RU2495126C2 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pOL-DsRed2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ OCT4 И LIN28 ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК DsRed2, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА - Google Patents
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pOL-DsRed2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ OCT4 И LIN28 ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК DsRed2, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2495126C2 RU2495126C2 RU2011150031/10A RU2011150031A RU2495126C2 RU 2495126 C2 RU2495126 C2 RU 2495126C2 RU 2011150031/10 A RU2011150031/10 A RU 2011150031/10A RU 2011150031 A RU2011150031 A RU 2011150031A RU 2495126 C2 RU2495126 C2 RU 2495126C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dsred2
- lin28
- oct4
- plasmid
- human
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии. Предложена плазмидная генетическая конструкция pOL-DsRed2, построенная на основе плазмидного вектора pIRES (Clontech), в который помещены фрагменты кДНК генов ОСТ4 и LIN28 человека, соединенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей F2А-пептид, и кДНК гена, кодирующая флуоресцентный белок DsRed2. Изобретение обеспечивает одновременную трансляцию белков ОСТ4 и LIN28 человека и флуоресцентного белка DsRed2 при получении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и животных в медицине и ветеринарии. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.
Description
Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии и может быть использовано для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и животных.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) - это тип стволовых клеток, которые могут быть получены из соматических клеток животных и человека в результате повышенной экспрессии набора определенных генов . Для получения ИПСК человека и животных успешно используется сверхэкспрессия таких генов как OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC . Позже группой Томсона ИПСК человека были успешно получены с использованием генов OCT4, SOX2, NANOG и LIN28 .
Известно, что для получения большинства новых линий ИПСК в настоящий момент используют генетические конструкции, полученные на основе ретро- и лентивирусных векторов. Этот метод характеризуется тем, что происходит случайное встраивание ДНК-копий геномов ретро- или лентивирусов в геномы клеток, что в свою очередь может приводить к нарушению функционирования генов .
Для полномасштабного применения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в фундаментальных и прикладных исследованиях, таких как скрининг новых лекарственных веществ, исследования в области токсикологии и регенеративной медицины, необходимо решение ряда проблем. Во-первых, необходима разработка методов получения ИПСК без генетической модификации их геномов. Во-вторых, способ получения ИПСК должен быть достаточно эффективным.
Известно, что плазмидные векторы -плазмиды- могут временно существовать в ядрах клеток, обеспечивая стабильную транскрипцию нуклеотидных последовательностей, находящихся под контролем конститутивных промоторов. Кроме того, известен метод, основанный на использовании специфических последовательностей - 2А-пептидов, позволяющий получать генетические конструкции, обеспечивающие трансляцию нескольких полипептидов (белков) с одной молекулы матричной РНК [5].
Задачей данного изобретения является конструирование полицистронной неинтегрирующейся плазмидной конструкции, кодирующей белки OCT4 и LIN28 человека и флуоресцентный белок DsRed2, обеспечивающей одновременную трансляцию данных белков и являющейся вектором при получении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Белки OCT4 и LIN28 необходимы для запуска репрограммирования клеток, а флуоресцентный белок DsRed2 служит маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК.
Реализация изобретения осуществляется следующим образом.
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК выполняется на основе плазмиды pIRES (Clontech) и включает следующие стадии:
1. выделяют РНК из клеток известной линии эмбриональных стволовых клеток человека HUES9 и производят синтез кДНК с помощью олиго-(dT) праймеров. Полученную кДНК используют в качестве матрицы для синтеза фрагментов, кодирующих белки;
2. синтез фрагмента кДНК гена OCT4 - позиции в мРНК 53-1135- (Homo sapiens POU domein, class 5, Transcription factor 1 (POU5F1)) человека, (регистрационный номер в GeneBank NM_002701), размером 1152 пар нуклеотидов, содержащего на 3'-конце последовательность F2A-пептида (OCT4-F2A). Синтез проводят с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами: hOCT45'NheI 5'-TTTTGCGCTAGCCATGGCGGGACACCTGGCTTCGG-3' (прямой праймер, содержит искусственно введенный сайт эндонуклеазы рестрикции Nhe I) и hOCT4 F2A 3'5'-CCTGCAAGTTTCAGCAAATCAAAGTTTAATGTCTGCTTTACTGGCGCACCCGAACCCGAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAGAGTGGTG-3' (обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность кодирующую пептид F2A);
3. синтез фрагмента кДНК гена LIN28 - позиции в мРНК 100-796- (Homo sapiens lin-28 homolog A (C. elegans)) (регистрационный номер в GeneBank NM_024674.4) размером 775 пар нуклеотидов, содержащего на 5'-конце последовательность F2A-пептида (F2A-KLF4). Синтез проводят с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами: hLIN28 F2A5' 5'- GCAGACATTAAACTTTGATTTGCTGAAACTTGCAGGTGATGTAGAGTCAAATCCAGGTCCAGCTCAGCCGACGACCATGGGCTCC-3' (прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность кодирующую пептид F2A) и hLIN28 3'MluI 5'- CACTTTCTCCAACGCGTCTGCTCCTCAAAACTTCCTG-3' (прямой праймер, содержит искусственно введенный сайт эндонуклеазы рестрикции Mlu I);
4. объединение фрагментов OCT4-F2A и F2A-LIN28 осуществляют методом полимеразной цепной реакции с использованием в качестве матриц перекрывающихся фрагментов OCT4-F2A и F2A-LIN28, а также праймеров hOCT45'NheI и hLIN28 3'MluI. В результате получают фрагмент OCT4-F2A-LIN28, размером 1891 пар нуклеотидов;
5. фрагмент ДНК, кодирующий белок DsRed2, вырезают из плазмиды pDsRed2 (Clontech) эндонуклеазой рестрикции Xba I, клонирован в сайт Xba I, находящийся в полилинкере B плазмиды pIRES (Clontech). В результате получают плазмида pIRES-DsRed2;
6. фрагмент ДНК OCT4-F2A-LIN28 клонируют с помощью набора реагентов pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) и штамма E.coli XL-10 Gold;
7. клоны плазмиды pGEM-T Easy со встройками - pGEM-OCT4-F2A-LIN28 последовательности выделяют стандартным методом щелочного лизиса (Maniatis, Т., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Sping Harbor Laboratory Press);
8. фрагмент OCT4-F2A-LIN28 вырезают из плазмиды pGEM-OCT4-F2A-LIN28 с помощью эндонуклеазы рестрикции EcoR I и лигируют с плазмидой pIRES-DsRed2 гидролизованной эндонуклеазой рестрикции EcoR I, сайт которой расположен в полилинкере А.
В результате получена плазмида pOL-DsRed2 размером 8714 п.н. (OL=OCT4, LIN28).
На Фиг.1 изображена карта плазмидной генетической конструкции pOL-DsRed2. Фрагмент ДНК кодирующий белки OCT4 и LIN28 встроен в сайт EcoR I в полилинкер А плазмиды pIRES, а ДНК кодирующая DsRed2 встроена в сайт Xba I полилинкера В плазмиды pIRES.
Описание и позиции в нуклеотидной последовательности (п.н., пара нуклеотидов) функциональных элементов генетической плазмидной конструкции pOL-DsRed2 представлены в таблице 1.
Таблица 1 | |
Элемент плазмидной генетической конструкции | Позиции в последовательности конструкции, п.н. |
p CMV IE - энхансер/промотор цитомегаловируса | 1-750 |
IVS - интрон | 890-1022 |
Промотор РНК-полимеразы T7 | 1067-1085 |
Фрагмент ДНК OCT4-F2A-LIN28 | 1096-2984 |
IRES - внутренний сайт посадки рибосом | 3020-3601 |
DsRed2- кДНК гена DsRed2 | 3624-4350 |
Промотор РНК-полимеразы T3 | 4396-4418 |
SV40 poly A - фрагмент содержащий сигнал полиаденилирования мРНК вируса SV40 | 4429-4651 |
Ориджин репликации f1 | 4747-5203 |
p SV40 - энхансер/ранний промотор вируса SV40 | 5268-5686 |
SV40 ori - ориджин репликации вируса SV40 | 5584-5650 |
Neo-r - ген устойчивости к неомицину | 5731-6526 |
Синтетический сигнал полиаденилирования | 6591-6640 |
Amp-r - ген устойчивости к ампициллину | 7052-7913 |
Полученная плазмидная генетическая конструкция pOL-DsRed2 построена на основе плазмидного вектора pIRES (Clontech), в который помещены фрагменты кДНК генов OCT4 и LIN28 человека, соединенные нуклеотидной последовательностью кодирующей F2A-пептид и кДНК гена, кодирующего флуоресцентный белок DsRed2.
Транскрипция единой мРНК OCT4-F2A-LIN28-IRES-DsRed2 осуществляется с конститутивного промотора p CMV IE, обеспечивающего высокий уровень наработки мРНК.
Наличие последовательностей F2A и IRES позволяет одновременно транслировать белки OCT4, LIN28 и DsRed2 с одной молекулы мРНК.
Фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок DsRed2, является маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК.
Плазмидная генетическая конструкция pOL-DsRed2 предназначена для временной или постоянной экспрессии генов OCT4, LIN28 и DsRed2 в культивируемых клетках человека, обеспечивает стабильную экспрессию введенного гена.
Рекомбинантная плазмида pOL-DsRed2 может использоваться в качестве вектора для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.
Список использованной литературы
1. Takahashi K. and S. Yamanaka. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006. 126(4): p.663-76.
2. Takahashi K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 2007. 131(5): p.861-72.
3. Yu J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007. 318(5858): p.1917-20.
4. Okita K. et al. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science, 2008. 322(5903): p.949-53.
5. Szymczak A.L. and Vignali D.A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther, 2005. 5(5): p.627-38.
6. Cowan C.A. et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med, 2004. 350(13): p.1353-6.
Claims (3)
1. Рекомбинантная плазмида pOL-DsRed2, кодирующая белки ОСТ4 и LIN28 человека и флуоресцентный белок DsRed2, предназначенная для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, представляющая собой генетическую конструкцию на основе плазмиды pIRES, содержащая следующие конструктивные элементы: фрагмент ДНК, кодирующий белки ОСТ4 и LIN28 человека, включающий последовательность, кодирующую F2A, расположенную между последовательностями ОСТ4 и LIN28, встроен в сайт рестрикции EcoR I в полилинкер А плазмиды pIRES, размер встройки 1888 пар нуклеотидов, и фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок DsRed2, встроенный в сайт ХЬа I полилинкера В плазмиды pIRES; транскрипция полицистронной мРНК OCT4-F2A-LIN28-IRES-DsRed2 осуществляется с конститутивного промотора р CMV IE.
2. Рекомбинантная плазмида pOL-DsRed2 по п.1, где разделение нуклеотидных последовательностей элементами F2A и IRES позволяет экспрессировать три белка с одной плазмиды одновременно.
3. Рекомбинантная плазмида pOL-DsRed2 по п.1, где фрагмент ДНК, кодирующий белки ОСТ4 и LIN28 человека, запускает репрограммирование клеток для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, а фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок DsRed2, является маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011150031/10A RU2495126C2 (ru) | 2011-12-08 | 2011-12-08 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pOL-DsRed2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ OCT4 И LIN28 ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК DsRed2, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011150031/10A RU2495126C2 (ru) | 2011-12-08 | 2011-12-08 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pOL-DsRed2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ OCT4 И LIN28 ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК DsRed2, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2495126C2 true RU2495126C2 (ru) | 2013-10-10 |
Family
ID=49303133
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011150031/10A RU2495126C2 (ru) | 2011-12-08 | 2011-12-08 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pOL-DsRed2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ OCT4 И LIN28 ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК DsRed2, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2495126C2 (ru) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100041054A1 (en) * | 2008-08-12 | 2010-02-18 | Amanda Mack | Methods for the production of ips cells |
RU2401307C1 (ru) * | 2009-05-15 | 2010-10-10 | Учреждение Российской академии наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН (ИХБФМ СО РАН) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFK2, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ПЕПТИДА, ЯВЛЯЮЩЕГОСЯ АНАЛОГОМ ФРАГМЕНТА КАППА-КАЗЕИНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПЕПТИДА И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПЕПТИД, АНАЛОГ ФРАГМЕНТА КАППА-КАЗЕИНА ЧЕЛОВЕКА, ОБЛАДАЮЩИЙ АПОПТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К РАКОВЫМ КЛЕТКАМ |
US20110312090A1 (en) * | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Nathan Meyer | Cardiomyocyte medium with dialyzed serum |
-
2011
- 2011-12-08 RU RU2011150031/10A patent/RU2495126C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100041054A1 (en) * | 2008-08-12 | 2010-02-18 | Amanda Mack | Methods for the production of ips cells |
RU2401307C1 (ru) * | 2009-05-15 | 2010-10-10 | Учреждение Российской академии наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН (ИХБФМ СО РАН) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFK2, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ПЕПТИДА, ЯВЛЯЮЩЕГОСЯ АНАЛОГОМ ФРАГМЕНТА КАППА-КАЗЕИНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПЕПТИДА И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПЕПТИД, АНАЛОГ ФРАГМЕНТА КАППА-КАЗЕИНА ЧЕЛОВЕКА, ОБЛАДАЮЩИЙ АПОПТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К РАКОВЫМ КЛЕТКАМ |
US20110312090A1 (en) * | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Nathan Meyer | Cardiomyocyte medium with dialyzed serum |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101871192B1 (ko) | 비-바이러스 접근법을 사용한 iPS 세포의 생산 방법 | |
US9371544B2 (en) | Compositions and methods for reprogramming eukaryotic cells | |
AU2009282133B2 (en) | Methods for the Production of IPS Cells | |
JP2011522540A5 (ru) | ||
JP7174958B2 (ja) | ステルス性を有するrnaを使った遺伝子発現系および当該rnaを含む遺伝子導入・発現ベクター | |
KR20180105670A (ko) | 벡터-프리 유도만능 줄기세포를 생성시키기 위한 방법 및 벡터 | |
Rohani et al. | Generation of human induced pluripotent stem cells using non-synthetic mRNA | |
Pietronave et al. | Advances and applications of induced pluripotent stem cells | |
Kulcenty et al. | Review Molecular mechanisms of induced pluripotency | |
KR20180029976A (ko) | 고품질 iPS 세포의 제조 방법 | |
RU2495126C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pOL-DsRed2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ OCT4 И LIN28 ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК DsRed2, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА | |
RU2495125C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pOK-DsRed2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ ОСТ4 И KLF4 ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК DsRed2, ПРЕДНАЗНАЧЕНАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА | |
RU2495124C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pSN-ZsGreen, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ SOX2 И NANOG ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК ZsGreen, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА | |
RU2477314C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pSM-ZsGreen, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ SOX2 И С-MYC ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК ZsGreen, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА | |
RU2495127C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pAd-SM, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ SOX2 И C-MYC ЧЕЛОВЕКА, ЯВЛЯЮЩАЯСЯ ОСНОВОЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУЛЕНТНЫХ АДЕНОВИРУСОВ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА | |
Wang et al. | Generation of transgene-free induced pluripotent stem cells with non-viral methods | |
AU2015255253A1 (en) | Methods for the production of ips cells | |
Pham et al. | Monitoring Multiple Pluripotency Biomarkers After Delivery of Reprogramming Factors to Human Somatic Cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191209 |