JP2001238681A - Blood-brain barrier reconstruction model by coculture - Google Patents

Blood-brain barrier reconstruction model by coculture

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JP2001238681A
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哲也 寺崎
Emi Nakajima
恵美 中島
Hisashi Iizasa
久 飯笹
Kenichi Hosoya
健一 細谷
Kenji Hattori
研之 服部
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a blood-brain barrier reconstruction model extremely useful for carrying out the fundamental research related to a blood-brain barrier permeation mechanism and screening a central action type drug based on the blood-brain barrier permeation mechanism, a drug having adverse effects in the center causing a problem, a drug targeting various receptors expressed in a cerebral capillary endothelial cell or a drug targeting disorder in the cerebral capillary endothelial cell. SOLUTION: A blood-brain barrier reconstruction model is prepared by coculturing an immortalized cerebral capillary endothelial cell line derived from a transgenic rat in which a large T antigenic gene of a temperature- sensitive mutant SV40tsA58 is transduced with an immortalized astrocyte cell line derived from the same rat in a noncontact state or coculturing the immortalized cerebral capillary endothelial cell line with the immortalized astrocyte cell line and an immortalized cerebral capillary perithelial cell line derived from the same rat in a noncontact state.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、血液脳関門再構築
モデル、より詳しくは、ラット由来の不死化脳毛細血管
内皮細胞株、不死化アストロサイト細胞株、不死化脳毛
細血管周皮細胞株を共培養することによる血液脳関門再
構築モデルの作製方法や、共培養することにより得られ
る血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化
脳毛細血管内皮細胞株や、かかる血液脳関門モデルや血
液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛
細血管内皮細胞株を用いた血液脳関門形成促進物質等の
スクリーニング方法等に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a blood-brain barrier remodeling model, more specifically, an immortalized brain capillary endothelial cell line derived from a rat, an immortalized astrocyte cell line, and an immortalized brain capillary pericyte cell line. Method for preparing a blood-brain barrier remodeling model by co-culturing, an immortalized brain capillary endothelial cell line with enhanced expression of a blood-brain barrier marker gene obtained by co-culturing, and a blood-brain barrier model And a screening method for a blood-brain barrier formation promoting substance using an immortalized brain capillary endothelial cell line in which expression of a marker gene of the blood-brain barrier is enhanced.

【０００２】[0002]

【従来の技術】血液脳関門（blood-brain barrier）と
は、血液から脳組織内への物質の移行を制限する関門で
あり、これによって、脳は有害物質などから守られてい
る。ニコチン、カフェイン、ヘロイン等の脂溶性物質は
この血液脳関門を容易に通過できるが、一般に極性物
質、強電解質など非脂溶性物質は通過しにくいものの、
脳の代謝に必要なＤ−グルコース等の水溶性物質はキャ
リヤーによって血液脳関門を透過して脳組織へ運ばれる
ことが知られている。脳毛細血管においては、隣接する
内皮細胞同士がタイト・ジャンクションと呼ばれる緊密
な結合を形成し、細胞間の隙間から漏出しないようにな
っており、そのため、脳内に出入りする物質は原則とし
て脳毛細血管内皮細胞を通過しなくてはならないとされ
ている。2. Description of the Related Art The blood-brain barrier is a barrier that restricts the transfer of a substance from blood to brain tissue, thereby protecting the brain from harmful substances and the like. Lipid-soluble substances such as nicotine, caffeine, and heroin can easily pass through the blood-brain barrier, but generally non-lipid-soluble substances such as polar substances and strong electrolytes are difficult to pass,
It is known that a water-soluble substance such as D-glucose necessary for brain metabolism is transported to a brain tissue through a blood-brain barrier by a carrier. In cerebral capillaries, adjacent endothelial cells form tight junctions called tight junctions and do not leak out from gaps between cells. It has to pass through vascular endothelial cells.

【０００３】上記のように、脳毛細血管内皮細胞は、脳
への栄養物質だけでなく細胞膜に発現している種々の輸
送系によって薬物を脳内へ輸送する。あるいは、その実
体はほとんど解明されていないが、血液脳関門には脳か
ら循環血液方向へ神経伝達物質の代謝物および異物を排
出する輸送系が働く特殊な生理機能が存在する。異物で
ある薬物の中には脂溶性が高いにも係わらず脳への移行
性が悪いものも多いことが知られており、その原因とし
て血液脳関門に存在する排出輸送系によって一旦脳内へ
移行した薬物がその移行速度の数十倍から数百倍も高い
速度で脳から排出されることが考えられている。例えば
エイズウイルス治療薬であるアジドチミジンは血液脳関
門排出輸送系の働きによって脳への移行性が著しく制限
されている（J. Pharmacol. Exp. Ther., 281, 369-37
5, 1997、ibid 282, 1509-1517, 1997）。このように中
枢作用型薬物の脳への移行において血液脳関門は極めて
重要な役割を果たしている。[0003] As described above, brain capillary endothelial cells transport drugs into the brain not only by nutrients to the brain but also by various transport systems expressed in cell membranes. Alternatively, although its substance is hardly elucidated, the blood-brain barrier has a special physiological function in which a transport system that excretes metabolites of neurotransmitters and foreign substances from the brain toward the circulating blood works. It is known that many foreign substances, which have a high fat-solubility but are poorly migrating to the brain, are caused by the efflux and transport system existing at the blood-brain barrier. It is believed that the transferred drug is excreted from the brain at a rate several tens to hundreds of times faster than its transfer rate. For example, azidothymidine, a therapeutic agent for AIDS virus, is significantly restricted from being transported to the brain by the action of the blood-brain barrier efflux transport system (J. Pharmacol. Exp. Ther., 281, 369-37).
5, 1997, ibid 282, 1509-1517, 1997). Thus, the blood-brain barrier plays a very important role in the transfer of centrally acting drugs to the brain.

【０００４】従来、血液脳関門のインビトロ実験系とし
ては、初代培養脳毛細血管内皮細胞単離方法（Audus＆B
orchardtら、Pharm. Res., 3, 81-87, 1986）に基づい
て、ウシから調製して実験が行われてきた。しかし、初
代培養細胞では、例えば中性アミノ酸輸送系で運ばれる
Ｌ−ドーパやヘキソース輸送系で運ばれるグルコースの
輸送速度がインビボ系に比べて数十倍以下と低いことが
報告され（Pardridgeら、J. Pharmacol. Exp. Ther., 2
53, 884-891, 1990）、逆に単純拡散による物質透過が
インビボ系よりも１５０倍以上高く、血液脳関門のモデ
ルとしては不十分であった。また、株化脳毛細血管内皮
細胞であるＭＢＥＣ−４（Tatsuta Tら、J. Biol. Che
m., 267, 20383-20391, 1992）では、インビボで発現し
ているｍｄｒ（multi drug resistance）１ａ遺伝子産
物が発現しておらず、またインビボで発現していないｍ
ｄｒ１ｂ遺伝子産物が発現している点で正常な脳毛細血
管内皮細胞ではないと考えられている。Conventionally, as an in vitro experimental system for the blood-brain barrier, a primary cultured brain capillary endothelial cell isolation method (Audus & B
orchardt et al., Pharm. Res., 3, 81-87, 1986) and have been prepared from bovines for experiments. However, in primary cultured cells, for example, it has been reported that the transport rate of L-dopa carried in a neutral amino acid transport system or glucose carried in a hexose transport system is several tens times or less lower than that in an in vivo system (Pardridge et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2
53, 884-891, 1990) On the contrary, the substance permeation by simple diffusion was more than 150 times higher than that of the in vivo system, and was insufficient as a model of the blood-brain barrier. Furthermore, MBEC-4 (Tatsuta T et al., J. Biol. Che
m., 267, 20383-20391, 1992), the mdr (multi drug resistance) 1a gene product expressed in vivo is not expressed, and the mdr (multi drug resistance) 1a gene product is not expressed in vivo.
It is thought that it is not a normal brain capillary endothelial cell in that the dr1b gene product is expressed.

【０００５】一方、脳毛細血管内皮細胞はアストロサイ
ト細胞との共培養により、脳毛細血管内皮細胞のＧＬＵ
Ｔ−１発現能力を高めることが知られている（Hayashi
Y.ら, GLIA, 19, 13-26, 1997）。しかし、共培養に使
用されるアストロサイト細胞は初代培養アストロサイト
細胞であるために、毎回調製する必要があるうえ、通常
生後1日ラットから分離培養しているために成熟ラット
のアストロサイト細胞とは異なる（Swanson R. A.ら, J
Neurosci., 17, 932-940, 1997）という問題がある。
これまで、アストロサイト細胞株として、ＫＧ−１−
Ｃ、Ｕ２５１、ＧＩ−１等のヒト由来の神経膠腫瘍細胞
（グリア細胞）やＲＣＲ−１、Ｃ６等のラット由来腫瘍
化グリア細胞が使用されてきたが、これらグリア細胞は
ＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein）を発現
し、アストロサイトの性質を有しているものの、ミエリ
ン鞘を形成するオリゴデンドロサイトの性質も共に有し
ているため、本来のアストロサイトだけの機能を反映し
ていない。例えば、Ｃ６細胞ではアストロサイトが本来
有しているＮａ+依存性Ｌ−グルタミン酸トランスポー
ターであるＧＬＵＴ−１及びＧＬＡＳＴが発現しておら
ず、神経細胞に発現する蛋白質であるＥＡＡＣ１が発現
している（PalosT. P.ら, Mol. Brain Res., 37, 297-3
03, 1996）。On the other hand, brain capillary endothelial cells are co-cultured with astrocyte cells to form GLU of brain capillary endothelial cells.
It is known to enhance T-1 expression ability (Hayashi
Y. et al., GLIA, 19, 13-26, 1997). However, the astrocyte cells used for co-culture are primary culture astrocyte cells, so they need to be prepared every time. Are different (Swanson RA et al., J
Neurosci., 17, 932-940, 1997).
Until now, KG-1-
Human-derived glial tumor cells (glial cells) such as C, U251, and GI-1 and tumor-derived glial cells derived from rats such as RCR-1 and C6 have been used. These glial cells are GFAP (glial fibrillary acidic). protein) and has the properties of astrocytes, but also has the properties of oligodendrocytes that form the myelin sheath, and therefore does not reflect the function of only astrocytes. For example, in C6 cells, GLUT-1 and GLAST, which are the Na + -dependent L-glutamic acid transporters originally possessed by astrocytes, are not expressed, and EAAC1, which is a protein expressed in nerve cells, is expressed. (Palos T. P. et al., Mol. Brain Res., 37, 297-3
03, 1996).

【０００６】脳毛細血管内皮細胞は、その周りが周皮細
胞及びアストロサイト細胞で覆われていることが報告さ
れている（Sci. Am. 255, 74-83, 1886）。また、林ら
の報告（Hayashi, Y.ら, GLIA 19, 13-26, 1997）によ
ると、ラット胎児のアストロサイト細胞とヒト臍帯静脈
内皮細胞（human umbilical cord vein）の共培養によ
り、ヒト臍帯静脈内皮細胞単培養と比較して、γ−ＧＴ
Ｐ活性が５倍高くなり、ＧＬＵＴ−１のｍＲＮＡが９〜
１１．６倍上昇したことから、アストロサイト細胞が脳
毛細血管内皮細胞とクロストークして血液脳関門を形成
していると考えられている。しかし、この報告による
と、ラット胎児由来のアストロサイト細胞と、ヒト臍帯
静脈由来の内皮細胞とを用いており、血液脳関門再構築
モデルとは言い難く、かつ調製が困難である。It has been reported that brain capillary endothelial cells are surrounded by pericytes and astrocyte cells (Sci. Am. 255, 74-83, 1886). According to a report by Hayashi et al. (Hayashi, Y. et al., GLIA 19, 13-26, 1997), human umbilical cord was co-cultured with astrocyte cells of rat embryos and human umbilical cord vein. Γ-GT compared to venous endothelial cell monoculture
P activity becomes 5-fold higher, and GLUT-1 mRNA is 9-
The 11.6-fold increase suggests that astrocyte cells cross-talk with brain capillary endothelial cells to form the blood-brain barrier. However, according to this report, astrocyte cells derived from a rat fetus and endothelial cells derived from a human umbilical vein are used, which is hardly a blood-brain barrier reconstruction model and difficult to prepare.

【０００７】また、本発明者らによる特開平１１−３４
１９８２号公報には、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ
５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニッ
クマウスより樹立した脳毛細血管内皮細胞株と、温度感
受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を
導入したトランスジェニックラットより樹立したアスト
ロサイト細胞株とを共培養することにより、脳毛細血管
内皮細胞のＧＬＵＴ−１発現能力を高まることが開示さ
れている。しかし、共培養に用いた脳毛細血管内皮細胞
株とアストロサイト細胞株とは、由来する動物種を異に
することから、厳密な意味での最適血液脳関門再構築モ
デルとするにはなお改良の余地があった。[0007] Further, Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-34 by the present inventors.
1982 discloses that the temperature-sensitive mutant SV40tsA
Co-culture of a brain capillary endothelial cell line established from a transgenic mouse into which the large T antigen gene of 58 was introduced and an astrocyte cell line established from a transgenic rat into which the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant SV40tsA58 was introduced By doing so, it is disclosed that the ability of brain capillary endothelial cells to express GLUT-1 is enhanced. However, the brain capillary endothelial cell line and the astrocyte cell line used in the co-culture differ from the animal species from which they were derived, so they must be improved to be an optimal blood-brain barrier reconstruction model in a strict sense. There was room for

【０００８】[0008]

【発明が解決しようとする課題】血液脳関門は薬物輸送
や脳代謝機能などにおいて重要な役割を果たしており、
現在までにインビトロでの再構築モデルが種々提案され
ているが、厳密な意味での最適血液脳関門再構築モデル
を作製することは困難とされてきた。本発明の課題は、
血液脳関門透過機構に基づいた中枢作用型薬物（抗痴呆
薬、脳腫瘍治療薬、ウイルス治療薬、精神神経作用
薬）、中枢での副作用が問題となる薬物、脳毛細血管内
皮細胞に発現する種々の受容体を標的とした薬物（脳微
小循環改善薬、脳浮腫治療薬）、または脳毛細血管内皮
細胞の障害（脳血管障害性痴呆症やアルツハイマー型痴
呆症）を標的とした薬物をスクリーニングする上で極め
て有用な血液脳関門再構築モデルを提供することにあ
る。The blood-brain barrier plays an important role in drug transport and brain metabolism.
To date, various in vitro reconstruction models have been proposed, but it has been considered difficult to create an optimal blood-brain barrier reconstruction model in a strict sense. The object of the present invention is to
Centrally acting drugs based on the blood-brain barrier permeation mechanism (anti-dementia drugs, drugs for treating brain tumors, drugs for treating viruses, drugs acting as psychiatric nerves), drugs with central side effects, various types of expression in brain capillary endothelial cells To screen for drugs that target the human receptor (cerebral microcirculation ameliorating agent, therapeutic agent for cerebral edema) or that target disorders of brain capillary endothelial cells (cerebrovascular dementia or Alzheimer's dementia) An object of the present invention is to provide a blood brain barrier reconstruction model which is extremely useful above.

【０００９】[0009]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究し、同種の動物より樹立した
不死化細胞株であるラット脳毛細血管内皮細胞株ＴＲ−
ＢＢＢ１３（ＦＥＰＭＢＰ−６８７３）、ラットアスト
ロサイト細胞株ＴＲ−ＡＳＴ９３２（ＦＥＰＭ ＢＰ−
６２８３）、ラット脳毛細血管周皮細胞株ＴＲ−ＰＣＴ
１（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）を用いて共培養すること
により、最適血液脳関門再構築モデルを作製することが
できることを見い出し、本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and have studied a rat brain capillary endothelial cell line TR-, which is an immortalized cell line established from the same animal species.
BBB13 (FEPMBP-6873), rat astrocyte cell line TR-AST932 (FEPM BP-
6283), rat brain capillary pericyte cell line TR-PCT
1 (FERMBP-7024) to find that an optimal blood-brain barrier reconstruction model can be produced by co-culturing, and completed the present invention.

【００１０】すなわち本発明は、ラット由来の不死化脳
毛細血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化アストロサ
イト細胞株とを共培養することを特徴とする血液脳関門
再構築モデルの作製方法（請求項１）や、ラット由来の
不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化ア
ストロサイト細胞株と、ラット由来の不死化脳毛細血管
周皮細胞株とを共培養することを特徴とする血液脳関門
再構築モデルの作製方法（請求項２）や、ラット由来の
不死化脳毛細血管内皮細胞株が、温度感受性変異株ＳＶ
４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトラン
スジェニックラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株
であることを特徴とする請求項１又は２記載の血液脳関
門再構築モデルの作製方法（請求項３）や、温度感受性
変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入
したトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管
内皮細胞株が、ＴＲ−ＢＢＢ１３（ＦＥＰＭ ＢＰ−６
８７３）であることを特徴とする請求項３記載の血液脳
関門再構築モデルの作製方法（請求項４）や、ラット由
来の不死化アストロサイト細胞株が、温度感受性変異株
ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したト
ランスジェニックラット由来の不死化アストロサイト細
胞株であることを特徴とする請求項１又は２記載の血液
脳関門再構築モデルの作製方法（請求項５）や、温度感
受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を
導入したトランスジェニックラット由来の不死化アスト
ロサイト細胞株が、ＴＲ−ＡＳＴ９３２（ＦＥＰＭ Ｂ
Ｐ−６２８３）であることを特徴とする請求項５記載の
血液脳関門再構築モデルの作製方法（請求項６）や、ラ
ット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株が、温度感受性
変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入
したトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管
周皮細胞株であることを特徴とする請求項２記載の血液
脳関門再構築モデルの作製方法（請求項７）や、温度感
受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を
導入したトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細
血管周皮細胞株が、ＴＲ−ＰＣＴ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
７０２４）であることを特徴とする請求項７記載の血液
脳関門再構築モデルの作製方法（請求項８）や、共培養
が、不死化脳毛細血管内皮細胞株と不死化アストロサイ
ト細胞株とを非接触状態で、又は不死化脳毛細血管内皮
細胞株と不死化アストロサイト細胞株及び不死化脳毛細
血管周皮細胞株とを非接触状態で培養する、非接触系共
培養であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記
載の血液脳関門再構築モデルの作製方法（請求項９）に
関する。That is, the present invention provides a method for preparing a blood-brain barrier remodeling model, comprising co-culturing a rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line and a rat-derived immortalized astrocyte cell line ( Claim 1) Co-culture of a rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line, a rat-derived immortalized astrocyte cell line, and a rat-derived immortalized brain capillary pericyte cell line. The method for preparing a blood-brain barrier remodeling model (Claim 2), and the method wherein the rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line is a temperature-sensitive mutant SV
3. The method for preparing a blood-brain barrier remodeling model according to claim 1 or 2, wherein the cell is an immortalized brain capillary endothelial cell line derived from a transgenic rat into which a large T antigen gene of 40tsA58 has been introduced (claim 3). Alternatively, an immortalized brain capillary endothelial cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant SV40tsA58 was introduced was TR-BBB13 (FEPM BP-6).
873), wherein the method for preparing a blood-brain barrier remodeling model according to claim 3 (claim 4) or the rat-derived immortalized astrocyte cell line is a large T antigen of a temperature-sensitive mutant SV40tsA58. 3. A method for preparing a blood-brain barrier remodeling model according to claim 1 or 2, which is an immortalized astrocyte cell line derived from a transgenic rat into which a gene has been introduced (claim 5), and a temperature-sensitive mutant SV40tsA58. An immortalized astrocyte cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene was introduced was TR-AST932 (FEPM B
P-6283), wherein the method for preparing a blood-brain barrier reconstruction model according to claim 5 (claim 6) or the rat-derived immortalized brain capillary pericyte cell line is a temperature-sensitive mutant 3. The method for preparing a blood-brain barrier remodeling model according to claim 2, which is an immortalized brain capillary pericyte cell line derived from a transgenic rat into which a large T antigen gene of SV40tsA58 has been introduced (claim 7). Immortalized brain capillary pericyte cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene of temperature-sensitive mutant SV40tsA58 was introduced was TR-PCT1 (FERM BP-
7024), wherein the method for preparing a blood-brain barrier remodeling model according to claim 7 (claim 8), and wherein the co-culture is performed using an immortalized brain capillary endothelial cell line and an immortalized astrocyte cell line. Culture in a non-contact state, or in a non-contact state with an immortalized cerebral capillary endothelial cell line and an immortalized astrocyte cell line and an immortalized cerebral capillary pericyte cell line. A method for producing a blood-brain barrier reconstruction model according to any one of claims 1 to 8 (claim 9).

【００１１】また本発明は、請求項１〜９のいずれか記
載の血液脳関門再構築モデルを用いるスクリーニング方
法であって、共培養中又は共培養の前後に、被検物質を
不死化脳毛細血管内皮細胞株と接触させ、血液脳関門の
マーカー遺伝子の発現の程度を測定・評価することを特
徴とする血液脳関門形成促進又は抑制物質のスクリーニ
ング方法（請求項１０）や、請求項１〜９のいずれか記
載の血液脳関門再構築モデルを用いるスクリーニング方
法であって、共培養中又は共培養の前後に、被検物質と
血液脳関門透過物質又は血液脳関門非透過物質とを不死
化脳毛細血管内皮細胞株と接触させ、これら血液脳関門
透過物質又は血液脳関門非透過物質の不死化脳毛細血管
内皮細胞内への透過の程度を測定・評価することを特徴
とする血液脳関門透過促進又は抑制物質のスクリーニン
グ方法（請求項１１）や、請求項１〜９のいずれか記載
の血液脳関門再構築モデルを用いるスクリーニング方法
であって、共培養中又は共培養の前後に、被検物質を不
死化脳毛細血管内皮細胞株と接触させ、不死化脳毛細血
管内皮細胞内への被検物質の透過の程度を測定・評価す
ることを特徴とする血液脳関門透過又は非透過物質のス
クリーニング方法（請求項１２）や、請求項１０記載の
血液脳関門形成促進又は抑制物質のスクリーニング方法
により得られる血液脳関門形成促進物質（請求項１３）
や、請求項１０記載の血液脳関門形成促進又は抑制物質
のスクリーニング方法により得られる血液脳関門形成抑
制物質（請求項１４）や、請求項１１記載の血液脳関門
透過促進又は抑制物質のスクリーニング方法により得ら
れる血液脳関門透過促進物質（請求項１５）や、請求項
１１記載の血液脳関門透過促進又は抑制物質のスクリー
ニング方法により得られる血液脳関門透過抑制物質（請
求項１６）や、請求項１２記載の血液脳関門透過又は非
透過物質のスクリーニング方法により得られる血液脳関
門透過物質（請求項１７）や、請求項１２記載の血液脳
関門透過又は非透過物質のスクリーニング方法により得
られる血液脳関門非透過物質（請求項１８）に関する。[0011] The present invention also provides a screening method using the blood-brain barrier reconstruction model according to any one of claims 1 to 9, wherein the test substance is immortalized during or after co-culture. A method for screening a substance that promotes or suppresses the formation of a blood-brain barrier (Claim 10), which comprises contacting with a vascular endothelial cell line and measuring / evaluating the degree of expression of a marker gene for the blood-brain barrier; 9. A screening method using the blood-brain barrier remodeling model according to any one of items 9, wherein the test substance and the blood-brain barrier permeable substance or the blood-brain barrier non-permeable substance are immortalized during or before and after co-culture. A blood-brain barrier, which is brought into contact with a brain-capillary endothelial cell line to measure and evaluate the degree of permeation of these blood-brain barrier-permeable substances or blood-brain-barrier-impermeable substances into immortalized brain capillary endothelial cells. A screening method for a hyperpromoting or inhibiting substance (Claim 11) or a screening method using the blood-brain barrier reconstruction model according to any one of Claims 1 to 9, wherein the method comprises the steps of: A test substance is brought into contact with an immortalized brain capillary endothelial cell line, and the degree of penetration of the test substance into the immortalized brain capillary endothelial cells is measured and evaluated. (Claim 12) and a blood-brain barrier formation-promoting substance obtained by the method for screening a blood-brain barrier formation-promoting or suppressing substance according to claim 10 (Claim 13)
A blood-brain barrier formation-inhibiting substance obtained by the method for screening a blood-brain barrier formation-promoting or suppressing substance according to claim 10 (claim 14); and a method for screening a blood-brain barrier penetration promoting or suppressing substance according to claim 11. A blood-brain barrier permeation enhancer obtained by the method (Claim 15), a blood-brain barrier permeation suppressor obtained by the method for screening a blood-brain barrier permeation promoting or suppressing substance according to Claim 11, or a claim. A blood-brain barrier permeable substance obtained by the method for screening a blood-brain barrier permeating or non-permeable substance according to claim 12, or a blood brain obtained by a blood-brain barrier permeating or non-permeable substance screening method according to claim 12. The present invention relates to a barrier non-permeable material (claim 18).

【００１２】また本発明は、ラット由来の不死化脳毛細
血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化アストロサイト
細胞株とを共培養することにより得られることを特徴と
する血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死
化脳毛細血管内皮細胞株（請求項１９）や、ラット由来
の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化
アストロサイト細胞株と、ラット由来の不死化脳毛細血
管周皮細胞株とを共培養することにより得られることを
特徴とする血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強し
た不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２０）や、ラッ
ト由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株が、温度感受性変
異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入し
たトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管内
皮細胞株であることを特徴とする請求項１９又は２０記
載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死
化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２１）や、温度感受性
変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入
したトランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管
内皮細胞株が、ＴＲ−ＢＢＢ１３（ＦＥＰＭ ＢＰ−６
８７３）であることを特徴とする請求項２１記載の血液
脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細
血管内皮細胞株（請求項２２）や、ラット由来の不死化
アストロサイト細胞株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔ
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェ
ニックラット由来の不死化アストロサイト細胞株である
ことを特徴とする請求項１９又は２０記載の血液脳関門
のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内
皮細胞株（請求項２３）や、温度感受性変異株ＳＶ４０
ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジ
ェニックラット由来の不死化アストロサイト細胞株が、
ＴＲ−ＡＳＴ９３２（ＦＥＰＭ ＢＰ−６２８３）であ
ることを特徴とする請求項２３記載の血液脳関門のマー
カー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞
株（請求項２４）や、ラット由来の不死化脳毛細血管周
皮細胞株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラ
ージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット
由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株であることを特徴と
する請求項２０記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発
現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２
５）や、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージ
Ｔ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来
の不死化脳毛細血管周皮細胞株が、ＴＲ−ＰＣＴ１（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７０２４）であることを特徴とする請求
項２５記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強
した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２６）や、共
培養が、不死化脳毛細血管内皮細胞株と不死化アストロ
サイト細胞株とを非接触状態で、又は不死化脳毛細血管
内皮細胞株と不死化アストロサイト細胞株及び不死化脳
毛細血管周皮細胞株とを非接触状態で培養する、非接触
系共培養であることを特徴とする請求項１９〜２６のい
ずれか記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強
した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２７）や、血
液脳関門のマーカー遺伝子が、アルカリフォスファター
ゼ遺伝子、γ−グルタミールトランスペプチダーゼ遺伝
子、Ｇｌｕｔ１遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の
遺伝子であることを特徴とする請求項１９〜２７のいず
れか記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強し
た不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項２８）や、アル
カリフォスファターゼ遺伝子の発現が、共培養すること
なく単独培養したときと比べて６倍以上増強したことを
特徴とする請求項２８記載の血液脳関門のマーカー遺伝
子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求
項２９）や、γ−グルタミールトランスペプチダーゼ遺
伝子の発現が、共培養することなく単独培養したときと
比べて２倍以上増強したことを特徴とする請求項２８又
は２９記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強
した不死化脳毛細血管内皮細胞株（請求項３０）や、Ｇ
ｌｕｔ１遺伝子の発現が、共培養することなく単独培養
したときと比べて１００倍以上増強したことを特徴とす
る請求項２８〜３０のいずれか記載の血液脳関門のマー
カー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞
株（請求項３１）に関する。[0012] The present invention also provides a marker gene for the blood-brain barrier, which is obtained by co-culturing a rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line and a rat-derived immortalized astrocyte cell line. Immortalized cerebral capillary endothelial cell line with enhanced expression of, a rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line, a rat-derived immortalized astrocyte cell line, and a rat-derived immortalized brain An immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of a blood-brain barrier marker gene, which is obtained by co-culturing with a capillary pericyte cell line (claim 20), and a rat-derived immortalized cell line. The immortalized brain capillary endothelial cell line is an immortalized brain capillary endothelial cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant SV40tsA58 has been introduced. An immortalized brain capillary endothelial cell line with enhanced expression of the blood brain barrier marker gene according to claim 19 or 20, or a large T antigen gene of a temperature-sensitive mutant SV40tsA58 was introduced. Immortalized cerebral capillary endothelial cell line derived from transgenic rat was TR-BBB13 (FEPM BP-6).
873), wherein the immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of the blood brain barrier marker gene according to claim 21 (claim 22) or a rat-derived immortalized astrocyte cell line is used. , Temperature-sensitive mutant SV40t
21. An immortalized cerebral capillary having enhanced expression of a blood brain barrier marker gene according to claim 19 or 20, which is an immortalized astrocyte cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene of sA58 has been introduced. An endothelial cell line (claim 23) and a temperature-sensitive mutant SV40.
An immortalized astrocyte cell line derived from a transgenic rat into which the large tsA58 large T antigen gene has been introduced,
An immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of a blood brain barrier marker gene according to claim 23, which is TR-AST932 (FEPM BP-6283), or a rat-derived endothelial cell line derived from a rat. The immortalized brain capillary pericyte cell line is a transgenic rat-derived immortalized brain capillary pericyte cell line into which the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant SV40tsA58 has been introduced. An immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of a blood-brain barrier marker gene (claim 2).
5) and an immortalized brain capillary pericyte cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant SV40tsA58 was introduced was TR-PCT1 (F
ERM BP-7024), wherein the immortalized brain capillary endothelial cell line with enhanced expression of the blood-brain barrier marker gene according to claim 25 (claim 26) or co-cultured with immortalized brain. A capillary endothelial cell line and an immortalized astrocyte cell line in a non-contact state, or an immortalized brain capillary endothelial cell line and an immortalized astrocyte cell line and an immortalized brain capillary pericyte cell line in a non-contact state An immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of a marker gene for the blood-brain barrier according to any one of claims 19 to 26, characterized in that it is a non-contact co-culture cultured in (27). Or that the blood-brain barrier marker gene is one or more genes selected from the group consisting of alkaline phosphatase gene, γ-glutamyl transpeptidase gene, and Glut1 gene. A co-culture of an immortalized brain capillary endothelial cell line with enhanced expression of the blood brain barrier marker gene according to any one of claims 19 to 27 (claim 28), and expression of an alkaline phosphatase gene. 29. An immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of a marker gene of the blood-brain barrier according to claim 28, wherein the expression is enhanced by 6 times or more as compared with the case of single culture (claim 29). 30. The expression of the marker gene of the blood brain barrier according to claim 28 or 29, wherein the expression of the glutamyl transpeptidase gene has been enhanced by a factor of two or more compared to when cultured alone without co-culturing. Immortalized brain capillary endothelial cell line (claim 30);
The immortality with enhanced expression of the marker gene for the blood-brain barrier according to any one of claims 28 to 30, wherein the expression of the lut1 gene is increased by 100 times or more as compared with the case of single culture without co-culture. The present invention relates to a cerebral capillary endothelial cell line (claim 31).

【００１３】また本発明は、被検物質と、請求項１９〜
３１のいずれか記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発
現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株とを接触さ
せ、血液脳関門のマーカー遺伝子の発現増強の程度を測
定・評価することを特徴とする血液脳関門形成促進又は
抑制物質のスクリーニング方法（請求項３２）や、被検
物質と血液脳関門透過物質又は血液脳関門非透過物質
と、請求項１９〜３１のいずれか記載の血液脳関門のマ
ーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細
胞株とを接触させ、これら血液脳関門透過物質又は血液
脳関門非透過物質の該不死化脳毛細血管内皮細胞内への
透過の程度を測定・評価することを特徴とする血液脳関
門透過促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項
３３）や、被検物質と、請求項１９〜３１のいずれか記
載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死
化脳毛細血管内皮細胞株とを接触させ、該不死化脳毛細
血管内皮細胞内への被検物質の透過の程度を測定・評価
することを特徴とする血液脳関門透過又は非透過物質の
スクリーニング方法（請求項３４）や、請求項３２記載
の血液脳関門形成促進又は抑制物質のスクリーニング方
法により得られる血液脳関門形成促進物質（請求項３
５）や、請求項３２記載の血液脳関門形成促進又は抑制
物質のスクリーニング方法により得られる血液脳関門形
成抑制物質（請求項３６）や、請求項３３記載の血液脳
関門透過促進又は抑制物質のスクリーニング方法により
得られる血液脳関門透過促進物質（請求項３７）や、請
求項３３記載の血液脳関門透過促進又は抑制物質のスク
リーニング方法により得られる血液脳関門透過抑制物質
（請求項３８）や、請求項３４記載の血液脳関門透過又
は非透過物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門透過物質（請求項３９）や、請求項３４記載の血
液脳関門透過又は非透過物質のスクリーニング方法によ
り得られる血液脳関門非透過物質（請求項４０）に関す
る。[0013] The present invention also relates to a test substance, and
31. contacting the immortalized brain capillary endothelial cell line with enhanced expression of the blood-brain barrier marker gene according to any of 31 above, and measuring / evaluating the degree of enhanced expression of the blood-brain barrier marker gene. 32. A method for screening a substance promoting or inhibiting blood-brain barrier formation (claim 32), a test substance, a blood-brain barrier permeable substance or a blood-brain barrier non-permeable substance, and the blood-brain barrier according to any one of claims 19 to 31. Contact with an immortalized brain capillary endothelial cell line in which the expression of a marker gene has been enhanced, and determine the degree of penetration of these blood-brain barrier permeable substances or blood-brain barrier non-permeable substances into the immortalized brain capillary endothelial cells. 33. A screening method for a substance promoting or inhibiting blood-brain barrier permeation characterized by measuring / evaluating (claim 33), a test substance, and a marker of the blood-brain barrier according to any one of claims 19 to 31. A blood brain, which is brought into contact with an immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced gene expression, and the degree of penetration of a test substance into the immortalized brain capillary endothelial cells is measured and evaluated. A method for screening a barrier-permeable or non-permeable substance (Claim 34), or a substance for promoting blood-brain barrier formation obtained by the method for screening or promoting a blood-brain barrier formation according to claim 32 (Claim 3)
5) a blood-brain barrier formation-inhibiting substance (claim 36) obtained by the method for screening a blood-brain barrier formation-promoting or suppressing substance according to claim 32; and a blood-brain barrier permeation promoting or suppressing substance according to claim 33. A blood-brain barrier permeation enhancer obtained by the screening method (Claim 37); a blood-brain barrier permeation suppressor obtained by the blood-brain barrier permeation promoting or inhibiting substance screening method according to Claim 33 (Claim 38); A blood-brain barrier permeating or non-permeating substance obtained by the method for screening a blood-brain barrier permeating or non-permeating substance according to claim 34 or a blood-brain barrier permeating or non-permeating substance obtained by the method according to claim 34. The present invention relates to a blood-brain barrier impermeable substance (claim 40).

【００１４】[0014]

【発明の実施の形態】本発明の血液脳関門再構築モデル
の作製方法は、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞
株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株とを共
培養することや、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細
胞株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株と、
ラット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株とを共培養す
ることを特徴とする。また、本発明の血液脳関門のマー
カー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞
株は、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラ
ット由来の不死化アストロサイト細胞株とを共培養する
ことにより得られることや、ラット由来の不死化脳毛細
血管内皮細胞株と、ラット由来の不死化アストロサイト
細胞株と、ラット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株と
を共培養することにより得られることを特徴とする。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The method for preparing a blood-brain barrier remodeling model of the present invention comprises co-culturing a rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line with a rat-derived immortalized astrocyte cell line. A rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line, a rat-derived immortalized astrocyte cell line,
It is characterized in that it is co-cultured with a rat-derived immortalized brain capillary pericyte cell line. In addition, the immortalized brain capillary endothelial cell line with enhanced expression of the blood brain barrier marker gene of the present invention is a rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line and a rat-derived immortalized astrocyte cell line. What can be obtained by co-culture, co-culture of rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line, rat-derived immortalized astrocyte cell line, and rat-derived immortalized brain capillary pericyte cell line The feature is that it is obtained by doing.

【００１５】上記ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細
胞株、不死化アストロサイト細胞株、及び不死化脳毛細
血管周皮細胞株としては、特に制限されるものではない
が、それぞれ正常な脳毛細血管内皮細胞、アストロサイ
ト細胞及び脳毛細血管周皮細胞が本来有する機能や性状
を保持したまま不死化細胞として樹立された細胞株が好
ましい。これら不死化細胞株の樹立方法としては特に制
限されないが、例えば、ＳＶ４０の温度感受性突然変異
株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランス
ジェニックラットから得られる不死化脳毛細血管内皮細
胞株、不死化アストロサイト細胞株及び不死化脳毛細血
管周皮細胞株が、温度条件によりその増殖を制御しう
る、すなわち３３〜３７℃において永久的増殖能を保持
し、３９℃においては増殖を停止するため、細胞固有の
分化形質の発現を制御することができることから好まし
い。The rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line, immortalized astrocyte cell line, and immortalized brain capillary pericyte cell line are not particularly limited, but each can be a normal brain capillary. A cell line established as an immortalized cell while retaining the functions and properties inherent in vascular endothelial cells, astrocyte cells, and brain capillary pericytes is preferable. The method for establishing these immortalized cell lines is not particularly limited. For example, immortalized brain capillary endothelial cell lines obtained from transgenic rats into which the large T antigen gene of SV40 temperature-sensitive mutant tsA58 has been introduced, Since astrocyte cell lines and immortalized brain capillary pericyte lines can control their growth by temperature conditions, i.e., retain their permanent growth ability at 33-37 ° C and stop growing at 39 ° C, It is preferable because the expression of the differentiation trait unique to the cell can be controlled.

【００１６】かかるＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔ
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェ
ニックラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株として
は、血液脳関門の酵素マーカーであるアルカリフォスフ
ァターゼ（ＡＬＰ）やγ−グルタミールトランスペプチ
ダーゼ（γ−ＧＴＰ）、ヘキソース輸送担体であるＧＬ
ＵＴ−１等を発現する細胞株ＴＲ−ＢＢＢ１、ＴＲ−Ｂ
ＢＢ５、ＴＲ−ＢＢＢ６、ＴＲ−ＢＢＢ１１、ＴＲ−Ｂ
ＢＢ１３等を具体的に例示することができる。上記細胞
株ＴＲ−ＢＢＢ１３は、ブタペスト条約に基づいて日本
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番
号ＦＥＰＭ ＢＰ−６８７３として寄託されている。Such a temperature-sensitive mutant of SV40 t
Immortalized brain capillary endothelial cell lines derived from transgenic rats into which the large T antigen gene of sA58 has been introduced include alkaline phosphatase (ALP) and γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTP), which are enzyme markers for the blood brain barrier. GL, a hexose transport carrier
Cell lines TR-BBB1, TR-B expressing UT-1 etc.
BB5, TR-BBB6, TR-BBB11, TR-B
BB13 and the like can be specifically exemplified. The cell line TR-BBB13 has been deposited under the Budapest Treaty under the Accession No. FEPM BP-6873 at the Research Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute of Japan, Ministry of International Trade and Industry.

【００１７】また、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔ
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェ
ニックラット由来の不死化アストロサイト細胞株として
は、Ｎａ+依存性Ｌ−グルタミン酸トランスポーター等
の発現能を有する細胞株ＴＲ−ＡＳＴ３２、ＴＲ−ＡＳ
Ｔ８１１、ＴＲ−ＡＳＴ９１２、ＴＲ−ＡＳＴ９３２、
ＴＲ−ＡＳＴ９４３等を具体的に例示することができ
る。上記細胞株ＴＲ−ＡＳＴ９３２は、ブタペスト条約
に基づいて日本通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に受託番号ＦＥＰＭ ＢＰ−６２８３として寄託
されている。同様に、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株
ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジ
ェニックラット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株とし
ては、ＰＤＧＦ受容体β及びアンギオポエチン−１等の
発現能を有する細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１、ＴＲ−ＰＣＴ２
等を具体的に例示することができる。上記細胞株ＴＲ−
ＰＣＴ１は、ブタペスト条約に基づいて日本通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＰＭ
ＢＰ−７０２４として寄託されている。The temperature-sensitive mutant of SV40 t
Examples of the immortalized astrocyte cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene of sA58 has been introduced include cell lines TR-AST32 and TR-AS capable of expressing Na + -dependent L-glutamic acid transporter and the like.
T811, TR-AST912, TR-AST932,
TR-AST943 and the like can be specifically exemplified. The above cell line TR-AST932 has been deposited under the Budapest Treaty with the Ministry of Economy, Trade and Industry of Japan, as a deposit number FEPM BP-6283 at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology. Similarly, as an immortalized brain capillary pericyte cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant tsA58 of SV40 has been introduced, the expression ability of PDGF receptor β, angiopoietin-1, etc. Cell lines TR-PCT1, TR-PCT2 having
And the like can be specifically exemplified. The above cell line TR-
PCT1 is accorded the Budapest Treaty to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the Ministry of International Trade and Industry of Japan under the accession number FEPM.
Deposited as BP-7024.

【００１８】本発明における血液脳関門再構築モデル
は、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラッ
ト由来の不死化アストロサイト細胞株とを共培養するこ
とや、ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と、ラ
ット由来の不死化アストロサイト細胞株と、ラット由来
の不死化脳毛細血管周皮細胞株とを共培養することによ
って作製することができる。共培養は、これら細胞株同
士を接触状態で培養することにより、又は、不死化脳毛
細血管内皮細胞株と不死化アストロサイト細胞株、若し
くは不死化脳毛細血管内皮細胞株と不死化アストロサイ
ト細胞株及び不死化脳毛細血管周皮細胞株とを、例えば
液性因子などは透過することができるが細胞は透過する
ことができない膜を介して、非接触状態で培養すること
により行うことができる。このような膜を介する非接触
状態での共培養により、不死化脳毛細血管内皮細胞株だ
けを他の細胞から簡単に分離することができるばかりで
なく、種々の孔サイズの膜を用いることにより、細胞相
互間の情報伝達を担う液性因子の分子量を推定すること
ができる。The blood-brain barrier remodeling model in the present invention is used for co-culturing an immortalized brain capillary endothelial cell line derived from a rat with an immortalized astrocyte cell line derived from a rat. It can be prepared by co-culturing a capillary endothelial cell line, a rat-derived immortalized astrocyte cell line, and a rat-derived immortalized brain capillary pericyte cell line. Co-culture is performed by culturing these cell lines in contact with each other, or by immortalized brain capillary endothelial cell line and immortalized astrocyte cell line, or immortalized brain capillary endothelial cell line and immortalized astrocyte cell line. The cell line and the immortalized cerebral capillary pericyte line can be cultured in a non-contact state, for example, through a membrane through which humoral factors and the like can pass but cells cannot. . By co-culturing in a non-contact state through such a membrane, not only can the immortalized brain capillary endothelial cell line be easily separated from other cells, but also by using membranes of various pore sizes. In addition, it is possible to estimate the molecular weight of a humoral factor responsible for signal transmission between cells.

【００１９】また、本発明の血液脳関門のマーカー遺伝
子、例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、γ−グル
タミールトランスペプチダーゼ遺伝子、Ｇｌｕｔ１遺伝
子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株は、前
記ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージ
Ｔ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来
の不死化脳毛細血管内皮細胞株を、前記不死化アストロ
サイト細胞株、又は該不死化アストロサイト細胞株と前
記不死化脳毛細血管周皮細胞株と共培養することにより
得ることができる。かかる血液脳関門のマーカー遺伝子
の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株として
は、共培養後も、共培養することなく単独培養したとき
と比べて、アルカリフォスファターゼ遺伝子の発現が６
倍以上、γ−グルタミールトランスペプチダーゼ遺伝子
の発現が２倍以上、Ｇｌｕｔ１遺伝子の発現が１００倍
以上増強された性状を維持した不死化脳毛細血管内皮細
胞株が好ましい。さらに、多孔性平面膜上で単層培養す
ると細胞が相互に結合して、表裏極性をもつ血液脳関門
を試験内で再構築することができる不死化脳毛細血管内
皮細胞株が特に好ましい。The immortalized cerebral capillary endothelial cell line of the present invention, in which the expression of marker genes for the blood-brain barrier, for example, the alkaline phosphatase gene, the γ-glutamyl transpeptidase gene, and the Glut1 gene are enhanced, is characterized by the temperature sensitivity of SV40. An immortalized cerebral capillary endothelial cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene of the mutant strain tsA58 has been introduced is used as the immortalized astrocyte cell line, or the immortalized astrocyte cell line and the immortalized brain capillary. It can be obtained by co-culturing with a pericyte cell line. As such an immortalized brain capillary endothelial cell line in which the expression of the marker gene of the blood brain barrier is enhanced, the expression of the alkaline phosphatase gene after co-culture is 6 times higher than when the cell is cultured alone without co-culture.
An immortalized cerebral capillary endothelial cell line that maintains the properties in which the expression of the γ-glutamyl transpeptidase gene is enhanced by a factor of 2 or more and the expression of the Glut1 gene is enhanced by a factor of 100 or more is preferred. Furthermore, an immortalized brain capillary endothelial cell line, which is capable of binding cells to each other when cultured in a monolayer on a porous flat membrane and reconstructing the blood-brain barrier with front and back polarity in a test, is particularly preferred.

【００２０】本発明における血液脳関門再構築モデルや
本発明の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した
不死化脳毛細血管内皮細胞は、血液から脳組織への物質
移行を制限している血液脳関門の研究、すなわち、脳の
栄養代謝研究や脳内への薬物透過研究及び血液脳関門に
おける防御機構の研究に活用することができる。従っ
て、医薬品の安全性や有効性に関するスクリーニング、
脳の栄養代謝及び恒常性機能障害に関連する疾患の診断
やその治療方法の開発の細胞レベルでの研究に有利であ
る。以下、本発明における血液脳関門再構築モデルや本
発明の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不
死化脳毛細血管内皮細胞を用いた、血液脳関門形成促進
又は抑制物質や、血液脳関門透過促進又は抑制物質や、
血液脳関門透過又は非透過物質のスクリーニング方法に
ついて説明する。The blood-brain barrier remodeling model of the present invention and the immortalized brain capillary endothelial cells of the present invention in which the expression of the marker gene of the blood-brain barrier is enhanced can be used to control the transfer of substances from blood to brain tissue. It can be used for the study of the brain barrier, that is, the study of nutritional metabolism of the brain, the study of drug penetration into the brain, and the study of defense mechanisms at the blood-brain barrier. Therefore, screening for drug safety and efficacy,
The present invention is advantageous for cell-level research for diagnosing diseases associated with cerebral nutritional metabolism and homeostatic dysfunction and developing therapeutic methods therefor. Hereinafter, using the blood-brain barrier remodeling model of the present invention or the immortalized brain capillary endothelial cells with enhanced expression of the blood-brain barrier marker gene of the present invention, Permeation promoting or inhibiting substances,
A method for screening a substance that has permeated or impregnated the blood-brain barrier will be described.

【００２１】血液脳関門再構築モデルを用いる血液脳関
門形成促進又は抑制物質のスクリーニングは、共培養中
又は共培養の前後に、被検物質を不死化脳毛細血管内皮
細胞株と接触させ、血液脳関門のマーカー遺伝子の発現
の程度を測定し、被検物質が非存在の対照の場合と比較
・評価することにより行うことができる。また、血液脳
関門形成促進又は抑制物質のスクリーニングは、被検物
質と血液脳関門マーカー遺伝子の発現が増強した不死化
脳毛細血管内皮細胞株とを接触させ、血液脳関門のマー
カー遺伝子の発現増強の程度を測定し、被検物質が非存
在の対照の場合と比較・評価することによっても行うこ
とができる。これらスクリーニングにより得られる血液
脳関門形成促進物質は、血液脳関門形成不全に起因する
治療剤として期待することができ、また、これら血液脳
関門形成促進又は抑制物質は、細胞レベルでの血液脳関
門形成の研究に有用である。Screening for a substance that promotes or inhibits blood-brain barrier formation using a blood-brain barrier reconstruction model involves contacting a test substance with an immortalized brain capillary endothelial cell line during or before or after co-culture. It can be carried out by measuring the expression level of the marker gene of the brain barrier, and comparing and evaluating the expression with a control in which the test substance is absent. Screening for a substance that promotes or suppresses blood-brain barrier formation involves contacting a test substance with an immortalized brain capillary endothelial cell line with enhanced expression of the blood-brain barrier marker gene, thereby enhancing expression of the blood-brain barrier marker gene. Can be also measured by measuring the degree of the above, and comparing and evaluating this with the control in which the test substance is absent. The blood-brain barrier formation-promoting substance obtained by these screenings can be expected as a therapeutic agent caused by blood-brain barrier dysfunction, and these blood-brain barrier formation-promoting or suppressing substances can be used at the cellular level. Useful for studying formation.

【００２２】血液脳関門再構築モデルを用いる血液脳関
門透過促進又は抑制物質のスクリーニングは、共培養中
又は共培養の前後に、既知の血液脳関門透過物質又は血
液脳関門非透過物質と被検物質とを、不死化脳毛細血管
内皮細胞株と接触させ、これら血液脳関門透過物質又は
血液脳関門非透過物質の不死化脳毛細血管内皮細胞内へ
の透過の程度を測定し、被検物質が非存在の対照の場合
と比較・評価することによって行うことができる。ま
た、血液脳関門透過促進又は抑制物質のスクリーニング
は、既知の血液脳関門透過物質又は血液脳関門非透過物
質と被検物質とを、血液脳関門マーカー遺伝子の発現が
増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株と接触させ、これ
ら血液脳関門透過物質又は血液脳関門非透過物質の不死
化脳毛細血管内皮細胞内への透過量の程度を測定し、被
検物質が非存在の対照の場合と比較・評価することによ
っても行うことができる。これらスクリーニングにより
得られる血液脳関門透過促進又は抑制物質は、脳の栄養
代謝研究や脳内への薬物透過研究や血液脳関門における
防御機構の研究に活用することができ、特に血液脳関門
透過促進物質は、中枢作用型薬物（抗痴呆薬、脳腫瘍治
療薬、ウイルス治療薬、精神神経作用薬）との併用剤と
して有用である。Screening for a substance promoting or inhibiting blood-brain barrier permeation using the blood-brain barrier remodeling model involves testing a known substance permeating a blood-brain barrier or a substance impervious to the blood-brain barrier during or before or after co-culture. The substance is brought into contact with an immortalized brain capillary endothelial cell line, and the degree of penetration of these blood-brain barrier permeable substances or blood-brain barrier non-permeable substances into the immortalized brain capillary endothelial cells is measured. Can be performed by comparing / evaluating the case where no is present. In addition, screening for a blood-brain barrier permeation-promoting or inhibitory substance is performed by using a known blood-brain-barrier permeant or a blood-brain-barrier non-permeant and a test substance, and immortalized brain capillaries with enhanced expression of the blood-brain barrier marker gene. By contacting with an endothelial cell line, the degree of permeation of these blood-brain barrier permeable substances or blood-brain barrier non-permeants into the immortalized brain capillary endothelial cells is measured. It can also be done by comparing and evaluating. The substances that promote or inhibit the blood-brain barrier permeation obtained by these screenings can be used for studies on nutritional metabolism of the brain, drug permeation into the brain, and research on defense mechanisms at the blood-brain barrier, particularly The substance is useful as a concomitant drug with centrally acting drugs (anti-dementia drugs, drugs for treating brain tumors, drugs for treating viruses, psychoactive drugs).

【００２３】血液脳関門再構築モデルを用いる血液脳関
門透過又は非透過物質のスクリーニングは、共培養中又
は共培養の前後に、被検物質を不死化脳毛細血管内皮細
胞株と接触させ、不死化脳毛細血管内皮細胞内への被検
物質の透過の程度を測定し、被検物質が非存在の対照の
場合と比較・評価することによって行うことができる。
また、血液脳関門透過又は非透過物質のスクリーニング
は、血液脳関門マーカー遺伝子の発現が増強した不死化
脳毛細血管内皮細胞株と被検物質とを接触させ、該不死
化脳毛細血管内皮細胞内への被検物質の透過量の程度を
測定し、被検物質が非存在の対照の場合と比較・評価す
ることによっても行うことができる。これらスクリーニ
ングにより得られる血液脳関門透過物質は、前記中枢作
用型薬物として期待することができ、血液脳関門非透過
物質は、中枢での副作用の問題がない薬物として期待す
ることができる。Screening of a blood-brain barrier permeating or non-permeating substance using a blood-brain barrier remodeling model is performed by bringing a test substance into contact with an immortalized brain capillary endothelial cell line during or before and after co-culture, and It can be performed by measuring the degree of penetration of the test substance into the cerebral capillary endothelial cells, and comparing and evaluating this with a control in which the test substance is absent.
Screening for a blood-brain barrier permeating or non-permeating substance is performed by contacting a test substance with an immortalized brain capillary endothelial cell line in which the expression of a blood brain barrier marker gene is enhanced, and It can also be carried out by measuring the degree of the amount of the test substance permeating into the sample, and comparing and evaluating this with a control in which the test substance is absent. The blood-brain barrier permeable substance obtained by these screenings can be expected as the centrally acting drug, and the blood-brain barrier non-permeable substance can be expected as a drug having no central side effects.

【００２４】[0024]

【実施例】以下の実施例をもって本発明をより詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定される
ものではない。 実施例１（トランスジェニックラットの作出） ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のＤＮＡを
導入したトランスジェニックラットは、下記の手順で作
出した。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples. Example 1 (Production of transgenic rat) Transgenic rats into which the DNA of SV40 temperature-sensitive mutant tsA58 was introduced were produced by the following procedure.

【００２５】１−１（導入遺伝子の調製） マイクロインジェクションにはＳＶ４０の温度感受性突
然変異株ｔｓＡ５８のゲノムＤＮＡを使用した。ｔｓＡ
５８のゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで開環し、ｐ
ＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に導入し、ＳｆｉＩ配列を
ＳａｃIIに変換してＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠
失するｏｒｉ（−）としたＤＮＡクローンｐＳＶｔｓＡ
５８ｏｒｉ（−）−２（Ohno T. et al., Cytotechnolo
gy, 165-172, 1991；図１参照）から常法に従い導入用
ＤＮＡを調製した。すなわち、大腸菌内で大量に増幅さ
せることにより得られたプラスミドＤＮＡのｐＳＶｔｓ
Ａ５８ｏｒｉ（−）−２を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造
社製）で消化した後、アガロース電気泳動法（１％ゲ
ル；ベーリンガー社製）により分離し、ゲルを溶解した
後、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿
処理を行いＤＮＡを回収した。回収した精製ＤＮＡをＴ
Ｅバッファー（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）に溶解して１７０μｇ／ｍ
ｌの精製ＤＮＡを含む溶液を得た。このＤＮＡ溶液を注
入用バッファー（０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）で５μｇ／ｍｌとな
るように希釈して注入用ＤＮＡ溶液を調製した。なお、
調製したＤＮＡ溶液は注入操作まで−２０℃で保存し
た。1-1 (Preparation of Transgene) The genomic DNA of the temperature-sensitive mutant tsA58 of SV40 was used for microinjection. tsA
58 genomic DNAs were opened with the restriction enzyme BamHI and p
The DNA clone pSVtsA, which was introduced into the BamHI site of BR322, converted the SfiI sequence into SacII and deleted the SV40 origin of replication (ori), which was ori (-).
58 ori (-)-2 (Ohno T. et al., Cytotechnolo
gy, 165-172, 1991; see FIG. 1) according to a conventional method. That is, pSVts of plasmid DNA obtained by large-scale amplification in Escherichia coli
A58 ori (-)-2 was digested with the restriction enzyme BamHI (Takara Shuzo), separated by agarose electrophoresis (1% gel; Boehringer), and the gel was dissolved, treated with phenol / chloroform and precipitated with ethanol. After the treatment, DNA was recovered. The recovered purified DNA is
E buffer (10 mM Tr with 1 mM EDTA)
is-HCl; pH 7.6) and dissolved in 170 μg / m
A solution containing 1 l of purified DNA was obtained. This DNA solution was added to an injection buffer (10 mM containing 0.1 mM EDTA).
(Tris-HCl; pH 7.6) to prepare a DNA solution for injection. In addition,
The prepared DNA solution was stored at −20 ° C. until the injection operation.

【００２６】１−２（トランスジェニックラットの作
出） ラット前核期受精卵への上記調製した注入用ＤＮＡ溶液
のマイクロインジェクションは下記の要領で行った。性
成熟した８週齢のウィスターラットを明暗サイクル１２
時間（４：００〜１６：００を明時間）、温度２３±２
℃、湿度５５±５％で飼育し、膣スメアにより雌の性周
期を観察して、ホルモン処理日を選択した。まず、雌ラ
ットにより１５０ＩＵ／ｋｇの妊馬血清性性腺刺激ホル
モン（日本ゼンヤク社製；ＰＭＳ全薬（pregnant mare
serum gonadotropin：ＰＭＳＧ））を腹腔内投与し、そ
の４８時間後に７５ＩＵ／ｋｇのヒト絨毛性性腺刺激ホ
ルモン（三共臓器社製；プベローゲン（human chorioni
c gonadotropin：ｈＣＧ））を投与して過剰***処理を
行った後、雄との同居により交配を行った．ｈＣＧ投与
３２時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。
卵管灌流及び卵の培養にはｍＫＲＢ液（Toyoda Y. and
Chang M.C., J. Reprod. Fertil., 36, 9-22, 1974）を
使用した。採取した受精卵を０．１％のヒアルロニダー
ゼ（シグマ社製；Hyaluronidase Typel-S）を含むｍＫ
ＲＢ液中で３７℃、５分間の酵素処理を行い卵丘細胞を
除去した後、ｍＫＲＢ液で３回洗浄して酵素を除去し、
ＤＮＡ注入操作までＣＯ2−インキュベーター内（５％
のＣＯ2−９５％のＡｉｒ，３７℃、飽和湿度）に保存
した。この様にして準備したラット受精卵の雄性前核に
前記ＤＮＡ溶液を注入した。注入した２２８個の卵を９
匹の仮親に移植して出産させ８０匹の産仔を得た。注入
ＤＮＡのラットへの導入は、離乳直後に断尾して得た尾
より調製したＤＮＡをＰＣＲ法により検定した［使用プ
ライマー；ｔｓＡ５８−１Ａ，５′−ＴＣＣＴＡＡＴＧ
ＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧ−３′（１３６５〜１３８４
部位に相当：配列番号１）、ｔｓＡ５８−１Ｂ，５′−
ＡＴＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧ−３′（１
５７１〜１５９０部位に相当：配列番号２）］。その結
果、遺伝子導入の認められた２０匹（雄６匹、雌８匹、
生別不明６匹）の産仔の中から性成熟期間を経過する１
２週齢まで生存した１１ラインのトランスジェニックラ
ット（雄ライン：＃０７−２，＃０７−５，＃０９−
６，＃１２−３，＃１９−５，雌ライン：＃０９−７，
＃１１−６，＃１２−５，＃１２−７，＃１８−５，＃
１９−８）を得た。これらのＧ0世代のトランスジェニ
ックラットとウィスターラットを交配し、雄ファウンダ
ーの２ライン（＃０７−２，＃０７−５）と雌ファウン
ダーの３ライン（＃０９−７，＃１１−６，＃１９−
８）において次世代以降への遺伝子の伝達を確認した。1-2 (Production of Transgenic Rat) Microinjection of the above prepared DNA solution for injection into fertilized rat eggs at the pronuclear stage was performed as follows. Sexually mature 8-week-old Wistar rats are subjected to a light-dark cycle 12
Time (40: 00-16: 00 light time), temperature 23 ± 2
The animals were bred at 55 ° C. and a humidity of 55 ± 5%, and the sexual cycle of the female was observed by vaginal smear, and the date of hormone treatment was selected. First, 150 IU / kg of pregnant horse serum gonadotropin (manufactured by Nippon Zenyaku; PMS all drugs (pregnant mare)
serum gonadotropin (PMSG)) was intraperitoneally administered, and 48 hours later, 75 IU / kg of human chorionic gonadotropin (manufactured by Sankyo Organ Co., Ltd .; pverogen (human chorioni)
After administration of c gonadotropin (hCG)), superovulation was performed, and then mating was performed by living with males. Pronuclear stage fertilized eggs were collected by fallopian tube perfusion 32 hours after hCG administration.
For oviduct perfusion and egg culture, mKRB solution (Toyoda Y. and
Chang MC, J. Reprod. Fertil., 36, 9-22, 1974). The collected fertilized eggs were treated with mK containing 0.1% hyaluronidase (manufactured by Sigma; Hyaluronidase Typel-S).
After removing the cumulus cells by performing an enzyme treatment at 37 ° C. for 5 minutes in an RB solution, the enzyme was removed by washing three times with an mKRB solution.
Until DNA injection operation in CO 2 -incubator (5%
(CO 2 -95% Air, 37 ° C., saturation humidity). The DNA solution was injected into the male pronucleus of the thus-prepared fertilized rat eggs. 9 228 eggs injected
The animals were transplanted into foster mothers and delivered to give birth to 80 offspring. The introduced DNA was introduced into rats by PCR using a DNA prepared from a tail obtained by cutting the tail immediately after weaning [primer used; tsA58-1A, 5'-TCCTAATG]
TGCAGTCAGGGTG-3 '(1365 to 1384)
Corresponding to the site: SEQ ID NO: 1), tsA58-1B, 5'-
ATGACGAGCTTTGGCACTTG-3 '(1
571 to 1590 sites: SEQ ID NO: 2)]. As a result, 20 animals (6 males, 8 females,
The sexual maturation period elapses from the offspring of 6 unidentified pups 1
11 lines of transgenic rats (male lines: # 07-2, # 07-5, # 09-
6, # 12-3, # 19-5, female line: # 09-7,
# 11-6, # 12-5, # 12-7, # 18-5, #
19-8) was obtained. It crossed these G 0 generation of transgenic rats and Wistar rats, 2 line of male founders (# 07-2, # 07-5) and female founders 3 line (# 09-7, # 11-6, # 19-
In 8), gene transfer to the next generation and beyond was confirmed.

【００２７】実施例２（脳毛細血管内皮細胞の調製） ２−１（脳毛細血管内皮細胞の分離） 実施例１で得られたＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔ
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェ
ニックラット（１匹）より大脳を摘出した。クリーンベ
ンチ内で摘出した大脳を氷冷した調整用緩衝液（１０ｍ
ＭのＨｅｐｅｓ、１００Ｕ／ｍｌのbenzylpenicillin p
otassium、１００μｇ／ｍｌのstreptomycin sulfate、
０．５％のウシ血清アルブミンを含むＨＢＳＳ）でよく
洗浄した後、大脳を１〜２ｍｍ3に細切し、１ｍｌ用テ
ーバー型テフロン（登録商標）製ホモゲナイザー（WHEA
TON社製）に移し、１ｍｌの氷冷した調整用緩衝液を加
え、４回のアップダウンのストロークを行い組織をホモ
ゲナイズしてスラリーを得た。得られたスラリーを遠心
（６００×ｇ、５分間、４℃）してペレットを得た。得
られたペレットを１ｍｌの酵素溶液（０．０１％のcoll
agenase/dispase（Boehringer Manheim社製）、１００
Ｕ／ｍｌのbenzylpenicillin potassium、１００μｇ／
ｍｌのstreptomycin sulfate、２０Ｕ／ｍｌのdeoxyrib
onuclease I、０．１４７μｇ／ｍｌのtosyl-lysine-ch
loromethylketoneを添加したＨＢＳＳ）に懸濁し、振盪
を加えた水浴中で酵素処理（３７℃、３０分間）を行
い、不要な組織から毛細血管を分離した。遠心（６００
×ｇ、５分間、４℃）してペレットを得た。得られたペ
レットから不要な組織を除去するため、１０ｍｌの１６
％のデキストランを含むＨＢＳＳにペレットを懸濁し、
遠心（１，０００×ｇ、１５分間、４℃）により毛細血
管画分のペレットを得た。得られたペレットを再び１ｍ
ｌの酵素溶液に懸濁して酵素処理（３７℃、３０分間）
を行うことで毛細血管を細切した。遠心（６００×ｇ、
５分間、４℃）してペレットを得た。次に、得られたペ
レットを２ｍｌの培養液（１５μｇ／ｍｌのendothelia
l cell growth factor、１００Ｕ／ｍｌのbenzylpenici
llin potassium、１００μｇ／ｍｌのstreptomycin sul
fate、２．５０μｇ／ｍｌのamphotericin Bを添加した
ＤＭＥＭ）に分散して１枚のコラーゲンタイプＩをコー
トした３５mmφ培養シャーレー（Becton Dickinson社
製）に播種した。３３℃の炭酸ガス培養器（５％ＣＯ2
−９５％Ａｉｒ、飽和湿度）内で培養（初代培養）し
た。培地を１週間に２回交換し、継代はトリプシン液
（０．０５％のTrypsin、０．５３ｍＭＥＤＴＡ；Gibco
BRL社製）を用いて細胞を剥離し、細胞を分散播種し
た。継代はおよそ１週間隔で行った。３回の継代の後、
１０2〜１０3個の細胞をコラーゲンタイプＩをコートし
た１００mmφ培養シャーレー（Becton Dickinson社製）
に播種した。３３℃の炭酸ガス培養器内で培養してコロ
ニー形成を行った。培地を１週間に２回交換し、７〜１
０日後にコロニーを形成した増殖速度の比較的速いコロ
ニーをペニシリンカップを用いて周囲の細胞から単離
し、得られた細胞を再び１００mmφ培養シャーレーに播
種して３３℃の炭酸ガス培養器内で培養してコロニー形
成を行った。ペニシリンカップを用いて増殖速度の比較
的速いコロニーを周囲の細胞から単離して５種の細胞株
（ＴＲ−ＢＢＢ１、ＴＲ−ＢＢＢ５、ＴＲ−ＢＢＢ６、
ＴＲ−ＢＢＢ１１、ＴＲ−ＢＢＢ１３）を得た。これら
の細胞株は内皮細胞特異的なスピンドルファイバー状の
継代を示した。なお、ＴＲ−ＢＢＢ１３株は、ブタペス
ト条約に基づいて日本通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に受託番号ＦＥＰＭ ＢＰ−６８７３とし
て寄託されている。Example 2 (Preparation of Brain Capillary Endothelial Cells) 2-1 (Isolation of Brain Capillary Endothelial Cells) Temperature-Sensitive Mutant of SV40 Obtained in Example 1
The cerebrum was isolated from one transgenic rat into which the large T antigen gene of sA58 was introduced. An ice-cooled adjustment buffer (10 m
M Hepes, 100 U / ml benzylpenicillin p
otassium, 100 μg / ml streptomycin sulfate,
After washing well with 0.5% bovine serum albumin (HBSS), the cerebrum was cut into 1-2 mm 3 , and a 1 ml Taber-type Teflon® homogenizer (WHEA) was used.
(Manufactured by TON Co., Ltd.), 1 ml of an ice-cooled adjustment buffer was added, and four up-down strokes were performed to homogenize the tissue to obtain a slurry. The resulting slurry was centrifuged (600 × g, 5 minutes, 4 ° C.) to obtain a pellet. The obtained pellet is mixed with 1 ml of an enzyme solution (0.01% coll).
agenase / dispase (Boehringer Manheim), 100
U / ml benzylpenicillin potassium, 100 μg /
ml of streptomycin sulfate, 20U / ml of deoxyrib
onuclease I, 0.147 μg / ml tosyl-lysine-ch
The suspension was suspended in HBSS to which loromethylketone was added, and subjected to an enzyme treatment (37 ° C., 30 minutes) in a shaking water bath to separate capillaries from unnecessary tissues. Centrifuge (600
× g, 5 minutes, 4 ° C.) to obtain a pellet. In order to remove unnecessary tissue from the obtained pellet, 10 ml of 16
The pellet is suspended in HBSS containing 5% dextran,
A pellet of the capillary fraction was obtained by centrifugation (1,000 × g, 15 minutes, 4 ° C.). The obtained pellet is again 1 m
1 enzyme solution and suspended (37 ° C, 30 minutes)
Was performed to cut the capillaries. Centrifugation (600 × g,
5 minutes at 4 ° C.) to obtain a pellet. Next, the obtained pellet was mixed with 2 ml of a culture solution (15 μg / ml endothelia).
l cell growth factor, 100 U / ml benzylpenici
llin potassium, 100 μg / ml streptomycin sul
fate, 2.50 μg / ml of amphotericin B) and dispersed in a 35 mmφ culture dish (Becton Dickinson) coated with one collagen type I. 33 ° C carbon dioxide incubator (5% CO 2
(Primary culture) in -95% Air, saturation humidity). The medium was changed twice a week, and the passage was performed using a trypsin solution (0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA; Gibco
The cells were detached using BRL (manufactured by BRL) and dispersed and seeded. Passaging was performed at approximately one week intervals. After three passages,
A culture dish of 100 mmφ in which 10 2 to 10 3 cells are coated with collagen type I (Becton Dickinson)
Seeded. Colonies were formed by culturing in a 33 ° C. carbon dioxide incubator. The medium was changed twice a week and 7-1
A colony that formed a colony after 0 days was isolated from surrounding cells using a penicillin cup, and the obtained cells were again seeded in a 100 mmφ culture dish and cultured in a 33 ° C. carbon dioxide incubator. To form a colony. Colonies having a relatively high growth rate were isolated from surrounding cells using a penicillin cup, and were separated into five cell lines (TR-BBB1, TR-BBB5, TR-BBB6,
TR-BBB11, TR-BBB13) were obtained. These cell lines exhibited spindle fiber-like passages specific to endothelial cells. The TR-BBB13 strain has been deposited under the Budapest Treaty with the Ministry of Economy, Trade and Industry of Japan, as a deposit number FEPM BP-6873.

【００２８】２−２（ラージＴ抗原タンパク質の確認） 上記実施例２−１で得られた５種の細胞株におけるラー
ジＴ抗原蛋白質の発現をウエスタンブロット法（実験医
学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズ「分子生物学的ア
プローチによる癌研究プロトコール」１０８〜１１５
頁、羊土社、１９９５年発行）により検討した。５種の
細胞株（継代数：２０）を９０mmφ培養シャーレーで飽
和まで培養した。回収した細胞を３％ＳＤＳ−ＰＢＳ
（ｐＨ７.４）で可溶化した後、遠心（１０，０００ｒ
ｐｍ １０分間）して不溶画分を除去した後、ブラッド
フォード法（BIO-RAD社製プロテインアッセイキットII
を使用）で総蛋白質量を定量した。それぞれ２０μｇの
蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
後、ニトロセルロース膜に転写した。３％スキムミルク
溶液でブロッキングしたニトロセルロース膜に１次抗体
として抗ＳＶ４０ラージＴ抗原抗体（CALBIOCHEM社製、
DPO2-C）を、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ
抗体（Amersham社製）を反応させ、ラージＴ抗原蛋白質
特異的な反応をアマシャム社製ECLウエスタンブロッテ
ィング検出システム（RPN2106M1）を用いて検出した。
５種の細胞株全てにおいてラージＴ抗原蛋白質の発現を
確認した。2-2 (Confirmation of Large T Antigen Protein) The expression of large T antigen protein in the five cell lines obtained in Example 2-1 was determined by Western blotting (Experimental Medicine, separate volume Bio Manual UP series, “Molecules”). Biological Approach to Cancer Research Protocol "108-115
Page, Yodosha, published in 1995). Five cell lines (passage number: 20) were cultured in a 90 mmφ culture dish until saturation. Recovered cells are 3% SDS-PBS
(PH 7.4), and then centrifuged (10,000 rpm).
pm for 10 minutes) to remove the insoluble fraction, followed by the Bradford method (BIO-RAD protein assay kit II).
Was used to determine the total amount of protein. After 20 μg of each protein was separated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, it was transferred to a nitrocellulose membrane. An anti-SV40 large T antigen antibody (CALBIOCHEM, Inc.) was used as a primary antibody on a nitrocellulose membrane blocked with a 3% skim milk solution.
DPO2-C) as a secondary antibody using HRP-labeled anti-mouse IgG
An antibody (Amersham) was reacted, and a large T antigen protein-specific reaction was detected using an ECL Western blotting detection system (RPN2106M1) manufactured by Amersham.
Expression of the large T antigen protein was confirmed in all five cell lines.

【００２９】２−３（細胞の同定） 上記実施例２−１で得られた細胞株が脳毛細血管内皮細
胞であることを、ＧＬＵＴ−１輸送担体およびｐ−糖蛋
白質の発現をウエスタンブロッティング法で検定した。
得られた各細胞株について、実施例２−２と同じ方法で
作製したニトロセルロース膜を用いて、１次抗体として
抗マウスＧＬＵＴ−１抗体（Chemicon社製、Temecular,
CA）又は抗ｐ−糖蛋白質ウサギ抗体（抗ｍｄｒ抗体、O
ncogeneResearch Products社製）を、２次抗体としてＨ
ＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Amersham社製）又はＨＲ
Ｐ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Cappel社製）を反応させ、
ＧＬＵＴ−１蛋白質あるいはｐ−糖蛋白質特異的な反応
をアマシャム社製ECLウエスタンブロッティング検出シ
ステム（RPN2106M1）を用いて検出した。５種の細胞株
全てにおいてＧＬＵＴ−１蛋白質及びｐ−糖蛋白質の発
現が確認された。従って、得られた５種の細胞が脳毛細
血管内皮細胞であることが同定された。2-3 (Identification of Cells) The cell line obtained in Example 2-1 was determined to be brain capillary endothelial cells by Western blotting using the GLUT-1 transporter and the expression of p-glycoprotein. Was tested.
For each of the obtained cell lines, an anti-mouse GLUT-1 antibody (manufactured by Chemicon, Temecular, Inc.) was used as a primary antibody using a nitrocellulose membrane prepared in the same manner as in Example 2-2.
CA) or anti-p-glycoprotein rabbit antibody (anti-mdr antibody, O
ncogeneResearch Products) as secondary antibody
RP-labeled anti-mouse IgG antibody (Amersham) or HR
Reaction with a P-labeled anti-rabbit IgG antibody (manufactured by Cappel)
A reaction specific to the GLUT-1 protein or p-glycoprotein was detected using an ECL Western blotting detection system (RPN2106M1) manufactured by Amersham. Expression of GLUT-1 protein and p-glycoprotein was confirmed in all five cell lines. Therefore, it was identified that the obtained five types of cells were brain capillary endothelial cells.

【００３０】２−４（グルコース輸送能の確認） 上記実施例２−１で得られた細胞株ＴＲ−ＢＢＢ１、Ｔ
Ｒ−ＢＢＢ５、ＴＲ−ＢＢＢ６、ＴＲ−ＢＢＢ１１、Ｔ
Ｒ−ＢＢＢ１３が機能的なＧＬＵＴ−１輸送担体を持つ
ことを、３−ＯＭＧ（3-o-methyl-D-glucose）取り込み
能を測定し、濃度依存的なグルコース輸送能を示すこと
で機能的なＧＬＵＴ−１輸送担体を有することを確認し
た。すなわち、２４穴細胞培養用プレートにＴＲ−ＢＢ
Ｂ株を３×１０5／ウェル／ｍｌとなるように播き、３
３℃の炭酸ガス培養基で２４時間培養して細胞をコンフ
ルエントにした。３−ＯＭＧの取り込みの測定は次の要
領で行った。まず、培地を吸引して除去した後、３７℃
に温めた２３２ｋＢｑ／ｍｌの［3Ｈ］３−ＯＭＧを含
むuptake bufferを０．２ｍｌ加えた。uptake buffer
（１２２ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭ
のＣａＣｌ2、１．４ｍＭのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．
４ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２５ｍＭ
のＮａＨＣＯ3）は、５％ＣＯ2−９５％Ｏ2で２０分間
バブリングしてＮａＯＨでｐＨ７．４に調製したもので
ある。１０秒後にuptake bufferを取り除き、４℃のupt
ake bufferで洗浄した。以下、uptake bufferを取り除
くまでの時間を２０秒間、３０秒間、１分間として同様
の操作を行った。細胞を１％のトライトンＸ−１００を
含む１ｍｌのＰＢＳで一晩可溶化し、液体シンチレーシ
ョンカウンターを用いて放射活性を測定し、３−ＯＭＧ
の取り込み能の直線性を確認した。結果、２０秒間の取
り込み時間を設定した。2-4 (Confirmation of Glucose Transport Ability) The cell lines TR-BBB1, T-cell obtained in Example 2-1 above
R-BBB5, TR-BBB6, TR-BBB11, T
The fact that R-BBB13 has a functional GLUT-1 transporter is determined by measuring the ability of 3-OMG (3-o-methyl-D-glucose) uptake and showing a concentration-dependent glucose transporter. GLUT-1 transport carrier was confirmed. That is, TR-BB was added to a 24-well cell culture plate.
The B strain was seeded at 3 × 10 5 / well / ml.
The cells were confluent by culturing in a carbon dioxide culture medium at 3 ° C. for 24 hours. The measurement of the uptake of 3-OMG was performed as follows. First, after removing the culture medium by suction, 37 ° C
0.2 ml of warmed uptake buffer containing 232 kBq / ml [ 3 H] 3-OMG was added. uptake buffer
(122 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.4 mM
CaCl 2 , 1.4 mM MgSO 4 .7H 2 O, 0.1 mM
4 mM K 2 HPO 4 , 10 mM Hepes, 25 mM
NaHCO 3 ) was prepared by bubbling with 5% CO 2 -95% O 2 for 20 minutes to pH 7.4 with NaOH. After 10 seconds, remove the uptake buffer and remove the uptake at 4 ° C.
Washed with ake buffer. Hereinafter, the same operation was performed by setting the time until the uptake buffer was removed to 20 seconds, 30 seconds, and 1 minute. Cells were solubilized overnight in 1 ml of PBS containing 1% Triton X-100, radioactivity was measured using a liquid scintillation counter, and 3-OMG was measured.
The linearity of the uptake ability was confirmed. As a result, a capture time of 20 seconds was set.

【００３１】次に、３−ＯＭＧの取り込みの基質濃度依
存性を検討した。細胞を３７℃に温めたuptake buffer
で洗浄した後、３７℃に温めた４６２ｋＢｑ／ウェルの
［3Ｈ］３−ＯＭＧを含むuptake bufferを０．２ｍｌ加
えた。ただし、非標識体の３−ＯＭＧを０、０．５、
１．５、１０、２０、３０、５０ｍＭ含むuptake buffe
rを使用して３−ＯＭＧの各濃度液とした。２０秒後にu
ptake bufferを取り除き、４℃の１０ｍＭの非標識体３
−ＯＭＧを含むuptake bufferで洗浄した。次に、１％
のトライトンＸ−１００を含む１ｍｌのＰＢＳで一晩可
溶化し、液体シンチレーションカウンターを用いて放射
活性を測定した。なお、、３−ＯＭＧの濃度に対する取
り込み速度のプロット式（Ｖ＝ＶｍａｘＸ［Ｓ］／（Ｋ
ｍ＋［Ｓ］）；Ｖｍａｘは最大速度定数、Ｋｍはミカエ
リス定数、［Ｓ］は基質濃度）を用いて３−ＯＭＧの取
り込みのＫｍとＶｍａｘを非線形最小二乗法プログラム
（Yamaoka K. et al., J. Pharmacobio-Dyn., 4, 879-8
85, 1981）を用いて解析した。この結果、ＧＬＵＴ−１
の基質である［3Ｈ］３−ＯＭＧの取り込みは濃度依存
的であり、そのミカエリス定数（Ｋｍ）は５．６ｍＭ、
最大取り込み速度定数（Ｖｍａｘ）は４５ｎｍｏｌ／ｍ
ｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。その初期取り込
み速度を７．０７〜１０．２μｌ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒ
ｏｔｅｉｎであった。結果を表１に示す。Next, the dependence of 3-OMG uptake on the substrate concentration was examined. Uptake buffer with cells warmed to 37 ° C
Then, 0.2 ml of an uptake buffer containing 462 kBq / well [ 3 H] 3-OMG, which had been heated to 37 ° C., was added. However, unlabeled 3-OMG is 0, 0.5,
Uptake buffe containing 1.5, 10, 20, 30, and 50 mM
r was used as each concentration solution of 3-OMG. U after 20 seconds
Remove the ptake buffer and remove 10 mM unlabeled 3 at 4 ° C.
-Washed with uptake buffer containing OMG. Next, 1%
Was dissolved overnight in 1 ml of PBS containing Triton X-100, and the radioactivity was measured using a liquid scintillation counter. It should be noted that a plot equation of the uptake rate with respect to the concentration of 3-OMG (V = VmaxX [S] / (K
m + [S]); Vmax is the maximum rate constant, Km is the Michaelis constant, [S] is the substrate concentration), and the Km and Vmax of 3-OMG incorporation are calculated using a nonlinear least squares program (Yamaoka K. et al., J. Pharmacobio-Dyn., 4, 879-8
85, 1981). As a result, GLUT-1
The uptake of [ 3 H] 3-OMG, which is a substrate of, is concentration-dependent, and its Michaelis constant (Km) is 5.6 mM.
The maximum uptake rate constant (Vmax) is 45 nmol / m
in / mg protein. The initial uptake rate is 7.07 to 10.2 μl / min / mg pr
otein. Table 1 shows the results.

【００３２】[0032]

【表１】 [Table 1]

【００３３】２−５（スカベンジャーレセプター機能の
確認） 上記実施例２−１で得られた細胞株ＴＲ−ＢＢＢ１３が
機能的なスカベンジャーレセプターを持つことを、蛍光
標識体である1,1' -dioctadecyl- 3,3,3',3'-tetrameth
yl-indocarbocyanine perchlorate標識アセチル化ＬＤ
Ｌ（Dil-Ac-LDL、Biomedical Technologies, Stoughto
n, MA）の取り込みを測定することで解析した。カバー
グラスに細胞株ＴＲ−ＢＢＢ１３を１×１０5／ウエル
／ｍｌ培地で播種し、３３℃の炭酸ガス培養器内で４８
時間培養して細胞をコンフルエントにした。Ｄｉｌ−Ａ
ｃ−ＬＤＬの取り込み測定は、まず、培地を吸引して除
去した後に予め３７℃に温めたuptake buffer II（１２
２ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＣａ
Ｃｌ2、１．４ｍＭのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．４ｍＭ
のＫ2ＨＰＯ4、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２５ｍＭのＮａ
ＨＣＯ3、１０ｍＭのＤ−ｇｌｕｃｏｓｅの溶液を５％
ＣＯ2−９５％Ｏ2で２０分間バブリングして、ＮａＯＨ
でｐＨ７．４に調整）で細胞を洗浄した。次に、３７℃
に温めた１０μｇ／２００μｌのＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ
を含むuptake buffer IIを０．２ｍｌ加え３０分間炭酸
ガス培養器でインキュベーションした。４時間後にupta
ke buffer IIを除去し、４℃のuptake buffer IIで３回
洗浄した。次に、３％ formaldehyde／ＰＢＳを加え２
０分間室温に保持して固定したものを共焦点レーザー顕
微鏡を用いて細胞内に取り込まれた蛍光を測定した。そ
の結果、スカベンジャーレセプターのリガンドである1,
1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyan
ine perchlorateで標識されたアセチル化ＬＤＬ（Ｄｉ
ｌ−Ａｃ−ＬＤＬ）が細胞内に取り込まれていることを
確認した。また、他の細胞株でも同様の結果が得た。2-5 (Confirmation of Scavenger Receptor Function) The fact that the cell line TR-BBB13 obtained in Example 2-1 has a functional scavenger receptor was confirmed by the use of a fluorescent label, 1,1'-dioctadecyl. -3,3,3 ', 3'-tetrameth
yl-indocarbocyanine perchlorate labeled acetylated LD
L (Dil-Ac-LDL, Biomedical Technologies, Stoughto
n, MA) was analyzed by measuring incorporation. The cell line TR-BBB13 was seeded on a cover glass at 1 × 10 5 / well / ml medium, and the cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 33 ° C. for 48 hours.
Cells were grown to confluence by culturing for hours. Dil-A
The c-LDL uptake measurement was performed by first removing the medium by suction, and then preheating the medium to 37 ° C. in the uptake buffer II (12
2 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.4 mM Ca
Cl 2 , 1.4 mM MgSO 4 .7H 2 O, 0.4 mM
K 2 HPO 4 , 10 mM Hepes, 25 mM Na
HCO 3 , 10 mM D-glucose solution 5%
Bubble with CO 2 -95% O 2 for 20 min.
The cells were washed at pH 7.4. Next, at 37 ° C
10 μg / 200 μl of Dil-Ac-LDL
Was added, and the mixture was incubated for 30 minutes in a carbon dioxide incubator. 4 hours later upta
The ke buffer II was removed and washed three times with 4 ° C. uptake buffer II. Next, add 3% formaldehyde / PBS and add 2
Fluorescence taken into cells was measured using a confocal laser microscope after fixing at room temperature for 0 minutes. As a result, scavenger receptor ligands 1,
1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl-indocarbocyan
acetylated LDL labeled with ine perchlorate (Di
1-Ac-LDL) was confirmed to be taken up into the cells. Similar results were obtained with other cell lines.

【００３４】２−６（アルカリフォスファターゼ及びγ
−グルタミルランスペプチダーゼ活性の確認） 上記実施例２−１で得られた細胞株が脳毛細血管内皮細
胞に発現しているアルカリフォスファターゼ活性及びγ
グルタミルトランスペプチダーゼ活性を発現することを
常法に従い測定した。測定には、アルカリ性ホスファＢ
−テストワコー及びγ−ＧＴＰ−テストワコー（和光純
薬社製）を使用し、それぞれのキットに記載された標準
測定法に従って測定した。尚、タンパク質量は、ブラッ
ドフォード法（プロテインアッセイキットII；BIO-RAD
社製）により測定した。その結果、アルカリフォスファ
ターゼ活性及びγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活
性はラット脳毛細血管リッチ画分（Brain Capillarie
s）を対照に、それぞれ８．７〜２５．８％及び５．４
〜２２．６％を示し、脳毛細血管内皮細胞特異酵素の発
現を認めた。結果を表２に示す。2-6 (Alkaline phosphatase and γ
-Confirmation of glutamyl orchid peptidase activity) The cell line obtained in the above Example 2-1 shows alkaline phosphatase activity and γ expressed in brain capillary endothelial cells.
Expression of glutamyl transpeptidase activity was measured according to a conventional method. For measurement, use alkaline phospha B
-Test Wako and γ-GTP-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were used and measured according to the standard measurement method described in each kit. The protein amount was determined by the Bradford method (Protein Assay Kit II; BIO-RAD).
(Manufactured by the company). As a result, the alkaline phosphatase activity and the γ-glutamyl transpeptidase activity were changed in the rat brain capillary rich fraction (Brain Capillarie).
s) as a control, 8.7 to 25.8% and 5.4, respectively.
２２22.6%, indicating the expression of brain capillary endothelial cell-specific enzymes. Table 2 shows the results.

【００３５】[0035]

【表２】 [Table 2]

【００３６】実施例３（アストロサイト細胞株の調製） ３−１（アストロサイト細胞株の分離） 上記の実施例１で得られたＳＶ４０の温度感受性突然変
異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトラン
スジェニックラット（５匹）から大脳を摘出した。脳ア
ストロサイト細胞の分離と回収は酵素法を用いて以下の
ように行った。大脳を１２１℃、１５分間で滅菌し、分
離バッファー（１２２ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣ
ｌ、１．４ｍＭのＣａＣｌ2、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4、
０．４ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、１０ｍＭのＧｌｕｃｏｓｅ、
１０ｍＭのＨｅｐｅｓ；ｐＨ７．４）の入ったシャーレ
に入れてクリーンベンチ内に移し、分離バッファーで洗
浄した。大脳をはさみで２ｍｍ角に細くし、あるいは小
さく刻み、１ｍｌの２．４Ｕ／ｍｌのディスパーゼ溶液
を加え、３７℃、１０分間で酵素処理した。未消化断片
を除去後、培地（１００Ｕ／ｍｌのPenicillin G、１０
０ｍｇ／ｍｌのstreptomycin sulfate、１０％のfetal
bovine serum、ＤＭＥＭ９．６ｇを２回蒸留水で１Ｌに
したもの）に懸濁した。Example 3 (Preparation of Astrocyte Cell Line) 3-1 (Isolation of Astrocyte Cell Line) The large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant tsA58 of SV40 obtained in the above Example 1 was introduced. The cerebrum was excised from the transgenic rats (5). Separation and recovery of brain astrocyte cells were performed using an enzymatic method as follows. The cerebrum is sterilized at 121 ° C. for 15 minutes, and separated with a separation buffer (122 mM NaCl, 3 mM KC).
1, 1.4 mM CaCl 2 , 1.2 mM MgSO 4 ,
0.4 mM K 2 HPO 4 , 10 mM Glucose,
It was placed in a Petri dish containing 10 mM Hepes (pH 7.4), transferred to a clean bench, and washed with a separation buffer. The cerebrum was thinned to 2 mm square or cut into small pieces with scissors, and 1 ml of 2.4 U / ml dispase solution was added thereto, followed by enzyme treatment at 37 ° C. for 10 minutes. After removing the undigested fragments, the medium (100 U / ml Penicillin G, 10
0mg / ml streptomycin sulfate, 10% fetal
bovine serum and 9.6 g of DMEM were made up to 1 L with double distilled water).

【００３７】得られた細胞懸濁液を培養皿（Corning社
製；＃４３０１６７）にて３７℃の５％ＣＯ2インキュ
ベーターで２日間培養した。３日目に３３℃の５％ＣＯ
2インキュベーターに移して培養を継続した。細胞の継
代には０．１％のコラゲナーゼ／ディスパーゼ溶液で３
７℃、５分間処理した後、４℃で２時間放置して細胞を
培養皿から剥離した。この細胞のクローニングはコロニ
ー形成法で行った。１〜３回継代した細胞について、細
胞を剥離後、１０2〜１０3個の細胞を９０ｍｍ培養皿に
播き、コロニー形成を行った。培地を吸引除去後、片側
にグリースを塗ったクローニングカップをコロニーが中
央にくるように培養皿に立てた。カップ内にのみ０．２
５％のトリプシン−ＥＤＴＡ液を加え、３３℃で１分間
インキュベートした。培地をカップ内に加え、ピペッテ
ィングして細胞を剥し、ダブリングタイムが約２４時間
で増殖し、約３０代まで継代が進んでも増殖性に顕著な
変化は見られなく安定であった。これらをＴＲ−ＡＳＴ
３２、ＴＲ−ＡＳＴ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、ＴＲ
−ＡＳＴ９３２、ＴＲ−ＡＳＴ９４３株とそれぞれ命名
した。なお、前記のように、ＴＲ−ＡＳＴ９３２株は、
ブタペスト条約に基づいて日本通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＰＭ ＢＰ−６２
８３として寄託されている。The obtained cell suspension was cultured in a culture dish (manufactured by Corning; # 430167) in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 2 days. On the third day, 5% CO at 33 ° C
It moved to 2 incubators and culture was continued. For cell passage, 3% with 0.1% collagenase / dispase solution
After treatment at 7 ° C for 5 minutes, the cells were left at 4 ° C for 2 hours to detach the cells from the culture dish. The cloning of the cells was performed by the colony forming method. After detaching the cells from the cells passaged 1 to 3 times, 10 2 to 10 3 cells were seeded on a 90 mm culture dish to form colonies. After the medium was removed by suction, a cloning cup with grease on one side was placed on a culture dish such that the colony was at the center. 0.2 only in cup
5% Trypsin-EDTA solution was added and incubated at 33 ° C. for 1 minute. The medium was added to the cup, the cells were detached by pipetting, and the cells grew in a doubling time of about 24 hours. Even if the cells were passaged up to about 30 generations, there was no remarkable change in proliferation, and the cells were stable. These are TR-AST
32, TR-AST811, TR-AST912, TR
-AST932 and TR-AST943 strain, respectively. As described above, the TR-AST932 strain is
Based on the Budapest Treaty, accession number FEPM BP-62 to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan
83.

【００３８】３−２（樹立した株化アストロサイト細胞
のＧＦＡＰの発現とＬグルタミン酸輸送能） 実施例３−１で得られた細胞株ＴＲ−ＡＳＴ３２、ＴＲ
−ＡＳＴ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、ＴＲ−ＡＳＴ９
３２、ＴＲ−ＡＳＴ９４３のアストロサイト特有の蛋白
質であるglial fibrillary acidic Protein（ＧＦＡ
Ｐ）の発現を免疫染色によって検討した。細胞をカバー
グラス上に培養しサンプルとした。ＰＬＰ溶液（過塩素
酸ナトリウム・Ｌリジン塩酸塩・パラホルムアルデヒド
混合液）で氷冷下で１５分間固定後、ブロッキング溶液
を用いてブロッキングを室温で６０分間行った。１００
倍希釈した抗ＧＦＡＰ抗体を室温で６０分作用させた
後、リンスバッファーで３回洗浄し、５００倍希釈した
ペルオキシターゼ標識抗ラビットＩｇＧを６０分間作用
させた。サンプルをリンスバッファーで十分に洗浄後、
発色反応を行った。氷冷した発色液を加え、顕微鏡で観
察し、サンプルが発色した時点で冷ＰＢＳを加え反応を
停止させ、この時点でネガティブコントロールと発色の
強さを比較した。発色試薬として３０％過酸化水素含有
３，３−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ−ＰＢＳ溶
液を用いた。その結果、ＴＲ−ＡＳＴ３２、ＴＲ−ＡＳ
Ｔ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、ＴＲ−ＡＳＴ９３２、
ＴＲ−ＡＳＴ９４３株のいずれにおいても、ＧＦＡＰの
発現を示す要請の染色が確認された。よってＴＲ−ＡＳ
Ｔ３２、ＴＲ−ＡＳＴ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、Ｔ
Ｒ−ＡＳＴ９３２、ＴＲ−ＡＳＴ９４３株はアストロサ
イト細胞株であることが確認された。3-2 (GFAP expression and L-glutamic acid transport ability of established established astrocyte cells) Cell lines TR-AST32, TR obtained in Example 3-1
-AST811, TR-AST912, TR-AST9
32, glial fibrillary acidic protein (GFA) which is a protein specific to astrocytes of TR-AST943.
The expression of P) was examined by immunostaining. The cells were cultured on a cover glass to obtain a sample. After fixing with a PLP solution (a mixed solution of sodium perchlorate, L-lysine hydrochloride and paraformaldehyde) for 15 minutes under ice-cooling, blocking was performed at room temperature for 60 minutes using a blocking solution. 100
After allowing the double-fold diluted anti-GFAP antibody to act for 60 minutes at room temperature, the well was washed three times with a rinse buffer, and a 500-fold diluted peroxidase-labeled anti-rabbit IgG was allowed to act for 60 minutes. After thoroughly washing the sample with rinse buffer,
A color reaction was performed. An ice-cooled coloring solution was added, and the mixture was observed under a microscope. When the sample developed color, the reaction was stopped by adding cold PBS. At this time, the intensity of the coloring was compared with that of the negative control. A 3,3-diaminobenzidine-PBS solution containing 30% hydrogen peroxide was used as a coloring reagent. As a result, TR-AST32, TR-AS
T811, TR-AST912, TR-AST932,
In each of the TR-AST943 strains, the required staining indicating the expression of GFAP was confirmed. So TR-AS
T32, TR-AST811, TR-AST912, T
It was confirmed that R-AST932 and TR-AST943 were astrocyte cell lines.

【００３９】実施例３−１で得られた細胞株ＴＲ−ＡＳ
Ｔ３２、ＴＲ−ＡＳＴ８１１，ＴＲ−ＡＳＴ９１２、Ｔ
Ｒ−ＡＳＴ９３２、ＴＲ−ＡＳＴ９４３株のグルタミン
酸輸送能を、［3Ｈ］Ｌ−ｇｕｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉ
ｄ（［3Ｈ］Ｌ−Ｇｌｕ）の取り込みによって検討し
た。２４穴細胞培養用プレートにＴＲ−ＡＳＴ株を２×
１０5細胞／ウェル培地となるように播き、３３℃のＣ
Ｏ2インキュベーターで３０時間培養し、コンフルエン
トにした。［3Ｈ］Ｌ−Ｇｌｕの取り込みの測定は以下
のように行った。まず培地を吸引し、３７℃に温めた上
記uptake buffer IIで洗浄後、３７℃に温めた４６．３
ｋＢｑ／ウェルの［3Ｈ］Ｌ−Ｇｌｕと９．２５ｋＢｑ
／ｍｌの［14Ｃ］イヌリンを含む０．２ｍｌのuptake b
uffer IIを添加し、２、５、１０、３０分後にトレーサ
ー液を取り除いて４℃の１ｍｌのuptakebuffer IIで３
回洗浄した。これに０．７５ｍｌの１％トライトンＸ−
１００溶液を加え、一晩放置し、細胞を可溶化し、液体
シンチレーションカウンターを用いて放射活性を測定し
た。その結果、Ｌ−グルタミン酸トランスポーターの基
質である［3Ｈ］Ｌ−Ｇｌｕの取り込みは濃度依存的で
あり、そのミカエリス定数（Ｋｍ）は９６μＭ、最大取
り込み速度定数（Ｖｍａｘ）は１．８ｎｍｏｌ／ｍｉｎ
／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。この取り込みはＮａ
+−ｆｒｅｅ ｂｕｆｆｅｒで有意に阻害され、また他
の基質であるＬ−ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄやＤ−ａ
ｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄで、有意な阻害を示した。結
果を表３に示す。表３から、得られた細胞株がアストロ
サイト本来の機能を保持していることが確認された。The cell line TR-AS obtained in Example 3-1
T32, TR-AST811, TR-AST912, T
Glutamate transport ability of R-AST932 and TR-AST943 strains was determined by [ 3 H] L-gulutamic acid.
Examination was performed by incorporation of d ([ 3 H] L-Glu). 2x TR-AST strain on 24-well cell culture plate
Seed at 10 5 cells / well medium at 33 ° C
The cells were cultured in an O 2 incubator for 30 hours to make them confluent. [ 3 H] L-Glu uptake was measured as follows. First, the medium was aspirated, washed with the above uptake buffer II warmed to 37 ° C., and then warmed to 37 ° C. 46.3.
[ 3 H] L-Glu at 9.25 kBq / well
0.2 ml of uptake b containing / 14 ml of [ 14 C] inulin
After 2, 5, 10, and 30 minutes, the tracer solution was removed, and 3 ml of 1 ml of uptakebuffer II at 4 ° C was added.
Washed twice. Add 0.75 ml of 1% Triton X-
100 solutions were added and left overnight to solubilize the cells, and the radioactivity was measured using a liquid scintillation counter. As a result, the uptake of [ 3 H] L-Glu, a substrate of the L-glutamate transporter, was concentration-dependent, with a Michaelis constant (Km) of 96 μM and a maximum uptake rate constant (Vmax) of 1.8 nmol / min.
/ Mg protein. This uptake is Na
+ -Free buffer significantly inhibited, and other substrates such as L-aspartic acid and Da
Spartic acid showed significant inhibition. Table 3 shows the results. From Table 3, it was confirmed that the obtained cell line retained the original function of astrocyte.

【００４０】[0040]

【表３】 [Table 3]

【００４１】実施例４（脳毛細血管周皮細胞の調製） ４−１（脳毛細血管周皮細胞の分離） 大脳からの脳毛細血管周皮細胞の分離はＩｃｈｉｋａｗ
ａらの方法（IchikawaN et al., (1996) J. Pharmacol.
Toxicol. Method., 36, 45-52）、Ｃａｐｅｔａｎｄｅ
ｓらの方法（Capetandes A and Gerristen ME (1990) I
nvest. Ophthalmol. Vis. Sci., 31, 1738-1744）を改
良して行った。実施例１で得られたＳＶ４０の温度感受
性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入し
たトランスジェニックラット（１匹）から脳を摘出し
た。摘出した脳は、大脳以外の間脳、脳管などを取り除
いた後、クリーンベンチ内で氷冷した調製用緩衝液（１
２２ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＣ
ａＣｌ2、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．４ｍ
ＭのＫ2ＨＰＯ4、１０ｍＭのＧｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭ
のＨｅｐｅｓ；ｐＨ７．４）でよく洗浄した。洗浄した
大脳は、組織を１〜２ｍｍ2に細切した。細切した組織
を１０ｍｌ用Potter-Elvehjemホモゲナイザー（東京理
化器械社製）に移し、大脳の４倍量の氷冷した調製用緩
衝液を加え、１０回のアップダウンのストロークを行い
組織をホモゲナイズし、３２％のデキストランを含むＰ
ＢＳを等量加え、３回のアップダウンのストロークを行
いスラリーを得た。Example 4 (Preparation of Brain Capillary Pericyte Cells) 4-1 (Separation of Brain Capillary Pericyte Cells) Brain capillary pericyte cells were isolated from the cerebrum by Ichikawa.
a et al. (Ichikawa N et al., (1996) J. Pharmacol.
Toxicol. Method., 36, 45-52), Capetande
(Capetandes A and Gerristen ME (1990) I
nphthal. Ophthalmol. Vis. Sci., 31, 1738-1744). The brain was excised from one transgenic rat into which the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant tsA58 of SV40 obtained in Example 1 was introduced. After removing the mesencephalon, brain tube, etc. other than the cerebrum, the extracted brain was ice-cooled in a clean bench in a preparation buffer (1).
22 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.4 mM C
aCl 2, MgSO 4 · 7H 2 O of 1.2 mM, 0.4 m
M K 2 HPO 4 , 10 mM Glucose, 10 mM
Hepes; pH 7.4). In the washed cerebrum, the tissue was minced to 1-2 mm 2 . The minced tissue was transferred to a 10 ml Potter-Elvehjem homogenizer (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.), and a four-fold volume of ice-cooled preparation buffer was added to the cerebrum. , P containing 32% dextran
An equal amount of BS was added, and three up-down strokes were performed to obtain a slurry.

【００４２】このスリラーを遠心（４℃下、４５００×
ｇで１５分間）して得られるペレットを２．４ｍｌの酵
素溶液［０．０６６％のcollagenase/dispase（Boehrin
gerMannheim 社製)、０．０３３％のＢＳＡ（シグマ社
製）を含むＰＢＳ］に懸濁し、振盪を加えた水溶中で酵
素処理（３７℃、３時間）を行い、不要な細胞外マトリ
ックスを分離し、遠心（４℃下、６００×ｇで５分間）
してペレットを得た。得られたペレットを１０ｍｌの培
養液（１００Ｕ／ｍｌのbenzylpenicillin potassium、
１００μｇ／ｍｌのstreptomycin sulfate、２．５０μ
ｇ／ｍｌのamphotericin B、２０％のＦＣＳを添加した
ＤＭＥＭ）に分散して４枚の３５ｍｍφ培養シャーレ
（Falcon社製）に種播した。３３℃の炭酸ガス培養器
（５％のＣＯ 2−９５％のＡｉｒ、飽和湿度）内で培養
（初代培養）した。培地を１週間に２回交換し、継代は
トリプシン液（０．０５％のTrypsin、０．５３ｍＭの
ＥＤＴＡ；Gibco BRL社製）を用いておよそ１週間隔で
行った。２回の継代の後、１０4個の細胞を１００ｍｍ
φ培養シャーレ（Falcon社製）に種播した。培地を１週
間に２回交換し、７〜１０日後にコロニーを形成した増
殖速度の比較的速いコロニーをペニシリンカップを用い
て周囲の細胞から単離し、得られた１０3個の細胞を再
び１００ｍｍφ培養シャーレに種播して３３℃の炭酸ガ
ス培養器内で培養してコロニー形成を行った。ペニシリ
ンカップを用いて増殖速度の比較的速いコロニーを周囲
の細胞から単離して２種の細胞株（ＴＲ−ＰＣＴ１，Ｔ
Ｒ−ＰＣＴ２）を得た。なお、前記のように、ＴＲ−Ｐ
ＣＴ１株は、ブタペスト条約に基づいて日本通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＰＭ
ＢＰ−７０２４として寄託されている。The chiller was centrifuged (4500 × 4 ° C.).
g for 15 minutes) and 2.4 ml of the yeast
Solution [0.066% collagenase / dispase (Boehrin
gerMannheim), 0.033% BSA (Sigma)
Containing PBS), and shake in an aqueous solution with shaking.
Untreated extracellular matrix (3 hours at 37 ° C)
And centrifugation (at 600 xg for 5 minutes at 4 ° C)
Thus, a pellet was obtained. The obtained pellet is cultivated for 10 ml.
Nutrient solution (100 U / ml benzylpenicillin potassium,
100μg / ml streptomycin sulfate, 2.50μ
g / ml amphotericin B, 20% FCS was added.
DMM) and disperse them into four 35 mmφ culture dishes.
(Falcon). 33 ℃ carbon dioxide incubator
(5% CO Two-95% Air, saturation humidity)
(Primary culture). The medium was changed twice a week.
Trypsin solution (0.05% Trypsin, 0.53 mM
EDTA; Gibco BRL) at approximately one week intervals
went. After two passages, 10Four100 mm of cells
The seeds were seeded on a φ culture petri dish (Falcon). Medium for one week
Was exchanged twice in between, and colonies formed after 7 to 10 days.
Use penicillin cups for colonies that grow relatively fast
From the surrounding cells and the resulting 10ThreeCells
And seeded in a 100 mmφ culture dish at 33 ° C
Colonies were formed by culturing in a culture vessel. Penisiri
Around relatively fast growing colonies
And two cell lines (TR-PCT1 and T-PCT1)
R-PCT2) was obtained. In addition, as described above, TR-P
The CT1 strain was approved by the Ministry of International Trade and Industry under the Budapest Treaty.
Accession number FEPM to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
 Deposited as BP-7024.

【００４３】４−２（ラージＴ抗原タンパク質の確認） 実施例４−１で得られた２種の細胞株のラージＴ抗原蛋
白質を、実施例２−２に記載のウェスタンブロット法に
より検出した。すなわち、２種の細胞株をそれぞれＰＢ
Ｓで洗浄後、１ｍＬの可溶化溶液（１％のＳＤＳ、１０
ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のglyceri
n）で可溶化し、１００℃で１０分間加熱した後、遠心
（１００００ｒｐｍで１０分間）して不溶画分を除去し
た後、ブラッドフォード法（ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプ
ロテインアッセイ試薬Ａを使用）で総蛋白質量を定量し
た。それぞれ１０μｇの蛋白質をＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分離後、ニトロセルロース膜に転写
した。３％のスキムミルク溶液でブロッキングしたニト
ロセルロース膜に１次抗体として抗ＳＶ４０ラージＴ抗
原マウス抗体（ＤＰ０２−Ｃ；CALBIOCHEM社製）を、２
次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Amersham
社製）を反応させ、ラージＴ抗原特異的な反応をアマシ
ャム社製ＥＣＬウエスタンブロティング検出システム
（ＲＰＮ２１０６Ｍ１）を用いて検出した。結果を表６
に示す。この結果、得られた２種の細胞株全てにおいて
ラージＴ抗原蛋白質を確認した。4-2 (Confirmation of Large T Antigen Protein) The large T antigen proteins of the two cell lines obtained in Example 4-1 were detected by the Western blot method described in Example 2-2. That is, two types of cell lines
After washing with S, 1 mL of solubilization solution (1% SDS, 10%
mM Tris, 1 mM EDTA, 10% glyceri
n), heated at 100 ° C. for 10 minutes, and centrifuged (10,000 rpm for 10 minutes) to remove insoluble fractions. The amount of protein was quantified. After 10 μg of each protein was separated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, it was transferred to a nitrocellulose membrane. An anti-SV40 large T antigen mouse antibody (DP02-C; manufactured by CALBIOCHEM) was used as a primary antibody on a nitrocellulose membrane blocked with a 3% skim milk solution.
HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (Amersham
And the reaction specific to large T antigen was detected using an ECL western blotting detection system (RPN2106M1) manufactured by Amersham. Table 6 shows the results
Shown in As a result, large T antigen protein was confirmed in all of the obtained two cell lines.

【００４４】４−３（ＰＤＧＦ受容体βとＴｈｙ−１の
確認） 得られた細胞株を単層培養し、細胞膜に発現されたＰＤ
ＧＦ受容体βとＴｈｙ−１を免疫染色し、顕微鏡を用い
て確認した。実施例４−１で得られた細胞株ＴＲ−ＰＣ
Ｔ１を24 well dish（Falcon社製）のカバーグラス上で
培養した。培養液を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した
後、０．５ｍＬの固定液（３．６％のパラホルムアルデ
ヒド）を加え、４℃で２０分間放置後、ＰＢＳでよく洗
浄した。０．５ｍＬの３％ＢＳＡ−ＰＢＳを加え、室温
で２時間放置してブロッキングした後、１次抗体（抗Ｐ
ＤＧＦ受容体βヤギ抗体；Santacruze社製、ＦＩＴＣ標
識抗Ｔｈｙ−１マウス抗体；Pharmingen社製）を室温で
１時間反応させた。０．１％のＢＳＡ−ＰＢＳで５回洗
浄後、２次抗体（ＦＩＴＣ標識抗ヤギＩｇＧ；シグマ社
製（ＰＤＧＦ受容体β検出のみ使用））を室温で１時間
反応させ、０．１％のＢＳＡ−ＰＢＳで５回洗浄した。
最後に標識した細胞をグリセリン封入液（９０％のglyc
erol、１ｍｇ／ｍＬのp-phenylendiamine、０．０１Ｍ
のＮａ2ＨＰＯ4；ｐＨ８．５）で封入した。観察は顕微
鏡で行った。この結果、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１では細胞
膜上にＰＤＧＦ受容体β、及びＴｈｙ−１の発現を認め
た。またＰＤＧＦ受容体βの発現は、ウェスタンブロッ
ト、ＲＴ−ＰＣＲにおいても確認した。なお、ＴＲ−Ｐ
ＣＴ２についても同様の結果が得られた。4-3 (Confirmation of PDGF Receptor β and Thy-1) The obtained cell line was cultured in a monolayer, and PD expressed on the cell membrane was obtained.
GF receptor β and Thy-1 were immunostained and confirmed using a microscope. Cell line TR-PC obtained in Example 4-1
T1 was cultured on a cover glass of a 24-well dish (Falcon). After removing the culture solution and washing the cells with PBS, 0.5 mL of a fixative (3.6% paraformaldehyde) was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 20 minutes, and then thoroughly washed with PBS. After adding 0.5 mL of 3% BSA-PBS and leaving at room temperature for 2 hours to perform blocking, the primary antibody (anti-P
A DGF receptor β goat antibody; manufactured by Santacruze, FITC-labeled anti-Thy-1 mouse antibody; manufactured by Pharmingen) was allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing 5 times with 0.1% BSA-PBS, a secondary antibody (FITC-labeled anti-goat IgG; manufactured by Sigma (only PDGF receptor β detection is used)) was reacted at room temperature for 1 hour, and 0.1% Washed 5 times with BSA-PBS.
Finally, label the cells with glycerin-filled solution (90% glycerin).
erol, 1mg / mL p-phenylendiamine, 0.01M
Na 2 HPO 4 ; pH 8.5). Observation was performed with a microscope. As a result, in cell line TR-PCT1, expression of PDGF receptor β and Thy-1 was recognized on the cell membrane. The expression of PDGF receptor β was also confirmed by Western blot and RT-PCR. In addition, TR-P
Similar results were obtained for CT2.

【００４５】４−４（アンギオポエチン−１とオステオ
ポエチン、ＩＣＡＭ−１の確認） 上記実施例４−１で得られた細胞株を単層培養し、細胞
に発現されたアンギオポエチン−１とオステオポエチン
（Osteopontin）、ＩＣＡＭ−１をＲＴ−ＰＣＲにて検
出した。すなわち、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１を１００ｍｍ
φ培養シャーレ（Falcon社製）に培養した。培養液を除
去し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、セルスクレーパー
（IWAKI社製）にて細胞をかき集め、ＲＮＡ抽出試薬
（Ｔｒｉｚｏｌ；Gibco社製）にて全ＲＮＡを抽出し
た。逆転写酵素（Rev Tra Ace：TOYOBO社製）を用い
て、抽出した全ＲＮＡ１μｇからｃＤＮＡを合成し、Ｐ
ＣＲ法（ｅｘＴａｑ；宝酒造社製）にて発現を確認し
た。ＰＣＲ増幅産物の確認は、５％アクリルアミドゲル
の電気泳動にて行った。この結果、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ
１においてアンギオポエチン−１とオステオポエチン及
びＩＣＡＭ−１の発現を確認した。なお、ＴＲ−ＰＣＴ
２についても同様の結果が得られた。4-4 (Confirmation of Angiopoietin-1, Osteopoietin and ICAM-1) The cell line obtained in Example 4-1 was cultured in a monolayer, and angiopoietin-expressed in the cells was obtained. 1, osteopoietin and ICAM-1 were detected by RT-PCR. That is, the cell line TR-PCT1 was
The cells were cultured in a φ culture dish (Falcon). After removing the culture solution and washing the cells with PBS, the cells were scraped with a cell scraper (manufactured by IWAKI) and total RNA was extracted with an RNA extraction reagent (Trizol; manufactured by Gibco). Using reverse transcriptase (Rev Tra Ace: manufactured by TOYOBO), cDNA was synthesized from 1 μg of the extracted total RNA.
Expression was confirmed by the CR method (exTaq; manufactured by Takara Shuzo). Confirmation of the PCR amplification product was performed by electrophoresis on a 5% acrylamide gel. As a result, the cell line TR-PCT
In No. 1, expression of angiopoietin-1, osteopoietin and ICAM-1 was confirmed. In addition, TR-PCT
Similar results were obtained for No. 2.

【００４６】４−５（高密度培養によるマトリックス塊
カルシウム沈着の確認） 上記実施例４−１で得られた細胞株を単層培養し、マト
リックス塊に沈着したカルシウムをｖｏｎｋｏｓｓａ染
色にて確認した。すなわち、１０6個の細胞株ＴＲ−Ｐ
ＣＴ１を、ＤＭＥＭにて１００ｍｍφ培養シャーレ（Fa
lcon社製）及び１００ｍｍφＩ型コラーゲンコート培養
シャーレ（IWAKI社製）に培養した。１００ｍｍφＩ型
コラーゲンコート培養シャーレの培養液には１０ｍＭの
β−グリセロリン酸を添加した。３日後培養液を除去
し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、８ｍＬの固定液（０．
１％のグルタールアルデヒドを含むＰＢＳ）を加え、室
温で１５分放置後、蒸留水で２回洗浄した。８ｍＬの５
％の硝酸銀水溶液（Wako社製）を加え遮光し、室温で３
０分放置した後、５％の硝酸銀水溶液を除去し、蒸留水
で２回洗浄した。シャーレは室温で３０分露光させ、観
察は顕微鏡で行った。この結果、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１
ではマトリック塊にカルシウムの沈着を認め、コラーゲ
ンコート培養シャーレではカルシウム沈着の増加を確認
した。なお、ＴＲ−ＰＣＴ２についても同様の結果が得
られた。4-5 (Confirmation of Calcium Deposition in Matrix Lump by High-Density Culture) The cell line obtained in Example 4-1 was cultured in a monolayer, and calcium deposited in the matrix lump was confirmed by vonkossa staining. That is, 10 6 cell lines TR-P
CT1 was cultured in a 100 mmφ culture dish (Fa
lcon) and a 100 mmφ type I collagen-coated culture dish (IWAKI). 10 mM β-glycerophosphate was added to the culture solution of a 100 mmφ type I collagen-coated culture dish. After 3 days, the culture was removed, the cells were washed with PBS, and then 8 mL of fixative (0.
After adding 1% glutaraldehyde in PBS), the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and then washed twice with distilled water. 8mL of 5
% Silver nitrate aqueous solution (manufactured by Wako), and shielded from light.
After standing for 0 minutes, the aqueous 5% silver nitrate solution was removed and washed twice with distilled water. The petri dish was exposed at room temperature for 30 minutes, and observation was performed with a microscope. As a result, the cell line TR-PCT1
In the sample, calcium deposition was observed in the matrix matrix, and an increase in calcium deposition was confirmed in the collagen-coated culture dish. Similar results were obtained for TR-PCT2.

【００４７】実施例５（血液脳関門再構築モデルの作
製） ５−１（共培養） 上記実施例２〜４で調製した、脳毛細血管内皮細胞株
（ＴＲ−ＢＢＢ１３）とアストロサイト細胞株（ＴＲ−
ＡＳＴ９３２）との共培養（以下「Ａ＋内皮細胞」とい
う）、及び脳毛細血管内皮細胞株（ＴＲ−ＢＢＢ１３）
とアストロサイト細胞株（ＴＲ−ＡＳＴ９３２）と脳毛
細血管周皮細胞株（ＴＲ−ＰＣＴ１）との共培養（以下
「Ａ＋Ｐ＋内皮細胞」という）を行った。なお、脳毛細
血管内皮細胞株（ＴＲ−ＢＢＢ１３）の単独培養をコン
トロールとした。Example 5 (Preparation of Blood-Brain Barrier Reconstruction Model) 5-1 (Co-culture) A brain capillary endothelial cell line (TR-BBB13) and an astrocyte cell line (TR-BBB13) prepared in Examples 2 to 4 above TR-
AST932) (hereinafter referred to as “A + endothelial cells”) and a brain capillary endothelial cell line (TR-BBB13)
And an astrocyte cell line (TR-AST932) and a brain capillary pericyte cell line (TR-PCT1) were co-cultured (hereinafter referred to as “A + P + endothelial cells”). A single culture of the brain capillary endothelial cell line (TR-BBB13) was used as a control.

【００４８】５−２（使用細胞株の調製） 上記実施例２により得られたＴＲ−ＢＢＢ１３は、ＤＭ
ＥＭ１［ＤＭＥＭ（ニッスイ社製；＃０５９１５）に最
終濃度で１０％のウシ胎児血清（ＪＲＨ社製；＃１２０
０３−７８Ｐ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００
μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン
（ＧＩＢＣＯ社製；＃１０３７８−０１６）、１５μｇ
／ｍｌのｂＥＣＧＦ（ベーリンガー社製；＃１０３３４
８４）］に分散して、コラーゲンタイプＩをコートした
培養皿（IWAKI社製；＃４０２０−１０）に播種し、５
％ＣＯ2／９５％ＡＩＲの条件下において３３℃で予め
培養しておいた。また、上記実施例３により得られたＴ
Ｒ−ＡＳＴ９３２及び上記実施例４により得られたＴＲ
−ＰＣＴ１は、ＤＭＥＭ２［ＤＭＥＭ（ニッスイ社製；
＃０５９１５）に最終濃度で１０％のウシ胎児血清（Ｊ
ＲＨ社製；＃１２００３−７８Ｐ）、１００Ｕ／ｍｌの
ペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、
２ｍＭのグルタミン（ＧＩＢＣＯ社製；＃１０３７８−
０１６）］が入った培養皿（Corning社製；＃４３０１
６７）で、５％ＣＯ2／９５％ＡＩＲの条件下において
３３℃で予め培養しておいた。5-2 (Preparation of Cell Line to be Used) TR-BBB13 obtained in Example 2 was
EM1 [DMEM (Nissui; # 05915) at a final concentration of 10% fetal bovine serum (JRH; # 120)
03-78P), 100 U / ml penicillin, 100
μg / ml streptomycin, 2 mM glutamine (GIBCO; # 10378-016), 15 μg
/ Ml of bECGF (Boehringer; # 10334)
84)] and seeded on a culture dish (IWAKI; # 4020-10) coated with collagen type I.
The cells were preliminarily cultured at 33 ° C. under the conditions of% CO 2 /95% AIR. In addition, the T obtained in Example 3 above was
R-AST932 and TR obtained by Example 4 above
-PCT1 is DMEM2 [DMEM (manufactured by Nissui;
# 05915) at a final concentration of 10% fetal bovine serum (J
RH; # 12003-78P), 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin,
2 mM glutamine (GIBCO; # 10378-
016)] (Corning Co .; # 4301)
67), the cells were previously cultured at 33 ° C. under the conditions of 5% CO 2 /95% AIR.

【００４９】５−３（非接触状態での培養） 上記予め培養した細胞株を用いて、図１に示すように、
非接触状態での培養を行った。ＤＭＥＭ１が入ったミリ
セル（ミリポア社製；Millicell：３．０μｍｃｕｌｔ
ｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ、３０ｍｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ、
＃ＰＩＴＰ０３０５０）に上記ＴＲ−ＢＢＢ１３（１×
１０5細胞／ウェル）を入れ、上記ＤＭＥＭ２の入った
下側の６ウェルプレートに上記ＴＲ−ＡＳＴ９３２（３
×１０ 4細胞／ウェル）、又はＴＲ−ＡＳＴ９３２及び
上記ＴＲ−ＰＣＴ１（１×１０5細胞／ウェル）を入れ
て、５％ＣＯ2／９５％ＡＩＲの条件下において３３℃
で４日間非接触状態で共培養した。これらの非接触系培
養における内皮細胞の酵素活性の変化を、血液脳関門の
内皮細胞の酵素マーカーであるアルカリフォスファター
ゼ（ＡＬＰ）やγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
（γ−ＧＴＰ）の活性を測定することにより調べた。5-3 (Culture in Non-Contact State) Using the previously cultured cell line, as shown in FIG.
Culture was performed in a non-contact state. Millimeter containing DMEM1
Cell (Millipore; Millicell: 3.0 μmult)
ure insert, 30mm diameter,
# PITP03050) to the above TR-BBB13 (1 ×
10FiveCells / well) and containing the above DMEM2
The above TR-AST932 (3
× 10 FourCells / well), or TR-AST932 and
The above TR-PCT1 (1 × 10FiveCells / well)
And 5% COTwo33 ° C. under conditions of / 95% AIR
For 4 days in a non-contact state. These non-contact culture media
Changes in endothelial cell enzymatic activity during feeding
Alkaline phosphater is an endothelial cell enzyme marker
(ALP) and γ-glutamyl transpeptidase
It was examined by measuring the activity of (γ-GTP).

【００５０】実施例６（酵素活性の測定） ６−１（タンパク質濃度） ＢＣＡ酵素アッセイ試薬（BCA Protein Assay Reagen
t；ＰＩＲＣＥ社製：＃５３１−２０７２１）の試薬Ａ
と試薬Ｂを５０：１の割合で混合して１日間放置し、ワ
ーキングソリューション（working solution）とした。
それぞれ０．１ｍｌの上記培養した３種類のサンプル
（コントロール、Ａ＋内皮細胞、Ａ＋Ｐ＋内皮細胞）及
びＢＳＡ標準液に、各２ｍｌのワーキングソリューショ
ンを加え、３７℃で３０分間インキュベートし、室温ま
で冷却した後、５６２ｎｍの波長における吸光度を測定
した。ＢＳＡ標準液により作成した検量線によりの３種
類のサンプルのタンパク質濃度をそれぞれ算出した。Example 6 (Measurement of enzyme activity) 6-1 (Protein concentration) BCA enzyme assay reagent (BCA Protein Assay Reagen)
t; Reagent A of PIRCE: # 531-20721)
And reagent B were mixed at a ratio of 50: 1 and left for 1 day to obtain a working solution.
2 ml of each working solution was added to 0.1 ml of each of the above cultured three types of samples (control, A + endothelial cells, A + P + endothelial cells) and BSA standard solution, incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and cooled to room temperature. The absorbance at a wavelength of 562 nm was measured. The protein concentration of each of the three samples was calculated based on a calibration curve prepared using the BSA standard solution.

【００５１】６−２（ＡＬＰ活性の測定） 次に、ＡＬＰテストワコー（ＷＡＫＯ社製：＃２７４−
０４４０１）の基質緩衝液０．５ｍｌを３７℃で３分間
予めインキュベーションしておいたものに、５０μｌの
上記培養した３種類のサンプル（コントロール、Ａ＋内
皮細胞、Ａ＋Ｐ＋内皮細胞）を加えて３７℃で１５分間
インキュベーションし、０．０２ＮのＮａＯＨ溶液を５
ｍｌ加えた後よく振り混ぜた。これらの溶液を４０５ｎ
ｍの波長で吸光度を測定し、予め作成しておいた検量線
から吸光度に相当するＡＬＰ活性値（ｍＵ／ｍｌ）を算
出し、上記蛋白濃度より１ｍｇの蛋白質当たりのＡＬＰ
活性値を求めた。結果を図２に示す。6-2 (Measurement of ALP Activity) Next, ALP Test Wako (manufactured by WAKO: # 274-)
04401) was pre-incubated for 3 minutes at 37 ° C. with 50 ml of the above three types of cultured samples (control, A + endothelial cells, A + P + endothelial cells). Incubate for 15 minutes and add 0.02N NaOH solution for 5 minutes.
After adding ml, the mixture was shaken well. 405 n of these solutions
The absorbance is measured at a wavelength of m, the ALP activity value (mU / ml) corresponding to the absorbance is calculated from a previously prepared calibration curve, and the ALP per 1 mg protein is calculated from the above protein concentration.
Activity values were determined. The results are shown in FIG.

【００５２】６−３（γ−ＧＴＰ活性の測定） また、γ−ＧＴＰテストワコー（ＷＡＫＯ社製：＃２７
３−３２７０１）の基質緩衝液３ｍｌを３７℃で５分間
予めインキュベーションしておいたものに、１５μｌの
上記培養した３種類のサンプル（コントロール、Ａ＋内
皮細胞、Ａ＋Ｐ＋内皮細胞）を加えて３７℃で正確に３
０分間インキュベーションし、４〜５回振って混合さ
せ、発色液Ｂを１００μｌ加えた後よく振り混ぜ、室温
にて１０分間放置した。これらの溶液を５５０ｎｍの波
長で吸光度を測定し、予め作成しておいた検量線から吸
光度に相当するγ−ＧＴＰ活性値（ｍＵ／ｍｌ）を算出
し、上記蛋白濃度より１ｍｇの蛋白質当たりのγ−ＧＴ
Ｐ活性値を求めた。結果を図３に示す。6-3 (Measurement of γ-GTP activity) Also, γ-GTP test Wako (manufactured by WAKO: # 27
To 3 ml of the substrate buffer of 3-32701) previously incubated at 37 ° C. for 5 minutes, 15 μl of the above three types of cultured samples (control, A + endothelial cells, A + P + endothelial cells) were added, and the mixture was added at 37 ° C. Exactly 3
The mixture was incubated for 0 minutes, mixed by shaking 4 to 5 times, added with 100 μl of Coloring Solution B, shaken well, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. The absorbance of these solutions was measured at a wavelength of 550 nm, the γ-GTP activity value (mU / ml) corresponding to the absorbance was calculated from a calibration curve prepared in advance, and γ per 1 mg of protein was calculated from the above protein concentration. -GT
The P activity value was determined. The results are shown in FIG.

【００５３】６−４（測定結果の比較） 上記の結果から、ＡＬＰ活性値はそれぞれ、脳毛細血管
内皮細胞株（ＴＲ−ＢＢＢ１３）のみを培養したコント
ロールにおいては３．９３±０．３９ｍＵ／ｍｇ、アス
トロサイト細胞株（ＴＲ−ＡＳＴ９３２）と共培養した
脳毛細血管内皮細胞株（Ａ＋内皮細胞）においては２
３．５±４．６９ｍＵ／ｍｇ、脳毛細血管周皮細胞株
（ＴＲ−ＰＣＴ１）とアストロサイト細胞株と共培養し
た脳毛細血管内皮細胞株（Ａ＋Ｐ＋内皮細胞）において
は２５．０±１．６ｍＵ／ｍｇであった。また、γ−Ｇ
ＴＰ活性値はそれぞれ、コントロールにおいては４．１
３±０．６８ｍＵ／ｍｇ、Ａ＋内皮細胞においては１
８．５±１．６ｍＵ／ｍｇ、Ａ＋Ｐ＋内皮細胞において
は１０．３±０．５ｍＵ／ｍｇであった。これらのこと
から、ＴＲ−ＢＢＢ１３単独培養に比較して、ＴＲ−Ａ
ＳＴ９３２と共培養することでＡＬＰ活性が６倍に増加
し、γ−ＧＴＰ活性が４．５倍に増加することがわかっ
た。また、ＴＲ−ＰＣＴ１とＴＲ−ＡＳＴ９３２と共培
養した脳毛細血管内皮細胞株のＡＬＰ活性が６倍に増加
し、γ−ＧＴＰ活性が２．５倍に増加することがわかっ
た。6-4 (Comparison of Measurement Results) From the above results, the ALP activity value was 3.93 ± 0.39 mU / mg in the control in which only the brain capillary endothelial cell line (TR-BBB13) was cultured. And 2 in the brain capillary endothelial cell line (A + endothelial cell) co-cultured with the astrocyte cell line (TR-AST932).
3.5 ± 4.69 mU / mg, 25.0 ± 1 in brain capillary endothelial cell line (A + P + endothelial cells) co-cultured with brain capillary pericyte line (TR-PCT1) and astrocyte cell line. It was 6 mU / mg. Also, γ-G
Each TP activity value was 4.1 in the control.
3 ± 0.68 mU / mg, 1 in A + endothelial cells
8.5 ± 1.6 mU / mg, and 10.3 ± 0.5 mU / mg for A + P + endothelial cells. From these facts, it was found that TR-A
It was found that co-culture with ST932 increased ALP activity 6-fold and gamma-GTP activity 4.5-fold. It was also found that the ALP activity of the brain capillary endothelial cell line co-cultured with TR-PCT1 and TR-AST932 increased 6-fold, and the γ-GTP activity increased 2.5-fold.

【００５４】実施例７（ＧＬＵＴ−１の検出） ７−１（ＲＴ−ＰＣＲ） 上記脳毛細血管内皮細胞株のみを培養したもの（コント
ロール）や、アストロサイト細胞株と共培養した脳毛細
血管内皮細胞株（Ａ＋内皮細胞）におけるＧ３ＰＤＨ
（ハウスキーピング遺伝子）やＧＬＵＴ−１（グルコー
ストランスポーター１）の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
により検出した。上記脳毛細血管内皮細胞株をミリセル
（ミリポア社製；Millicell：３．０μｍ ｃｕｌｔｕ
ｒｅ ｉｎｓｅｒｔ、３０ｍｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ、＃
ＰＩＴＰ０３０５０）で培養した。培養液を除去し、細
胞をＰＢＳで洗浄した後、セルスクレーパー（Iwaki社
製）にて細胞をかき集め、ＲＮＡ抽出試薬（Ｔｒｉｚｏ
ｌ；Gibco社製）にて全ＲＮＡを抽出した。逆転写酵素
（Rev Tra Ace：東洋紡社製）を用いて、抽出した全Ｒ
ＮＡ１μｇからｃＤＮＡを合成した。Example 7 (Detection of GLUT-1) 7-1 (RT-PCR) Culture of the above-mentioned brain capillary endothelial cell line alone (control) and brain capillary endothelium co-cultured with an astrocyte cell line G3PDH in cell line (A + endothelial cells)
(Housekeeping gene) and GLUT-1 (glucose transporter 1) expression by semi-quantitative RT-PCR
Detected by Millicell (Millipore; Millicell: 3.0 μm culture)
re insert, 30mm diameter, #
(PITP03050). After removing the culture solution and washing the cells with PBS, the cells were scraped with a cell scraper (manufactured by Iwaki), and an RNA extraction reagent (Trizo) was used.
l; manufactured by Gibco). Total R extracted using reverse transcriptase (Rev Tra Ace: Toyobo)
CDNA was synthesized from 1 μg of NA.

【００５５】７−２（プライマー） 得られたｃＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）２．０μｌに対し
て、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応における各遺伝子
のプライマーの組合せとしては、Ｇ３ＰＤＨ［Ｇ３ＰＤ
Ｈ−Ｆ：５′−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣ
ＡＣ−３′（配列番号３）、Ｇ３ＰＤＨ−Ｒ：５′−Ｔ
ＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３′（配列
番号４）］、ＧＬＵＴ−１［ＧＬＵＴ−１−Ｆ：５′−
ＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＧＧＣＣＴ−３′（配
列番号５）、ＧＬＵＴ−１−Ｒ：５′−ＡＧＣＧＧＡＡ
ＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＴＧ−３′（配列番号６）］を
それぞれ用いた。7-2 (Primer) A PCR reaction was performed on 2.0 μl of the obtained cDNA (50 ng / μl). As a combination of primers of each gene in the PCR reaction, G3PDH [G3PD
HF: 5'-ACCACAGTCCATGCCATCATC
AC-3 '(SEQ ID NO: 3), G3PDH-R: 5'-T
CCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '(SEQ ID NO: 4)], GLUT-1 [GLUT-1-F: 5'-
GATGATGAACCTGTTGGCCT-3 '(SEQ ID NO: 5), GLUT-1-R: 5'-AGCGGAA
CAGCTCCAAGATAG-3 '(SEQ ID NO: 6)].

【００５６】７−３（ＰＣＲ） 上記ｃＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）２μｌに、ＤＤＷを３
３．８μｌ、１０×Ｅｘ ｂｕｆｆｅｒを５．０μｌ、
２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ ｍｉｘを４．０μｌ、５Ｕ／
μｌのｒＥｘＴａｑを０．２μｌ、２０μＭの上記各プ
ライマーを２．５μｌ加え、全量５０μｌでＰＣＲ反応
を行った。サーマルサイクルのプログラムは、最初のみ
9４℃で３分間変性させ、その後９４℃で１分間熱変性
させ、５７℃で１分間伸張させ、７２℃で１分間アニー
リングするというサイクルを２５回繰り返し、最後に７
２℃で１０分間アニーリングを行った。その後、ＰＣＲ
増幅産物をアガロースゲル（２％）電気泳動法により分
離した後、エチジウムブロミド染色を行い、ＣＣＤイメ
ージアナライザーを用いて、それぞれのバンドの強度を
測定した。結果を図４に示す。7-3 (PCR) DDW was added to 2 μl of the above cDNA (50 ng / μl).
3.8 μl, 10 × Ex buffer 5.0 μl,
4.0 μl of 2.5 mM dNTPs mix, 5 U /
0.2 μl of μl of rExTaq and 2.5 μl of each of the above primers at 20 μM were added, and a PCR reaction was carried out in a total volume of 50 μl. The thermal cycle program is only for the first
A cycle of denaturation at 94 ° C. for 3 minutes, followed by heat denaturation at 94 ° C. for 1 minute, extension at 57 ° C. for 1 minute, and annealing at 72 ° C. for 1 minute was repeated 25 times, and finally 7 times.
Annealing was performed at 2 ° C. for 10 minutes. Then, PCR
After the amplification products were separated by agarose gel (2%) electrophoresis, ethidium bromide staining was performed, and the intensity of each band was measured using a CCD image analyzer. FIG. 4 shows the results.

【００５７】７−４（測定結果の比較） 上記結果から、アストロサイト細胞株と共培養した脳毛
細血管内皮細胞株（Ａ＋内皮細胞）の血液脳関門に発現
するヘキソース輸送担体のｍＲＮＡであるＧｌｕｔ１の
発現量は、Ｇ３ＰＤＨとの比較からして、脳毛細血管内
皮細胞株を単独培養したもの（コントロール）に比べて
１００倍増加していることがわかった。7-4 (Comparison of Measurement Results) Based on the above results, Glut1, an mRNA of a hexose transporter expressed at the blood-brain barrier of a brain capillary endothelial cell line (A + endothelial cell) co-cultured with an astrocyte cell line. Expression level was found to be 100-fold higher than that of G3PDH as compared to that obtained by culturing the brain capillary endothelial cell line alone (control).

【００５８】[0058]

【発明の効果】本発明によると、よりインビボに近いイ
ンビトロの血液脳関門実験系の再構築が可能となり、従
来の共培養と比べて条件的不死化細胞株を使用した共培
養系は飛躍的に細胞−細胞間相互作用が促進され、血液
脳関門が本来の機能に近いところまで、再現できること
がわかった。したがって、本発明の血液脳関門再構築モ
デル等を用いることにより、血液脳関門に関する基礎的
研究成果が得られる上に、薬物の血液脳透過機構に基づ
いた中枢作用型薬物（抗痴呆薬、脳腫瘍治療薬、ウイル
ス治療薬、精神神経作用薬）や、中枢での副作用が問題
となる薬物のスクリーニングを効率的に行うことができ
るだけでなく、脳毛細血管内皮細胞に発現する種々の受
容体を標的とした薬物（脳微小循環改善薬、脳浮腫治療
薬）の効果や脳毛細血管内皮細胞の障害（脳血管障害性
痴呆症やアルツハイマー型痴呆症）の評価が可能とな
る。According to the present invention, it is possible to reconstruct an in vitro blood-brain barrier experiment system that is closer to in vivo, and a co-culture system using a conditionally immortalized cell line is dramatically different from conventional co-culture. It was found that the cell-cell interaction was promoted and that the blood-brain barrier could be reproduced to a point close to its original function. Therefore, by using the blood-brain barrier reconstruction model and the like of the present invention, not only basic research results on the blood-brain barrier can be obtained, but also centrally acting drugs (anti-dementia drugs, brain tumors) based on the blood-brain permeation mechanism of drugs. Therapeutic drugs, virus therapeutics, and neuropsychiatric drugs) and drugs with central side effects that are problematic, as well as targeting various receptors expressed on brain capillary endothelial cells. It is possible to evaluate the effect of drugs (improved cerebral microcirculation, therapeutic agent for cerebral edema) and disorders of brain capillary endothelial cells (cerebrovascular dementia and Alzheimer's dementia).

【００５９】[0059]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Reconstitution of the Blood-Brain Barrier in Vascular Endothelial Cells <130> A081P09 <140> <141> <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer(tsA58-1A) <400> 1 tcctaatgtg cagtcaggtg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer(tsA58-1B) <400> 2 atgacgagct ttggcacttg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer(G3PDH-F) <400> 3 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer(G3PDH-R) <400> 4 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer(GLUT-1-F) <400> 5 gatgatgaac ctgttggcct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer(GLUT-1-R) <400> 6 agcggaacag ctccaagatg 20[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Reconstitution of the Blood-Brain Barrier in Vascular Endothelial Cells <130> A081P09 <140> <141> <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 < 210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer (tsA58-1A) <400> 1 tcctaatgtg cagtcaggtg 20 <210> 2 <211> 20 <212 > DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer (tsA58-1B) <400> 2 atgacgagct ttggcacttg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 > <223> Description of Artificial Sequence: Primer (G3PDH-F) <400> 3 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer (G3PDH-R) <400> 4 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer (GLUT-1-F) < 400> 5 gatgatgaac ctgttggcct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Art ificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer (GLUT-1-R) <400> 6 agcggaacag ctccaagatg 20

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】本発明における非接触系共培養法の概略を示す
図である。FIG. 1 is a diagram schematically showing a non-contact co-culture method in the present invention.

【図２】本発明の共培養による血液脳関門再構築モデル
のＡＬＰ活性の結果を示す図である。FIG. 2 shows the results of ALP activity of a blood-brain barrier remodeling model by co-culture according to the present invention.

【図３】本発明の共培養による血液脳関門再構築モデル
のγ−ＧＴＰ活性の結果を示す図である。FIG. 3 is a graph showing the results of γ-GTP activity in a blood-brain barrier reconstruction model by co-culture according to the present invention.

【図４】本発明の共培養による血液脳関門再構築モデル
におけるＧＬＵＴ−１発現結果を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing the results of GLUT-1 expression in a blood-brain barrier reconstruction model by co-culture according to the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/54 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/50 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/68 (Ｃ１２Ｑ 1/42 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/48 Ａ (Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/54 (Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｑ 1/54 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 細谷 健一 宮城県仙台市太白区三神峯１−３ ３− 501 (72)発明者 服部 研之 東京都文京区白山４−22−２前島方 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB01 CB17 CB26 DA20 DA77 DA80 FB07 4B024 AA11 BA31 CA04 DA02 EA04 FA10 GA12 HA11 4B063 QQ02 QQ08 QQ26 QQ33 QQ68 QS33 4B065 AA91X AA91Y AA95Y AB01 AC02 BA04 BC11 CA46 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI theme coat ゛ (Reference) C12Q 1/54 G01N 33/50 Z G01N 33/15 33/68 33/50 C12R 1:91) 33/68 (C12Q 1/42 // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) C12R 1:91) (C12Q 1/48 A (C12Q 1/42 C12R 1:91) C12R 1:91) (C12Q 1/54 ( C12Q 1/48 C12R 1:91) C12R 1:91) C12N 15/00 ZNAA (C12Q 1/54 5/00 A C12R 1:91) C12R 1:91) (72) Inventor Kenichi Hosoya Taichiro, Sendai City, Miyagi Prefecture 1-3-501 Sankamine, Ward 3-72 (72) Inventor: Kenyuki Hattori F-term (reference) 2G045 AA40 BB20 CB01 CB17 CB26 DA20 DA77 DA80 FB07 4B024 AA11 BA31 CA04 DA02 EA04 FA10 GA12 HA11 4B063 QQ02 QQ08 QQ26 QQ33 QQ68 QS33 4B065 AA91X AA91Y AA95Y AB01 AC02 BA04 BC11 CA46

Claims (40)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞
株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株とを共
培養することを特徴とする血液脳関門再構築モデルの作
製方法。1. A method for preparing a blood-brain barrier remodeling model, comprising co-culturing a rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line and a rat-derived immortalized astrocyte cell line. 【請求項２】 ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞
株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株と、ラ
ット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株とを共培養する
ことを特徴とする血液脳関門再構築モデルの作製方法。2. A method of co-culturing a rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line, a rat-derived immortalized astrocyte cell line, and a rat-derived immortalized brain capillary pericyte cell line. To create a blood-brain barrier reconstruction model. 【請求項３】 ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞
株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ
抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来の
不死化脳毛細血管内皮細胞株であることを特徴とする請
求項１又は２記載の血液脳関門再構築モデルの作製方
法。3. The rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line is a large T of the temperature-sensitive mutant SV40tsA58.
The method for producing a blood-brain barrier remodeling model according to claim 1 or 2, which is an immortalized brain capillary endothelial cell line derived from a transgenic rat into which an antigen gene has been introduced. 【請求項４】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラッ
ト由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株が、ＴＲ−ＢＢＢ
１３（ＦＥＰＭ ＢＰ−６８７３）であることを特徴と
する請求項３記載の血液脳関門再構築モデルの作製方
法。4. An immortalized brain capillary endothelial cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant SV40tsA58 has been introduced is TR-BBB.
13 (FEPM BP-6873). The method for producing a blood-brain barrier reconstruction model according to claim 3, wherein 【請求項５】 ラット由来の不死化アストロサイト細胞
株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ
抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来の
不死化アストロサイト細胞株であることを特徴とする請
求項１又は２記載の血液脳関門再構築モデルの作製方
法。5. The rat-derived immortalized astrocyte cell line is a large T of the temperature-sensitive mutant SV40tsA58.
The method for producing a blood-brain barrier remodeling model according to claim 1 or 2, which is an immortalized astrocyte cell line derived from a transgenic rat into which an antigen gene has been introduced. 【請求項６】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラッ
ト由来の不死化アストロサイト細胞株が、ＴＲ−ＡＳＴ
９３２（ＦＥＰＭ ＢＰ−６２８３）であることを特徴
とする請求項５記載の血液脳関門再構築モデルの作製方
法。6. An immortalized astrocyte cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant SV40tsA58 has been introduced is TR-AST.
The method for producing a blood-brain barrier reconstruction model according to claim 5, wherein the model is 932 (FEPM BP-6283). 【請求項７】 ラット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞
株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージＴ
抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来の
不死化脳毛細血管周皮細胞株であることを特徴とする請
求項２記載の血液脳関門再構築モデルの作製方法。7. The rat-derived immortalized brain capillary pericyte cell line is a large T of the temperature-sensitive mutant SV40tsA58.
The method for producing a blood-brain barrier reconstruction model according to claim 2, which is an immortalized brain capillary pericyte cell line derived from a transgenic rat into which an antigen gene has been introduced. 【請求項８】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラッ
ト由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株が、ＴＲ−ＰＣＴ
１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７０２４）であることを特徴とす
る請求項７記載の血液脳関門再構築モデルの作製方法。8. An immortalized brain capillary pericyte cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant SV40tsA58 has been introduced is TR-PCT.
1 (FERM BP-7024). The method for producing a blood-brain barrier reconstruction model according to claim 7, 【請求項９】 共培養が、不死化脳毛細血管内皮細胞株
と不死化アストロサイト細胞株とを非接触状態で、又は
不死化脳毛細血管内皮細胞株と不死化アストロサイト細
胞株及び不死化脳毛細血管周皮細胞株とを非接触状態で
培養する、非接触系共培養であることを特徴とする請求
項１〜８のいずれか記載の血液脳関門再構築モデルの作
製方法。9. The co-culture, wherein the immortalized brain capillary endothelial cell line and the immortalized astrocyte cell line are not in contact with each other, or the immortalized brain capillary endothelial cell line and the immortalized astrocyte cell line and immortalized. The method for producing a blood-brain barrier reconstruction model according to any one of claims 1 to 8, wherein the method is a non-contact co-culture in which a brain capillary pericyte cell line is cultured in a non-contact state. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか記載の血液脳
関門再構築モデルを用いるスクリーニング方法であっ
て、共培養中又は共培養の前後に、被検物質を不死化脳
毛細血管内皮細胞株と接触させ、血液脳関門のマーカー
遺伝子の発現の程度を測定・評価することを特徴とする
血液脳関門形成促進又は抑制物質のスクリーニング方
法。10. A screening method using the blood-brain barrier reconstruction model according to any one of claims 1 to 9, wherein the test substance is immortalized during or before and after co-culture. A method for screening for a substance that promotes or suppresses the formation of the blood-brain barrier, comprising contacting the strain with a strain and measuring and evaluating the degree of expression of a marker gene for the blood-brain barrier. 【請求項１１】 請求項１〜９のいずれか記載の血液脳
関門再構築モデルを用いるスクリーニング方法であっ
て、共培養中又は共培養の前後に、被検物質と血液脳関
門透過物質又は血液脳関門非透過物質とを不死化脳毛細
血管内皮細胞株と接触させ、これら血液脳関門透過物質
又は血液脳関門非透過物質の不死化脳毛細血管内皮細胞
内への透過の程度を測定・評価することを特徴とする血
液脳関門透過促進又は抑制物質のスクリーニング方法。11. A screening method using the blood-brain barrier reconstruction model according to any one of claims 1 to 9, wherein a test substance and a blood-brain barrier permeant or blood are collected during or before or after co-culture. A brain barrier impermeable substance is brought into contact with an immortalized brain capillary endothelial cell line, and the degree of permeation of the blood brain barrier impervious substance or the blood brain barrier impervious substance into the immortalized brain capillary endothelial cells is measured and evaluated. A method of screening for a substance promoting or inhibiting blood-brain barrier permeation. 【請求項１２】 請求項１〜９のいずれか記載の血液脳
関門再構築モデルを用いるスクリーニング方法であっ
て、共培養中又は共培養の前後に、被検物質を不死化脳
毛細血管内皮細胞株と接触させ、不死化脳毛細血管内皮
細胞内への被検物質の透過の程度を測定・評価すること
を特徴とする血液脳関門透過又は非透過物質のスクリー
ニング方法。12. A screening method using the blood-brain barrier reconstruction model according to any one of claims 1 to 9, wherein the test substance is immortalized during or before and after co-culture. A method for screening for a permeated or non-permeated substance at the blood-brain barrier, comprising measuring and evaluating the degree of penetration of a test substance into immortalized brain capillary endothelial cells by contact with a strain. 【請求項１３】 請求項１０記載の血液脳関門形成促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門形成促進物質。13. A substance promoting blood-brain barrier formation obtained by the method for screening a substance promoting or suppressing blood-brain barrier formation according to claim 10. 【請求項１４】 請求項１０記載の血液脳関門形成促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門形成抑制物質。14. A blood-brain barrier formation inhibitory substance obtained by the method for screening for a blood-brain barrier formation promoting or suppressing substance according to claim 10. 【請求項１５】 請求項１１記載の血液脳関門透過促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門透過促進物質。15. A blood-brain barrier permeation enhancer obtained by the method for screening for a substance promoting or inhibiting blood-brain barrier according to claim 11. 【請求項１６】 請求項１１記載の血液脳関門透過促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門透過抑制物質。16. A blood-brain barrier permeation inhibitor obtained by the method for screening for a blood-brain barrier permeation promoting or suppressing substance according to claim 11. Description: 【請求項１７】 請求項１２記載の血液脳関門透過又は
非透過物質のスクリーニング方法により得られる血液脳
関門透過物質。17. A blood-brain barrier permeable substance obtained by the method for screening a blood-brain barrier permeable or non-permeable substance according to claim 12. 【請求項１８】 請求項１２記載の血液脳関門透過又は
非透過物質のスクリーニング方法により得られる血液脳
関門非透過物質。18. A blood-brain barrier non-permeable substance obtained by the method for screening a blood-brain barrier permeated or non-permeable substance according to claim 12. 【請求項１９】 ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細
胞株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株とを
共培養することにより得られることを特徴とする血液脳
関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血
管内皮細胞株。19. The expression of a marker gene for the blood-brain barrier, which is obtained by co-culturing a rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line with a rat-derived immortalized astrocyte cell line. Enhanced immortalized brain capillary endothelial cell line. 【請求項２０】 ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細
胞株と、ラット由来の不死化アストロサイト細胞株と、
ラット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株とを共培養す
ることにより得られることを特徴とする血液脳関門のマ
ーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細
胞株。20. A rat-derived immortalized brain capillary endothelial cell line, a rat-derived immortalized astrocyte cell line,
An immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of a blood-brain barrier marker gene, which is obtained by co-culturing a rat-derived immortalized brain capillary pericyte cell line. 【請求項２１】 ラット由来の不死化脳毛細血管内皮細
胞株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージ
Ｔ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来
の不死化脳毛細血管内皮細胞株であることを特徴とする
請求項１９又は２０記載の血液脳関門のマーカー遺伝子
の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。21. The immortalized brain capillary endothelial cell line derived from a rat is an immortalized brain capillary endothelial cell line derived from a transgenic rat into which a large T antigen gene of a temperature-sensitive mutant SV40tsA58 has been introduced. An immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of the marker gene for the blood brain barrier according to claim 19 or 20. 【請求項２２】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８
のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラ
ット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株が、ＴＲ−ＢＢ
Ｂ１３（ＦＥＰＭ ＢＰ−６８７３）であることを特徴
とする請求項２１記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の
発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。22. Temperature-sensitive mutant SV40tsA58
Immortalized cerebral capillary endothelial cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene was introduced was TR-BB
22. The immortalized brain capillary endothelial cell line according to claim 21, wherein the expression is B13 (FEPM BP-6873). 【請求項２３】 ラット由来の不死化アストロサイト細
胞株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージ
Ｔ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来
の不死化アストロサイト細胞株であることを特徴とする
請求項１９又は２０記載の血液脳関門のマーカー遺伝子
の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。23. The immortalized astrocyte cell line derived from a rat is a transgenic rat-derived immortalized astrocyte cell line into which a large T antigen gene of a temperature-sensitive mutant SV40tsA58 has been introduced. 21. An immortalized brain capillary endothelial cell line in which expression of the marker gene for the blood brain barrier according to 20 is enhanced. 【請求項２４】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８
のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラ
ット由来の不死化アストロサイト細胞株が、ＴＲ−ＡＳ
Ｔ９３２（ＦＥＰＭ ＢＰ−６２８３）であることを特
徴とする請求項２３記載の血液脳関門のマーカー遺伝子
の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。24. The temperature-sensitive mutant SV40tsA58
Immortalized astrocyte cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene was introduced was TR-AS
The immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of a marker gene for the blood brain barrier according to claim 23, which is T932 (FEPM BP-6283). 【請求項２５】 ラット由来の不死化脳毛細血管周皮細
胞株が、温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８のラージ
Ｔ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット由来
の不死化脳毛細血管周皮細胞株であることを特徴とする
請求項２０記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が
増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。25. The rat-derived immortalized brain capillary pericyte cell line is a transgenic rat-derived immortalized brain capillary pericyte cell line into which the large T antigen gene of the temperature-sensitive mutant SV40tsA58 has been introduced. 21. An immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of a blood brain barrier marker gene according to claim 20. 【請求項２６】 温度感受性変異株ＳＶ４０ｔｓＡ５８
のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラ
ット由来の不死化脳毛細血管周皮細胞株が、ＴＲ−ＰＣ
Ｔ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７０２４）であることを特徴と
する請求項２５記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発
現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。26. Temperature-sensitive mutant SV40tsA58
Immortalized cerebral capillary pericyte cell line derived from a transgenic rat into which the large T antigen gene was introduced was TR-PC
The immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of a marker gene for the blood brain barrier according to claim 25, which is T1 (FERM BP-7024). 【請求項２７】 共培養が、不死化脳毛細血管内皮細胞
株と不死化アストロサイト細胞株とを非接触状態で、又
は不死化脳毛細血管内皮細胞株と不死化アストロサイト
細胞株及び不死化脳毛細血管周皮細胞株とを非接触状態
で培養する、非接触系共培養であることを特徴とする請
求項１９〜２６のいずれか記載の血液脳関門のマーカー
遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。27. The co-culture, wherein the immortalized brain capillary endothelial cell line and the immortalized astrocyte cell line are not in contact with each other, or the immortalized brain capillary endothelial cell line and the immortalized astrocyte cell line and immortalized. 27. Immortality with enhanced expression of a marker gene of the blood-brain barrier according to any one of claims 19 to 26, which is a non-contact co-culture in which the brain capillary pericyte cell line is cultured in a non-contact state. Cerebral capillary endothelial cell line. 【請求項２８】 血液脳関門のマーカー遺伝子が、アル
カリフォスファターゼ遺伝子、γ−グルタミールトラン
スペプチダーゼ遺伝子、Ｇｌｕｔ１遺伝子から選ばれる
１種又は２種以上の遺伝子であることを特徴とする請求
項１９〜２７のいずれか記載の血液脳関門のマーカー遺
伝子の発現が増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。28. The blood brain barrier marker gene is one or more genes selected from alkaline phosphatase gene, γ-glutamyl transpeptidase gene, and Glut1 gene. An immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of the blood brain barrier marker gene according to any one of the above. 【請求項２９】 アルカリフォスファターゼ遺伝子の発
現が、共培養することなく単独培養したときと比べて６
倍以上増強したことを特徴とする請求項２８記載の血液
脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化脳毛細
血管内皮細胞株。29. The expression of the alkaline phosphatase gene is 6 times lower than that in the case of single culture without co-culture.
29. The immortalized brain capillary endothelial cell line according to claim 28, wherein the expression of a marker gene for the blood brain barrier is enhanced by a factor of at least two. 【請求項３０】 γ−グルタミールトランスペプチダー
ゼ遺伝子の発現が、共培養することなく単独培養したと
きと比べて２倍以上増強したことを特徴とする請求項２
８又は２９記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が
増強した不死化脳毛細血管内皮細胞株。30. The method according to claim 2, wherein the expression of the γ-glutamyl transpeptidase gene is enhanced by a factor of two or more as compared with the case of single culture without co-culture.
30. An immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of the blood-brain barrier marker gene according to 8 or 29. 【請求項３１】 Ｇｌｕｔ１遺伝子の発現が、共培養す
ることなく単独培養したときと比べて１００倍以上増強
したことを特徴とする請求項２８〜３０のいずれか記載
の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死化
脳毛細血管内皮細胞株。31. The marker expression of the blood-brain barrier marker gene according to any one of claims 28 to 30, wherein the expression of the Glut1 gene is enhanced 100 times or more as compared with the case of single culture without co-culture. Immortalized brain capillary endothelial cell line with enhanced expression. 【請求項３２】 被検物質と、請求項１９〜３１のいず
れか記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強し
た不死化脳毛細血管内皮細胞株とを接触させ、血液脳関
門のマーカー遺伝子の発現増強の程度を測定・評価する
ことを特徴とする血液脳関門形成促進又は抑制物質のス
クリーニング方法。32. A test substance is brought into contact with an immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of the blood brain barrier marker gene according to any one of claims 19 to 31, and a blood brain barrier marker gene is obtained. A method for screening a substance that promotes or suppresses the formation of the blood-brain barrier, which comprises measuring and evaluating the degree of expression enhancement of E. coli. 【請求項３３】 被検物質と血液脳関門透過物質又は血
液脳関門非透過物質と、請求項１９〜３１のいずれか記
載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強した不死
化脳毛細血管内皮細胞株とを接触させ、これら血液脳関
門透過物質又は血液脳関門非透過物質の該不死化脳毛細
血管内皮細胞内への透過の程度を測定・評価することを
特徴とする血液脳関門透過促進又は抑制物質のスクリー
ニング方法。33. An immortalized brain capillary endothelium having enhanced expression of a test substance, a blood-brain barrier permeable substance, or a blood-brain barrier impervious substance, and the marker gene of the blood-brain barrier according to any one of claims 19 to 31. Contacting a cell line with the cell line, and measuring and evaluating the degree of penetration of the blood-brain barrier permeable substance or the blood-brain barrier non-permeable substance into the immortalized brain capillary endothelial cells. Or a method of screening for an inhibitor. 【請求項３４】 被検物質と、請求項１９〜３１のいず
れか記載の血液脳関門のマーカー遺伝子の発現が増強し
た不死化脳毛細血管内皮細胞株とを接触させ、該不死化
脳毛細血管内皮細胞内への被検物質の透過の程度を測定
・評価することを特徴とする血液脳関門透過又は非透過
物質のスクリーニング方法。34. A test substance is brought into contact with an immortalized brain capillary endothelial cell line having enhanced expression of the blood brain barrier marker gene according to any one of claims 19 to 31, and the immortalized brain capillary is contacted with the test substance. A method for screening a substance that has permeated or is not permeated through the blood-brain barrier, comprising measuring and evaluating the degree of penetration of a test substance into endothelial cells. 【請求項３５】 請求項３２記載の血液脳関門形成促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門形成促進物質。A blood-brain barrier formation-promoting substance obtained by the method for screening for a blood-brain barrier formation-promoting or suppressing substance according to claim 32. 【請求項３６】 請求項３２記載の血液脳関門形成促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門形成抑制物質。36. A blood-brain barrier formation inhibitory substance obtained by the method for screening for a blood-brain barrier formation promoting or suppressing substance according to claim 32. 【請求項３７】 請求項３３記載の血液脳関門透過促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門透過促進物質。37. A blood-brain barrier penetration enhancer obtained by the method for screening for a substance promoting or inhibiting blood-brain barrier according to claim 33. 【請求項３８】 請求項３３記載の血液脳関門透過促進
又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる血液
脳関門透過抑制物質。38. A blood-brain barrier permeation inhibitor obtained by the method for screening a substance promoting or inhibiting blood-brain barrier permeation according to claim 33. 【請求項３９】 請求項３４記載の血液脳関門透過又は
非透過物質のスクリーニング方法により得られる血液脳
関門透過物質。39. A blood-brain barrier permeable substance obtained by the method for screening a blood-brain barrier permeable or non-permeable substance according to claim 34. 【請求項４０】 請求項３４記載の血液脳関門透過又は
非透過物質のスクリーニング方法により得られる血液脳
関門非透過物質。40. A blood-brain barrier non-permeable substance obtained by the method for screening a blood-brain barrier permeated or non-permeable substance according to claim 34.
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