CN104232611A - 一种重组布氏白僵菌蛋白酶k及其工业化生产与纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组布氏白僵菌蛋白酶K及其工业化生产与纯化方法，涉及基因改造和蛋白质工程技术领域，通过生物信息手段得到适于毕赤酵母重组表达的重组白僵菌蛋白酶K编码基因，合成该优化基因并在真核***表达成功，得到了酶活明显大于传统林伯氏白色念球菌蛋白酶K的重组蛋白酶K，并提供了该重组白僵菌蛋白酶K的工业化生产与纯化方法。本发明通过化学合成该编码基因并构建GS115/pPIC9K-ProK高产工程菌，克服了天然产品产量低、费用高的缺陷，并显著降低了相关产业的蛋白酶K使用成本，具有广泛的应用前景。

Description

一种重组布氏白僵菌蛋白酶K及其工业化生产与纯化方法

技术领域：

本发明涉及基因改造和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种重组布氏白僵菌蛋白酶K及其工业化生产与纯化方法。

背景技术：

蛋白酶K(Proteinase K,EC 3.4.21.64,又名肽链内切酶K、腐生真菌碱性蛋白酶、白色念球菌丝氨酸蛋白酶、白色念球菌蛋白酶K)，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。该蛋白可通过切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键降解天然角蛋白(keratin)，并因此而得名。由于蛋白酶K在盐酸胍(3M)、尿素(4M)和SDS(0.5-1％)中均可以稳定存在并具有降解蛋白质的能力，因而被广泛应用于脉冲电泳用染色体DNA制备、蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制品中的核酸酶。

蛋白酶K最早于1974年从林伯氏白色念球菌中纯化得到。但一直以来天然菌株培养困难、产量过低的问题严重阻碍了蛋白酶K的实际应用。1985年测定其天然氨基酸序列后，多个国家的研究者及相关公司投入了很大精力尝试实现该蛋白的大规模重组表达，于2000年前后实现该蛋白在大肠杆菌***中的重组表达，但此方法只能得到包涵体蛋白，变复性过程导致生产成本增高、产量损失严重；直到2008年左右才实现了该蛋白的毕赤酵母***分泌表达，至此，林伯氏白色念球菌蛋白酶K的生产和应用进入了一个快速发展的时期。与此同时，林伯氏白色念球菌蛋白酶K野生型及各种突变体的表达纯化专利在很短时间内被各大国际制药公司垄断(Patent No.:WO 02/072634A2,US 7368274B2)，作为后入者的中国企业很难绕开相关专利保护加入到该酶的研发、生产和销售过程中去。

为解决上述问题，本发明人对公开基因数据库中的蛋白酶K同源序列进行了深入的生物信息学分析，结合已有蛋白酶K晶体结构及保守位点比对，发现布氏白僵菌中的一种蛋白酶基因其编码产物可能具有完整的蛋白酶K生物学活性。经过编码基因优化改造、真核细胞-酵母细胞外分泌表达得到该重组蛋白酶，经生物化学及酶学实验测定证明该蛋白具有完整的蛋白酶K活性，且其蛋白酶活性较野生型林伯氏白色念球菌蛋白酶K高出50％。通过优化表达***，本发明人利用酵母细胞外分泌表达技术大规模发酵高效表达该重组蛋白酶K，并进一步提高该酶的活性及产量；采用高效亲和蛋白纯化方式，提高蛋白酶K在纯化过程中的回收率，实现该酶的规模化和连续化生产，完成了本发明。迄今为止，在专利文件及非专利文件中均未发现关于布氏白僵菌重组蛋白酶K工业生产的报道。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种活性好、设计合理、操作简单的重组布氏白僵菌蛋白酶K及其工业化生产与纯化方法。

本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：

一种重组布氏白僵菌蛋白酶K，含有全长氨基酸序列、特别是含有第99到第380位氨基酸序列或与该区段氨基酸序列同源性高于95％的氨基酸序列，且具有蛋白酶K的生物活性。

所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的DNA编码方法是将野生型布氏白僵菌蛋白酶K的编码序列替换为宿主细胞偏好密码子组成的DNA序列，减去原有信号肽序列并加入组氨酸标记及酶切位点后，再通过化学合成的方式制备得到的。

所述宿主细胞偏爱密码子为酵母偏爱密码子。

所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的表达载体具有这样的结构：将所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的DNA表达的启动子序列连接到编码重组氏白僵菌蛋白酶K的DNA上游，也可将终止子连接到重组氏白僵菌蛋白酶K的DNA下游。

所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的表达载体可选用pPICZ、pPICZ Q、pGAPZ、pGAPZ Q、pGAPZ Q A和pPIC9K中的任何一种，优选pPIC9K。

所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的表达载体中可***用于挑选重组体的选择标记基因或用于检测导入基因表达的报告基因。

所述选择标记基因包括但不限于潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，报告基因包括但不限于β-葡糖醛酸酶(GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、荧光素酶(LUC)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因。

所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的表达载体中可包含附加序列，使重组布氏白僵菌蛋白酶K以融合蛋白(与附加序列编码的蛋白或肽融合)的形式表达。

所述附加序列包括但不限于编码信号肽或前肽的核苷酸序列，以及编码His标签或GST标签的核苷酸序列。

所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的转化细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选真核细胞。

所述真核细胞包括但不限于酵母细胞，优选酵母细胞。

所述酵母细胞为毕赤酵母细胞、假丝酵母细胞、多型汉逊酵母细胞、球拟酵母细胞、裂殖酵母细胞和克鲁维酵坶细胞中的一种，优选毕赤酵母细胞。

所述毕赤酵母细胞为GS115酵母细胞，并采用电击转化法获得毕赤酵母的转化体：先将线性化表达载体转化到酵母感受态细胞中，再将菌体悬液涂布于平板上，培养平板直至出现单个菌落。

所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的试剂盒包含重组氏白僵菌蛋白酶K、编码重组氏白僵菌蛋白酶K的DNA、表达载体及转化细胞中的一种或多种。

所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的试剂盒还可另外包括一种或多种组分，组分由试管、反应缓冲液、PCR引物、dNTP、Taq聚合酶、逆转录酶、DNA酶、RNA酶抑制剂、DEPC水和无菌水构成，但不总限于此。

一种重组布氏白僵菌蛋白酶K的工业化生产方法，包括如下步骤：

1)从挑取的转化子中得到重组布氏白僵菌蛋白酶K表达量最高的20个菌株，摇瓶培养，离心得到发酵上清液，再进行酶活、表达产量、消化BSA等试验，进一步选取一株最好菌株进行中试放大试验；

2)在14L发酵罐水平进行最佳培养条件探索，包括培养基配方、溶氧量、诱导时间和诱导剂甲醇的用量；

3)将14L发酵罐得到的发酵条件移植到500L发酵罐生产规模试验，完全复制中试发酵条件，连续发酵培养48、72、108h，在线监控各项发酵指标和电泳测定蛋白表达水平，下罐离心分离菌体和发酵液。

所述中试发酵条件采用YPD培养基和MM培养基，甲醇诱导时间为48、108h，溶氧量为20％、30％、40％，甲醇用量为0.5％、3％(v/v)。

一种重组布氏白僵菌蛋白酶K的纯化方法，包括如下步骤：在重组布氏白僵菌蛋白酶K的C端添加六聚组氨酸标签，发酵液首先经离心分离，上清液再经金属离子螯合亲和层析纯化，然后再经离子交换层析纯化、浓缩，最后冻干成为成品酶。

本发明的有益效果是：

1)首次优化得到适于毕赤酵母重组表达的布氏白僵菌蛋白酶K编码DNA，通过化学合成上述编码基因并构建GS115/pPIC9K-ProK高产工程菌，克服天然产品产量低、费用高的缺陷；

2)通过摇瓶及发酵罐大量获得活性高于现有市售野生型林伯氏白色念球菌蛋白酶K的重组布氏白僵菌蛋白酶K产品；

3)避免了传统纯化方法中多步骤使用超滤导致大部分蛋白沉淀而导致收率降低的缺陷，从而使得综合回收率相比现有技术提高了80％。

4)显著降低相关产业的蛋白酶K使用成本，具有广泛的应用前景。

附图说明：

图1为本发明酵母表达载体PIC9K载体图谱；

图2为本发明利用SDS-PAGE电泳检测重组布氏白僵菌蛋白酶K在GS115菌株中的表达情况(实验室规模；摇瓶发酵)；

图3为本发明利用SDS-PAGE电泳检测不同条件下重组布氏白僵菌蛋白酶K前体自我剪切形成成熟蛋白酶K的结果；实施方式中没有提到图3！

图4为本发明利用SDS-PAGE电泳检测相同蛋白浓度条件下重组布氏白僵菌蛋白酶K与林伯氏白色念球菌蛋白酶K降解小牛血清BSA的效果；

图5为本发明F-C分析法酪氨酸标准曲线；

图6为本发明利用SDS-PAGE电泳检测重组布氏白僵菌蛋白酶K在中试发酵条件下的表达情况(生产规模；发酵罐发酵)。

具体实施方式：

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

1)布氏白僵菌蛋白酶K毕赤酵母重组表达优化编码基因的获得：

从GeneBank数据库中查询得到布氏白僵菌蛋白酶K原始cDNA序列(Gene ID:AY520815，SEQ ID NO.2)，按照毕赤酵母细胞内tRNA丰度数据，将布氏白僵菌蛋白酶K原始编码基因中的稀有三联体密码子替换为毕赤酵母细胞中tRNA丰度最高的相应密码子核苷酸，最终获得适于毕赤酵母重组表达的布氏白僵菌蛋白酶K优化基因编码序列。该优化过程中布氏白僵菌蛋白酶K原始cDNA序列中信号肽编码区段被去除，且最终A+T碱基数达到序列全长的50％，符合毕赤酵母重组表达要求(SEQ ID NO.3)。

2)重组布氏白僵菌蛋白酶K表达载体pPIC9K-ProK的构建：

将野生型布氏白僵菌蛋白酶K的编码序列(SEQ ID NO.2)替换为由毕赤酵母偏好密码子组成的DNA序列，在其5’端添加EcoRⅠ酶切位点GAATTC，3’端顺次添加六聚组氨酸标签CACCATCACCACCATCAC(SEQ ID NO.4)、终止密码子TAA及NotⅠ酶切位点GCGGCCGC，利用化学方法合成所得的序列(SEQ ID NO.5)(生工生物工程(上海)股份有限公司)。上述化学合成的序列己克隆至pUC57质粒中(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

扩增pUC57/ProK质粒，分别用限制性内切酶EcoR I、Not I将ProK编码序列切下，与进行同样双酶切的pPIC9K载体(美国Invitrogen公司)连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取克隆，扩增质粒，分别用限制性内切酶EcoR I、Not I鉴定质粒。

通过上述方法，将编码野生型布氏白僵菌蛋白酶K的DNA片段亚克隆至酵母表达载体pPIC9K中(如图1所示)，从而构建出野生型蛋白酶K表达载体pPIC9K-ProK。

测序结果表明，目标片段正确***上述表达载体中。

3)重组布氏白僵菌蛋白酶K表达载体pPIC9K-ProK的转化：

利用限制性内切酶SalⅠ酶切步骤2中所构建的重组质粒，使之线性化，然后用TE缓冲液(pH 8.0)溶解至lμg/μL的浓度，取20μL溶解的质粒与GS115酵母感受态细胞混匀，转移至冰预冷的电转杯(两极间隙0.1cm)中，冰浴5min。采用电击转化的方法，利用电转化仪内置的毕赤酵母转化参数进行电击，将上述表达载体转化到GS115酵母感受态细胞中。

电击完毕后，迅速向电转杯中加入1mL冰预冷的1M山梨醇溶液，轻轻混匀，转至1.5mL EP管中。将菌体悬液涂布于MD平板(13.4g/L酵母基础氮源、0.4mg/L坐物素、20g/L葡萄糖、1.5％琼脂)上，每500μL涂布一块平板。将平板置于30℃环境培养直至出现单个菌落，得到GS115/pPIC9K-ProK。

4)高拷贝数和Mut⁺表型的GS115/pPIC9K-ProK的筛选：

分别配制四个G418浓度梯度(0.75mg/mL、1mg/mL、1.75mg/mL、2.0mg/mL)的YPD筛选平板(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，1.5％琼脂)。对于在步骤3中进行培养的MD平板，用无菌牙签各挑取50个酵母单菌落，点在上述四个G418浓度梯度的YPD筛选平板中，并作相应编号。每个克隆均做4个梯度的筛选。

pPIC9K表达载体能够赋予毕赤酵母遗传霉素抗性，其抗性水平主要依赖于整合的kan基因的拷贝数。单拷贝的pPIC9K整合到毕赤酵母基因组后，可赋予毕赤酵母约0.25mg/mL的遗传霉素抗性水平。由于kan基因与表达盒(pAOX1及目的基因)之间存在遗传连锁，因而可根据遗传霉素的抗性水平来大致推断该克隆所包含的目标蛋白编码基因拷贝数。

通过观察上述筛选平板，初步判定GS115/pPIC9K-ProK酵母克隆是否含有高拷贝数的目标蛋白编码基因。筛选平板中G418的含量越高，且酵母菌落生长外形越大，表明该酵母单克隆中含有较多目标蛋白基因的拷贝，能够耐受较高浓度的G418。

同时，对上述单克隆进行PCR鉴定。引物为5'AOX1(SEQ ID NO.6)、3'AOX1(SEQ ID NO.7)。

5'AOX1:GACTGGTTCCAATTGACAAGC

3'AOX1:GCAAATGGCATTCTGACATCC

PCR体系(50μL)：

PCR反应条件为：98℃预变性10min，98℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸2min，反应进行30个循环。

利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小。用SalⅠ线性化质粒转化GS115后，大多在HIS4位点上发生重组，大多数转化子是Mut⁺表型；然而由于质粒含有AOX1基因序列，有可能在AOX1位点发生重组，破坏野生型AOX1基因，产生Mut^s转化子。因此，理论上，若目的片段***成功且表型为Mut⁺，应有2200bp左右、1632bp左右的两条条带；若只有1632bp一条条带，则表型可能为Mut^s。

PCR结果显示可以扩增出2200bp左右的条带，表明目的片段***成功，且表型为Mut⁺。

SEQ ID NO.1-NO.7的序列表如下所示：

①SEQ ID NO.1布氏白僵菌蛋白酶K氨基酸序列

②SEQ ID NO.2布氏白僵菌蛋白酶K编码DNA序列(1143bp)

③SEQ ID NO.3密码子优化后的重组布氏白僵菌蛋白酶K编码DNA序列(1098bp)

④SEQ ID NO.4六聚组氨酸标签DNA序列(18bp)

caccatcacc accatcac   18

⑤SEQ ID NO.5化学合成方式制备的重组布氏白僵菌蛋白酶K的DNA序列(1130bp)

⑥SEQ ID NO.65'AOX1引物DNA序列(21bp)

gactggttcc aattgacaag c   21

⑦SEQ ID NO.73'AOX1引物DNA序列(21bp)

gcaaatggca ttctgacatc c   21

5)重组布氏白僵菌蛋白酶K在酵母细胞中的表达及检测(实验室规模)：

将步骤4筛选得到的高拷贝数和Mut⁺表型的GS115/pPIC9K-ProK的酵母单菌落接种至20mL YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)中，30℃，250rpm培养24h。1500g离心收集菌体。用10mL MM培养基(13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，5mL/L甲醇)重悬菌体。随后在30℃，250rpm下摇瓶(2L)诱导表达。每4-8h从发酵液中取样以备检测，并向诱导表达的发酵液中补加终浓度为1％(v/v)的甲醇。连续5d，共培养108h。

培养后，离心培养基，从而得到含有上述重组布氏白僵菌蛋白酶K的发酵液上清，并置于4℃保存。

利用SDS-PAGE检测本发明的重组布氏白僵菌蛋白酶K在酵母细胞中的表达，SDS-PAGE配方如下：

在小烧杯中依次加入12％分离胶所需溶液成分，灌入预先装配好的双层玻璃板的间隙中，室温放置20min以上，直至凝胶聚合完全。再在小烧杯中依次加入5％浓缩胶所需溶液成分，灌入双层玻璃板间己凝聚的分离胶上方的间隙，室温放置20min以上，直至凝胶聚合完全。

2×SDS蛋白上样buffer配方：1.5M Tris-HCL pH 6.8 10ml，4g SDS，溴酚蓝0.2g，甘油40ml，加双蒸水定容至100ml。

将GS115/pPIC9K-ProK的培养基上清由4℃冰箱取出，取20μL上清液混合等体积的2×SDS蛋白上样buffer后以沸水浴处理10min，12000g离心1min，吸取上清加入到如上制备的凝胶的样品孔道中，上样量为10μL，同时加入蛋白质分子量标准，200V恒压电泳1.5h，卸下凝胶。按下述配方所示配制染色液和脱色液，进行考马斯亮蓝染色，以观察样品中的目的蛋白条带。

染色液配方：双蒸水500ml；乙醇400ml；醋酸100ml；1g考马斯亮蓝R-250。

脱色液配方：双蒸水500ml；乙醇400ml；醋酸100ml。

结果如图2所示，摇瓶条件下培养到66h方可在发酵液上清(摇瓶发酵)中观察到明显的目的蛋白条带。

其中，蛋白质分子量标准(Unstained Protein Molecular Weight Marker，Fermentas)的5条可见的蛋白条带分别表示45kD、35kD、25kD、18.4kD及14.4kD的蛋白大小。

由电泳结果可见，本发明的重组布氏白僵菌蛋白酶K能够在酵母细胞中有效表达。

6)重组布氏白僵菌蛋白酶K的活性检测：

利用上述所得到的摇瓶培养发酵液上清，用BCA法测定蛋白质浓度，用PBS将发酵液上清的蛋白浓度调整到1mg/mL。同时用PBS将市售林伯氏白色念球菌蛋白酶K(宝生物工程(大连)有限公司)配制成1mg/mL酶溶液。

反应底物为盐酸胍变性的BSA：将5mg BSA溶于6M盐酸胍、50mMTris-CI(pH8.0)、5mM DTT，终体积为1mL。95℃水浴20min；降至室温后，加入50mM Tris-CI(pH 7.5)及5mM CaCI₂，使盐酸胍的终浓度降至2M以下。

反应温度：37℃，反应体系(10μL)为：BSA溶液4μL，酶溶液6μL。

混合反应液在37℃反应30s、1min、5min、10min和30min后迅速加入2×SDS蛋白上样buffer 10μL后，沸水浴处理10min。12000g离心1min，吸取上清加入到如上制备的凝胶的样品孔道中，上样量为10μL。同时加入蛋白质分子量标准(Unstained Protein Molecular Weight Marker，Fermentas)。200V恒压电泳1.5h后，卸下凝胶。进行考马斯亮蓝染色、脱色，以观察样品中的目的蛋白条带。

结果如图4所示，相同蛋白浓度、相同反应时间条件下，重组布氏白僵菌蛋白酶K对BSA的降解能力显著强于野生型林伯氏白色念球菌蛋白酶K。

结果表明本发明的重组布氏白僵菌蛋白酶K具有明显的蛋白酶活性且活性高于野生型林伯氏白色念球菌蛋白酶K。

7)重组布氏白僵菌蛋白酶K的比活性定量检测：

通过如下方法检测利用步骤5中的实验方案得到的本发明的重组布氏白僵菌蛋白酶K的酶活性。

用50mM磷酸钾溶液配制0.65％(w/v)干酪素溶液，缓慢加热直至形成单一均匀的分散体，在37℃下用1M HCl溶液或NaOH溶液调节pH至7.5。配制含10mM NaAc和5mM Ca(Ac)₂的溶液，在37℃下用0.1M HCI或NaOH调节pH至7.5。用冷却至室温的含10mM NaAc和5mM Ca(Ac)₂的溶液配制浓度为0.1～0.2U/mL的重组布氏白僵菌蛋白酶K溶液，此溶液为用前配制。

按照下列顺序依次加入各试剂(mL)：

37℃孵育30min并间歇地手动混匀，用50号滤纸过滤并收集澄清液进行下一步实验。

①标准曲线：

将10mL福林酚试剂用水稀释至40mL，配制0.5N F-C试剂。缓慢加热直至酪氨酸溶解并冷却至室温，配制1.1mM L-酪氨酸标准品溶液，然后依次加入下列试剂(mL)。

②样品测定：

在4个小瓶中，分别依次加入下列试剂(mL)：

37℃孵育并间歇地手动混匀，30min后取出小瓶冷却至室温。如果溶液呈现混浊状，用0.45μm滤膜过滤后有利于吸光度值测定。将反应液转移至玻璃容器中，用分光光度计在660nm处测定Stdl～5、空白、样品及对照的吸光度值。

结果计算：

标准曲线：△_660nm Std＝A_660nm Std-A_660空白

用△_660nm Std和L-酪氨酸的量(μmol)绘制标准曲线图。

所得标准曲线如图5所示。

样品测定：△_660nm样品＝A_660nm试样-A_660nm空白

利用标准曲线计算出释放的L-酪氨酸的量(μmol)。

酶活性(U/mL)＝(释放的L-酪氨酸的量(μmol))×11/(1×10×2)。

其中：11＝反应终止时的总体积(mL)，10＝反应时间(min)，1＝反应时酶试剂体积(mL)，2＝比色时所用反应液体积(mL)。

U/mg固体＝(U/mL酶)/(mg固体/mL酶)

U/mg蛋白＝(U/mL酶)/(mg蛋白/mL酶)

酶活性定义：1个酶活性单位定义为，在pH 7.5，37℃条件下，每分钟从干酪素中分解出1.0μmol(181μg)的L-酪氨酸。(福林酚法进行比色)

在6mL的反应体系中，试剂终浓度为：42mM磷酸钾，0.54％(w/v)干酪素，1.7mM NaAc，0.8mM Ca(Ac)₂和0.1～0.2U/mL的蛋白酶K溶液，结果如下表所示：

可见，本发明制备得到的重组布氏白僵菌蛋白酶K可显示出明显优于野生型林伯氏白色念球菌蛋白酶K的酶活性，其活性较本实验中所使用的两种市售林伯氏白色念球菌蛋白酶K比活均高出约50％

8)重组布氏白僵菌蛋白酶K的工业大规模生产及纯化：

从挑取的转化子中得到基因突变型重组蛋白酶K表达量最高的20个菌株。利用步骤5)中所述的实验方案，摇瓶培养20株工程菌株，从发酵液中纯化蛋白酶K并进行酶活、表达产量、消化BSA等试验，进一步选取一株最好菌株进行中试放大试验。

在14L发酵罐水平进行基因工程菌株最佳培养条件探索，参考美国Invitrogen公司的毕赤酵母培养方案，采用与摇瓶发酵中相同的培养基，甲醇诱导时间为108h，溶氧量控制在40％，诱导剂甲醇的用量为1.5％(v/v)，诱导后间隔8h取样，电泳分析蛋白酶K表达量。

将14L发酵罐得到的技术方案，移植到500L罐生产规模试验，完全复制中试发酵条件，连续发酵培养72h，随时在线监控各项发酵指标和电泳测定蛋白表达水平，下罐离心分离菌体和发酵液。

取诱导后不同时间段(16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h)的重组布氏白僵菌蛋白酶K菌株发酵液上清作为检测对象，进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图6所示。

其中，蛋白质分子量标准(Unstained Protein Molecular Weight Marker，Fermentas)的7条可见的蛋白条带分别表示116kD、66.2kD、45kD、35kD、25kD、18.4kD及14.4kD的蛋白大小。

由图6可见，利用该工业化大规模生产方式，可有效提高本发明的重组布氏白僵菌蛋白酶K的产率(高于200mg/L发酵液)。该产率优于摇瓶条件下的重组布氏白僵菌蛋白酶K(20mg/L发酵液)，从而使得后期纯化、冻干的高收率成为可能，为规模化工业生产提供了条件。

利用在重组布氏白僵菌蛋白酶K的C端添加的六聚组氨酸标签，极大减少了非特异性结合到纯化柱中的无关杂蛋白和核酸以及其它非特异性结合分子，发酵液经过10000rpm高速离心分离、金属螯合柱层析和离子交换柱层析分离、和冻干后成为成品酶，避免了传统纯化方法中多步骤使用超滤导致大部分蛋白沉淀而导致收率降低的缺陷，从而使得综合回收率相比现有技术提高了80％。

利用SDS-PAGE检测经上述工艺纯化后的蛋白酶K的纯度。结果如图3所示。可以看出，纯化后的重组蛋白酶K只具有全长前体蛋白酶K及自我剪切后的成熟蛋白酶K条带，两者总量超过总蛋白量的99％。在4℃、25℃及添加或不添加CaCl₂条件下放置24h后，绝大部分前体蛋白酶K均能自我剪切为成熟蛋白酶K。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (13)

1.一种重组布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：含有全长氨基酸序列、特别是含有第99到第380位氨基酸序列或与该区段氨基酸序列同源性高于95％的氨基酸序列，且具有蛋白酶K的生物活性。

2.根据权利要求1所述的一种重组布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的DNA编码方法是将野生型布氏白僵菌蛋白酶K的编码序列替换为宿主细胞偏好密码子组成的DNA序列，减去原有信号肽序列并加入组氨酸标记及酶切位点后，再通过化学合成的方式制备得到的，所述宿主细胞偏爱密码子为酵母偏爱密码子。

3.根据权利要求1所述的一种重组布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于，所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的表达载体具有这样的结构：将所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的DNA表达的启动子序列连接到编码重组氏白僵菌蛋白酶K的DNA上游，也可将终止子连接到重组氏白僵菌蛋白酶K的DNA下游。

4.根据权利要求3所述的一种重组布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的表达载体可选用pPICZ、pPICZ Q、pGAPZ、pGAPZ Q、pGAPZ Q A和pPIC9K，优选pPIC9K。

5.根据权利要求3所述的一种重组布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的表达载体中可***用于挑选重组体的选择标记基因或用于检测导入基因表达的报告基因，所述选择标记基因包括潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，报告基因包括β-葡糖醛酸酶(GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、荧光素酶(LUC)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因。

6.根据权利要求3所述的一种重组布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的表达载体中可包含附加序列，使重组布氏白僵菌蛋白酶K以融合蛋白(与附加序列编码的蛋白或肽融合)的形式表达，所述附加序列包括编码信号肽或前肽的核苷酸序列，以及编码His标签或GST标签的核苷酸序列。

7.根据权利要求1所述的一种重组布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的转化细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选真核细胞，所述真核细胞优选酵母细胞。

8.根据权利要求7所述的一种重组布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述酵母细胞可选用毕赤酵母细胞、假丝酵母细胞、多型汉逊酵母细胞、球拟酵母细胞、裂殖酵母细胞和克鲁维酵坶细胞，优选毕赤酵母细胞。

9.根据权利要求8所述的一种重组布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述毕赤酵母细胞为GS115酵母细胞，并采用电击转化法获得毕赤酵母的转化体：先将线性化表达载体转化到酵母感受态细胞中，再将菌体悬液涂布于平板上，培养平板直至出现单个菌落。

10.根据权利要求1所述的一种重组布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述重组布氏白僵菌蛋白酶K的试剂盒包含重组氏白僵菌蛋白酶K、编码重组氏白僵菌蛋白酶K的DNA、表达载体及转化细胞中的一种或多种，还可另外包括一种或多种组分，组分由试管、反应缓冲液、PCR引物、dNTP、Taq聚合酶、逆转录酶、DNA酶、RNA酶抑制剂、DEPC水和无菌水构成。

11.一种重组布氏白僵菌蛋白酶K的工业化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)从挑取的转化子中得到重组布氏白僵菌蛋白酶K表达量最高的20个菌株，摇瓶培养，离心得到发酵上清液，再进行酶活、表达产量、消化BSA等试验，进一步选取一株最好菌株进行中试放大试验；

2)在14L发酵罐水平进行最佳培养条件探索，包括培养基配方、溶氧量、诱导时间和诱导剂甲醇的用量；

3)将14L发酵罐得到的发酵条件移植到500L发酵罐生产规模试验，完全复制中试发酵条件，连续发酵培养48、72、108h，在线监控各项发酵指标和电泳测定蛋白表达水平，下罐离心分离菌体和发酵液。

12.根据权利要求11所述的一种重组布氏白僵菌蛋白酶K的工业化生产方法，其特征在于，所述中试发酵条件采用YPD培养基和MM培养基，甲醇诱导时间为48、108h，溶氧量为20％、30％、40％，甲醇用量为0.5％、3％(v/v)。

13.一种重组布氏白僵菌蛋白酶K的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：在重组布氏白僵菌蛋白酶K的C端添加六聚组氨酸标签，发酵液首先经离心分离，上清液再经金属离子螯合亲和层析纯化，然后再经离子交换层析纯化、浓缩，最后冻干成为成品酶。