JP2011254827A - 酵母及びその育種方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定な配列からなるアミノ酸配列において、配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列を、FLOタンパク質に組み込む遺伝子改変によって、凝集性が付与又は強化されたことを特徴とする酵母、及び、特定な配列からなるアミノ酸配列において、配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列を、FLOタンパク質に組み込む遺伝子改変によって、凝集性を付与又は強化することを特徴とする。
【選択図】なし
Description
J. Bacteriol.,150,878(1982)
(1) 酵母に凝集性を付与する活性を有するポリペプチドを提供すること;
(2) 酵母に凝集性を付与する活性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子DNAを提供すること;
(3) 上記の遺伝子DNAを利用して、凝集性が付与または強化された酵母の育種方法を提供すること;
請求項2記載の発明は、前記遺伝子改変が、前記FLOタンパク質に存在する配列番号1〜5で示されるアミノ酸配列の何れか又はこれら配列を3回以下の範囲で繰り返してなるアミノ酸配列を、前記配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列に置き換えるものであることを特徴とする請求項1記載の酵母である。
請求項4記載の発明は、前記遺伝子改変が、前記FLO遺伝子に存在する配列番号1〜5で示されるアミノ酸配列の何れかをコードするDNA又はこれら配列を3回以下の範囲で繰り返してなるアミノ酸配列をコードするDNAを、前記配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列をコードするDNAに置き換えるものであることを特徴とする請求項3記載の酵母である。
請求項5記載の発明は、前記遺伝子改変が、前記配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列をコードするDNAが組み込まれたベクターによって成されることを特徴とする請求項1〜4の何れかに記載の酵母である。
請求項6記載の発明は、宿主である非凝集性酵母に凝集性を付与してなることを特徴とする請求項1〜5の何れかに記載の酵母である。
請求項7記載の発明は、宿主である凝集性酵母の凝集性を強化してなることを特徴とする請求項1〜5の何れかに記載の酵母である。
請求項9記載の発明は、前記遺伝子改変が、前記FLOタンパク質に存在する配列番号1〜5で示されるアミノ酸配列の何れか又はこれら配列を3回以下の範囲で繰り返してなるアミノ酸配列を、前記配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列に置き換えるものであることを特徴とする請求項8記載の酵母の育種方法である。
請求項11記載の発明は、前記遺伝子改変が、前記FLO遺伝子に存在する配列番号1〜5で示されるアミノ酸配列の何れかをコードするDNA又はこれら配列を3回以下の範囲で繰り返してなるアミノ酸配列をコードするDNAを、前記配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列をコードするDNAに置き換えるものであることを特徴とする請求項10記載の酵母の育種方である。
請求項12記載の発明は、前記遺伝子改変が、前記配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列をコードするDNAが組み込まれたベクターによって成されることを特徴とする請求項8〜11の何れかに記載の酵母の育種方法である。
請求項13記載の発明は、宿主である非凝集性酵母に凝集性を付与することを特徴とする請求項8〜12の何れかに記載の酵母の育種方法である。
請求項14記載の発明は、宿主である凝集性酵母の凝集性を強化することを特徴とする請求項8〜12の何れかに記載の酵母の育種方法である。
スに感受性を示す。
2W、YHR213Wには上記の配列はなかった。
(1−1) Total RNAの抽出
サッカロマイセス属セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AM12菌株をYPD培地(1% Yeast extract、2% Polypeptone、2% D−glucose)で30℃、8時間培養し、菌体を回収後、Roche Diagnostics社製 High Pure RNA Isolation kitを用いてTotal RNAの抽出を行った。
抽出したTotal RNAを鋳型に、タカラバイオ社製 3’−Full RACE
Core Setを用いて、逆転写反応を、続いてPCR反応を行った。Total RNAは65℃で10分間加熱後、氷上で急冷し、1μgを逆転写反応(反応液量20μlの系)に用いた。逆転写反応液組成は、キットのプロトコールに従って行った。PCRサーマルサイクラーの反応条件は、30℃10分間、42℃60分間、95℃5分間、5℃5分間を1サイクル行った。
R反応を行った。PCR用酵素としては、東洋紡社製の高正確性ポリメラーゼKOD−Plus−Ver.2を用いた。その結果、約0.6kbpのPCR断片が得られた。PCR反応条件として94℃2分間の後、98℃10秒間、60℃30秒間、68℃5分間を1サイクルとして30サイクル行い、反応終了後は4℃にした。
5’−CTGCTCGAGCTCGGCTACTGTGAATGATGTTG−3’
Setの3sites Adaptor Primerを用いた。
PCR産物を1%のTAEアガロースゲルにて電気泳動を行った結果、約0.6kbpの位置にバンドが見られた。このバンドをゲルから切り出し、キアゲン社製のQiagen quick Gel extraction kitを用いて抽出精製を行った。
東洋紡社製TArget Clone(登録商標)−Plus−キットを用いて、PCR産物をpTA2ベクター(アンピシリン耐性遺伝子をマーカーとして持つ)に組み込み、大腸菌DH5αに形質転換した。次に、得られたアンピシリン耐性を示す大腸菌から東洋紡社製のMagExtractor−Plasmid−を用いてプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドを制限酵素EcoRIで処理し、1%のTAEアガロース電気泳動を行った結果、pTA2ベクターにPCR産物が組み込まれていることが確認された。
PCR産物を組み込まれたpTA2ベクターを鋳型に、Dye Terminatorサイクルシーケンス反応を行った。次に、BECKMAN COULTER社製のCEQ8000 DNA Analysis Systemを用い、塩基配列の決定を行った。PCR産物の両側は、ユニバーサルプライマーのM13 Primer M3とM13 Primer RVを用いて解読を行った。次に、得られた塩基配列を基に設計した以下のプライマーを用いてPCR産物の内側の配列を決定した。最終的に、二つの独立した実験から得られたPCR産物を組み込まれたpTA2ベクターについて、遺伝子断片の全長配列を解読し、二つが一致していることを確認した。
M13 Primer M3 (配列番号7)
5’−GTAAAACGACGGCCAGT−3’
M13 Primer RV (配列番号8)
5’−CAGGAAACAGCTATGAC−3’
c00258−F3 (配列番号9)
5’−CTGCTCGAGCTCATGAACAGTGCTACCAGTGAG−3’c00258−F4 (配列番号10)
5’−ACAGTAGTCACCTCTTCGCT−3’
得られた塩基配列からアミノ酸への変換は、株式会社ゼネティックス製の遺伝子情報処理ソフトウェア GENETYX(登録商標)Ver.9 Windows(登録商標)版を用いて行った。
示す。
<既知配列との比較>
既知配列との比較は、インターネットを介した同ソフトウェアの塩基配列対塩基配列データベースのBLAST検索(BLASTN)、タンパク質配列対タンパク質配列データベースのBLAST検索(BLASTP)、および付属のホモロジー解析機能、マルチプルアライメント機能を用いて行った。
(3−1)フォスミドゲノムライブラリーの作製
AM12菌株をYPD培地で30℃、8時間培養し、菌体を回収後、Genomic DNA Buffer Set & Genomic−tip (キアゲン製)を用いてゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAをDNA断片化装置によりランダムに断片化し、Mighty Cloning Blunt End(タカラバイオ製)を使用してDNA断片の末端を平滑処理し、パルスフィールド電気泳動による33〜48kb付近のサイズのDNAをゲルから分画した。切り出したゲル断片からDNAを精製し、インサートDNAとした。調整したインサートDNA断片とベクターpCC1FOS(EPICENTER製)をT4DNAリガーゼ(タカラバイオ製)を用いて4℃で終夜ライゲーション反応を行なった。ベクターライゲーション後、MaxPlax Lambda packaging Extract(EP ICENTER製)を用いて、in vitro packagingを行った。ライブラリーの一部を用いて宿主大腸菌EPI300に形質転換し、タイターを測定した。また、ランダムに選択した16個の白コロニーよりFosmid DNAを抽出し、Not Iで制限酵素処理した後、パルスフィールド電気泳動でインサートサイズが30Kb以上であることを確認した。
約1万クローン分のライブラリー溶液を宿主大腸菌EPI300に導入し、形質転換体を作製した。方法は、10mM MgSO4と0.2%(w/v)のマルトースを添加したLB培地に宿主大腸菌EPI300のシングルコロニーを植菌し、37℃で3〜5時間振とう培養を行った。遠心して集菌し、上清を廃棄した後、上清と等量の10mM MgSO4に、菌体を懸濁した。
養した。終濃度が12.5μg/mlになるように、クロラムフェニコールを添加したLB寒天培地(100μmol/ml IPTG、40μg/ml X−Gal)に播種し、37℃で一晩培養した。クロラムフェニコール耐性寒天培地を入れた96穴プレートの1ウェルに、100クローンになるように形質転換体を添加し、終夜37℃で、静置培養をした。実際に含まれるクローン数は、これと同時に1ウェルに添加したのと同じ量をシャーレ寒天培地にプレーティングし計測した。
作製したクローンプールグリセロールストックプレートから一部をLB培地に植菌し、培養後にアルカリ−SDS法を用いてフォスミドDNAを調整し、20μL/wellの滅菌蒸留水に溶解した。
作製した各ウェルのクローンプールDNAを鋳型に、LA Taq polymerase(タカラバイオ製)、FLO9−3Fプライマー(配列番号14)、FLO9−2Rプライマー(配列番号15)を用いて、一次スクリーニングPCR(アニーリング温度55℃、30サイクル)を行った。PCR産物の電気泳動を行い、バンドが見られたウェルを一次陽性クローンとした。
5’−TGGTCAAGCAGTTATAGTGTA−3’
FLO9−2R(配列番号15)
5’−AGTTATCAAAGCATTCGCCAA−3’
得られた一次陽性クローンのPCR産物から直接、プライマーウォーキング法によってシーケンスを行い、獲得したクローンの塩基配列の一部を決定した。
酵母AM12菌株においてFLO9遺伝子が発現しているかどうか、また、その発現強度を調べるために、DNAマイクロアレイ解析を実施した。AM12菌株、及び非凝集性酵母としてS288C菌株をYPD培地で30℃、3時間培養し、菌体を回収後、実施例1と同様に、High Pure RNA Isolation kit(Roche Diagnostics製)を用いてTotal RNAの抽出を行った。抽出したRNAを用いてDNAマイクロアレイ実験を行った。DNAチップは、Yeast Oligo Microarray(V2)(Agilent Order Number 251507210525)(アジレント製)を用い、一色のラベリング方法で行った。このDNA
チップには標準株S288C株の全遺伝子6000個に対応したオリゴDNAがのっており、酵母より抽出したRNAとのハイブリダイゼーションにより各遺伝子の発現強度を測定することができる。FLO9に関しては、A_06_P1087のプローブを用いた。
(5−1)FLO1遺伝子の酵母発現ベクター(pAUR123−FLO1)の作製
サッカロマイセス属セレビシエY258菌株由来のYAR050W(FLO1)のORF領域(開始コドンから終止コドンを含む)を挿入したBG1805−ampベクターを保持する大腸菌DH5α株をOpen Biosystems社のYeast ORF collectionより入手した(カタログNo.YSC3867−9520537)。Y258菌株由来FLO1遺伝子の配列、及び推定される翻訳物の配列を配列番号18に示す。常法に従って大腸菌よりプラスミドを抽出し、それを鋳型にc02553−F2プライマー(配列番号20)及びc00258−R3プライマー(配列番号21)を用いてPCRを行い、FLO1 ORF領域を増幅した。得られたPCR産物を制限酵素Xho Iで処理し、電気泳動後、ゲルから目的サイズのバンドを切り出し、MagExtractor−PCR&Gel Clean up−キット(東洋紡製)を用いて抽出し、FLO1断片とした。一方、pAUR123ベクター(タカラバイオ製)を制限酵素Xho Iで処理後に、CIAP処理し、電気泳動後、ゲルから目的バンドを切り出し、MagExtractor−PCR&Gel Clean up−キット(東洋紡製)を用いて抽出し、pAUR123−Xho I断片とした。pAUR123−Xho I断片とFLO1断片はT4リガーゼを用いて連結し、連結物を大腸菌HST08Premium(タカラバイオ製)に形質転換し、アンピシリン耐性を示すコロニーを獲得した。コロニーを培養後、常法に従ってプラスミドを抽出精製し、プラスミドpAUR123−FLO1とした。シーケンス解析により、FLO1断片の挿入の向きが正しいことを確認した。
5’−CTGCTCGAGCTCATGACAATGCCTCATCGCTA−3’
c00258−R3プライマー(配列番号21)
5’−CGACTCGAGTTAAATAATTGCCAGCAATAAGGACGC−3’
実施例1で取得した酵母AM12菌株由来FLO9C末端の断片(171アミノ酸)は、Y258菌株由来FLO1(907アミノ酸、配列番号18)上の746番目アミノ酸から終止コドンまでの位置に該当する。そこで、Y258菌株由来のFLO1の746番目から終始コドンまでの領域とAM12菌株由来FLO9C末端の断片(171アミノ酸)とを置き換えたFLO1/FLO9キメラタンパク質を発現できるプラスミドの作製を行った。
Clean up−キット(東洋紡製)を用いて抽出し、FLO1−1−745断片とした。pAUR123−FLO9C断片とFLO1−1−745断片はIn−Fusionキット(タカラバイオ社製)を用いて連結し、連結物を大腸菌HST08 Premium(タカラバイオ社製)に形質転換し、アンピシリン耐性を示すコロニーを獲得した。コロニーを培養後、常法に従ってプラスミドを調製し、プラスミドpAUR123−FLO1/FLO9キメラとした。シーケンス解析により、FLO1/FLO9キメラ断片の配列、及び挿入の向きが正しいことを確認し、次の実験に用いた。
5’−CTGTGAATGATGTTGTTACG−3’
p123−R4プライマー(配列番号25)
5’−CAGTTGATTGTATGCTTGGT−3’
F1N−Fプライマー(配列番号26)
5’−GCATACAATCAACTGATGACAATGCCTCATCGCTA−3’
F9C−R1プライマー(配列番号27)
5’−CAACATCATTCACAGTAGCC−3’
文部科学省NBRP「酵母」から提供された非凝集性のサッカロマイセス属セレビシエBY1994株(DKD−5D、SH1994)を宿主として用いた。また、上述のpA
UR123−FLO1、pAUR123−FLO1/FLO9キメラ、pAUR123の3種類のプラスミドをそれぞれ酵母への導入に用いた。
前述のpAUR123−FLO1、pAUR123−FLO1/FLO9キメラ、FLO1遺伝子を持たないpAUR123のプラスミド(タカラバイオ社製)をそれぞれ導入した酵母株3種類について、オーレオバシジンの終濃度が1μg/mlになるように添加したYPD液体培地5mlに植菌し、30℃で2日間の振とう培養を行った。培養後に試験管を静置し、目視によって各株の凝集沈降性を比較した。
Claims (14)
- 配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列を、FLOタンパク質に組み込む遺伝子改変によって、凝集性が付与又は強化されたことを特徴とする酵母。
- 前記遺伝子改変が、前記FLOタンパク質に存在する配列番号1〜5で示されるアミノ酸配列の何れか又はこれら配列を3回以下の範囲で繰り返してなるアミノ酸配列を、前記配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列に置き換えるものであることを特徴とする請求項1記載の酵母。
- 配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列をコードするDNAを、FLO遺伝子に組み込む遺伝子改変によって、凝集性が付与又は強化されたことを特徴とする酵母。
- 前記遺伝子改変が、前記FLO遺伝子に存在する配列番号1〜5で示されるアミノ酸配列の何れかをコードするDNA又はこれら配列を3回以下の範囲で繰り返してなるアミノ酸配列をコードするDNAを、前記配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列をコードするDNAに置き換えるものであることを特徴とする請求項3記載の酵母。
- 前記遺伝子改変が、前記配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列をコードするDNAが組み込まれたベクターによって成されることを特徴とする請求項1〜4の何れかに記載の酵母。
- 宿主である非凝集性酵母に凝集性を付与してなることを特徴とする請求項1〜5の何れかに記載の酵母。
- 宿主である凝集性酵母の凝集性を強化してなることを特徴とする請求項1〜5の何れかに記載の酵母。
- 配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列を、FLOタンパク質に組み込む遺伝子改変によって、凝集性を付与又は強化することを特徴とする酵母の育種方法。
- 前記遺伝子改変が、前記FLOタンパク質に存在する配列番号1〜5で示されるアミノ酸配列の何れか又はこれら配列を3回以下の範囲で繰り返してなるアミノ酸配列を、前記配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列に置き換えるものであることを特徴とする請求項8記載の酵母の育種方法。
- 配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列をコードするDNAを、FLO遺伝子に組み込む遺伝子改変によって、凝集性を付与又は強化することを特徴とする酵母の育種方法。
- 前記遺伝子改変が、前記FLO遺伝子に存在する配列番号1〜5で示されるアミノ酸配列の何れかをコードするDNA又はこれら配列を3回以下の範囲で繰り返してなるアミノ酸配列をコードするDNAを、前記配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列をコードするDNAに置き換えるものであることを特徴とする請求項10記載の酵母の育種方法。
- 前記遺伝子改変が、前記配列番号1〜3で示される配列の繰り返しを4回以上有するアミノ酸配列をコードするDNAが組み込まれたベクターによって成されることを特徴とする請求項8〜11の何れかに記載の酵母の育種方法。
- 宿主である非凝集性酵母に凝集性を付与することを特徴とする請求項8〜12の何れかに記載の酵母の育種方法。
- 宿主である凝集性酵母の凝集性を強化することを特徴とする請求項8〜12の何れかに記載の酵母の育種方法。
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