JP6122605B2 - Whitening method and screening method for melanin synthesis inhibitor - Google Patents
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Description
本発明は、美白方法、並びにメラニン合成抑制剤のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a whitening method and a screening method for a melanin synthesis inhibitor.
皮膚のシミ、ソバカスなどの色素沈着は、ホルモンの異常や紫外線、皮膚局所の炎症が原因となってメラニンが過剰に形成され、これが皮膚内に沈着するものと考えられている。皮膚の色素沈着の原因となるこのメラニンは、表皮基底層にある色素細胞（メラノサイト）内で合成され、メラノソームと呼ばれる小胞に貯蔵される。このメラノソームがメラノサイト内を移動し、周囲角化細胞（ケラチノサイト）に取り込まれ、皮膚が黒色化する。このメラノサイト内におけるメラニンは、チロシンが酵素チロシナーゼの作用によりドーパキノンを経て酵素的または非酵素的な酸化反応により黒色のメラニンへと変化して生成される。そこでこれまで、第一段階の反応であるチロシナーゼの活性を抑制することが、メラニンの生成を抑制するうえで重要であると考えられ、チロシナーゼ活性を阻害する物質の開発が行われてきた。 It is considered that pigmentation such as skin spots and buckwheat forms excessive melanin due to hormonal abnormalities, ultraviolet rays, and local inflammation of the skin, which deposits in the skin. This melanin, which causes skin pigmentation, is synthesized in pigment cells (melanocytes) in the basal layer of the epidermis and stored in vesicles called melanosomes. This melanosome moves in the melanocyte and is taken up by surrounding keratinocytes (keratinocytes), and the skin becomes black. Melanin in the melanocytes is produced by converting tyrosine into black melanin through an enzymatic or non-enzymatic oxidation reaction via dopaquinone by the action of the enzyme tyrosinase. Thus, it has been considered that the suppression of tyrosinase activity, which is the first stage reaction, is important in suppressing the production of melanin, and substances that inhibit tyrosinase activity have been developed.
しかしながら、チロシナーゼの活性を抑制する化合物はハイドロキノンを除いてはその効果が緩慢であるため、皮膚色素沈着の改善効果が十分でないことがある（特許文献１））一方で、ハイドロキノンは効果が認められるが、感作性があるため一般の使用が制限されている。そこで、チロシナーゼ活性阻害以外の作用機序による美白剤の開発が望まれている。 However, since the effect of a compound that suppresses the activity of tyrosinase is slow except for hydroquinone, the effect of improving skin pigmentation may not be sufficient (Patent Document 1), whereas hydroquinone has an effect. However, due to its sensitization, general use is limited. Therefore, development of a whitening agent by an action mechanism other than tyrosinase activity inhibition is desired.
一方、骨髄由来の樹状細胞で、皮膚などの重層扁平上皮に特有の細胞であるランゲルハンス細胞は、抗原処理、抗原提示能力によって皮膚免疫機能の中心的な役割を演じているとされており、外部からの異物としての抗原の進入に対し、すみやかに接触して処理し、リンパ節へ移動してＴ細胞にそれを提示し、以後の一連の免疫応答反応が始まると考えられている。ランゲルハンス細胞は加齢とともにその数が減少することが知られており、皮膚老化の一因を担うと考えられており、またランゲルハンス細胞は紫外線や接触刺激などのストレス下での、皮膚免疫の低下が知られている（特許文献４及び５）。 On the other hand, dendritic cells derived from bone marrow, Langerhans cells, which are unique to the stratified squamous epithelium such as skin, are said to play a central role in skin immune function by antigen processing and antigen presentation ability. It is considered that the entry of an antigen as a foreign substance from the outside is immediately contacted and processed, moves to a lymph node and presents it to T cells, and a series of subsequent immune response reactions are initiated. It is known that the number of Langerhans cells decreases with age, and it is thought to contribute to skin aging. Langerhans cells decrease skin immunity under stress such as ultraviolet rays and contact stimulation. Is known (Patent Documents 4 and 5).
本発明は、より効果的な美白方法を提供することを目的とするものである。さらに、本発明は、より効率的かつ簡便に被験物質の美白効果を評価できる方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a more effective whitening method. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method capable of evaluating the whitening effect of a test substance more efficiently and simply.
本発明者らが、加齢に応じて減少することが知られているランゲルハンス細胞の存在領域について研究を行ったところ、シミの部位においてランゲルハンス細胞が有意に減少していることを驚くべきことに見出した（図１〜図３）。この知見に基づき、ランゲルハンス細胞がシミの形成に寄与していると仮説を立て鋭意研究を行ったところ、ランゲルハンス細胞が、メラノサイトによるメラニン合成応答を抑制すること（図４）が確認された。この知見に基づき、本願発明者らは、ランゲルハンス細胞を活性化することによるメラニン産生抑制方法、美白方法、並びにランゲルハンス細胞の活性を指標としたメラニン産生抑制効果又は美白効果について薬剤をスクリーニングする方法を発明するに至った。さらに、当該スクリーニング方法を介し、βグルカンがメラニン産生抑制効果又は美白効果を有することを突き止め、βグルカンを含むメラニン産生抑制剤又は美白剤を完成するに至った。 When the present inventors studied the existence region of Langerhans cells that are known to decrease with age, it was surprising that the Langerhans cells were significantly reduced at the site of the stain. (FIGS. 1 to 3). Based on this finding, a hypothetical study was conducted with the hypothesis that Langerhans cells contributed to the formation of spots, and as a result, it was confirmed that Langerhans cells suppress the melanin synthesis response by melanocytes (FIG. 4). Based on this finding, the inventors of the present application have developed a method for screening a drug for a melanin production inhibitory effect, a whitening method by activating Langerhans cells, and a melanin production inhibitory effect or a whitening effect using the activity of Langerhans cells as an index. It came to invent. Furthermore, through the screening method, it was found that β-glucan has a melanin production inhibitory effect or a whitening effect, and a melanin production inhibitor or a whitening agent containing β-glucan has been completed.
より具体的に、本願発明は以下のものに関する：
（１） ランゲルハンス細胞を活性化させる工程を含む、メラニン産生抑制方法。
（２） 前記ランゲルハンス細胞の活性化工程が、β−グルカンを投与することを含む、項目（１）に記載のメラニン産生抑制方法。
（３） 項目（１）又は（２）に記載の前記メラニン産生抑制方法を含む美白方法。
（４） ランゲルハンス細胞を含む培養物中に、候補薬剤を添加する工程；及び
ランゲルハンス細胞の活性を指標として、メラニン産生抑制効果を判定する工程
を含む、メラニン産生抑制効果又は美白効果について薬剤をスクリーニングする方法。
（５） 前記活性が、ランゲルハンス細胞を誘因する活性又はランゲルハンス細胞増殖を促進する活性である、項目（４）に記載の方法。
（６） ランゲルハンス細胞活性化剤を含む、美白剤。
（７） 前記ランゲルハンス細胞活性化剤がβ−グルカンである、項目（６）に記載の美白剤。
（８） ランゲルハンス細胞活性化剤を含む、メラニン産生抑制剤。
（９） 前記ランゲルハンス細胞活性化剤がβ−グルカンである、項目（８）に記載のメラニン産生抑制剤。
More specifically, the present invention relates to:
(1) A method for inhibiting melanin production, comprising a step of activating Langerhans cells.
(2) The method for inhibiting melanin production according to item (1), wherein the step of activating Langerhans cells comprises administering β-glucan.
(3) Whitening method including the said melanin production suppression method as described in item (1) or (2).
(4) screening a drug for a melanin production inhibitory effect or a whitening effect, comprising: adding a candidate drug to a culture containing Langerhans cells; and determining a melanin production inhibitory effect using the activity of Langerhans cells as an index. how to.
(5) The method according to item (4), wherein the activity is an activity that induces Langerhans cells or an activity that promotes Langerhans cell proliferation.
(6) A whitening agent comprising a Langerhans cell activator.
(7) The whitening agent according to item (6), wherein the Langerhans cell activator is β-glucan.
(8) A melanin production inhibitor comprising a Langerhans cell activator.
(9) The melanin production inhibitor according to item (8), wherein the Langerhans cell activator is β-glucan.
本発明によって、ランゲルハンス細胞を活性化させることにより、メラニン産生を抑制することが可能となった。また、ランゲルハンス細胞の活性を指標として、メラニン産生抑制効果又は美白効果を有する薬剤をスクリーニングすることが可能になった。 According to the present invention, it is possible to suppress melanin production by activating Langerhans cells. In addition, it has become possible to screen for drugs having a melanin production inhibitory effect or a whitening effect using the activity of Langerhans cells as an index.
本発明のメラニン産生抑制方法は、in vivo、ex vivo又はin vitroにおいて、ランゲルハンス細胞を活性化させる工程を含む。本発明において、ランゲルハンス細胞は、骨髄由来の樹状細胞であり、有棘層の中から上層に存在する遊走性を有する細胞であり、ＣＤ１ａ等のマーカーを発現する細胞である。ランゲルハンス細胞の機能として、外界から侵入した異物を補足・認識してＴ細胞へ提示する機能、癌細胞を認識する機能、免疫寛容を誘導する機能、細胞外のＡＴＰを分解する機能などが挙げられ、ランゲルハンス細胞は主に皮膚における免疫応答反応に関与する細胞である。ここで、ランゲルハンス細胞の活性化とは、ランゲルハンス細胞の有する機能のうちの少なくとも１つを亢進することをいうが、さらにランゲルハンス細胞の増殖、誘因、又は減少の抑制も含むものとする。 The method for inhibiting melanin production of the present invention includes a step of activating Langerhans cells in vivo, ex vivo or in vitro. In the present invention, Langerhans cells are dendritic cells derived from bone marrow, are cells having a migratory property present in the upper layer from the spinous layer, and are cells expressing a marker such as CD1a. The functions of Langerhans cells include the function of capturing and recognizing foreign substances invading from the outside world and presenting them to T cells, the function of recognizing cancer cells, the function of inducing immune tolerance, and the function of degrading extracellular ATP. Langerhans cells are cells that are primarily involved in the immune response in the skin. Here, the activation of the Langerhans cell refers to enhancing at least one of the functions of the Langerhans cell, and further includes the suppression of the growth, induction or decrease of the Langerhans cell.
In vivoにおけるランゲルハンス細胞の活性化は、β−グルカンなどのランゲルハンス細胞活性化剤を、経口、又は非経口投与、例えば経皮、皮内、皮下、筋中、経静脈、経動脈などで投与することによる。顔面や、シミ、ソバカスなどの部位に局所的に投与する観点からは、経皮、皮内又は皮下投与が好ましい。Ex vivo 又はin vitroにおけるランゲルハンス細胞の活性化は、ex vivo 又はin vitroで培養されているランゲルハンス細胞を含む培養物にβ−グルカンなどのランゲルハンス細胞活性化剤を投与することにより行われる。 In vivo activation of Langerhans cells is achieved by administering a Langerhans cell activator such as β-glucan orally or parenterally, for example, transdermally, intradermally, subcutaneously, intramuscularly, intravenously, or transarterially. It depends. Percutaneous, intradermal or subcutaneous administration is preferred from the viewpoint of local administration to the face, sites such as spots and freckles. Activation of Langerhans cells ex vivo or in vitro is performed by administering a Langerhans cell activator such as β-glucan to a culture containing Langerhans cells cultured ex vivo or in vitro.
ランゲルハンス細胞活性化剤としては、本願発明の一態様であるメラニン産生抑制効果又は美白効果について薬剤をスクリーニングする方法により同定された薬剤が挙げられ、例えばβ−グルカンが挙げられる。これらの他にランゲルハンス細胞活性化剤としては、本技術分野において知られているランゲルハンス細胞減少抑制剤、例えばクジン、エンジュ、オウバク、カンゾウ、シコン、テンチャ、トウキなどから選ばれる植物抽出物なども挙げられる（特許文献５）。 Examples of the Langerhans cell activator include a drug identified by a method for screening a drug for a melanin production inhibitory effect or a whitening effect, which is one embodiment of the present invention, such as β-glucan. In addition to these, Langerhans cell activators include Langerhans cell decrease inhibitors known in the art, such as plant extracts selected from Kujin, Enju, Awaku, Licorice, Shikon, Tencha, Toki and the like. (Patent Document 5).
β−グルカンは、グルコースがβ１，３−型で結合した多糖であり、任意の植物、菌類、細菌由来であってもよいし、合成されたもの、例えばβ−グルカン合成酵素を用いて合成されたものであってもよい。その重量平均分子量は、１，０００〜５，０００，０００ダルトンあり、好ましくは１０，０００〜１，０００，０００ダルトン、さらに好ましくは１００，０００〜５００，０００ダルトンである。β−グルカンの由来元は、例えばアガリクス、霊芝などのキノコ類、パン酵母、ビール酵母などの酵母などが挙げられる。本実施例ではスエヒロタケ由来のβ−グルカンが用いられており、スエヒロタケのβ−グルカンを用いる点から、その重量平均分子量は５００，０００ダルトン以下、例えば４５０，０００ダルトンが好ましい。任意の植物、菌類、細菌に由来するβ−グルカンは、天然物であるため全ての結合がβ１，３型で結合していないものも含まれうる。例えば酵母由来のβ−グルカンでは、β１，６型の結合が含まれることがあるが、そのようなものにおいても、主な結合がβ１，３型で結合されていれば、本発明のβ−グルカンに該当するものとする。 β-glucan is a polysaccharide in which glucose is bound in β1,3-type, and may be derived from any plant, fungus, or bacterium, or synthesized, for example, synthesized using β-glucan synthase. It may be. The weight average molecular weight is 1,000 to 5,000,000 daltons, preferably 10,000 to 1,000,000 daltons, and more preferably 100,000 to 500,000 daltons. Examples of the origin of β-glucan include mushrooms such as agaricus and ganoderma, yeast such as baker's yeast and brewer's yeast. In this example, Suehirotake-derived β-glucan is used. From the viewpoint of using Suehirotake's β-glucan, its weight average molecular weight is preferably 500,000 daltons or less, for example, 450,000 daltons. Since β-glucan derived from any plant, fungus, or bacterium is a natural product, it may include those in which all bonds are not bound in β1,3 type. For example, β-glucan derived from yeast may contain β1,6 type linkages, and even in such cases, if the main linkages are β1,3 type linkages, the β-glucan of the present invention can be used. It shall correspond to glucan.
メラニンは、基底層に存在するメラノサイトにより生成され、メラニンを含むメラノソームがメラノサイトからケラチノサイトへと供与される。より具体的に、メラノサイトは、紫外線の照射などにより生成した活性酸素やメラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）、エンドセリンなどの情報伝達物質を介して活性化され、チロシンからドーパ、ドーパキノンなどを介してメラニンを生成する。 Melanin is produced by melanocytes present in the basal layer, and melanosomes containing melanin are donated from melanocytes to keratinocytes. More specifically, melanocytes are activated through active oxygen, melanocyte-stimulating hormone (MSH), endothelin, and other information-transmitting substances generated by ultraviolet irradiation, etc., and melanin is produced from tyrosine through dopa, dopaquinone, etc. To do.
本発明におけるメラニン産生抑制方法は、本発明の別の態様である美白方法に応用することができる。美白方法とは、皮膚中のメラニン量を低下させることにより、美容上又は医療上好ましい程度に肌を白くする方法をいい、顔や手足を含む全身の皮膚の美白及びシミ、くすみ、肝斑、ソバカスなどの局所的な色素沈着部位の美白の両方を包含する。メラノサイトで生成されたメラニンは、基底層においてケラチノサイトに受け渡され、皮膚のターンオーバーによりメラニンを含むケラチノサイトは表皮から脱落する。皮膚のターンオーバーは常に行われているため、基底層のメラノサイトにおいてメラニン産生が抑制されることにより、ターンオーバーを介して次第に美白効果が現れる。本発明におけるメラニン産生抑制方法又は美白方法は、医師の診察の下で行われる医療目的の他、美容販売員、エステティシャンなどにより行われる美容目的で行われうる。 The method for inhibiting melanin production in the present invention can be applied to the whitening method which is another aspect of the present invention. The whitening method refers to a method of whitening the skin to the extent that is cosmetically or medically favorable by reducing the amount of melanin in the skin, and whitening and staining of the whole body skin including the face and limbs, dullness, liver spots, Includes both local whitening of pigmented sites such as buckwheat. The melanin produced in the melanocytes is transferred to the keratinocytes in the basal layer, and the keratinocytes containing melanin are removed from the epidermis by the turnover of the skin. Since the skin is always turned over, the whitening effect gradually appears through the turnover by suppressing the production of melanin in the melanocytes of the basal layer. The melanin production suppression method or whitening method in the present invention can be performed for the purpose of beauty performed by a beauty salesperson, an esthetician, or the like, in addition to a medical purpose performed under medical examination.
本発明のメラニン産生抑制方法及び美白方法は、従来のメラニン産生抑制方法又は美白方法において用いられているハイドロキノンなどのチロシナーゼ活性阻害剤などに比較して、過剰な刺激応答反応の沈静化に基づいて恒常性維持をもたらすことによるため、メラノサイトの生理的機能自体を阻害することがない点で優れていると考えられる。 The melanin production suppression method and the whitening method of the present invention are based on the calming of an excessive stimulus response response as compared to tyrosinase activity inhibitors such as hydroquinone used in the conventional melanin production suppression method or whitening method. It is considered to be excellent in that it does not inhibit the physiological function of melanocytes because it brings about maintenance of homeostasis.
本発明の別の態様では、本発明は、メラニン産生抑制効果又は美白効果について薬剤をスクリーニングする方法にも関する。この方法は、ランゲルハンス細胞を含む培養物中に、候補薬剤を添加する工程；及びランゲルハンス細胞の活性を指標として、メラニン産生抑制効果又は美白効果を判定する工程を含む。ランゲルハンス細胞の活性の指標として用いられるものとして、ランゲルハンス細胞数、培地中のメラノサイト刺激ホルモン量、培地中のＡＴＰ量が挙げられる。すなわち、ランゲルハンス細胞を含む培養物中でランゲルハンス細胞を増加、培地中のメラノサイト刺激ホルモン量を低下、又は培地中のＡＴＰ量を低下させることができる候補薬剤を、メラニン産生抑制効果又は美白効果を有する薬剤としてスクリーニングすることができる。 In another aspect of the present invention, the present invention also relates to a method of screening a drug for a melanin production inhibitory effect or a whitening effect. This method includes a step of adding a candidate drug to a culture containing Langerhans cells; and a step of determining a melanin production inhibitory effect or a whitening effect using the activity of Langerhans cells as an index. Examples of the Langerhans cell activity index include the number of Langerhans cells, the amount of melanocyte-stimulating hormone in the medium, and the amount of ATP in the medium. That is, a candidate drug capable of increasing Langerhans cells in a culture containing Langerhans cells, decreasing the amount of melanocyte stimulating hormone in the medium, or decreasing the amount of ATP in the medium has a melanin production inhibitory effect or a whitening effect It can be screened as a drug.
本発明のスクリーニング方法により、従来は、メラニン産生抑制効果又は美白効果を調べるためには、メラノサイトの活性を抑制する薬剤を調べる必要があったが、本願発明は、複数の細胞種が存在する実際の皮膚に近い状態での刺激応答反応が反映される点で従来のスクリーニング方法に比べて優れている。 Conventionally, in order to examine the melanin production inhibitory effect or the whitening effect by the screening method of the present invention, it has been necessary to examine a drug that suppresses the activity of melanocytes. This is superior to the conventional screening method in that the stimulus response in a state close to the skin is reflected.
ランゲルハンス細胞を含む培養物には、皮膚切片、皮膚から取得して継代培養されたランゲルハンス細胞、或いは幹細胞や分化能を有する細胞から分化させたランゲルハンス細胞様細胞の培養物を含む。ランゲルハンス細胞を含む培養物として、例えば線維芽細胞、又は幹細胞（例えば上皮幹細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞）からin vitroで分化された線維芽細胞を、コラーゲン、フィブリン、ポリ乳酸などのポリマーや、キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類により構成された培養支持体上で培養して得られた三次元培養皮膚から得られた角層シートも含まれる。三次元培養皮膚として、ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング）から商業的に入手可能なヒト３次元培養表皮モデル製品が用いられる。幹細胞としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、造血幹細胞が挙げられるが、これらに限られるものではなく、ランゲルハンス細胞へ分化可能で自己増殖可能な細胞の全てが包含される。分化能を有する細胞としては、臍帯血の血液細胞やヒト末梢血単球が挙げられ、これらの細胞はランゲルハンス細胞へと分化させることが可能である。ランゲルハンス細胞を含む培養物には、ランゲルハンス細胞の他、皮膚を構成する細胞、例えば、ケラチノサイト、メラノサイト、α樹状細胞、メルケル細胞などの細胞が含まれてもよい。 The culture containing Langerhans cells includes skin slices, Langerhans cells obtained from the skin and subcultured, or cultures of Langerhans cell-like cells differentiated from stem cells or cells having differentiation ability. Examples of cultures containing Langerhans cells include fibroblasts or fibroblasts differentiated in vitro from stem cells (eg epithelial stem cells, embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells), collagen, fibrin, polylactic acid, etc. Also included is a stratum corneum sheet obtained from a three-dimensional cultured skin obtained by culturing on a culture support composed of a polymer and a polysaccharide such as chitin, chitosan, chondroitin sulfate, and hyaluronic acid. As the three-dimensional cultured skin, a human three-dimensional cultured epidermis model product commercially available from LabCyte EPI-MODEL (Japan Tissue Engineering Co., Ltd.) is used. Stem cells include, but are not limited to, ES cells, iPS cells, and hematopoietic stem cells, and all cells that can be differentiated into Langerhans cells and can proliferate are included. Examples of the cells having differentiation ability include umbilical cord blood cells and human peripheral blood monocytes, and these cells can be differentiated into Langerhans cells. In addition to the Langerhans cells, the culture containing Langerhans cells may contain cells that constitute the skin, such as keratinocytes, melanocytes, α-dendritic cells, Merkel cells, and the like.
候補薬剤とは、ランゲルハンス細胞の活性化、より好ましくは増殖、誘因、又は減少の抑制といった効果を発揮しうる可能性のある薬剤をいい、例えば化合物ライブラリーや、微生物、動植物等の抽出物のライブラリーなどが候補薬剤として用いられる。 Candidate drugs refer to drugs that may exert an effect such as activation of Langerhans cells, more preferably proliferation, triggering, or suppression of decrease, such as compound libraries, extracts of microorganisms, animals and plants, etc. A library or the like is used as a candidate drug.
ランゲルハンス細胞の活性を指標とするとは、ランゲルハンス細胞の増殖、誘因、又は減少の抑制を指標とすることであり、より好ましくはランゲルハンス細胞を含む培養物における、ランゲルハンス細胞の誘因又は減少の抑制を指標とすることである。メラニン産生抑制効果の判定は、対照となる候補薬剤未添加培養物に比較して、候補薬剤を添加した培養物にランゲルハンス細胞の数が多い場合に、添加した候補薬剤がメラニン産生抑制効果及び美白効果を有すると判定することができる。好ましくは、候補薬剤を添加した場合に、対照に比較して有意差をもってランゲルハンス細胞の数が多い場合に、メラニン産生抑制効果及び美白効果を有すると判定することができる。 The activity of Langerhans cells is used as an indicator of inhibition of the growth, triggering, or reduction of Langerhans cells, and more preferably, the inhibition of Langerhans cells is induced in a culture containing Langerhans cells. It is to do. When the number of Langerhans cells is higher in the culture to which the candidate drug has been added, the candidate drug added has the effect of inhibiting melanin production and whitening. It can be determined that it has an effect. Preferably, when a candidate drug is added, if the number of Langerhans cells is significantly greater than that of the control, it can be determined that the drug has a melanin production inhibitory effect and a whitening effect.
ランゲルハンス細胞の数は、ランゲルハンス細胞特異的マーカー、例えばＣＤ１ａ、ＣＤ３９、ＣＤ２０７などに対する抗体を用いてセルソーターによって、又はこれらの抗体を用いた免疫染色を用いて判定される。セルソーターを用いて細胞数を計測する場合、トリプシンを用いて培養物を個々の細胞へと分離することが必要となる。免疫染色を用いて判定する場合、個別に染色された細胞の数を計測してもよいが、ハイスループットスクリーニングにおいてスクリーニングを自動化する観点から、免疫染色で染色後の、染色部位の面積や染色量に基づいて判定が行われてもよい。 The number of Langerhans cells is determined by a cell sorter using antibodies against Langerhans cell specific markers such as CD1a, CD39, CD207, or using immunostaining with these antibodies. When counting the number of cells using a cell sorter, it is necessary to separate the culture into individual cells using trypsin. When judging using immunostaining, the number of individually stained cells may be counted, but from the viewpoint of automating screening in high-throughput screening, the area and amount of staining after staining with immunostaining The determination may be made based on the above.
薬剤のスクリーニングとは、候補薬剤ライブラリーから自動化されたロボットなどを用いて、本発明に係るスクリーニングを行うハイスループットスクリーニング、並びにヒトが手動で行うスクリーニングの両方を含む。 Drug screening includes both high-throughput screening in which screening according to the present invention is performed using a robot automated from a candidate drug library, and screening performed manually by a human.
本発明のさらに別の態様では、上記スクリーニング方法の結果、メラニン産生抑制効果及び美白効果を有すると判定されたメラニン産生抑制剤又は美白剤にも関する。例えば、本明細書中において、β-グルカンがメラニン産生抑制効果又は美白効果を有することが示されているため、本発明は、β-グルカンを含むメラニン産生抑制剤又は美白剤にも関する。さらに、本発明においてβ-グルカンは、ランゲルハンス細胞活性化剤又は減少抑制剤として用いることができる。 In still another aspect of the present invention, the present invention relates to a melanin production inhibitor or a whitening agent determined to have a melanin production inhibitory effect and a whitening effect as a result of the screening method. For example, in the present specification, since β-glucan is shown to have a melanin production inhibitory effect or a whitening effect, the present invention also relates to a melanin production inhibitor or a whitening agent containing β-glucan. In the present invention, β-glucan can be used as a Langerhans cell activator or a decrease inhibitor.
メラニン産生抑制剤又は美白剤は、顔、手脚を始め全身における日焼け後の又は生来の皮膚の色を、美容上又は医療上好ましい程度にまで白化させるため、或いはシミ、くすみ、ソバカス、肝斑など、褐変した一部の皮膚を周囲の皮膚の色へと戻すために用いられる。メラニン産生抑制剤又は美白剤は、経口、又は非経口、例えば経皮、皮内、筋中、静脈内、動脈内投与されてもよいが、顔面や、シミ、ソバカス、くすみ、肝斑などの色素沈着部位に局所的に投与する観点からは、経皮、皮内又は皮下投与が好ましく、経皮投与が最も好ましい。経皮投与される場合、メラニン産生抑制剤又は美白剤は、皮膚外用剤に配合される。皮膚外用剤中の配合量は、特に限定されないが、通常０．０１質量％〜２質量％の範囲で配合される。より好ましくは、配合量の上限は、０．５、１．０、及び２．０質量％の中から選択され、配合量の下限は、０．０１、０．０５、及び０．１質量％の中から選択される任意の範囲で配合されてもよい。 A melanin production inhibitor or whitening agent is used to whiten the skin color after tanning or in the body, including the face, hands and legs, to the extent that it is cosmetically or medically favorable, or to spots, dullness, buckwheat, liver spots, etc. It is used to return some browned skin to the surrounding skin color. The melanin production inhibitor or whitening agent may be administered orally or parenterally, for example, transdermally, intradermally, intramuscularly, intravenously, intraarterially, but it may be administered to the face, spots, freckles, dullness, liver spots, etc. From the viewpoint of local administration at the site of pigmentation, transdermal, intradermal or subcutaneous administration is preferred, and transdermal administration is most preferred. When administered transdermally, the melanin production inhibitor or whitening agent is blended in the external preparation for skin. Although the compounding quantity in a skin external preparation is not specifically limited, Usually, it mix | blends in 0.01 mass%-2 mass%. More preferably, the upper limit of the blending amount is selected from 0.5, 1.0, and 2.0 mass%, and the lower limit of the blending amount is 0.01, 0.05, and 0.1 mass%. You may mix | blend in the arbitrary ranges selected from these.
本発明のメラニン産生抑制剤又は美白剤には、β-グルカンに加えて、本発明の効果を損なわない範囲で、通常の化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる他の成分、例えば油分、湿潤剤、紫外線防止剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、界面活性剤、防腐剤、保湿剤、香料、水、アルコール、増粘剤、粉末、着色剤、生薬、その他各種薬効成分等を必要に応じて適宜配合することができる。 The melanin production inhibitor or whitening agent of the present invention includes, in addition to β-glucan, other components that are used in skin external preparations such as ordinary cosmetics and pharmaceuticals, for example, oils, as long as the effects of the present invention are not impaired. Wetting agents, UV protection agents, antioxidants, sequestering agents, surfactants, preservatives, moisturizers, fragrances, water, alcohol, thickeners, powders, coloring agents, herbal medicines, and other various medicinal ingredients are required Depending on the case, it can be blended appropriately.
さらに、本発明のメラニン産生抑制剤又は美白剤には、他の一般的に知られている美白剤、例えばビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸、ルシノール、エラグ酸、トラネキサム酸、リノール酸等も適宜配合することができる。その他の美白剤として、植物抽出物が、その安全性や皮膚への刺激の穏やかさを期待して種々開発されており、本発明のメラニン産生抑制剤又は美白剤は、これらの植物抽出物を含んでもよい。植物抽出物の一例として、キク科植物、トウダイグサ科植物などの抽出物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 Further, the melanin production inhibitor or whitening agent of the present invention includes other generally known whitening agents such as vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, glucoside ascorbate, arbutin, kojic acid, lucinol, ellagic acid. , Tranexamic acid, linoleic acid, and the like can be appropriately blended. As other whitening agents, various plant extracts have been developed with the expectation of their safety and mild irritation to the skin, and the melanin production inhibitor or whitening agent of the present invention uses these plant extracts. May be included. Examples of plant extracts include, but are not limited to, extracts from Asteraceae plants, Euphorbiaceae plants, and the like.
本発明のメラニン産生抑制剤又は美白剤は、化粧料、医薬品、又は医薬部外品に含まれてもよい。好ましい態様では本発明のメラニン産生抑制剤又は美白剤が含まれる化粧料、医薬品は、皮膚外用剤の形態をとる。その剤型は、皮膚に適用可能であれば特に限定されず、例えば、溶液状、乳化状、固形状、半固形状、粉末状、粉末分散状、水−油二層分離状、水−油−粉末三層分離状、軟膏状、ゲル状、エアゾール状、ムース状、スティック状等、任意の剤型が適用できる。また、その使用形態も任意であり、例えば化粧水、乳液、クリーム、ローション、パック、エッセンス、ジェル等のフェーシャル化粧料や、ファンデーション、化粧下地、コンシーラー等のメーキャップ化粧料、さらには浴用剤などに用いられる。 The melanin production inhibitor or whitening agent of the present invention may be contained in cosmetics, pharmaceuticals, or quasi drugs. In a preferred embodiment, the cosmetics and pharmaceuticals containing the melanin production inhibitor or whitening agent of the present invention take the form of a skin external preparation. The dosage form is not particularly limited as long as it can be applied to the skin. For example, it is a solution, emulsion, solid, semi-solid, powder, powder dispersion, water-oil two-layer separation, water-oil. -Arbitrary dosage forms such as powder three-layer separation, ointment, gel, aerosol, mousse, and stick can be applied. The use form is also arbitrary. For example, facial cosmetics such as lotion, milky lotion, cream, lotion, pack, essence, gel, makeup cosmetics such as foundation, makeup base, concealer, and bath preparations. Used.
以下、具体例を挙げてさらに本発明を説明するが、これらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be further described with specific examples, but is not limited thereto.
実施例１：シミ部位におけるランゲルハンス細胞数の測定
健常男性の肩から皮膚をパンチバイオプシーで採取し、凍結切片を作製して、一次抗体として２００倍希釈の抗ＣＤ１ａ抗体（Ｒ＆Ｄ社）、二次抗体として２００倍希釈のＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社）を用い、反応時間をそれぞれ１時間として、蛍光免疫染色を行い、顕微鏡下で撮影した。結果を図１に示す。基底層にメラニンの沈着が見られるシミ部位では、蛍光染色されたランゲルハンス細胞の数が減少しているのがわかった。
Example 1: Measurement of the number of Langerhans cells at a spot site A skin was collected from a shoulder of a healthy male by punch biopsy, a frozen section was prepared, and 200-fold diluted anti-CD1a antibody (R & D) as a primary antibody, secondary antibody As an example, a 200-fold diluted FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (SIGMA) was used, and each reaction time was 1 hour, followed by fluorescent immunostaining and photographed under a microscope. The results are shown in FIG. It was found that the number of fluorescently stained Langerhans cells decreased at the spot site where melanin deposition was observed in the basal layer.
健常男性１１名の肩のシミ部位とその近傍からパンチバイオプシーで直径２ｍｍの皮膚を採取し、凍結切片を作製した。抗ＣＤ１ａ抗体（Ｒ＆Ｄ社）及びＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社）を用いて、上記と同様に蛍光免疫染色を行い、顕微鏡下で表皮面積当たりのＣＤ１ａ陽性のランゲルハンス細胞数を計数し、結果を図２に示した。シミ部位では、近傍部位に比べ、ランゲルハンス細胞の数が有意に少なかった。 Skin with a diameter of 2 mm was collected with punch biopsy from and around the shoulder spot of 11 healthy men, and a frozen section was prepared. Using anti-CD1a antibody (R & D) and FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (SIGMA), fluorescent immunostaining was performed as described above, and the number of CD1a-positive Langerhans cells per epidermis area was counted under a microscope. Is shown in FIG. The number of Langerhans cells was significantly less at the spot site than at the nearby site.
健常女性７名の顔から、シミ部位とその近傍の皮膚を２ｍｍのパンチバイオプシーで採取し、凍結切片を作製した。抗ＣＤ１ａ抗体（Ｒ＆Ｄ社）及びＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社）を用いて、上記と同様に蛍光免疫染色を行い、顕微鏡下で表皮面積当たりのＣＤ１ａ陽性のランゲルハンス細胞数を計数し、結果を図３に示した。シミ部位では、近傍部位に比べ、ランゲルハンス細胞の数が有意に少なかった。 From the faces of seven healthy women, the spot site and the skin in the vicinity thereof were collected with a 2 mm punch biopsy to prepare frozen sections. Using anti-CD1a antibody (R & D) and FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (SIGMA), fluorescent immunostaining was performed as described above, and the number of CD1a-positive Langerhans cells per epidermis area was counted under a microscope. Is shown in FIG. The number of Langerhans cells was significantly less at the spot site than at the nearby site.
実施例２：ランゲルハンス細胞によるメラノサイト（Ｂ１６細胞）からのメラニン合成の抑制
臍帯血由来のＣＤ３４陽性の造血幹細胞（ＬＯＺＮＡ社から購入）から、Mollah ZUらの論文（.J Invest Dermatol 120, 256-265 (2003)）に記載された方法に従って、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社）の存在下で２週間培養してランゲルハンス細胞様細胞（ＬＣ細胞）を準備した。９６穴プレートに２０，０００個のＢ１６メラノーマ細胞を播種し、１０％の牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ニッスイ社）中で２４時間培養し、対照群（ＡＴＰ（−）ＬＣ（−））、ＡＴＰ添加及びＬＣ未添加群（ＡＴＰ（＋）、ＬＣ（−））、ＡＴＰ添加及びＬＣ添加群（ＡＴＰ（＋）ＬＣ（＋））を準備した。ＬＣ添加は、２４時間培養後のメラノーマ細胞に対し１０，０００個の上記ランゲルハンス細胞様細胞を添加することにより行われた。ＡＴＰの添加は、ランゲルハンス細胞様細胞の添加の５分後、又はＬＣ未添加群では同じタイミングで、１００μＭのＡＴＰを添加することにより行われた。１時間後に培養液を交換することによって培養液中のランゲルハンス細胞様細胞及びＡＴＰを除去した後、さらに２４時間培養した。培養後、分光光度計（ＢｅｃｈＭａｒｋ Ｐｌｕｓ， ＢＩＯＲＡＤ社）を用いて、メラニン定量に用いられる４０５ｎｍの吸光度を測定した。
Example 2: Suppression of melanin synthesis from melanocytes (B16 cells) by Langerhans cells From umbilical cord blood-derived CD34 positive hematopoietic stem cells (purchased from LOZNA), Mollah ZU et al. (.J Invest Dermatol 120, 256-265 According to the method described in (2003)), Langerhans cell-like cells (LC cells) were prepared by culturing in the presence of G-CSF, SCF, Flt3L, TNFα, and TGFβ (Peprotec) for 2 weeks. A 96-well plate was seeded with 20,000 B16 melanoma cells, cultured in DMEM medium (Nissui) containing 10% fetal bovine serum for 24 hours, a control group (ATP (−) LC (−)), ATP addition and LC non-addition groups (ATP (+), LC (−)), ATP addition and LC addition groups (ATP (+) LC (+)) were prepared. LC addition was performed by adding 10,000 of the Langerhans cell-like cells to the melanoma cells cultured for 24 hours. The addition of ATP was performed by adding 100 μM ATP 5 minutes after the addition of Langerhans cell-like cells or at the same timing in the LC non-added group. After replacing the culture solution after 1 hour, Langerhans cell-like cells and ATP in the culture solution were removed, followed by further culture for 24 hours. After culturing, the absorbance at 405 nm used for melanin determination was measured using a spectrophotometer (BechMark Plus, BIORAD).
実施例１の結果により、シミの部位においてランゲルハンス細胞が有意に減少していることが示された（図１〜図３）。さらに実施例２により、ランゲルハンス細胞が、メラノサイトによるメラニン合成応答を抑制すること（図４）が確認され、ランゲルハンス細胞がシミの形成に寄与していることが示された。これらの実験結果により、本発明のうち、ランゲルハンス細胞を活性化することによるメラニン産生抑制方法、美白方法がサポートされる。 The results of Example 1 showed that Langerhans cells were significantly reduced at the spot site (FIGS. 1 to 3). Furthermore, Example 2 confirmed that Langerhans cells suppress the melanin synthesis response by melanocytes (FIG. 4), indicating that Langerhans cells contribute to the formation of spots. These experimental results support the melanin production suppression method and the whitening method by activating Langerhans cells in the present invention.
実施例３：ランゲルハンス細胞によるケラチノサイトからのメラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ)の産生抑制
２４穴用のカルチャーインサートにヒト表皮ケラチノサイトを３００，０００個／５０μｌ ＣｎＴ０７培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍｓ社）播種し、２日後にカルチャーインサート内の培養液を除いて、さらにＣｎＴ０２−３ＤＴ培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて７日間培養することにより、重層化した表皮様構造を作製した。ＡＴＰ未添加ＬＣ未添加群（ＡＴＰ（−））、ＡＴＰ添加ＬＣ未添加群（ＡＴＰ（＋））、ＡＴＰ添加ＬＣ添加群（ＡＴＰ（＋）ＬＣ（＋））の表皮用構造を準備した。ＬＣ添加は、下層の培養液に実施例２で準備したランゲルハンス細胞様細胞を１０，０００個添加することにより行われた。ＡＴＰの添加は、ランゲルハンス細胞様細胞の添加の５分後、又はＬＣ未添加群では同じタイミングで１００μＭのＡＴＰを添加することにより行われた。１時間後に培養液を交換することによって培養液中のランゲルハンス細胞及びＡＴＰを除去した後、さらに４８時間培養した。培養後、培養液を回収して、ＥＬＩＳＡキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．社）によってαＭＳＨを定量し、結果を図５に示した。
Example 3: Inhibition of production of melanocyte-stimulating hormone (MSH) from keratinocytes by Langerhans cells Seed 300,000 human epidermal keratinocytes / 50 μl CnT07 medium (CELLnTEC advanced cell systems) on culture inserts for 24 wells, 2 days Later, the culture solution in the culture insert was removed, and further culturing was carried out for 7 days using CnT02-3DT medium (CELLnTEC advanced cell systems) to prepare a layered epidermis-like structure. A structure for the epidermis was prepared for the ATP-free LC-added group (ATP (-)), ATP-added LC-free group (ATP (+)), and ATP-added LC-added group (ATP (+) LC (+)). LC addition was performed by adding 10,000 Langerhans cell-like cells prepared in Example 2 to the lower layer culture solution. Addition of ATP was performed 5 minutes after the addition of Langerhans cell-like cells, or by adding 100 μM ATP at the same timing in the LC non-addition group. After replacing the culture solution after 1 hour, Langerhans cells and ATP in the culture solution were removed, followed by further culturing for 48 hours. After culturing, the culture broth was collected, and αMSH was quantified by ELISA kit (Phoenix Pharmaceuticals Inc.). The results are shown in FIG.
実施例４：紫外線照射による増大したケラチノサイトからのＡＴＰ放出、並びにランゲルハンス細胞存在下における当該ＡＴＰ放出の低下
９６穴プレートに２，０００個の正常ケラチノサイトをＣｎＴ０７培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍｓ社）中で播種し、４日間培養した。３群のケラチノサイト培養物を準備し、対照群（ＵＶ照射無し、ランゲルハンス細胞様細胞添加無し）、ＵＶ照射群（ＵＶ照射有り、ランゲルハンス細胞様細胞添加無し）、ＬＣ細胞添加群（ＵＶ照射有り、ランゲルハンス細胞様細胞添加有り）に分けた。ＬＣ細胞添加群に実施例２で準備した２，０００個のランゲルハンス細胞様細胞を添加し、添加後にＵＶ照射を行った。ＵＶ照射群及びＬＣ細胞添加群に３０ｍＪ／平方ｃｍの紫外線を照射し、１０分後に培養液を回収し、市販のルシフェリン−ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて、培養液中のＡＴＰ量を測定し、結果を図６に示した。
Example 4: Increased ATP release from keratinocytes by UV irradiation and reduction of the ATP release in the presence of Langerhans cells 2,000 normal keratinocytes were seeded in CnT07 medium (CELLnTEC advanced cell systems) in 96-well plates And cultured for 4 days. Three groups of keratinocyte cultures were prepared, control group (no UV irradiation, no Langerhans cell-like cell addition), UV irradiation group (with UV irradiation, no Langerhans cell-like cell addition), LC cell addition group (with UV irradiation, Langerhans cell-like cells were added). 2,000 Langerhans cell-like cells prepared in Example 2 were added to the LC cell addition group, and UV irradiation was performed after the addition. The UV irradiation group and the LC cell addition group were irradiated with 30 mJ / square cm of ultraviolet light, and after 10 minutes, the culture solution was collected, and the amount of ATP in the culture solution was measured using a commercially available luciferin-luciferase assay kit (Perkin Elmer). Was measured, and the results are shown in FIG.
実施例５：ＡＴＰ添加に応答する培養皮膚におけるメラニン含量の変化
ヒトメラノサイト４５０,０００個を１０ｃｍシャーレに播種し、ｍｅｄｉｕｍ２５４培地で１０日間培養し、０．３から３００μＭのＡＴＰを添加してさらに５日間培養したものを、６５℃の１ＭのＮａＯＨ＋１０％ＤＭＳＯ溶液中で溶解し、吸光度（４００ｎｍ）を測定し、結果を図７に示した。
Example 5: Change in melanin content in cultured skin in response to ATP addition 450,000 human melanocytes were seeded in a 10 cm dish, cultured in medium 254 medium for 10 days, added with 0.3 to 300 μM ATP and further 5 Those cultured for 1 day were dissolved in 1M NaOH + 10% DMSO solution at 65 ° C., and the absorbance (400 nm) was measured. The results are shown in FIG.
実施例３〜５の結果により、ランゲルハンス細胞が、ケラチノサイトによるメラノサイト刺激ホルモンの放出を抑制すること（図５）、ランゲルハンス細胞がケラチノサイトから放出される細胞外刺激伝達因子であるＡＴＰを抑制していること（図６）が確認された。さらに、培養皮膚モデルにおいて、メラニン含量を示す吸光度がＡＴＰ添加により増加したことが示された（図７）。これらの結果に基づき、本発明者らは、紫外線などの刺激により、ランゲルハンス細胞の活性（すなわちＡＴＰａｓｅ活性等）が低下することにより、細胞外ＡＴＰ及びα-ＭＳＨの産生増加を招き、それによりメラニン産生が増加してシミが形成するというシミ形成メカニズムを明らかにした。 From the results of Examples 3 to 5, the Langerhans cells suppress the release of melanocyte-stimulating hormone by keratinocytes (FIG. 5), and the Langerhans cells suppress ATP, which is an extracellular stimulating factor released from keratinocytes. (FIG. 6) was confirmed. Furthermore, in the cultured skin model, it was shown that the absorbance indicating melanin content was increased by the addition of ATP (FIG. 7). Based on these results, the present inventors decreased the activity of Langerhans cells (ie, ATPase activity) by stimulation such as ultraviolet rays, leading to increased production of extracellular ATP and α-MSH, thereby causing melanin We clarified the mechanism of stain formation in which production increases and stains form.
実施例６：ランゲルハンス細胞を活性化することによるメラノーマ細胞からのメラニン合成の抑制
マウスメラノーマＢ１６細胞を９６穴マイクロプレートに播種し、１０％の牛胎児血清を含むＤＭＥＭ（ニッスイ）培地中で３７℃にて培養した。Ｂ１６細胞の培養物を、溶媒対照群、ＡＴＰ群（ＡＴＰのみを添加し、ＬＣ細胞を添加しない）、ＬＣ群（ＬＣ細胞の添加後、ＡＴＰを添加する）、グルカン処理ＬＣ群（グルカン前処理したＬＣ細胞の添加後、ＡＴＰを添加する）にわけ、メラニン合成に対する影響を調べた。ＬＣ細胞としては、実施例２に記載の臍帯血由来の造血幹細胞から分化させたランゲルハンス細胞様細胞を用いた。ＬＣ群及びグルカン処理ＬＣ群においてＬＣ細胞の添加の一時間後に終濃度１００μＭとなるようにＡＴＰを添加した。グルカン前処理ＬＣ細胞群においては、予めランゲルハンス細胞様細胞培養液に１％β−グルカン（スエヒロタケ由来、重量平均分子量：４５０，０００ダルトン）を添加し、その２４時間後にＰＢＳ洗浄したＬＣ細胞をＢ１６細胞の培養物に加え、３７℃で培養した。それぞれの群においてＡＴＰ添加後２日間の培養した後に吸光光度計（ＢｅｃｈＭａｒｋ Ｐｌｕｓ， ＢＩＯＲＡＤ社）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定した。培地のみの吸光度をバックグラウンドとして差し引いた値を表１及び図８に示す。
Example 6: Inhibition of melanin synthesis from melanoma cells by activating Langerhans cells Mouse melanoma B16 cells were seeded in a 96-well microplate and incubated at 37 ° C in DMEM (Nissui) medium containing 10% fetal calf serum. Incubated in The culture of B16 cells was divided into solvent control group, ATP group (only ATP was added, and LC cells were not added), LC group (after addition of LC cells, ATP was added), glucan-treated LC group (glucan pre-treatment) After addition of the LC cells, ATP was added), and the influence on melanin synthesis was examined. As the LC cells, Langerhans cell-like cells differentiated from cord blood-derived hematopoietic stem cells described in Example 2 were used. In the LC group and the glucan-treated LC group, ATP was added to a final concentration of 100 μM one hour after the addition of LC cells. In the glucan pretreated LC cell group, 1% β-glucan (derived from Shirohirotake, weight average molecular weight: 450,000 daltons) was previously added to the Langerhans cell-like cell culture solution, and 24 hours later, PBS-washed LC cells were treated with B16. In addition to the cell culture, the cells were cultured at 37 ° C. After culturing for 2 days after adding ATP in each group, the absorbance at 405 nm was measured using an absorptiometer (BechMark Plus, BIORAD). Values obtained by subtracting the absorbance of the medium alone as the background are shown in Table 1 and FIG.
実施例７：β−グルカンによるランゲルハンス細胞の活性化
実施例２に従い分化させた１０，０００個のランゲルハンス細胞様細胞を９６穴プレート上の穴に播種し、０％、０．１％、１％のβ−グルカン（スエヒロタケ由来、重量平均分子量４５０，０００ダルトン）を添加して、２４時間培養した。血球計算版を用いて細胞数を計数した結果、表２に示すように、β−グルカンの濃度依存的にランゲルハンス細胞の増加が示された。
実施例６の結果により、細胞外刺激伝達因子であるＡＴＰによって促進されたメラノーマからのメラニン合成が、ランゲルハンス細胞の存在によって抑制されること、さらにグルカン処理をランゲルハンス細胞に行うことにより、その抑制効果が向上したことが示された。さらに実施例７の結果により、β−グルカンによってランゲルハンス細胞の活性化（増加）することが示された。ランゲルハンス細胞の活性化作用を有することが示されたβグルカンは、ランゲルハンス細胞の活性化を指標としてメラニン産生抑制効果又は美白効果について薬剤をスクリーニングすることにより得られた薬剤であり、このようなスクリーニング方法が実施可能であることが示された。 According to the result of Example 6, melanin synthesis from melanoma promoted by ATP, which is an extracellular stimulus transmission factor, is suppressed by the presence of Langerhans cells, and further, the glucan treatment is performed on Langerhans cells, thereby suppressing the effect. Was shown to improve. Furthermore, the result of Example 7 showed that β-glucan activated (increases) Langerhans cells. Β-glucan that has been shown to have Langerhans cell activation activity is a drug obtained by screening a drug for melanin production inhibitory effect or whitening effect using Langerhans cell activation as an index. It has been shown that the method is feasible.
Claims (2)
ランゲルハンス細胞の活性を指標として、メラニン産生抑制効果を判定する工程
を含む、メラニン産生抑制効果又は美白効果について薬剤をスクリーニングする方法。 A method for screening a drug for a melanin production inhibitory effect or a whitening effect, comprising: adding a candidate drug to a culture containing Langerhans cells; and determining a melanin production inhibitory effect using the activity of Langerhans cells as an index.
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