JP2012525819A - 増大した光出力を有する合成オプロフォルスルシフェラーゼ - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図8
Description
本願は、米国仮出願第61/174,838号(出願日:2009年5月1日)に基づく優先権を主張する(参照によりその全体が本願に組み込まれる)。
本発明のアミノ酸改変ルシフェラーゼの残基は、L配置の残基、D-配置の残基、又は天然に存在しないアミノ酸、例えばノルロイシン、L-エチオニン、β-2-チエニルアラニン、5-メチルトリプトファン ノルバリン、L-カナバニン、p-フルオロフェニルアラニン、p-(4-ヒドロキシベンゾイル)フェニルアラニン、2-ケト-4-(メチルチオ)酪酸、β-ヒドロキシロイシン、γ-クロロノルバリン、γ-メチルD-ロイシン、β-D-Lヒドロキシロイシン、2-アミノ-3-クロロ酪酸、N-メチル-D-バリン、3,4,ジフルオロ-L-フェニルアラニン、5,5,5-トリフルオロロイシン、4,4,4,-トリフルオロ-L-バリン、5-フルオロ-L-トリプトファン、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-ベンジル-L-フェニルアラニン、チアプロリン、5,5,5-トリフルオロロイシン、5,5,5,5',5',5'-ヘキサフルオロロイシン、2-アミノ-4-メチル-4-ペンテン酸、2-アミノ-3,3,3-トリフルオロ-メチルペンタン酸、2-アミノ-3-メチル-5,5,5-トリ-フルオロペンタン酸、2-アミノ-3-メチル-4-ペンテン酸、トリフルオロバリン、ヘキサフルオロバリン、ホモシステイン、ヒドロキシリジン、オルニチン、ならびに当該技術分野で公知方法によって場合により--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH=CH--(シス及びトランス)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--及びCH2SO--などの結合によって置換されたペプチド結合を有するアミノ酸の残基であることができる。標準的ポリペプチド命名法に従って、以下の対応表に天然に存在するアミノ酸残基の略語を示す。
本発明は、増大した安定性、増大した発光、例えば発光の増加、発光キネティクスのより優れた安定性、又は改変された発光色、又はその両方を示す改変ルシフェラーゼをもたらす、野生型ルシフェラーゼに対する少なくとも1つのアミノ酸置換を有する改変ルシフェラーゼ又はそのタンパク質フラグメント(例えば、欠失を有するもの、例えば1〜約5残基の欠失を有するもの)及びそれらのキメラ(融合体)(米国特許出願第60/985,585号及び第11/732,105号を参照のこと、これらの開示は、参照により本願に組み込まれる)を含む。改変ルシフェラーゼのルシフェラーゼ配列は、対応する野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列と実質的に同じである。実質的に同じ配列を有するポリペプチド又はペプチドとは、完全にではないが、主として同じであり、それが関連している配列の機能活性を保持しているアミノ酸配列を意味する。一般に、少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%であるが、100%未満であるアミノ酸配列同一性である場合、2つのアミノ酸配列は実質的に同じであるか、あるいは実質的に相同である。一実施形態において、改変ルシフェラーゼは組換えポリヌクレオチドによってコードされる。
改変ルシフェラーゼ、そのフラグメントをコードする望ましい核酸分子、例えば発光活性を有するもの、あるいは他の分子によって補完されて発光活性をもたらすことができるもの、又は発光活性を有するその融合体がひとたび調製されれば、改変ルシフェラーゼ、そのフラグメント、例えば、相補性のためのもの、又は発光活性を有するその融合体をコードする発現カセットを調製できる。例えば、改変ルシフェラーゼをコードする核酸配列を含む核酸分子は、場合により、転写調節配列、例えば1以上のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列又はそれらの組み合わせに作動可能に連結され、発現カセットを形成する。核酸分子又は発現カセットは、場合により選択マーカー遺伝子を含むベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターに導入され、このベクターは、目的とする細胞、例えば、原核細胞、例えばエッシェリヒア・コーリー(E.coli)、ストレプトミセス種(Streptomyces spp.)、バシラス種(Bacillus spp.)、スタフィロコッカス種(Staphylococcus spp.)などばかりでなく、植物(双子葉植物もしくは単子葉植物)、真菌、酵母、例えば、ピキア(Pichia)、サッカロミセス(Saccharomyces)もしくはシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)又は哺乳動物細胞を含む真核細胞、それらの溶解物、あるいはin vitro転写/翻訳混合物に導入されることができる。哺乳動物細胞は、限定するものではないが、ウシ、ヤギ、羊、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類(例えばサル)及びヒト細胞を含む。哺乳動物細胞株は、限定するものではないが、CHO、COS、293、HeLa、CV-1、SH-SY5Y、HEK293及びNIH3T3細胞を含む。
本発明の改変ルシフェラーゼ、そのフラグメント又はその融合体をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子(ポリヌクレオチド)もまた提供される。一実施形態において、単離された核酸分子は、少なくとも1つの選択された宿主における発現に最適化された核酸配列を含む。最適化された配列は、コドン最適化された配列、すなわち、他の生物体、例えば遠縁の生物体に対して、ある生物体においてより頻繁に用いられるコドンを含むばかりでなく、コザック配列及び/又はイントロンを加えるもしくは改変する改変及び/又は望ましくない配列、例えば潜在的転写因子結合部位を除去する改変を含む。このような最適化された配列は、宿主細胞に導入されたとき、増大した促進、例えばタンパク質発現のレベル増加をもたらすことができる。
深海エビであるオプロフォルス・グラキリロストリスから分泌されるルシフェラーゼは、高い活性、高い量子収率及び広い基質特異性(セレンテラジン、セレンテラジンアナログ)などの多くの興味ある特性を有することが示されている。オプロフォルスの生物発光反応は、セレンテラジン(ルシフェリン)の分子状酸素による酸化がオプロフォルスルシフェラーゼにより触媒されて、462nmに最大強度を有する光ならびにCO2及びセレンテラミドの生成物を生じたときに起こる(Shimomura et al., Biochemistry, 17:994 (1978);この文献は、454nmであるとしたInouye(2000)とは異なる)。最適な発光は、0.05〜0.1M NaClの存在下、40℃、pH9で起こり、この酵素の熱に対する著しい抵抗性により、高度に精製された酵素が用いられる場合、50℃より上の温度で可視発光が生じ、部分精製された酵素が使用される場合、70℃より上で可視発光が生じる。pH8.7においては、この天然のルシフェラーゼは、おおよそ分子量130,000を有し、31,000のモノマー4つを含むと推定される。低いpHでは、この天然のルシフェラーゼは重合する傾向がある。
隠れマルコフモデル(Hidden Markov Model)(HMM)に基づく鋳型ライブラリー検索(Karplus et al., bioinformatics, 14:846 (1998))を用い、http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.htmlにおけるSWISS-MOREL Template Identification Tool(Arnold et al., bioinformatics, 22:195 (2006))を用いて遠縁の鋳型構造を検出した。
既知の三次構造を有する遠いOgLucホモログを同定するために、https://genesilico.pl/meta2(Kurowski et al., Nucl. Acids Res., 31:3305 (2003))における“GeneSilico meta-server”を用いるフォールド認識法もまた用いた。
特記しない限り、ランダム置換を有する出発OgLuc配列のバリアントは、エラープローン変異誘発PCRシステムであるGeneMorph IIランダム変異誘発キット(Stratagene社; Daughtery, PNAS USA 97(5):2029 (2000))(製造業者の使用説明書に従って)及び当該技術分野で公知のNNK飽和を用いて作製した。得られたバリアントを、pF1K Flexi(登録商標)T7ベース発現ベクター(Promega社)に構築し、これを当該技術分野で公知の技術を用いてKRXエッシェリヒア・コーリーに形質転換するために用いた。得られたライブラリーをエッシェリヒア・コーリー内で発現させ、出発OgLucタンパク質と比較して発光の増加を示すバリアントをスクリーニングした。当該技術分野で公知の標準的配列決定技術を用いて、目的とする各クローンにおけるアミノ酸置換を同定した。
OgLucにおけるアミノ酸置換を有する改変ルシフェラーゼバリアントをコードするプラスミドDNAを含むエッシェリヒア・コーリークローンを96ウェルプレートで培養し、放っておく(walk away)誘導、すなわち自己誘導で17時間誘導した(Shagat et al., “KRX Autoinduction Protocol: A Convenient Method for Protein Expression,” Promega Notes 98:17 (2008))。各バリアント及び対応する出発ルシフェラーゼには、6回の反復試験を行った。150mM HEPES(pH8.0)、100mMチオ尿素、0.1X PLB(Promega社、カタログ番号E194A)、0.1mg/mLリゾチーム及び0.001U/μL RQ1DNアーゼからなる溶解緩衝液を用いて細胞を溶解し、Infinite 500 Tecanルミノメーターを用い、レニラルシフェラーゼ基質試薬(Promega社)を用いて発光を測定した。150mM KCl、1mM CDTA、10mM DTT、0.5%テルギトール、20μMセレンテラジン(Promega社))を含む“Glo”0.5%テルギトール(tergitol)アッセイ緩衝液(“0.5%テルギトール”)又は20μMセレンテラジン(Promega社)を含む“フラッシュ(Flash)”RLAB緩衝液(Promega社)(“RLAB”)のいずれかを溶解物試料に注入により添加した後に直ちに測定を行った。添加後直ちに測定するこの発光測定は、“T=0”時点の測定であり、種々の実施形態において、試料によって生成される全光出力(発光)の尺度として用いられる。バリアントと対応する出発ルシフェラーゼとの間で6回の反復試験の平均発光を比較した。種々の実施形態において、対応する目的とする出発ルシフェラーゼ、例えば合成OgLucに対して発光測定値を正規化し、特定の実施形態において、これを“倍の”(すなわち2倍、3倍、4.5倍などの)改善、増加などと呼ぶ。
実施例4に記載されている誘導培養物から溶解物試料を調製した。反復試験の96ウェルプレートで溶解物試料を、種々の温度、例えば22、30、37、42、50又は54℃を含む温度でインキュベートした。種々の時点でプレートを-70℃においた。実施例4に記載されているように、発光を測定する前に、各プレートをRT、すなわち22℃で10分間解凍した。実施例4に記載されている0.5%テルギトールアッセイ緩衝液で試料をアッセイした。各時点のプレートに関する、実施例4に記載されている“T=0”測定を用いてタンパク質の半減期を測定した。タンパク質の安定性を示す半減期を、対応する目的とする出発ルシフェラーゼ、例えばOgLucに対して正規化した。
OgLucにおけるカリシン構造特性の復元が、全体的なタンパク質の安定性及び活性を改善することができるかどうかを試験するために、OgLuc配列の合成バージョンを設計した。合成バージョンは、エッシェリヒア・コーリー及び哺乳動物細胞に対して最適化されたコドン使用頻度を含み、位置166のAsnに置換するArgもしくはLysのいずれかに対応したコドンを含んだ。前述のように、番号付けは配列番号1に基づく。コドン最適化(エッシェリヒア・コーリーに対する)及び、コドン166のArg又はLysへのヌクレオチド変化は、合成手段(Gene Dinamics, LLC)によって操作された。クローンOgLuc+N166Rにおいては、AACコドンをCGT(Argをコードする)に変えた。クローンOgLuc+N166Kにおいては、AACコドンをAAA(Lysをコードする)に変えた。
実施例に記載されている部位特異的変異誘発によってさらなるOgLucバリアントを作製して、以下の位置(配列番号1に対して2、4、11、44、54、90、115、124又は138)の1つにおける置換を得た。N166Rと組み合わせたこれらの位置の置換は、WT OgLucと比較して増加した全光出力(発光)が得られることが実施例6で示された。図5A〜5C、6A〜6C、7A〜7C、8、9A〜9D、10A〜10C、11A〜11B、12A〜12B及び33A〜33Eにおいて、“WT”、“N166R”及び“T2T”は、それぞれ配列番号2、14及び32によってコードされるタンパク質を指し、“T2T+N166R”は、N166Rに置換を有する、配列番号32によってコードされるタンパク質のことを言い、“A4E”、“Q11R”、“V44I”、“A54F”、“A54F+N166R”、“A54I”、“P115E”、“P155E+N166R”、“Y138I”、“Q124K”、“Y138C+N166R”及び“I90V”は、それぞれ、図5Aにおける“試料”列において示されるそれぞれの残基において置換を有する、配列番号2によってコードされるタンパク質を指す。これらのバリアントは、実施例4に記載されているように発光を測定することによって評価した。図5A〜5C及び7A〜7Cに、0.5%テルギトール(図5A〜5C)又はRLAB(図7A〜7C)のいずれかを用いた、WT OgLucバリアントのT=0における平均発光を要約する。バリアントの発光におけるWT OgLucに対する倍増加を図6A〜B(0.5%テルギトール)及び図8(RLAB)に示す。バリアントの発光におけるN166Rバリアントに対する倍増加を図33A(0.5%テルギトール)及び33B(RLAB)に示す。図5B、6B及び7Bは、それぞれ図5C、6C及び7Cと同じデータであるが、小さなバーがより明確に見えるように異なる尺度で示してある。
部位33及び68における置換を有するさらなる合成OgLucバリアントを作製した。具体的には、WT OgLuc(図13A〜13B、14A〜14B、15A〜15B、16A〜16B、17及び33A〜33Eにおいて“WT A33K”及び“WT F68Y”として特定される)及びOgLuc+N166R(図13A〜13B、14A〜14B、15A〜15B、16A〜16B、17及び33A〜33Eにおいて“N166R A33K”及び“N166R F68Y”として特定される)バリアント配列においてA33K及びF68Y置換を作製し、対応する出発WT OgLuc(図13A〜13B、14A〜14B、15A〜15B、16A〜16B、17及び33A〜33Eにおいて“WT”として特性される)及びOgLuc+N166Rバリアント(図13A〜13B、14A〜14B、15A〜15B、16A〜16B、17及び33A〜33Eにおいて“N166R”として特定される)と比較した。0.5%テルギトール及びRLABを用いたときの、OgLuc A33K及びF68YバリアントのT=0における平均発光を、それぞれ図13A及び13Bに示す。図14A(0.5%テルギトール)及び14B(RLAB)においてWT OgLucに対するバリアントの発光における倍増加でさらに示されるように、A33K及びF68Yバリアントは、それぞれの対応する出発OgLucと比較して強い発光を示した。野生型バックグラウンドにおいて、A33K及びF68Yは、別々に、RLABを用いた場合、WTに対して1.6及び1.7倍の増加(図14B参照)を示し、WT(0.5%テルギトール)に対して3.8及び3.9倍の増加を示した(図14A)。OgLuc+N166Rバックグラウンドにおいて、A33K及びF68Yは、別々に、RLABを用いた場合、WT OgLucに対して5.1及び3.3倍の増加を示し(図14B参照)、0.5%テルギトールを用いた場合、WT OgLucに対して9.2及び5倍の増加を示した(図14A)。
種々のバリアントにおけるアミノ酸置換が、タンパク質の安定性に対しても効果を有するかどうかを測定するために、種々の温度で種々のバリアントを測定し、安定性に対する効果を測定した。図24に示すように、室温(約22°C)では、野生型OgLucは、タンパク質半減期1時間を示したが、C1バリアントはタンパク質半減期9.4時間を示した。図24に示すように、30℃では、OgLuc N166Rバリアントはタンパク質半減期21分を示したが、C1+A4Eバリアントは、6時間後で減少は認められなかった。30℃では、レニラルシフェラーゼのタンパク質半減期は7.9時間であった。30℃における安定性の順位は、OgLuc C1+A4E>レニラルシフェラーゼ>OgLuc N166Rである。図24に示すように、37℃では、OgLuc N166Rバリアントのタンパク質半減期は2分であったが、C1+A4Eバリアントでは減少は認められなかった。54℃では、種々のバリアントのタンパク質半減期は、次のとおり(C1:7分、C1+A4E:8分、C1+C2+A4E:128分、C1+C3+A4E:24分)であった。野生型OgLuc及びOgLuc N166Rバリアントの半減期は、これらが不安定すぎるので、54℃では測定できなかった。
種々のバリアントにおけるアミノ酸置換が、シグナルの安定性にも効果を有するかどうかを測定するために、シグナルの安定性に関して種々のバリアントをスクリーニングした。RLABを用いた場合のシグナルの安定性を、実施例4に記載されているように測定した。種々のバリアントに関して、以下のシグナル半減期(野生型OgLuc:1.8分、レニラルシフェラーゼ:0.8分、C1:1.7分、C1+A4E:1.7分、C1+C2+A4E:12.6分、C1+C3+A4E:3.3分)が測定された(図25)。
OgLuc+N166R、C1+A4E及びC1+C2+A4Eバリアントに関して、レニラルシフェラーゼと比較して、基質としてcoelenterzaine(Promega社)を用いた場合に最強の発光を示す最適の波長を測定した。実施例4に記載されているようにして試料を調製した。Varioskanルミノメーター及び0.5%テルギトールを用い、5nmきざみで発光の波長を測定することによってスペクトルピークを測定した。スペクトルの最高のRLU値によってデータを正規化した。図26に示すように、レニラは480nmにスペクトルピークを示すが、OgLuc+N166R、C1+A4E及びC1+C2+A4Eは465nmにスペクトルピークを有し、以前455nmであると報告された天然OgLucからはシフトしている(Inouye, FEBS Letters, 481(1):19-25 (2000))。
実施例3に記載されているようにして、C1+A4Eバリアントのランダム変異誘発によってさらなるバリアントを作製した。実施例4に記載されているようにして、全光出力を測定した。限定するものではないが、典型的なC1+A4Eバリアント(すなわちC1+A4Eよりも少なくとも1.2倍明るいもの)を、試料ID及びアミノ酸置換に関して図27A及び27Bに記載した。配列番号1に対して位置20、54、72、77、79、89、90又は164にアミノ酸置換を有するC1+A4Eバリアントは、対応する出発C1+A4Eバリアントに対して少なくとも1.9倍の発光の増加を示した。
Claims (37)
- 野生型オプロフォルスルシフェラーゼに対して少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1の野生型オプロフォルスルシフェラーゼのアミノ酸に対応する位置で少なくとも1つのアミノ酸置換を含む改変ルシフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、改変ルシフェラーゼポリペプチドが、野生型オプロフォルスルシフェラーゼに対して、増大した発光、増大したシグナルの安定性、及び増大したタンパク質安定性の少なくとも1つを有することを特徴とするポリヌクレオチド。
- コードされた改変ルシフェラーゼポリペプチドが、野生型オプロフォルスルシフェラーゼに対して増大した発光を有し、配列番号1に対応する位置2、4、11、20、23、28、33、34、44、45、51、54、68、72、75、76、77、89、90、92、99、104、115、124、135、138、139、143、144、164、166、167又は169の少なくとも1つでアミノ酸置換を有する、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 改変ルシフェラーゼポリペプチドが、野生型オプロフォルスルシフェラーゼに対して増大したシグナルの安定性を有し、配列番号1に対応する位置4、11、20、28、33、54、68、75、115、124、138、143又は166の少なくとも1つでアミノ酸置換を有する、請求項1又は2記載のポリヌクレオチド。
- コードされた改変ルシフェラーゼポリペプチドが、野生型オプロフォルスルシフェラーゼに対して増大したタンパク質安定性を有し、配列番号1に対応する位置11、20、28、33、34、44、45、51、54、68、72、75、77、89、90、92、99、104、115、124、135、138、139、143、144、164、166、167又は169の少なくとも1つでアミノ酸置換を有する、請求項1〜3のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- コードされた改変ルシフェラーゼポリペプチドが、配列番号10の野生型オプロフォルスルシフェラーゼのN末端に対応するルシフェラーゼ残基の欠失をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- 欠失が、多くてもルシフェラーゼ配列の27残基である、請求項5記載のポリヌクレオチド。
- 野生型オプロフォルスルシフェラーゼが、オプロフォルス・グラキリロストリス、オプロフォルス・グリマルディ、オプロフォルス・スピニカウダ、オプロフォルス・フォリアケウス、オプロフォルス・ノバエゼランジアエ(Oplophorus novaezelandiae)、オプロフォルス・チプス又はオプロフォルス・スピノウス由来である、請求項1〜6のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- コードされた改変ルシフェラーゼポリペプチドが、配列番号1に対応するT2S、A4E/S/R/G/D/T/L、Q11R/V/I/L/K/T、Q20R、E23V、S28P、A33K、L34M、V44I/L、V45E、G51V、A54F/T/V/G/S/W/L/I、F68S/Y/V、L72Q、M75R/K/Q/G/T/A、I76V、F77W、V79I、K89E、I90T/V、L92S/A/G/Q、I99V、P104L、P115E/I/Q/L/V/G/H/R/S/C/A/T、Q124K、N135K、Y138V/I/N/T/L/C/R/M/K、D139E、I143L、N144K、C164S、N166R/K/A/L/P/Q/S、I167V又は169Lの少なくとも1つに対応する置換を含む、請求項1〜7のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- コードされた改変ルシフェラーゼポリペプチドが、配列番号1に対応する位置11、33、44、54、115、124、138及び166でアミノ酸置換を含む、請求項1〜8のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- 置換が、Q11R、A33K、V44I、A54F、P115E、Q124K、Y138I及びN166Rを含む、請求項9記載のポリヌクレオチド。
- コードされた改変ルシフェラーゼが、配列番号1に対応する位置4でアミノ酸置換をさらに含む、請求項9又は10記載のポリヌクレオチド。
- 位置4のアミノ酸がグルタミン酸である、請求項11記載のポリヌクレオチド。
- コードされた改変ルシフェラーゼが、配列番号1に対応する位置45、135、104、139及び167でアミノ酸置換をさらに含む、請求項9〜12のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- 位置45のアミノ酸がグルタミン酸であり、位置104がロイシンであり、位置135がリジンであり、位置139がグルタミン酸であり、位置167がバリンである、請求項13記載のポリヌクレオチド。
- コードされた改変ルシフェラーゼが、配列番号1に対応する位置28、34、51、99及び143でアミノ酸置換をさらに含む、請求項9〜12のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- 位置28のアミノ酸がプロリンであり、位置34がメチオニンであり、位置51がバリンであり、位置99がバリンであり、位置143がロイシンである、請求項16記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号1に対応する位置20、54、68、72、77、79、89、90、92又は164で少なくとも1つのアミノ酸の置換をさらに含む、請求項11又は12記載のポリヌクレオチド。
- 位置20のアミノ酸がアルギニンであり、位置54がイソロイシンであり、位置68がセリンであり、位置72がグルタミンであり、位置75がリジンであり、位置77がトリプトファンであり、位置79がイソロイシンであり、位置89がグルタミン酸であり、位置90がトレオニン又はバリンであり、位置92がグリシン、グルタミン、セリン又はアラニンであり、位置164がセリンである、請求項17記載のポリヌクレオチド。
- コードされた改変ルシフェラーゼポリペプチドが、配列番号1に対応する位置23、28、143及び166でアミノ酸置換を含む、請求項1〜8のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- 置換が、E23V、S28P、I143V、及びN166Rを含む、請求項19記載のポリヌクレオチド。
- コードされた改変ルシフェラーゼポリペプチドが、配列番号1に対応する位置4、34、76及び166でアミノ酸置換を含む、請求項1〜8のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- 置換が、A4S、L34M、I76V及びN166Rを含む、請求項21記載のポリヌクレオチド。
- コードされた改変ルシフェラーゼポリペプチドが、配列番号1に対応する位置51、99及び166でアミノ酸置換を含む、請求項1〜8のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- 置換が、G51V、I99V及びN166Rを含む、請求項23記載のポリヌクレオチド。
- 改変ルシフェラーゼポリペプチドに結合された目的とするポリペプチドをコードし、前記目的とするポリペプチド及び改変ルシフェラーゼポリペプチドが、融合タンパク質として発現されることができる、請求項1〜24のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜25のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結される、請求項26記載のベクター。
- 請求項1〜25のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド又は請求項26もしくは27記載のベクターを含む細胞。
- 請求項28記載の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項1〜25のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド又は請求項26もしくは27記載のベクターを含む非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項1〜25のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドによってコードされる改変ルシフェラーゼ。
- 請求項1〜25のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
- 請求項1〜24のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドによってコードされる改変ルシフェラーゼを含む融合タンパク質。
- 改変ルシフェラーゼの発現を可能にする条件下で請求項28記載の細胞を培養することを含む改変ルシフェラーゼの製造方法。
- 改変ルシフェラーゼの発現を可能にする条件下で細胞に請求項26又は27記載のベクターを導入することを含む改変ルシフェラーゼの製造方法。
- 請求項1〜25のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド又は請求項26もしくは27記載のベクターを含むキット。
- 請求項31記載の改変ルシフェラーゼを含むキット。
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