JP4700395B2 - 酸性条件下で使用するためのプロモーター及びその利用 - Google Patents
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(a)配列番号1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号1に記載の塩基配列若しくはその一部に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(c)配列番号1に記載の塩基配列において1あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び/又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a)配列番号2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列若しくはその一部に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(c)配列番号2に記載の塩基配列において1あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び/又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a)配列番号3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号3に記載の塩基配列若しくはその一部に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(c)配列番号3に記載の塩基配列において1あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び/又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a)配列番号4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号4に記載の塩基配列若しくはその一部に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(c)配列番号4に記載の塩基配列において1あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び/又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
本発明のプロモーターは、本プロモーターに対して機能的に結合されたタンパク質をコードするDNAの発現を、有機酸の存在下においてはじめて活性化するか、有機酸の存在しないときよりも促進するか、あるいは有機酸の濃度が高まると促進するプロモーター活性を有する(以下、当該活性を本プロモーター活性という。)。ここで、「機能的な結合」とは、結合されたタンパク質をコードするDNAの発現を本プロモーターの影響下あるいは支配下におくような結合をいう。なお、「有機酸」とは、酸性を示す有機化合物であるが、有機酸が備える酸性基としては好ましくはカルボン酸基である。また、有機酸は、遊離の酸の他、有機酸塩を含む。このような有機酸として、具体的には、乳酸、酪酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、アジピン酸などを挙げることができ、好ましくは、乳酸である。乳酸には、L−乳酸、D−乳酸、及びDL−乳酸があるが、これらのいずれをも含む。「有機酸の存在下」とは、有機酸が本発明のプロモーター保持する宿主の成育環境において存在することを意味し、該有機酸は本発明のプロモーターを保持する宿主が生産するものであってもよいし、培地に対して添加されるなど宿主以外から供給されるものであってもよいし、これらの双方であってもよい。有機酸の培地における濃度は特に限定されず、本発明のプロモーターに機能的に結合されたDNAが発現されあるいは促進される範囲であればよい。
本発明は、本プロモーターを含むDNA構築物も提供する。本発明のDNA構築物は、特に限定しないでプラスミド(DNA)、ウイルス(DNA)、バクテリオファージ(DNA)、レトロトランスポゾン(DNA)、人工染色体(YAC、PAC、BAC、MAC等)を、外来遺伝子の導入形態(染色体外あるいは染色体内)や宿主細胞の種類に応じて選択してベクターとしての形態をとることができる。したがって、本DNA構築物は、本プロモーターDNAの他、これらのいずれかの態様のベクターとしてのDNA等を備えることができる。本DNA構築物は、好ましくは、プラスミドベクター又はウイルスベクターの形態を採る。また、好ましい原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクター、動物細胞性ベクター、植物細胞性ベクターは当該分野において周知である。本DNA構築物は、細胞質あるいは宿主細胞において宿主染色体外において保持されていてもよいし、また、宿主染色体に組み込まれて保持されていてもよい。
本DNA構築物は、適当な宿主細胞に、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウム法、PEG法、直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入することができる。これにより本発明の形質転換体を得ることができる。本DNA構築物の導入後、その宿主細胞は、選択培地で培養される。
本発明の物質生産方法は、これらの形質転換体のいずれかを準備する工程と、この形質転換体を有機酸を含む培地において培養する工程と、を備えている。本DNA構築物が導入されて得られる形質転換体を培養することにより、培養液などの培地中に外来遺伝子の発現産物であるタンパク質を生成させることができる。このような物質生産方法によれば、酸性条件下においてコードDNAの発現が促進されるため、培地に有機酸を添加するなどにより有機酸を培地に存在させることで、有用タンパク質の生産を促進することができる。また、コードDNAが有機酸生産に関与するタンパク質をコードするものである場合には、形質転換体による有機生産によって有機酸を培地に供給して有機酸を培地に存在させることができる。この結果、該コードDNAの発現が促進されて有機酸が生産されれば、それによって、さらにコードDNAの発現が促進される。なお、コードDNAが有機酸生産に関与するタンパク質をコードするものであっても、培地に外部から有機酸を添加することができる。
(定量的PCR法によるプロモーターの発現解析)
乳酸生産能をもつ組換え酵母として、特開2003−259878(特願2002−65879)で作製した組換え酵母を用い、中和剤を使用しない非中和条件下(pH1.0〜pH3.0)で乳酸発酵を行い、発酵開始6時間後と、30時間後の菌体を採取し、これよりRNAを調整した。RNAの調整にはRneasyMiniキット(キアゲン社製)を用いた。得られたRNAをファーストストランドcDNA合成キット(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)に従って、cDNA合成を行った。
実施例1において有効な発現を示した高発現候補プロモーターとして、上記4種類の遺伝子のプロモーターのDNA断片をクローニングした。またプロモーター評価のコントロールとして、高発現プロモーターとして知られるPDC1遺伝子プロモーターも取得した。
新たに構築したこの染色体導入型ベクターをそれぞれ、pBTRP−TDH1P−LDHベクター、pBTRP−TPI1P−LDHベクター、pBTRP−CCW12P−LDHベクター、pBTRP−RSP31P−LDHベクターと名付けた。また、プロモーター比較のコントロールとして、PDC1遺伝子プロモーター下でL−LDH遺伝子が発現可能なベクターについても構築し、これをpBTRP−PDC1P−LDHベクターと名づけた。以下に、本実施例におけるベクター構築工程の詳細を図1に基づいて説明するが、ベクター構築の手順はこれに限定されるものではない。なお、ベクター構築における一連の反応操作は、一般的なDNAサブクローニング法に準じて行い、一連の酵素類はタカラバイオ社製のものを使用した。
一般的なDNAサブクローニング法に従って、プレベクターpBTRP−LDHの構築を行った。本発明者らが既に構築したpBTrp−PDC1−LDHKCBベクター(特開2003−259878号公報に記載)を制限酵素ApaI、PstI処理して得られた断片を、同様の制限酵素で処理したpBluescriptII SK+ベクター(東洋紡社製)に導入し、pBTRP−PDC1Dベクターを構築した。続いて本ベクターに、PCR増幅によって取得しこれを制限酵素SacI、NotI処理したTRX1断片(700bp)と、PCR増幅によって取得しこれを制限酵素SpeI、BamHI処理したLDHKCB断片(2000bp)とを順次連結し、プレベクターpBTRP−LDHを構築した。
・PDCIP−LDH−U(31mer,Tm値58.3℃)未端に制限酵素BamH1サイトを付加:ata tat ggatcc gcg tttatt tac ctatctc (配列番号:28)
・PDClP−LDH−D(31mer、Tm値54.4℃)末端に制限酵素EcoRIサイトを付加:atatatgaat tctttgattg atttgactgt g(配列番号:29)
・PDC1D−LDH−U(34mer、Tm値55.3℃)未端に制限酵素XhoIサイトを付加:ata tat ctc gag gcc agctaa ctt cttggtcga c (配列番号:30)
・PDCID−LDH−D(31mer、Tm値54.4℃)末端に制限酵素ApaIサイトを付加:ata tat gaa ttc tttgat tga ttt gac tgtg (配列番号:31)
プレベクターpBTRP−LDHを制限酵素NotI、SpeI処理し、これに上記実施例3において取得したプロモーター配列を同様の制限酵素にて処理後、それぞれ連結させた最終ベクターを作製した。今回作製したpBTRP−TDH1P−LDHベクター、pBTRP−TPI1P−LDHベクター、pBTRP−CCW12P−LDHベクター、pBTRP−RSP31P−LDHベクターおよび比較コントロールとして作製したpBTRP−PDC1P−LDHベクターについての詳細なマップを図2〜図5に示す。
宿主である酵母IFO2260株(社団法人・発酵研究所に登録されている菌株)のトリプトファン合成能を欠損した株をYPD培養液10mlにて、30℃で対数増殖期(OD600nm=0.8)まで培養した。これにFrozen−EZ Yeast TransformationIIキット(ZYMO RESEARCH社製)を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピテントセルに上述の実施例4にて構築した染色体導入型ベクターを制限酵素PvuII処理し、遺伝子導入した。なお、具体的な導入ベクターは、pBTRP−TDH1P−LDHベクター、pBTRP−TPI1P−LDHベクター、pBTRP−CCW12P−LDHベクター、pBTRP−RSP31P−LDHベクターおよび比較コントロールとして作製したpBTRP−PDC1P−LDHベクターの5種類である。これらの形質転換試料を洗浄後、100μlの滅菌水に溶解させてトリプトファン選抜培地に塗沫し、それぞれについて30℃静置培養下で形質転換体の選抜を行った。
作製した形質転換体におけるL−乳酸生産量を測定し、高発現プロモーターとして知られるPDC1プロモーターを用いた乳酸生産量と比較することで、取得した4種類のプロモーターの非中和条件下での活性を検証した。得られた4種類の形質転換酵母をYPD液体培地5mlに植菌し、30℃、130rpmで一晩、振盪培養を行い、OD600nm=1.2のものを初発菌体とした。このうちの2mlを10%グルコース含有YPD培養液20ml、および10%相当のショ糖を含有したケーンジュース培養液20mlにそれぞれ植菌し(全量22ml)、中和剤として炭酸カルシウム(ナカライテスク社製)1gを添加したものを、30℃で、4日間静置培養した。乳酸生産量の測定には、多機能バイオセンサBF−4装置(王子計測機器社製)を用い、仕様の詳細は付属のマニュアルに従った。これらの結果を図6に示す。
配列番号:27 修飾されたウシ由来L−乳酸脱水素酵素をコードするDNA
配列番号:28〜31 合成プライマー
Claims (24)
- 以下の配列(a)〜(c)から選択されるポリヌクレオチドであって、酸性条件下において有機酸生産用プロモーター活性を有する、酸性条件下で使用するためのプロモーター。
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号1に記載の塩基配列若しくはその一部に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号1に記載の塩基配列との相同性が90%以上であるポリヌクレオチド
(c)配列番号1に記載の塩基配列において1あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び/又は付加された塩基配列からなり、配列番号1に記載の塩基配列との相同性が90%以上であるポリヌクレオチド
- 微生物における有機酸生産用プロモーターである、請求項1に記載のプロモーター。
- 酵母による有機酸生産用プロモーターである、請求項2に記載のプロモーター。
- 非中和条件下で有機酸を生産する有機酸生産用プロモーターである、請求項2又は3に記載のプロモーター。
- pHが1.0〜3.0において有機酸を生産する有機酸生産用プロモーターである、請求項2〜4のいずれかに記載のプロモーター。
- 宿主のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の発現が抑制された状態でピルビン酸に由来する有機酸を生産するための有機酸生産用プロモーターである、請求項2〜5のいずれかに記載のプロモーター。
- 酸性条件誘導的プロモーターである、請求項1〜6のいずれかに記載のプロモーター。
- 前記酸性条件は乳酸酸性条件である、請求項1〜7のいずれかに記載のプロモーター。
- 請求項1〜8のいずれかに記載のプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするDNAを備える、DNA構築物。
- 前記タンパク質は乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質である、請求項9に記載のDNA構築物。
- 前記タンパク質は、ウシ由来の乳酸脱水素酵素である、請求項10に記載のDNA構築物。
- さらに、オートレギュレーション機構を備えるピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の遺伝子破壊のための相同組換え用のDNAを備える、請求項9〜11のいずれかに記載のDNA構築物。
- 請求項9に記載のDNA構築物を保持する形質転換体。
- 前記プロモーター及び前記タンパク質をコードするDNAは、宿主染色体上に組み込まれている、請求項13に記載の形質転換体。
- 酵母である、請求項13又は14に記載の形質転換体。
- 前記酵母はサッカロマイセス属に属するものである、請求項15に記載の形質転換体。
- 宿主染色体上のオートレギュレーション機構を備えるピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の発現が抑制されている、請求項15又は16に記載の形質転換体。
- 前記タンパク質は、乳酸脱水素酵素活性を有する、請求項13〜17のいずれかに記載の形質転換体。
- 請求項13〜17のいずれかに記載の形質転換体を準備する工程と、
この形質転換体を有機酸を含む培地において培養する工程と、
を備える、有機酸生産方法。 - 前記培養工程は、前記宿主細胞による有機酸生産により前記培地に有機酸を供給することを含む工程である、請求項19に記載の物質生産方法。
- 前記培養工程は、前記培地に有機酸を添加することを含む工程である、請求項19又は20に記載の方法。
- 前記タンパク質は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、
前記培養工程は、乳酸を生産する工程である、請求項19〜21のいずれかに記載の方法。 - 前記培養工程は、培地を中和することなく前記形質転換体を培養する工程である、請求項19〜22のいずれかに記載の方法。
- 前記培養工程は、培地のpHが1.0〜3.0の範囲で前記形質転換体を培養する工程である、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
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