチレン樹脂、アセタール樹脂、ポリビニルアセタール樹脂から選択されるいずれか１種以上を用いることができる。アクリル樹脂、スチレン樹脂は側鎖の親水性で適宜、親水性の度合いが変えられ、ポリビニルアセタール樹脂はアセタール化度を変えることで同等に目的の親水性が得られる。また、ポリビニルアセタール樹脂、特にブチラール樹脂はフェノール樹脂やエポキシ樹脂、メラミン樹脂等を添加して架橋反応を起こすことで塗膜強度が上がるため、印刷物の擦れやキズにも強く、電極として第２の電極層を最表面に位置させる場合には特に好適である。この架橋反応を補助する目的でイソシアネートやジアルデヒド等の硬化剤を併用することも可能である。第１の樹脂よりも親水性の高い上記の樹脂を用いることで、第１の電極層よりも水性の液体に対する接触角が低く濡れ性が高い第２の電極層を得ることができる。第２の電極層１０５の吸水率は、０．２％以上であることが好ましい。

第２の電極層の濡れ性が高いので、反応部へ酵素やメディェータを溶解した水性溶液をディスペンサーやインクジェット、マスク転写、謄写印刷等で塗布する際に均一な塗面が得られる。親水性の程度は、使用する塗布液や塗布プロセスに応じて適宜設定される。

本実施形態に係る第２の電極層１０５においては、カーボン顔料、第２の樹脂はそれぞれ５重量％以上６０重量％以下、１０重量％以上４０重量％以下とすることが好ましい。カーボン顔料が５重量％未満であるとカーボン顔料同士が電気的接続を有する確率が急激に低下して電極層としての導電性が失われる。また、カーボン顔料が６０重量％より多いと顔料間の空隙が多くなり、物理的な賦型強度、接着強度、耐摩擦強度が失われて、要求される構造・機能が保持できなくなる。さらに、カーボン表面の酸化還元状態が安定せず、後工程で添加する酵素や電子受容体も空隙に不均一に吸着するようになる。また、第２の樹脂が１０重量％未満であると、第２の電極層１０５の塗工特性が低下して塗膜強度も低下することとなり、４０重量％より多いと、同様に第２の電極層１０５の塗工特性が低下して導電性も低下することとなる。なお、第２の電極層１０５には、必要に応じて他の導電性顔料、硬化剤や架橋剤のような反応試薬、加工適性改善のための助剤や添加剤等をカーボン顔料と有機バインダーとに混合してもよい。また、第２の電極層１０５の表面に機械的研磨やコロナ・プラズマのような放電手法による物理的エッチング等を施して、表面の活性化を向上させてもよい。

第２の電極層１０５の厚さは０．１μｍ以上１０μｍ以下の範囲とすることが好ましく、より好ましくは０．３μｍ以上２．０μｍ以下である。第２の電極層１０５は、導電カーボン顔料比が高く、０．１μｍ未満であると反応部１４０との隔絶が製造、保管、酵素反応の各条件、経時安定を保証する上で困難となる。また、導電カーボン顔料比が低く、１０μｍより厚いとカーボン層の抵抗が高くなる。本実施形態に係る第２の電極層１０５は、第１の電極層１０３を被覆することで、反応部１４０に含有される電子受容体に対する親和性を付与し、試料中に含まれる被検出物と酵素との反応により生じた電気信号を、電子受容体を介して第１の電極層１０３に伝達しやすくすることができる。抵抗の低い電極系を得るには、より好ましくは、第２の電極層１０５の厚さを、第１の電極層１０３の厚さよりも大きくするとよい。さらに好ましくは、第２の電極層１０５の厚さを、第１の電極層１０３の厚さの１．５倍以上とするとよい。

後述するバイオセンサ１０００の反応部１４０はフェリシアン化カリウム、ベンゾキノン化合物、オスミューム錯体、フェロセン誘導体、フェナジンメトサルフェート等酸化還元酵素で分解、放出した電子で還元されやすい化学物質を含むため、保存環境での金属の腐食やポテンシォスタットで電圧印荷した時の副反応が懸念される。このため、従来の金属層は反応部に対して耐水・絶縁されていた。本発明においては、第２の樹脂を含む第２の電極層までは反応に寄与する化学物質が浸透して電子伝達するが、耐水性を有する第１の樹脂を含む第１の電極層は電子伝達のみに寄与し、金属層への腐食、副反応は生じない。

作用極１１０、対極１２０、参照極１３０にはそれぞれ金属層１０１により形成された配線部１５０が電気的に接続されており、電極系１００と配線部１５０とは一体で構成されている。配線部１５０により電極系１００への電圧印加、電気信号の取り出しを行うことができる。作用極１１０、対極１２０を炭素よりも低抵抗の金属材料と炭素材料との積層構造とすることにより、従来に比べて電極系１００の抵抗値を大幅に下げることができ、高感度のバイオセンサを提供することができる。また、配線部１５０と電極系１００を一体的に構成することにより、さらに高感度のバイオセンサを提供することができる。さらに参照極１３０に貴金属を用いる必要がないため、製造コストを低減することができる。

（反応部）
本実施形態において、反応部１４０は生体由来物質を含み、基質特異的な物質の変化移動に伴う、化学ポテンシャル、熱あるいは光学的な変化を電気信号へ変換する。反応部１４０は、生体由来物質として、例えば、酵素と電子受容体とを含む。グルコース濃度を測定する場合には、酵素としてグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を用いることができる。電子受容体はフェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体、オスミューム誘導体等を用いることができる。酵素と電子受容体は、適宜溶媒で希釈して用いる。本実施形態に係る溶媒としては、例えば、水、アルコール、水−アルコール混合溶媒がある。また、直鎖、環状の炭化水素貧溶媒に均一分散させてもよい。酵素と電子受容体とをそれぞれ１試験体当り０．３ユニット以上１０ユニット以下と０．５μｇ以上２００μｇ以下とすることが好ましい。グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼは、純度の高いものが好ましく、上述の範囲の活性を有するものであれば、特に由来となる生物種は限定されず、例えば、グルコースオキシダーゼとしては、東洋紡社製ＧＬＯ−２０１を用いることができる。反応部１４０の酵素及び電子受容体は、酵素量（力価／ユニット）に準じた反応量が得られるが、反応部１４０の性能を担保する最適重量部の小過剰でよい。

また、反応部１４０は、その面積に比例した検出電流が得られるため、可能な範囲で広く設定することが好ましい。反応部１４０は親水性高分子と混合したり、あるいは親水性高分子及び界面活性剤と混合したりして構成してもよい。親水性高分子としては、カルボキシルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニル酢酸、ポリビニルブチラール等、またはこれらの混合物を用いることができる。親水性高分子と混合すると、血液はゲル状となり応答電流値は若干低下するが、赤血球や他のタンパク質などのセンサ応答への影響を低減することができる。界面活性剤を含有させると粘度の高い試料液であっても、センサの内部へ試料液を容易に導くことができるので、好ましい。反応部１４０に用いる界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、若しくはポリエチレングリコール類等が挙げられる。反応部１４０を形成する場合、酵素は４０℃以上で長時間放置すると活性を失うため、溶媒の乾燥は４０℃以下で行い、乾燥後は速やかに室温にもどすことが好ましい。

なお、本実施形態においては、反応部１４０を第２の電極層１０５の上面に配置した例を示したが、本実施形態に係るバイオセンサ１０００はこれに限定されるものではなく、反応部１４０は、第２の電極層１０５の上層であれば、他の位置でもよく、第２の基材１１００と第３の基材１２００との間に配設されてもよい。

（第２の基材）
第２の基材１１００は、第１の基材１７０と第３の基材１２００との間に間隙を設け、外部からバイオセンサ１０００へ試料供給を行うための流路を設けるための基材である。第２の基材１１００には少なくとも１つの試料供給路１５１０を形成する。試料供給路１５１０は、第２の基材１１００を水平方向に貫通して設けられた流路であり、外部から供給される試料を作用極１１０に導く。第２の基材１１００は、剛体であってもよく、弾性体であってもよい。中でも電気絶縁性を有する弾性体を用いることが好ましく、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリスチレン（ＰＳ）樹脂、ポリプロピレン（ＰＰ）樹脂等のフィルムを好適に用いることができる。

試料供給路１５１０の幅は０．５ｍｍ以上５ｍｍ以下の範囲とすることが好ましい。試料供給路１５１０の幅が０．５ｍｍ未満であると、流路への毛細管現象によるに安定した試料供給がされなくなる。また、反応部１４０の電極面積を広く取れないため、感度が低くなる。また５ｍｍより大きくなると、バイオセンサ１０００を第１の基材１７０の電極系１００形成面に対して垂直に切断した際、試料供給路１５１０の幅の中心線へ向かって第１の基材及び第３の基材がアーチ状につぶれ、試料供給路１５１０内の容積が変化し易くなる。試料供給路１５１０の幅は、全体にわたって均一の幅であってもよいし、第２の基材１１００の試料供給路１５１０の導入部である外縁に向かって、幅が広くなるような形状であってもよい。

第２の基材１１００はさらに試料供給路１５１０とは別の空気抜き流路１５３０を備えていてもよい。本実施形態に係るバイオセンサ１０００において、空気抜き流路１５３０は、試料供給路１５１０に接続され、試料供給路１５１０と空気抜き流路１５３０とを合わせてＴ字状の流路を構成している。このような構成とすることで、外部から試料が供給された場合に、試料供給路１５１０内の空気が逃げる空気抜き流路１５３０が機能する。空気抜き流路１５３０の幅は、０．３ｍｍ以上１０ｍｍ以下の範囲とすることが好ましい。空気抜き流路１５３０の幅が０．３ｍｍ未満であると接着剤や基材のバリが空気抜きの邪魔となり、また１０ｍｍより大きくなると基材が変形した際、隣接する供給路にも変形がおよび供給路容積の変動要因となる。第２の基材１１００の厚さは、試料供給路１５１０及び空気抜き流路１５３０の高さとなり、１５μｍ以上５００μｍ以下の範囲とすることが好ましい。第２の基材１１００の厚さが１５μｍ未満であると基材の凹凸の影響で容積変化が生じ易く、毛細管現象による試料供給も安定しなくなる。また５００μｍより大きくなると反応部１４０に均一に試料が流れず、反応部１４０の一部に試料が流れない可能性が出てくる。

なお、本実施形態においてはＴ字状の流路を例示したが、本発明に係るバイオセンサはこれに限定されるものではなく、第２の基材１１００に試料を導入する「Ｕ」の字状の切欠部を備えた試料供給路を形成し、第２の基材１１００の切欠部に対応する位置に貫通孔を備えた第３の基材１２００を配設してもよい。

（第３の基材）
第３の基材１２００は、蓋材として機能する基材である。第３の基材１２００は例えば、樹脂基材、セラミック基材、ガラス基材、半導体基材、金属基材などを用いることができる。第１の基材１２００は、剛体であってもよく、あるいは弾性体であってもよい。中でも電気絶縁性の弾性体を用いることが好ましく、例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリスチレン（ＰＳ）樹脂、ポリプロピレン（ＰＰ）樹脂等のフィルムを好適に用いることができる。第３の基材１２００の形状は、第１の基材１７０に合わせて採用されるが、配線部１５０が露出するように一部に切欠部を有している。

（接着層）
図４に示すように、第２の基材１１００の下部表面には、接着層１８５ａが形成される。また、第２の基材１１００と第３の基材１２００とを貼り合わせるために、第２の基材１１００の上部表面に接着層１８５ｂをさらに形成する。接着層１８５ｂは、第３の基材１２００の下部表面に形成してもよい。接着層１８５ａ及び接着層１８５ｂの材料としては、例えば、合成接着剤としてはアクリル系接着剤、エステル系接着剤、ビニル系接着剤、シリコン系接着剤等、天然接着剤としてはニカワ、天然ゴム、樹液等の澱粉のり・天然高分子等を用いることができる。接着層１８５ａ及び接着層１８５ｂの厚さは、３μｍ以上５０μｍ以下が好ましい。接着層１８５ａは、金属層１０１、第２の電極層１０５及び反応部１４０を合わせた厚さ以上、例えば２０μｍ程度で形成すると、第２の基材１１００と第１の基材１７０とが接着層１８５ａを介して密着され、試料供給路１５１０から供給される試料が配線部１５０に流入するのを防御することができる。また、第１の基材１７０と接着層１８５ａとが密着していることで、配線部１５０の金属層１０１の防錆を実現することができる。

第３の基材１２００は、接着層１８５ｂを介して第２の基材１１００に固着し、第１の基材１７０に固着する。第３の基材１２００の下部表面に接着層１８５ｂを形成することで、第２の基材１１００、対極１２０及び参照極１３０を接着層１８５ｂで包埋するようにしてもよい。また、本実施形態に係る金属層１０１は、金属箔のエッチングまたは金属の蒸着により形成する場合に、第１の基材１７０の上部表面にドライラミネート用接着剤を塗布して形成した接着層を介して固着してもよい。このような接着層には、ポリエステル系の２液硬化接着剤等を用いることができる。

また、本発明の実施形態に係るバイオセンサ１０００は反応部１４０の酵素を変更することで、グルコースセンサのみならず、コレステロールセンサ、アルコールセンサ、スクロールセンサ、乳酸センサ、フルクトースセンサなどの酵素に関与する反応系に広く用いることができる。各バイオセンサに用いる酵素としてはコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ等の反応系に合ったものを適宜用いることができる。

（バイオセンサの製造方法）
次に図３及び図４を用いて上述の実施形態において説明したバイオセンサ１０００の製造方法について説明する。図３（ａ）〜図４（ｄ）はバイオセンサ１０００の製造過程を示し、図２（ａ）のＡ−Ａ’断面に相当する図である。また、図４（ｅ）は、図２（ａ）のＢ−Ｂ’断面に相当する図である。

（電極系の製造工程）
第１の基材１７０の第１の面上（上面）に、所定のパターンを有する金属層を形成する（図３（ａ））。本実施形態に係る金属層１０１は、金属箔のエッチングまたは金属の蒸着で形成するのが好ましい。金属箔のエッチングまたは金属の蒸着で形成すると、従来の銀ペーストを印刷するよりも、厚さを均一にすることができ、金属層１０１の幅を均一にすることができる。金属箔のエッチングまたは金属の蒸着で形成することにより、金属層１０１は、従来の銀ペーストによる電極層に比して薄く形成することができるため、電極層の抵抗を抑え、感度を高めることができる。また、上述の材料を用いることで、金属層１０１の表面処理を行うことなく、カーボンを含む第１の電極層１０３を形成することができる。

金属層１０１の所定部分に、導電性カーボンと第１の樹脂とを含有する第１の塗工液を印刷法により塗布する（図３（ｂ））。ピンホールの発生を防ぐために、第１の塗工液は少なくとも複数回塗布することが好ましい。これにより金属層１０１の少なくとも上面を被覆する第１の電極層１０３を形成する。より好ましくは第１の電極層１０３で金属層１０１の上面及び側面を被覆する。

第１の電極層１０３を所定の時間乾燥させた後に、第１の電極層１０３上に位置するように、カーボンと、第２の樹脂とを含有する第２の塗工液を塗布する（図３（ｃ））。ピンホールの発生を防ぐために、第２の塗工液は少なくとも複数回塗布することが好ましい。これにより第１の電極層１０３の少なくとも上面を被覆する第２の電極層１０５を形成する。より好ましくは第２の電極層１０５で第１の電極層１０３の上面及び側面を被覆する。

このように形成した電極の１つの第２の電極層１０５の上面に、酵素及び電子受容体を含む溶液をディスペンサーで塗布した後、４０℃で乾燥させ、溶媒成分を除去する。このようにして、作用電極１１０を形成し（図３（ｄ））、電極系１００を製造する。

なお、第１の塗工液は、第１の樹脂を溶解するための第１の溶剤を含有する。また、第２の塗工液は、第２の樹脂を溶解するための第２の溶剤を含有する。同系統の溶剤を含有する塗工液を重ね塗りすると、侵食による亀裂やトラッピングなどの不具合が発生しやすくなる。この為、例えば、第１の樹脂としてケトン系に溶解する樹脂を選択し、親水性の第２の樹脂としてアルコール系に溶解する樹脂にする。ケトン系の溶剤を含む第１の塗工液を塗布・乾燥して第１の電極層１０３を形成し、第１の電極層１０３に含まれる第１の樹脂が溶解しないアルコール系の溶剤を含む第２の塗工液を塗布・乾燥して第２の電極層１０５を形成することにより、第１の電極層１０３を侵食することなく形成することが出来る。

（第２の基材の製造工程）
図４（ａ）〜図４（ｄ）は、第２の基材１１００及び第３の基材１２００を形成し、第１の基材１７０上に形成した電極系１００を貼付し、バイオセンサ１０００を製造する工程を示す図である。第２の基材１１００の第１の基材１７０及び電極系１００を貼付する面と、第３の基材１２００を貼付する面とに、接着層１８５を形成する（図４（ａ））。上面及び下面の両面に接着層１８５が形成された基材１１００に打ち抜き加工を施し、試料供給路１５１０及び空気抜き流路１５３０を形成して第２の基材１１００を製造する（図４（ｂ））。

（第３の基材の製造工程）
基材１２００に所定の打ち抜き加工を施し、配線部１５０の少なくとも一部が露出する切欠部を形成して、第３の基材１２００を製造する。

（貼合工程）
第２の基材１１００の一方の面に第３の基材１２００を貼合する（図４（ｃ））。その後、第２の基材１１００の他方の面に、第２の基材１１００と電極系１００が対向するように配置して第１の基材１７０を貼合する（図４（ｄ）及び（ｅ））。図４（ｄ）は図２（ａ）のＡ−Ａ’断面に相当する図であり、試料供給路１５１０及び空気抜き流路１５３０が形成され、Ａ−Ａ’断面では、空気抜き流路１５３０が外部へ開口している。図４（ｅ）は図２（ａ）のＢ−Ｂ’断面に相当する図であり、第１の基材１７０と第２の基材１１００の両端部は、接着層１８５ａで貼付される。なお、貼合の順序は第２の基材１１００と第１の基材１７０を貼合してから、第２の基材１１００に第３の基材１２００を貼合してもよい。

（断裁工程）
上述の工程は多面付けで行われ、貼合が完了した後、断裁して個々のバイオセンサ１０００を得る。

以上説明したように、本実施形態に係るバイオセンサの製造方法によると、金属層の一端上にカーボンと、第１の樹脂とを含む第１の塗工液を塗布して第１の電極層を形成し、第１の電極層上に位置するように、カーボンと、第２の樹脂とを含有する第２の塗工液を塗布して第２の電極層を形成し、第１の樹脂は第２の樹脂よりも疎水性が高いことにより、試料中の水分や反応部に含まれる電子受容体が第２の電極層内部に侵入するのを抑制し、電子受容体の酸化還元反応により第２の電極層の下に配設された金属層を腐食するのを抑制することができる。

（測定装置）
図５は、本発明の一実施形態に係るバイオセンサ１０００と測定装置１００００に接続した様子を示す模式図であり、図５（ａ）は全体図である。測定装置１００００は、公知の測定装置であって、本発明に係るバイオセンサ１０００を接続して、試料中に含まれる被検出物を検出する装置である。測定装置１００００は、例えば、バイオセンサ１０００で生じた電気信号を受信するための接続電極１３０００、演算部（図示せず）、電源（図示せず）、表示部１１０００及び操作部１２０００を備える。

図５（ｂ）は、図５（ａ）のバイオセンサ１０００を接続した破線部における測定装置１００００の内部を説明する図である。バイオセンサ１０００は、測定装置１００００の装着部に装着されると、バイオセンサ１０００の３つの金属配線１０１の端部が測定装置１００００の接続電極１３００にそれぞれ接続する。この接続により、バイオセンサ１０００で生じた電気信号は、測定装置１００００に伝達される。なお、第１の基材１７０に２本の金属層１０１を配設して、一方に作用極２１を、他方に対極２３及び参照極２５を別々に配設した場合は、測定装置１００００の接続電極は２本となる。

測定方法としては、例えば、測定者がバイオセンサ１０００を測定装置１００００に装着し、バイオセンサ１０００の先端から第２の基材１１００に設けられた試料供給路１５１０に試料を導入し、操作部１２０００を操作して、測定を開始する。試料供給路１５１０に導入された試料に被検出物が含まれる場合は、被検出物と、反応部１４０に配設された生体由来物質とが反応し、電気信号がバイオセンサ１０００の第２の電極層１０５で検出され、第１の電極層１０３を介して金属層１０１の端部から、測定装置１００００の接続電極１３０００を介して、測定装置１００００に伝達される。測定装置１００００は、バイオセンサ１０００から受信した電気信号を演算部で測定値に変換する。得られた測定値は、表示部１１０００に表示され、測定者は測定結果を視覚的に認識することができる。

以下の実施例に、上述した実施形態において説明した本発明に係るバイオセンサ１０００の一例を具体的に説明する。

（実施例１）
厚さ１００μｍのＰＥＴフィルム（東レ社製ルミラー）の基板の上部表面に、ドライラミネート剤を用いて接着層を形成した。接着層を介して厚さ７μｍのアルミニウムフィルム（東洋アルミ社製）を貼り合せた。アルミニウムフィルムの表面に１．５ｍｍ幅の線状のレジストパターンを印刷法で形成した。揺動式の塩酸槽（２Ｎ）にレジストパターンを形成した上記の積層フィルムを浸漬させてアルミニウムをエッチングした。水洗を行った後、水酸化ナトリウム槽（０．５Ｎ）に積層フィルムを浸漬させてレジストパターンを剥離した。その後、再度水洗を行った後、金属層１０１を形成した。

金属層１０１の１．５ｍｍ幅のアルミパターンにグラビア印刷用製版９０線で幅２．１ｍｍ、長さ３ｍｍインキ転写パターンを作製し、基材の幅方向センター合せで左右０．３ｍｍ程度被る状態にアライメントして、カーボン顔料としてカーボンブラックを含み、第１の樹脂として塩化ビニルと酢酸ビニルの共重合体を含み、第１の溶剤として酢酸エチル、メチルエチルケトン（１：１）を含むカーボングラビアインキ（ＦＤＫ導電墨インキ、合同インキ社製）を第１の塗工液として印刷し、１２０℃で１０分間乾燥して、第１の電極層１０３を形成した。ここで、グラビア印刷用製版の線数は、グラビア版１インチに刻まれた線数を意味し、線数が多い設定ほど刻まれた溝の深さは浅くなり、インキの転写量は少なくなる。したがって、同じ濃度のインキを異なる線数の版で転写すると、インキの塗膜厚は線数の少ないものほど大きくなる。実施例１においては、カーボン被覆により形成した第１の電極層１０３とアルミパターンの金属層１０１の表面の厚さの差から第１の電極層１０３は０．７μｍ厚であった。

第１の電極層１０３の上に同一のグラビア印刷用製版、同一のアライメントで、カーボン顔料としてカーボンブラックを含み、第２の樹脂としてブチラール樹脂を含み、第２の溶剤としてトルエン、イソプロピルアルコール、メチルエチルケトン（６０：２５：１５）を含むカーボングラビアインキ（処理ＰＥＴ用導電墨インキ、合同インキ社製）を第２の塗工液として印刷し、１２０℃で１０分間乾燥して、第２の電極層１０５を形成した。カーボン被覆により形成した第１の電極層１０３及び第２の電極層１０５とアルミパターンの金属層１０１の表面の厚さの差から第２の電極層１０５は１．２μｍ厚であった。金属層１０１の長手方向に対して、第１の電極層１０３及び第２の電極層１０５の先端からアルミニウム剥き出し部分の金属層１０１の長さの総計が３３ｍｍになるよう切り出し、第１の電極層１０３及び第２の電極層１０５の先端から３０ｍｍ離れた金属層１０１との間の抵抗値を測定したところ、１５Ωであった。

（比較例１）
比較例１として、実施例１と同様に金属層１０１を形成した。金属層１０１の１．５ｍｍ幅のアルミパターンにグラビア印刷用製版５０線で幅２．１ｍｍ、長さ３ｍｍインキ転写パターンを作製し、基材の幅方向センター合せで左右０．３ｍｍ程度被る状態にアライメントして、実施例１の第２の塗工液と同様のカーボングラビアインキ（処理ＰＥＴ用導電墨インキ、合同インキ社製）を印刷し、１２０℃で１０分間乾燥してカーボンを含む電極層９０７を形成した。カーボン被覆により形成したカーボンを含む電極層９０７とアルミパターンの金属層１０１の表面の厚さの差からカーボンを含む電極層９０７は２μｍ厚であった。金属層１０１の長手方向に対して、カーボンを含む電極層９０７の先端からアルミニウム剥き出し部分の金属層１０１の長さの総計が３３ｍｍになるよう切り出し、カーボンを含む電極層９０７の先端から３０ｍｍ離れた金属層１０１との間の抵抗値を測定したところ、２０Ωであった。

（比較例２）
比較例１と同様に金属層１０１の１．５ｍｍ幅のアルミパターンにグラビア印刷用製版８０線で幅２．１ｍｍ、長さ３ｍｍインキ転写パターンを作製し、基材の幅方向センター合せで左右０．３ｍｍ程度被る状態にアライメントして、実施例１の第２の塗工液と同様のカーボングラビアインキ（処理ＰＥＴ用導電墨インキ、合同インキ社製）を印刷し、１２０℃で１０分間乾燥してカーボンを含む電極層９０７を形成した。カーボン被覆により形成したカーボンを含む電極層９０７とアルミパターンの金属層１０１の表面の厚さの差からカーボンを含む電極層９０７は１μｍ厚であった。金属層１０１の長手方向に対して、カーボンを含む電極層９０７の先端からアルミニウム剥き出し部分の金属層１０１の長さの総計が３３ｍｍになるよう切り出し、カーボンを含む電極層９０７の先端から３０ｍｍ離れた金属層１０１との間の抵抗値を測定したところ、１３Ωであった。

（耐水性・耐薬品性の評価）
以上のようにして得た実施例１、比較例１及び比較例２の電極を用いて、作用極、対極及び参照極をそれぞれ２．４ｍｍピッチになるように配し、長さ３ｍｍの電極層の先端部分の２．４ｍｍを残し、上下０．３ｍｍを耐水性粘着テープでマスクした。この２．４ｍｍ幅のマスク間に酵素としてグルコースオキシダーゼ（東洋紡社製ＧＬＯ−２０１）を１ユニット、電子受容体としてフェリシアン化カリウム７０μｇを蒸留水２μＬに溶解し、均一に滴下して作用極を作製した。これを室温で４時間乾燥した後、乾燥剤の入った密栓ガラス瓶に１日保管し、標準酵素電極とした。また、この密栓ガラスを４０℃で２ヶ月保管したものを耐水性、耐薬品性の比較酵素電極とした。酵素電極の評価はポテンシオスタット（エービーエス社製ＡＬＤ７６０）の作用極、対極、参照極に配線し、０．５Ｖ電圧印加で被検体２．５μＬ滴下後２秒後の電流を検出した。なお、被検体は生理食塩水にグルコースを１００ｍｇ／ｄＬの濃度に調製した人工標準グルコース液を用いた。

実施例１においては、標準酵素電極、比較酵素電極はともに１０個とも電流が検出された。一方、比較例１の標準酵素電極では１０個とも電流が検出されたが、比較酵素電極では１０個中２個で電流が消失した。また、比較例２の標準酵素電極では１０個中、３個電流が消失し、比較酵素電極では１０個全てで電流が消失した。これらの結果から、比較例においては、金属層が酸化や腐食により劣化し、カーボン電極層との界面での電気抵抗が増大したものと推察される。一方、本実施例に係る２層のカーボン電極層を備えたバイオセンサの酵素電極では、製造直後、及び２ヶ月の長期保管後においても金属層の腐食を抑制し、良好な電気特性を得られることが明らかとなった。

１００：電極系、１０１：金属層、１０３：第１の電極層、１０５：第２の電極層１０５、１１０：作用極、１２０：対極、１３０：参照極、１４０：酵素反応部、１５０：配線部、１７０：第１の基材、１８５ａ：接着層、１８５ｂ：接着層、９００：従来の電極系、９０７：カーボンを含む電極層、９１０：作用極、９２０：対極、９３０：参照極、９４０：酵素反応部、１０００：バイオセンサ、１１００：第２の基材、１２００：第３の基材、１５１０：試料供給路、１５３０：空気抜き流路、１００００：測定装置、１１０００：表示部、１２０００：操作部、接続電極１３０００

Claims (4)

1. 第１の基材と、
   前記第１基材の第１の面上に配置された金属層と、
   前記金属層の一端上に配設されたカーボン及び第１の樹脂を含む第１の電極層と、
   前記第１の電極層を覆うように配設されたカーボンを含む第２の電極層と、
   前記第２の電極層上に位置するように配設された反応部と、を備え、
   前記第１の電極層は前記第２の電極層よりも吸水率が低い第１の樹脂を含むことを特徴とするバイオセンサ。
2. 前記第２の電極層は、前記第１の電極層よりも親水性が高い第２の樹脂を含むことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
3. 第１の基材の第１の面上に、所定のパターンを有する金属層を形成し、
   前記金属層の一端上に、カーボンと、第１の樹脂と、第１の溶剤とを含有する第１の塗工液を塗布して、第１の電極層を形成し、
   前記第１の電極層上に位置するように、カーボンと、第２の樹脂と、第２の溶剤とを含有する第２の塗工液を塗布して、第２の電極層を形成し、
   前記第２の電極層上に位置するように反応部を形成し、
   前記第１の樹脂は前記第２の樹脂よりも吸水率が低い樹脂であることを特徴とするバイオセンサの製造方法。
4. 前記第２の樹脂は前記第１の樹脂よりも親水性が高いことを特徴とする請求項３に記載のバイオセンサの製造方法。

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