JP2011200224A - Evaluation device and evaluation method of percutaneous absorption - Google Patents
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Description
本発明は、物質の皮膚透過量と透過した物質の有効性及び／又は安全性の評価を同時に測定できることを特徴とする経皮吸収評価装置及びその評価方法に関する。 The present invention relates to a percutaneous absorption evaluation apparatus and an evaluation method thereof capable of simultaneously measuring the amount of substance permeated through the skin and the evaluation of the effectiveness and / or safety of the permeated substance.
従来、物質の経皮吸収については、フランツ型セルやｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅセルなどを利用して皮膚を透過した物質量を測定し、得られた累積透過量からＦｌｕｘなどの物質透過パラメータを算出し、物質そのもの、あるいは製剤のポテンシャルを評価するものである。一方、物質の有効性及び／又は安全性の評価は、細胞に直接物質を暴露させてその生理活性を評価してきた。そのため、皮膚に吸収された物質が、実際に標的とする細胞までどのくらい送達されるのか、そして、送達された物質が本当に有効性及び／又は安全性を示すのかを同時に評価する方法はなく、間接的に考察するのみであった。 Conventionally, for percutaneous absorption of substances, the amount of substance that has permeated through the skin is measured using a Franz-type cell or side-by-side cell, and the substance permeation parameters such as flux are calculated from the obtained accumulated permeation amount. The potential of the substance itself or the drug product is evaluated. On the other hand, evaluation of the effectiveness and / or safety of a substance has been performed by exposing the substance directly to cells and evaluating its physiological activity. Therefore, there is no way to evaluate at the same time how much the substance absorbed into the skin is delivered to the target cells and whether the delivered substance really shows efficacy and / or safety, but indirectly It was only considered.
ところで、共培養物を利用した技術及び評価方法としては、賦活化する物質をスクリーニングすること等に応用できる共培養物に関する技術（特許文献１）や、アレルゲンの評価で２つの細胞を共培養したものを利用する技術（特許文献２）のなどが報告されている。また、メラノサイト及びケラチノサイトを共培養してメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送を検出する方法について報告されている（特許文献３）。しかしながら、一般には、安定かつ効率的に共培養物を作成する条件を見出すには、培地の最適化やｐＨの調整など非常に煩雑な作業を要する。 By the way, as a technique and an evaluation method using a co-culture, two cells were co-cultured by a technique (Patent Document 1) applicable to screening a substance to be activated (Patent Document 1) or allergen evaluation. A technique using a device (Patent Document 2) has been reported. Further, a method for detecting melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes by co-culturing melanocytes and keratinocytes has been reported (Patent Document 3). However, in general, in order to find a condition for stably and efficiently preparing a co-culture, very complicated work such as optimization of a medium and adjustment of pH is required.
また、物質の有効性や安全性を容易に試験するための装置として、再構成組織のサンプルと、物理的、生物学的及び／又は化学的刺激がサンプルに与える影響、又はサンプルが物理的、生物学的及び／又は化学的刺激に与える影響を検出システムと関連づけた装置や（特許文献４）、再構成表皮と免疫細胞を共培養することで、より皮膚に近い安定な評価モデルとなりうることが報告されているが、物質の皮膚透過量と透過した物質の有効性及び／又は安全性の評価を同時に測定できることを特徴とする経皮吸収評価装置及びその評価方法についての報告はこれまでにない。 In addition, as a device for easily testing the effectiveness and safety of substances, the sample of reconstituted tissue and the effects of physical, biological and / or chemical stimuli on the sample, or the sample is physically It can be a stable evaluation model that is closer to the skin by co-culturing an apparatus that associates the effect on biological and / or chemical stimulation with a detection system (Patent Document 4), or reconstructed epidermis and immune cells. However, there has been no report on a transdermal absorption evaluation device and its evaluation method characterized in that it can simultaneously measure the amount of substance permeated through the skin and the effectiveness and / or safety of the permeated substance. Absent.
上述の通り、従来、物質の皮膚透過量と透過した物質の有効性及び／又は安全性の評価を同時に測定できることを特徴とする経皮吸収評価装置及びその評価方法については知られていない。従って、新規の物質の皮膚透過量と透過した物質の有効性及び／又は安全性の評価を同時かつ簡便に測定できる経皮吸収評価装置及びその評価方法を提供することを目的とする。 As described above, conventionally, a transdermal absorption evaluation apparatus and an evaluation method thereof that can simultaneously measure the amount of substance permeated through the skin and the effectiveness and / or safety of the permeated substance have not been known. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a percutaneous absorption evaluation apparatus and an evaluation method thereof capable of simultaneously and simply measuring a skin permeation amount of a new substance and an effectiveness and / or safety evaluation of the permeated substance.
本発明者らは、物質の皮膚透過量と透過した物質の有効性及び／又は安全性の評価を同時に測定できることを特徴とする経皮吸収評価装置及びその評価方法について鋭意研究した結果、表皮等価物と、評価対象細胞とを用いた装置、より好ましくは表皮等価物として培養皮膚と評価対象細胞とを共培養した装置を用いることにより、物質の皮膚透過量と透過した物質の有効性及び／又は安全性の評価を同時に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of earnest research on the percutaneous absorption evaluation apparatus and its evaluation method characterized in that the present inventors can simultaneously measure the skin permeation amount of the substance and the effectiveness and / or safety evaluation of the permeated substance. And a device using the cells to be evaluated, and more preferably using a device in which the cultured skin and the cells to be evaluated are co-cultured as the epidermis equivalent, Or it discovered that safety | security evaluation could be measured simultaneously and came to complete this invention.
本発明に記載の経皮吸収評価装置を用いることにより、従来、物質の皮膚透過量と透過した物質の有効性及び／又は安全性の評価を同時に困難だった評価を、簡便かつ迅速に測定できる。従って、物質及び／又は物質を含む外用組成物がもつ、皮膚に対する効果を直接的に測定できることから、実際に皮膚に塗布して有効に作用する物質及び／又は物質を含む外用組成物の開発を効率よくおこなうことができる。 By using the percutaneous absorption evaluation apparatus described in the present invention, it is possible to easily and quickly measure an evaluation that has been difficult at the same time because of the amount of permeation through the skin and the effectiveness and / or safety of the permeated substance. . Therefore, since the effect on the skin of the substance and / or the external composition containing the substance can be directly measured, the development of the external composition containing the substance and / or substance that acts effectively when actually applied to the skin. It can be done efficiently.
以下、本発明の構成を更に詳細に説明する。
本発明に係わる経皮吸収評価装置は、表皮等価物と、評価対象細胞とを用いるものである。本発明に係わる経皮吸収評価装置は、物質の皮膚透過量と透過した物質の有効性及び／又は安全性の評価を同時に測定することができる。
Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in more detail.
The transdermal absorption evaluation apparatus according to the present invention uses an epidermis equivalent and cells to be evaluated. The percutaneous absorption evaluation apparatus according to the present invention can simultaneously measure the amount of substance permeated through the skin and the evaluation of the effectiveness and / or safety of the permeated substance.
本発明で用いる表皮等価物としては、培養皮膚、シリコンフィルム、濾過膜、セルロース膜からなる群から選択される１種又は２種以上を挙げることができる。これらは特に限定されるものではないが、物質の代謝を含め、より皮膚に近い環境で測定することが望ましい場合は、再構成皮膚を用いて評価対象細胞と共培養して用いることが望ましいが、おおよその見当をつける場合など安価に評価する場合はその限りではない。 Examples of the epidermal equivalent used in the present invention include one or more selected from the group consisting of cultured skin, silicon film, filtration membrane, and cellulose membrane. These are not particularly limited, but when it is desirable to measure in an environment closer to the skin, including metabolism of the substance, it is desirable to use the reconstructed skin and co-culture with the cells to be evaluated. However, this is not the case when evaluating cheaply, such as when making approximate estimates.
培養再構成皮膚としては、ＲＨＥ再生ヒト表皮モデル（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製）、ＥＰＩＳＫＩＮ再生ヒト表皮モデル（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製）、皮膚３次元モデルＥＰＩ−２００・２１２・２００Ｘ・６０６・６０６Ｘ・２０１（ＭａｔＴｅｋ社製）、皮膚３次元モデルＥＦＴ−４００・４１２（ＭａｔＴｅｋ社製）、ＴＥＳＴＳＫＩＮTM（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ＬＳＥ−ｈｉｇｈ ＭＡＴＲＥＸTM ＬＤＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ、（Ｊ−ＴＥＣ社製）などの市販品が挙げられるが、再構成皮膚の強度が強い点を考慮するとＲＨＥ再生ヒト表皮モデルおよび、ＥＰＩＳＫＩＮ再生ヒト表皮モデルを用いるのが望ましい。なお、種類の異なる単層培養細胞を共培養するためには、培地の最適化やｐＨの選定など非常に煩雑な作業を要するが、再構成皮膚を用いることで簡便に評価対象細胞との安定かつ効率的に共培養物を作成することができる。 As the cultured reconstructed skin, RHE regenerated human epidermis model (manufactured by SkinEthic), EPISKIN regenerated human epidermis model (manufactured by SkinEthic), three-dimensional skin model EPI-200 / 212 / 200X / 606 / 606X / 201 (manufactured by MatTek) ), Skin three-dimensional model EFT-400 / 412 (manufactured by MatTek), TESTSKIN ™ (manufactured by TOYOBO), LSE-high MATREX ™ LDM (manufactured by TOYOBO), LabCyte EPI-MODEL, (manufactured by J-TEC), etc. However, it is preferable to use the RHE regenerated human epidermis model and the EPISKIN regenerated human epidermis model in view of the strength of the reconstructed skin. Note that co-culture of different types of monolayer cultured cells requires extremely complicated operations such as medium optimization and pH selection. And a co-culture can be created efficiently.
本発明で用いる評価対象細胞としては、線維芽細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、ランゲルハンス細胞、単球細胞、色素細胞などが挙げられ、これらを１種又は２種以上用いることができる。これらの評価対象細胞は、有効性及び／又は安全性の評価目的によって適宜選択されるべきである。 Examples of evaluation target cells used in the present invention include fibroblasts, adipocytes, vascular endothelial cells, Langerhans cells, monocyte cells, pigment cells, and the like, and one or more of these can be used. These cells to be evaluated should be appropriately selected depending on the purpose of evaluating efficacy and / or safety.
有効性の評価に用いる細胞としては、特に限定されるものではないが、線維芽細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、色素細胞などが挙げられる。安全性の評価に用いる細胞としては、特に限定されるものではないが、ランゲルハンス細胞、単球細胞などが挙げられるほか、細胞毒性を評価する場合は、血管内皮細胞や線維芽細胞などを用いることもできる。 Although it does not specifically limit as a cell used for effectiveness evaluation, A fibroblast, an adipocyte, a vascular endothelial cell, a pigment cell etc. are mentioned. Cells used for safety evaluation are not particularly limited, but include Langerhans cells, monocyte cells, etc. In addition, when evaluating cytotoxicity, vascular endothelial cells, fibroblasts, etc. should be used. You can also.
評価対象細胞として、線維芽細胞を用いた場合、経皮吸収した物質が発現する線維芽細胞におけるコラーゲン産生作用、ヒアルロン酸産生作用、エラスチン産生作用、細胞増殖促進及び／又は抑制作用、各種サイトカイン産生促進及び／又は抑制作用の評価、フィブリリン産生作用、コラーゲナーゼなどのマトリクスメタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼなどの活性及び／又は産生阻害などのプロテアーゼ活性抑制作用などの評価をおこなうことができる。 When fibroblasts are used as cells to be evaluated, collagen production, hyaluronic acid production, elastin production, cell growth promotion and / or suppression, and various cytokine production in fibroblasts that express percutaneously absorbed substances. Evaluation of promotion and / or inhibition activity, fibrillin production activity, activity of matrix metalloprotease such as collagenase, serine protease, cysteine protease, aspartic protease, and / or inhibition of protease activity such as production inhibition Can do.
評価対象細胞として、脂肪細胞を用いた場合、経皮吸収した物質が発現する脂肪細胞における脂質分解作用、リパーゼ活性阻害、細胞増殖促進及び／又は抑制作用、各種サイトカイン産生促進及び／又は抑制作用などの評価をおこなうことができる。 When adipocytes are used as the cells to be evaluated, lipolysis action, lipase activity inhibition, cell growth promotion and / or suppression action, various cytokine production promotion and / or suppression action, etc. in adipocytes expressing transdermally absorbed substances Can be evaluated.
評価対象細胞として、血管内皮細胞を用いた場合、経皮吸収した物質が発現する血管内皮細胞における細胞増殖促進及び／又は抑制作用、一酸化窒素産生作用、各種サイトカイン産生促進及び／又は抑制作用などの評価をおこなうことができる。各種サイトカインとしては、特に限定されるものではないが、インターロイキン、インターフェロン、ＴＧＦ、ＦＧＦ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、エイコサノイド、ＳＣＦ、ＭＣＰ及びＣＳＦなどが挙げられる。これらの評価をすることで、抗炎症作用、抗老化作用、美白作用、などの有効性を評価することができる。 When vascular endothelial cells are used as the cells to be evaluated, cell proliferation promotion and / or suppression action, nitric oxide production action, various cytokine production promotion and / or inhibition action, etc. in vascular endothelial cells expressing the percutaneously absorbed substance Can be evaluated. Examples of various cytokines include, but are not limited to, interleukin, interferon, TGF, FGF, KGF, HGF, IGF, eicosanoid, SCF, MCP, and CSF. By performing these evaluations, the effectiveness of anti-inflammatory action, anti-aging action, whitening action, etc. can be evaluated.
評価対象細胞として、ランゲルハンス細胞を用いた場合、経皮吸収した物質が発現するランゲルハンス細胞における各種表面抗原産生促進及び／又は抑制作用などの評価をおこなうことができる。 When Langerhans cells are used as the cells to be evaluated, various surface antigen production promotion and / or inhibitory effects in Langerhans cells in which a percutaneously absorbed substance is expressed can be evaluated.
評価対象細胞として、単球細胞を用いた場合、経皮吸収した物質が発現する単球細胞における感作性などの評価をおこなうことができる。 When monocyte cells are used as the cells to be evaluated, it is possible to evaluate sensitization in monocyte cells in which a substance absorbed through the skin is expressed.
評価対象細胞として、色素細胞を用いた場合、経皮吸収した物質が発現する色素細胞におけるメラニン産生促進及び／又は抑制作用、チロシナーゼ活性促進及び／又は抑制作用、チロシナーゼ産生促進及び／又は抑制作用、各種サイトカイン産生促進及び／又は抑制作用の評価をおこなうことができる。 When pigment cells are used as cells to be evaluated, melanin production promotion and / or suppression action, tyrosinase activity promotion and / or inhibition action, tyrosinase production promotion and / or inhibition action in pigment cells in which a substance absorbed through the skin is expressed, Various cytokine production promotion and / or inhibitory effects can be evaluated.
評価対象となる物質は、主に化粧品及び／又は医薬品に利用できる成分を対象とし、そのまま皮膚等価物に塗布することもできるし、水、油性成分、各種溶媒などに溶解又は分散物として、更に乳化製剤として適用することもできる。また、化粧品、例えば抗老化用化粧品、美白用化粧品、保湿用化粧品、サンスクリーン化粧品、トイレタリー製品、医薬品製剤などを塗布することができる。 Substances to be evaluated mainly target components that can be used in cosmetics and / or pharmaceuticals, and can be applied directly to the skin equivalent, or dissolved or dispersed in water, oily components, various solvents, etc. It can also be applied as an emulsified preparation. In addition, cosmetics such as anti-aging cosmetics, whitening cosmetics, moisturizing cosmetics, sunscreen cosmetics, toiletry products, pharmaceutical preparations and the like can be applied.
化粧品及び／又は医薬品に利用できる成分のうち、生理活性成分としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、テトライソパルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、トラネキサム酸及びその誘導体、エラグ酸、ルシノールなどの美白剤、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、アミノ酸、糖類、ムコ多糖、セラミド、ステロール及びその誘導体、リン脂質及びそれらの誘導体などの肌荒れ防止剤、レチノール及びそれらの誘導体、ビタミンＡ酸およびそれらの誘導体、コトリエノール、ユビキノン、アロエ、オウゴンなどの抗老化剤や各種ビタミン類やその誘導体、トコフェロール、酢酸トコフェロール、ＳＯＤ、β−カロテン、カテキン、ポリフェノールなどの抗酸化剤、カフェイン、カカオ、セイヨウキズタ、ビスナジンなどのスリミング剤、カモミラ、シソ、カルニチン、リン脂質及びそれらの誘導体、機能性多糖などの抗炎症剤などが挙げられる。 Among the components that can be used in cosmetics and / or pharmaceuticals, bioactive ingredients include ascorbic acid, magnesium ascorbate phosphate, ascorbyl palmitate, ascorbyl stearate, ascorbyl tetraisopalmitate, ascorbyl glucoside, arbutin, tranexamic acid And derivatives thereof, whitening agents such as ellagic acid and lucinol, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid, amino acids, sugars, mucopolysaccharides, ceramides, sterols and derivatives thereof, phospholipids and derivatives thereof, retinol and derivatives thereof , Vitamin A acids and their derivatives, anti-aging agents such as cotrienol, ubiquinone, aloe, ougon and various vitamins and their derivatives, tocopherol, tocopherol acetate, SOD, β-carotate , Catechin, an anti-oxidant such as polyphenol, caffeine, cocoa, ivy, slimming agents such as visnadine, Kamomira, perilla, carnitine, phospholipids and their derivatives, and the like, such as anti-inflammatory agents such as functional polysaccharide.
また、生理活性成分などがより効率的に経皮吸収され、有効性及び／又は安全性がより発現される化粧品又は医薬品の剤型を検討するための方法としても利用できるため、化粧品又は医薬品の処方設計の検討に利用すると非常に効率的にそれらの開発を進めることができる。 In addition, since it can be used as a method for studying a dosage form of a cosmetic or pharmaceutical product in which a physiologically active ingredient is more efficiently transdermally absorbed and is more effective and / or safe, When used for studying prescription design, they can be developed very efficiently.
物質の皮膚透過量と透過した物質の有効性及び／又は安全性の評価を同時に測定するには、図１または図２の培地をサンプリングして測定すればよい。物質の皮膚透過量は例えば、高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーを用いて定量することができ、透過した物質の有効性及び／又は安全性の評価は、例えば評価対象細胞として線維芽細胞を用いてコラーゲン産生促進作用を評価する場合は、ＥＬＩＳＡ法により、また、コラーゲナーゼ活性作用を評価する場合は、擬似基質を用いた活性測定法により評価することができる。 In order to simultaneously measure the amount of substance permeated through the skin and the effectiveness and / or safety of the permeated substance, the medium in FIG. 1 or FIG. 2 may be sampled and measured. The amount of substance permeated through the skin can be quantified using, for example, high performance liquid chromatography or gas chromatography, and the evaluation of the effectiveness and / or safety of the permeated substance is performed using, for example, fibroblasts as cells to be evaluated. Thus, when evaluating the collagen production promoting action, it can be evaluated by ELISA, and when evaluating the collagenase activity action, it can be evaluated by an activity measuring method using a pseudo-substrate.
図１または図２は、表皮等価物と、評価対象細胞とを用いることを特徴とする、物質の皮膚透過量と透過した物質の有効性及び／又は安全性の評価を同時に測定できることを特徴とする経皮吸収評価装置である。 FIG. 1 or FIG. 2 is characterized in that the skin permeation amount of a substance and the evaluation of the effectiveness and / or safety of the permeated substance can be measured simultaneously, using an epidermis equivalent and a cell to be evaluated. This is a transdermal absorption evaluation device.
本経皮吸収評価装置は、皮膚等価物３を支持するバスケット２を収容するウェル１を含む。ウェル１が配置されるバスケット２は、ウェル１を着脱可能に固定できてもよい。バスケット２は皮膚等価物３を支持する底壁７を含む。底壁７は貫通穴８を有する。また、バスケット２に底膜７を固定するためのインサート９を有するものもある。バスケットという用語は制限的な意味で使用するものではなく、ウェル１内に配置された任意の支持体を含む。ウェル１は、複数（例えば１２個）のウェルを有するプレートの一部を固定することができる。ウェル１には、溶液５（例えば、培地など）が充填されている。表皮等価物３は、例えば前述の培養皮膚などである。評価対象細胞４は、例えば前述の線維芽細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、ランゲルハンス細胞、色素細胞などである。評価対象となる物質６は、例えば化粧品及び／又は医薬品に利用できる成分、それを含む溶液、溶解又は分散物、乳化製剤、また、化粧品、トイレタリー製品、医薬品製剤などである。表皮等価物は、例えば、０．２〜５ｃｍ２の範囲、特に０．３〜２ｃｍ２の範囲の面積を有する。
The percutaneous absorption evaluation apparatus includes a well 1 that accommodates a
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
リン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウム又はＬ−アスコルビン酸の水溶液又はそれを含有する乳化製剤の経皮吸収試験 Transdermal absorption test of an aqueous solution of L-ascorbyl magnesium phosphate or L-ascorbic acid or an emulsified preparation containing the same
１．試験の概要
皮膚の抗老化素材であるリン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウム（以下、ＶＣＰＭｇ）又はＬ−アスコルビン酸（以下、ＶＣ）の水溶液又はＶＣＰＭｇ又はＶＣを含有する乳化製剤適用後のＶＣＰＭｇの累積透過量及び線維芽細胞のコラーゲン産生量をそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定法及びＥＬＩＳＡ法にて測定した。なお、コラーゲン産生量を測定する試験であるため、支持体の構成物の影響を考慮し、２種類の異なる表皮等価物を用いて評価した（ＥＰＩＳＫＩＮ；コラーゲン、ＲＨＥ；ポリカーボネート）。
1. Summary of test Cumulative permeation amount of VCPMg after application of an aqueous solution of L-ascorbyl phosphate (hereinafter referred to as VCPMg) or L-ascorbic acid (hereinafter referred to as VC), which is an anti-aging material of skin, or an emulsified preparation containing VCPMg or VC And the collagen production amount of fibroblasts were measured by high performance liquid chromatography (HPLC) measurement method and ELISA method, respectively. Since this is a test for measuring the amount of collagen produced, it was evaluated using two different epidermal equivalents (EPISKIN; collagen, RHE; polycarbonate) in consideration of the influence of the composition of the support.
２．実験方法
経皮吸収試験の前日にヒト正常線維芽細胞を播種し、ＥＰＩＳＫＩＮまたはＲＨＥをプレインキュベーションした。試験当日ＥＰＩＳＫＩＮまたはＲＨＥとヒト正常線維芽細胞をＫＧ２培地で共培養し、試料を適用した。図４および図５は、経皮吸収試験のセッティングである（表皮等価物３はＥＰＩＳＫＩＮまたはＲＨＥ、評価対象細胞４は線維芽細胞、評価対象となる物質６はＶＣＰＭｇ水溶液又はＶＣＰＭｇを含有する乳化製剤）。２４時間後に試料を取り除き、４８時間までインキュベーションを続けた。経時的に培養液を採取しＶＣＰＭｇ又はＶＣの累積透過量をＨＰＬＣにて測定した。また、４８時間後に採取した培養液中コラーゲン産生量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。コントロールとして、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。
2. Experimental Method Human normal fibroblasts were seeded the day before the percutaneous absorption test and preincubated with EPISKIN or RHE. On the day of the test, EPISKIN or RHE and human normal fibroblasts were co-cultured in KG2 medium, and the sample was applied. 4 and 5 show the settings of the transdermal absorption test (
３．結果
ＥＰＩＳＫＩＮ を用いた場合のＶＣＰＭｇ又はＶＣの累積透過量を表１に、４８時間後のコラーゲン産生量を表２に示した。またＲＨＥを用いた場合のＶＣＰＭｇ又はＶＣの累積透量を表３に、４８時間後のコラーゲン産生量を表４に示した。いずれの表皮等価物を用いても累積透過量は製剤中ＶＣＰＭｇ又はＶＣ濃度および時間依存的に増加した。４８時間後のコラーゲン産生量は製剤中ＶＣＰＭｇ又はＶＣ濃度依存的に増加した。また、単純な水溶液よりも乳化製剤とした方がより、累積透過量及びコラーゲン産生量が高かった。
なお、ＶＣＰＭｇとＶＣを比較すると、ＶＣはＶＣＰＭｇよりも累積透過量及びコラーゲン産生量が低かった。これは、ＶＣが再構成皮膚を通過するときに代謝、分解されやすいことから、ＶＣとして線維芽細胞に到達しにくかったためと考えられる。
線維芽細胞にＶＣを直接暴露させてコラーゲン産生能を評価した場合、その効果が極めて高いことがよく知られているが、実際に皮膚に塗布した場合は、ＶＣよりもＶＣＰＭｇの方がはるかに有効であることが示唆された。
また、ＥＰＩＳＫＩＮと比較して、ＲＨＥではコラーゲン量の定量により適していることが示された。すなわち、本経皮吸収装置でコラーゲン量を評価する場合、支持体がコラーゲンで構成されているＥＰＩＳＫＩＮよりも、支持体の構成物がポリカーボネートであるＲＨＥが、表皮等価物として適していることが示唆された。
本結果より、本経皮吸収評価装置は、物質の経皮吸収量及び経皮吸収した物質が評価対象細胞である線維芽細胞に作用して発現する効果を同時にかつ簡便に評価できることが明らかとなった。
When VCPMg was compared with VC, VC had a lower cumulative permeation amount and collagen production amount than VCPMg. This is thought to be because it was difficult to reach fibroblasts as VC because VC is easily metabolized and decomposed when passing through reconstituted skin.
It is well known that collagen production ability is evaluated by directly exposing fibroblasts to VC, but VCPMg is much more effective than VC when applied to the skin. It was suggested to be effective.
Moreover, it was shown that RHE is more suitable for quantifying the amount of collagen than EPISKIN. That is, when evaluating the amount of collagen with this percutaneous absorption device, it is suggested that RHE, whose constituent of the support is polycarbonate, is more suitable as an epidermis equivalent than EPISKIN where the support is composed of collagen. It was done.
From this result, it is clear that the percutaneous absorption evaluation apparatus can simultaneously and easily evaluate the percutaneous absorption amount of the substance and the effect that the percutaneously absorbed substance acts on the fibroblast as the evaluation target cell. became.
Ｎ−アセチルグルコサミンの水溶液又はそれを含有する乳化製剤の経皮吸収試験 Transdermal absorption test of aqueous solution of N-acetylglucosamine or emulsified preparation containing the same
１．試験の概要
皮膚の抗老化素材であるＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＮＡＧ）水溶液又はＮＡＧを含有する乳化製剤適用後のＮＡＧ累積透過量及び線維芽細胞のヒアルロン酸産生量をそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定法及びＥＬＩＳＡ法にて測定した。
1. Outline of the test High-performance liquid chromatography (NAG cumulative permeation amount and hyaluronic acid production amount of fibroblasts after application of an aqueous solution of N-acetylglucosamine (hereinafter referred to as NAG), which is an anti-aging material for skin, or an emulsion preparation containing NAG) HPLC) Measurement method and ELISA method.
２．実験方法
経皮吸収試験の前日にヒト正常線維芽細胞を播種し、ＥＰＩＳＫＩＮをプレインキュベーションした。試験当日ＥＰＩＳＫＩＮとヒト正常線維芽細胞をＫＧ２培地で共培養し、試料を適用した。図４は、経皮吸収試験のセッティングである（表皮等価物３はＥＰＩＳＫＩＮ、評価対象細胞４は線維芽細胞、評価対象となる物質６はＮＡＧ水溶液又はＮＡＧを含有する乳化製剤）。２４時間後に試料を取り除き、４８時間までインキュベーションを続けた。経時的に培養液を採取しＮＡＧの累積透過量をＨＰＬＣにて測定した。また、４８時間後に採取した培養液中ヒアルロン酸産生量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。コントロールとして、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。
2. Experimental Method One day before the percutaneous absorption test, normal human fibroblasts were seeded, and EPISKIN was preincubated. On the day of the test, EPISKIN and normal human fibroblasts were co-cultured in KG2 medium and the sample was applied. FIG. 4 shows the settings for the percutaneous absorption test (
３．結果
ＮＡＧ累積透過量を表５に、４８時間後のヒアルロン酸産生量を表６に示した。累積透過量は製剤中ＮＡＧ濃度および時間依存的に増加した。４８時間後のヒアルロン酸産生量は製剤中ＮＡＧ濃度の依存的に増加した。そして、単純な水溶液よりも乳化製剤とした方がより、累積透過量及びヒアルロン酸産生量が高かった。
本結果より、本経皮吸収評価装置は、物質の経皮吸収量及び経皮吸収した物質が評価対象細胞である線維芽細胞に作用して発現する効果を同時にかつ簡便に評価できることが明らかとなった。
From this result, it is clear that the percutaneous absorption evaluation apparatus can simultaneously and easily evaluate the percutaneous absorption amount of the substance and the effect that the percutaneously absorbed substance acts on the fibroblast as the evaluation target cell. became.
Epigallocatechin-3-gallateの水溶液又はそれを含有する乳化製剤の経皮吸収試験 Transdermal absorption test of aqueous solution of Epigallocatechin-3-gallate or emulsified preparation containing it
１．試験の概要
皮膚の抗酸化及び抗老化素材であるEpigallocatechin-3-gallate（以下、ＥＧＣＧ）水溶液又はＥＧＣＧを含有する乳化製剤適用後のＥＧＣＧ累積透過量及び線維芽細胞のコラーゲナーゼ活性をそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定法及び擬似基質にて測定した。
1. Outline of the test High-speed liquids for cumulative permeation of EGCG and collagenase activity of fibroblasts after application of an aqueous solution of epigallocatechin-3-gallate (EGCG), which is an antioxidant and anti-aging material, or an emulsion containing EGCG It measured by the chromatography (HPLC) measuring method and the pseudo substrate.
２．実験方法
経皮吸収試験の前日にヒト正常線維芽細胞を播種し、ＥＰＩＳＫＩＮをプレインキュベーションした。試験当日ＥＰＩＳＫＩＮとヒト正常線維芽細胞をＫＧ２培地で共培養し、試料を適用した。図４は、経皮吸収試験のセッティングである（表皮等価物３はＥＰＩＳＫＩＮ、評価対象細胞４は線維芽細胞、評価対象となる物質６はＥＧＣＧ水溶液又はＥＧＣＧを含有する乳化製剤）。２４時間後に試料を取り除き、４８時間までインキュベーションを続けた。経時的に培養液を採取しＥＧＣＧ累積透過量をＨＰＬＣにて測定した。また、４８時間後に採取した培養液中のコラーゲナーゼ活性を擬似基質にて測定した。コントロールとして、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。
2. Experimental Method One day before the percutaneous absorption test, normal human fibroblasts were seeded, and EPISKIN was preincubated. On the day of the test, EPISKIN and normal human fibroblasts were co-cultured in KG2 medium and the sample was applied. FIG. 4 shows the settings for the percutaneous absorption test (
３．結果
ＥＧＣＧの累積透過量を表７に、４８時間後のコラーゲナーゼ活性を表８に示した。累積透過量は製剤中ＥＧＣＧ濃度および時間依存的に増加した。４８時間後のコラーゲナーゼ活性は製剤中ＥＧＣＧ濃度の依存的に増加した。そして、単純な水溶液よりも乳化製剤とした方がより、累積透過量は高く、コラーゲナーゼ活性は低くなった。
本結果より、本経皮吸収評価装置は、物質の経皮吸収量及び経皮吸収した物質が評価対象細胞である線維芽細胞に作用して発現する効果を同時にかつ簡便に評価できることが明らかとなった。
From this result, it is clear that the percutaneous absorption evaluation apparatus can simultaneously and easily evaluate the percutaneous absorption amount of the substance and the effect that the percutaneously absorbed substance acts on the fibroblast as the evaluation target cell. became.
Ｌ−カルニチンの水溶液又はそれを含有する乳化製剤の経皮吸収試験 Transdermal absorption test of aqueous solution of L-carnitine or emulsified preparation containing the same
１．試験の概要
皮膚のスリミング素材であるＬ−カルニチン水溶液又はＬ−カルニチンを含有する乳化製剤適用後のＬ−カルニチン累積透過量及び脂肪細胞の脂肪分解作用をそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定法及び遊離グリセロール定量にて測定した。
1. Summary of Test High-performance liquid chromatography (HPLC) measurement method for L-carnitine cumulative permeation amount and adipocyte lipolytic action after application of emulsion preparation containing L-carnitine aqueous solution or L-carnitine, which is a skin slimming material, and Measured by free glycerol quantification.
２．実験方法
経皮吸収試験の前日に脂肪細胞を播種し、ＥＰＩＳＫＩＮをプレインキュベーションした。試験当日ＥＰＩＳＫＩＮと脂肪細胞をＫＧ２培地で共培養（ＫＧ２）し、試料を適用した。図４は、経皮吸収試験のセッティングである（表皮等価物３はＥＰＩＳＫＩＮ、評価対象細胞４は脂肪細胞、評価対象となる物質６はＬ−カルニチン水溶液又はＬ−カルニチンを含有する乳化製剤。２４時間後に試料を取り除き、４８時間までインキュベーションを続けた。経時的に培養液を採取しＬ−カルニチン累積透過量をＨＰＬＣにて測定した。また、４８時間後に採取した培養液中の遊離グリセロール量を測定した。コントロールとして、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。
2. Experimental Method Adipocytes were seeded on the day before the percutaneous absorption test and preincubated with EPISKIN. On the day of the test, EPISKIN and adipocytes were co-cultured in KG2 medium (KG2), and the sample was applied. FIG. 4 shows the settings for the percutaneous absorption test (
３．結果
Ｌ−カルニチン累積透過量を表９に、４８時間後の脂肪分解作用を表１０に示した。累積透過量は製剤中Ｌ−カルニチン濃度および時間依存的に増加した。４８時間後の脂肪分解作用は製剤中Ｌ−カルニチン濃度の依存的に増加した。そして、単純な水溶液よりも乳化製剤とした方がより、累積透過量及び遊離グリセロールが高かった。
本結果より、本経皮吸収評価装置は、物質の経皮吸収量及び経皮吸収した物質が評価対象細胞である脂肪細胞に作用して発現する効果を同時にかつ簡便に評価できることが明らかとなった。
From this result, it becomes clear that the percutaneous absorption evaluation apparatus can simultaneously and easily evaluate the amount of the substance absorbed percutaneously and the effect that the substance absorbed percutaneously acts on the adipocytes as the evaluation target cells. It was.
リゾフォスファチジン酸の水溶液又はそれを含有する乳化製剤の経皮吸収試験 Transdermal absorption test of aqueous solution of lysophosphatidic acid or emulsified preparation containing the same
１．試験の概要
リゾフォスファチジン酸（以下、ＬＰＡ）水溶液又はＬＰＡを含有する乳化製剤適用後のＬＰＡ累積透過量及び血管内皮細胞の一酸化窒素産生促進作用をそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定法及びＧｒｉｅｓｓ法にて測定した。
1. Outline of the test High-performance liquid chromatography (HPLC) measurement method for lysophosphatidic acid (hereinafter, LPA) aqueous solution or LPA cumulative permeation amount after application of LPA-containing emulsion formulation and vascular endothelial cell nitric oxide production promoting action And the Griess method.
２．実験方法
経皮吸収試験の前日に血管内皮細胞を播種し、ＥＰＩＳＫＩＮをプレインキュベーションした。試験当日ＥＰＩＳＫＩＮと血管内皮細胞をＫＧ２培地で共培養し、試料を適用した。図４は、経皮吸収試験のセッティングである（表皮等価物３はＥＰＩＳＫＩＮ、評価対象細胞４は血管内皮細胞、評価対象となる物質６はＬＰＡ水溶液又はＬＰＡを含有する乳化製剤。２４時間後に試料を取り除き、４８時間までインキュベーションを続けた。経時的に培養液を採取しＬＰＡ累積透過量をＨＰＬＣにて測定した。また、４８時間後に採取した培養液中の一酸化窒素量をＧｒｉｅｓｓ法にて測定した。
2. Experimental Method On the day before the percutaneous absorption test, vascular endothelial cells were seeded and preincubated with EPISKIN. On the day of the test, EPISKIN and vascular endothelial cells were co-cultured in KG2 medium and the sample was applied. FIG. 4 shows the settings for the percutaneous absorption test (
３．結果
ＬＰＡ累積透過量を表１１に、４８時間後の一酸化窒素産生促進作用を表１２に示した。累積透過量は製剤中ＬＰＡ濃度および時間依存的に増加した。４８時間後の一酸化窒素産生促進作用は製剤中ＬＰＡ濃度の依存的に増加した。そして、単純な水溶液よりも乳化製剤とした方がより、累積透過量及び一酸化窒素量が高かった。
本結果より、本経皮吸収評価装置は、物質の経皮吸収量及び経皮吸収した物質が評価対象細胞である血管内皮細胞に作用して発現する効果を同時にかつ簡便に評価できることが明らかとなった。
From this result, it is clear that the percutaneous absorption evaluation apparatus can simultaneously and easily evaluate the transdermal absorption amount of the substance and the effect that the percutaneously absorbed substance acts on the vascular endothelial cells as the evaluation target cells. became.
コウジ酸又はコウジ酸ジイソパルミチル（以下、ＫＩＰ）の水溶液又はそれを含有する乳化製剤の経皮吸収試験 Transdermal absorption test of aqueous solution of kojic acid or diisopalmityl kojate (hereinafter referred to as KIP) or an emulsified preparation containing the same
１．試験の概要
皮膚の美白素材であるコウジ酸又はＫＩＰの水溶液又はコウジ酸又はＫＩＰを含有する乳化製剤適用後のコウジ酸累積透過量、チロシナーゼ活性阻害作用及び色素細胞のメラニン産生抑制作用をそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定法、ドーパオキシダーゼ活性測定法及びアルカリ可溶化法にて測定した。
1. Outline of the test Kojic acid or KIP aqueous solution that is a skin whitening material, or Kojic acid cumulative permeation amount, tyrosinase activity inhibitory action, and pigment cell melanin production inhibitory action after application of an emulsion preparation containing kojic acid or KIP It measured by the chromatography (HPLC) measuring method, the dopa oxidase activity measuring method, and the alkali solubilization method.
２．実験方法
経皮吸収試験の前日に色素細胞を播種し、ＥＰＩＳＫＩＮをプレインキュベーションした。試験当日ＥＰＩＳＫＩＮと色素細胞をＫＧ２培地で共培養し、試料を適用した。図４は、経皮吸収試験のセッティングである（表皮等価物３はＥＰＩＳＫＩＮ、評価対象細胞４は色素細胞、評価対象となる物質６はコウジ酸水溶液又はコウジ酸を含有する乳化製剤。２４時間後に試料を取り除き、一週間までインキュベーションを続けた。経時的に培養液を採取しコウジ酸又はＫＩＰの累積透過量をＨＰＬＣにて測定した。また、チロシナーゼ活性阻害作用はドーパオキシダーゼ活性測定法にて測定し、一週間後に採取した色素細胞中のメラニン量をアルカリ可溶化法にて測定した。コントロールとして、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。
2. Experimental Method Pigment cells were seeded on the day before the transdermal absorption test, and EPISKIN was preincubated. On the day of the test, EPISKIN and pigment cells were co-cultured in KG2 medium and the sample was applied. FIG. 4 shows the settings for the percutaneous absorption test (
３．結果
コウジ酸又はＫＩＰの累積透過量を表１３に、チロシナーゼ活性阻害作用及び一週間後のメラニン産生抑制作用を表１４に示した。累積透過量は製剤中コウジ酸又はＫＩＰの濃度および時間依存的に増加した。チロシナーゼ活性阻害作用及びメラニン産生抑制作用は製剤中コウジ酸又はＫＩＰの濃度依存的に増加した。また、コウジ酸については、単純な水溶液よりも乳化製剤とした方が、より累積透過量が高かった。
なお、コウジ酸とＫＩＰの乳化製剤での結果を比較すると、コウジ酸はＫＩＰよりも累積透過量、チロシナーゼ活性阻害作用及びメラニン産生抑制作用が低かった。これは、コウジ酸が皮膚のとの親和性が低いため経皮吸収しにくいことから、コウジ酸として色素細胞に到達しにくかったためと考えられる。
色素細胞にコウジ酸を直接暴露させてチロシナーゼ活性阻害作用又はメラニン産生抑制作用を評価した場合、その効果が極めて高いことがよく知られているが、実際に皮膚に塗布した場合は、コウジ酸よりもＫＩＰの方がはるかに有効であることが示唆された。
本結果より、本経皮吸収評価装置は、物質の経皮吸収量及び経皮吸収した物質が評価対象細胞である色素細胞に作用して発現する効果を同時にかつ簡便に評価できることが明らかとなった。
In addition, when the results of the emulsion preparations of kojic acid and KIP were compared, kojic acid had lower cumulative permeation amount, tyrosinase activity inhibiting action and melanin production inhibiting action than KIP. This is probably because kojic acid has a low affinity with the skin and is difficult to absorb transdermally, so it was difficult to reach the pigment cells as kojic acid.
It is well known that when kojic acid is directly exposed to pigment cells and the tyrosinase activity inhibitory action or melanin production inhibitory action is evaluated, the effect is extremely high, but when actually applied to the skin, It was suggested that KIP is much more effective.
From this result, it becomes clear that the percutaneous absorption evaluation apparatus can simultaneously and easily evaluate the transdermal absorption amount of the substance and the effect that the substance absorbed percutaneously acts on the pigment cell as the evaluation target cell. It was.
１ ウェル
２ バスケット
３ 表皮等価物
４ 評価対象細胞
５ 溶液
６ 物質
７ 底壁
８ 貫通穴
９ インサート
1 well 2
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