JP2010508248A - アテローム性動脈硬化症の治療のためのed−bフィブロネクチンドメインをターゲットとする融合タンパク質の使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療および予防のための医薬の製造のための、特異的にED−Bフィブロネクチンを認識する抗体部分、エフェクター部分、および場合により、一またはそれ以上の融合タンパク質リンカー(複数)および/または抗体リンカー(複数)を含む、融合タンパク質の使用に関する。
Description
本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療および予防のための医薬の製造のための、フィブロネクチンのエキストラドメインB(ED−B)を特異的に認識する抗体部分、エフェクター部分、および場合により一またはそれ以上の融合タンパク質リンカーおよび/または抗体リンカーを含む融合タンパク質の使用に関する。
アテローム性動脈硬化症は、心血管系イベントによって悪化した、大、中動脈の慢性炎症性脂質蓄積症として知られている。これらは一般に、心臓、脳、脚部そして他の組織中における突発性動脈血栓症の結果である。リン脂質とコレステロールの沈着の結果としての病的内膜肥厚は、最も早期の検知可能なアテローム性の変化を構成し、続いてマクロファージと、CD4+およびCD8+T細胞の浸潤が起こる(Virami R, et al., Arterioscler, Thromb Vasc Biol 2005, 25:2054−61; Xu QB, et al., Clin Immunol Immunpathol,1990,56:344−359)。その後、この過程は、アテローム性動脈硬化プラークをかん流させる栄養血管の増殖へとつながる(Rose R.N Engl J Med.,1999,340:115−126;Wilson SH,et al.,Circulation.,2002,105:415−418)。プラーク内出血をもたらす栄養血管の破裂は、無症候性のプラークを高リスクで不安定な損傷へ発展させる重要な過程である(Kolodgie FD,et al.,N Engl J Med.,2003,349:2316−2325)。プラーク内出血とプラーク破裂は、微小血管の密度の増加と関わりがある(Fleiner M,et al.,Circulation 2004,110,2843−2850)。プラークの破裂は、急性心筋梗塞で死亡する患者の75%で起こる急性冠動脈症候群における内腔の血栓の主要な原因である(Davies MJ,et al.,N Engl J Med,1984,310:1137−1140)。前述のアテローム性動脈硬化プラークの有効な画像法ならびにそれらについての治療法および予防法は、大きな関心事である。冠動脈疾患(CAD)またはアテローム性動脈硬化症の予防は、一般的に、禁煙やダイエット、体重減少、運動のような治療上のライフスタイルの変化に関連する。すでにCADもしくは他の血管床におけるアテローム性動脈硬化症を罹患している患者またはCADを発症する高リスクにある患者において、より低い総コレステロールまたは低比重リポタンパクコレステロール(LDL−C)は、心血管罹患率、死亡率および全死亡率の減少に関与している。3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル コエンザイムAリダクターゼ阻害剤(たとえばアトロバスタチン(リピトール(登録商標))、プラバスタチン(プラバコール(登録商標))、シンバスタチン(ゾコール(登録商標)))を用いた治療法は、予防心臓病学に対して大きな影響があった。臨床試験は,血清中のコレステロールの減少が、コレステロールを減らすために使用された方法に関係なく、主要な心血管イベントの減少と相関していることを一貫して示している。しかし、急性冠不全症候群の患者に対して、これらの薬剤の早期臨床データを支持する試験ベースの証拠はほとんどない。たいてい、これらの患者は、血小板抑制薬(たとえばアスピリン(登録商標)またはクロピドグレル(プラビックス(登録商標)))、抗凝血薬(ヘパリンの皮下注射)、そして血管拡張薬(たとえばニトログリセリン、カルシウム拮抗薬)で治療される。これらの全身療法は、CADの患者の臨床症状を一時的に減少させるかもしれないが、それらが、プラークの大きさを小さくしたり、もしくはプラークの形態を改善し、または安定化をすること、あるいは進行性のアテローム性動脈硬化症に対して著しく即効性の効果があることは知られていない。明白な、および/または臨床的に症候性のCADにおいて、現在の選択され得る治療法には、バルーン冠動脈形成術や冠動脈バイパス手術が含まれる(Braunwald E,et al.,in Harrison’s Principle of Internal Medicine,most recent edition(2005),McGraw−Hill)。これらの進襲性治療法は、急性または亜急性の症状を緩和するかもしれないが、本来的に局所的な治療法なので、それらには、潜在的な進行性の動脈硬化性疾患に対して大きな効果を有さない。
今のところ知られている、血管形成に関する最も選択的なマーカーの一つが、エキストラ ドメイン B(ED−B)フィブロネクチンである。FN(フィブロネクチン)は、健常組織と体液の一帯で豊富に発現している、高分子量の細胞外マトリックス(ECM)構成要素である。さまざまな異なるFNアイソフォームが、一次転写物のレベルでの選択的スプライシングにより生成し得る。ED−Bは、91個のアミノ酸からなる小さいドメインであり、配列的にマウス、ラット、ヒトで同一であり、再生中の子宮内膜や卵巣のいくつかの血管を除いて、通常、血漿と組織フィブロネクチンのいずれにも存在しない(Alessi P.et al.,Biochim.Biophys.Acta,2004,1654:39−49;Viti F.et al.,Cancer Res.,1999,59:347−352)。しかし、それは、血管新生に関わる活性化組織の再形成中にフィブロネクチン分子へと挿入され、それによりアテローム性動脈硬化プラーク中の新生血管のような新生血管構造の周辺に特異的に蓄積するようになるかもしれない。したがって、ED−BフィブロネクチンおよびとくにED−Bドメインはそれ自体、分子治療のターゲットとなる(Zardi et al.,EMBO J.,1987,6:2337−2342,Carnemolla et al.,J.Cell Biol.,1989,108:1139−1148,Castellani et al.,Int.J.Cancer,1994,59:612−618)。
これに関連して、血管形成マーカーを選択的に標的とすることができる分子は、関節リウマチ、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑編成症のような、血管増殖を特徴とする病気の診断や治療の臨床的な機会を作り出す。(O’Reilly et al.,Nat. Med.,1996,2:689,O’Reilly et al.,Cell,1997,88:277,Friedlander et al.,Science,1995,270:1500,Pasqualini et al.,Nat.Biotechnol.,1997,15:542,Huang et al.,Science,1997275:547,Kim et al.,Nature,1993,362:841,Schmidt−Erfurth et al.,Br.J.Cancer,1997,75:54).
近年、フィブロネクチンのED−Bに特異的な多くの良質な抗体が創製された。特に、ED−Bに対してピコモーラーの結合親和性を示すヒト一本鎖Fv抗体フラグメントであるL19は、たとえば実験的腫瘍モデルにおいて(Viti F.et al.,Cancer Res.,1999,59:347−352;Tarli L,et al.,Blood,1999,94:192−198)、そして固形がん患者の腫瘍病巣において(Santimaria M.et al.,Clin.Cancer Res.,2003,9:571−579)新たに形成された腫瘍血管を選択的に標的とすることができることが証明された。本発明に従って使われるかもしれない他の抗体は、BC1、CGS−1およびCGS−2である。BC−1は、特異的にED−Bフィブロネクチンを認識するが、ED−BフィブロネクチンのED−Bドメインとは結合しない。
サイトカインは、広範囲に細胞間の情報伝達に使われるたんぱく性のシグナル物質の一群である。免疫システムの発達と機能に対する重要性はさておき、サイトカインはまた、非常に多くの免疫疾患、炎症性疾患、感染症に大きな役割を果たす。サイトカインは、人体や動物の体の障害の治療のための非常に有効な化合物となり得ると従来からわかっている。インターフェロンαは、慢性骨髄性白血病(CML)や有毛細胞白血病に対して単剤治療剤として活性があり、そしていくらかの患者には完全に持続的な寛解を誘導することができる(Kamtarjian HM,et al.,Blood 2006,108:1835−1840;Baker PK,et al.,Blood 2002,100:647−653;Damasio EE,et al.,Eur J Haematol 2000,64:42−52)。ペグインターフェロンαは、慢性B、C、D型肝炎に対する積極的治療剤として単剤、あるいはラミブジンまたはアデフォビルとの併用で広く用いられている(Wursthorn K,et al.,Hepatology 2006,44:675−684;Desmond,CP,et al.,J Viral Hepatitis 2006,13:311−315;Niro GA,et al.,Hepatology 2006,44:713−720)。インターフェロンβは、多発性硬化症の治療に広く使われている(Kappos L,et al.,Neurology 2006,67:944−953)。腫瘍壊死因子α(TNFα)は、四肢分離かん流法(ILP;Grunhagen D,et al.,Cancer 2006,106:1776−84)に関連して、肉腫の患者のための患肢温存治療としてメルファランとの併用療法において承認されている。それはまた、メラノーマ患者に対して同様の手法で首尾よく使用されている(Lejeune F,et al.,Cancer Immunity,2006,6:1−17)。特に、インターロイキン−2(IL2)は、とりわけ抗腫瘍試験において最も強いサイトカインの一つとして特徴付けられた。それは、種々の抗腫瘍エフェクター細胞の刺激を含めて、一そろいの感染制御効果を示す(Rosenberg S.A.,J.Intern.Med.,2001,250:462−475)。しかし、転移性腎細胞癌患者の臨床的治療のために承認されているにも関わらず、全身的に適用されたIL2は、期待したほどの成功が認められなかった。全身的に適用されたIL2の治療効果は、投与量の上昇を制限して治効量の投与を阻止する、深刻な、本質的に生死に関わる副作用(たとえば起立性低血圧、血管漏出症候群や深い倦怠感)により妨げられる(Bubenik J.et al.,Cancer Immunol.Immunother.,2000,49:116−122;Baluna R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999,96:3957−3962)。加えて、全身に送達されたIL2の早い分解または排出が、さらにその有効性を減少させる。一方、IL2の局所的投与は、より成功しており、悪性滲出液の調整およびすでに罹患している腫瘍病巣の著しい寛解へと進展する(Bubenik J.et al.,Cancer Immunol.Immunother.,2000,49:116−122;Den Otter W.et al.,J.Urol.,1998,159:1183−1186;Baselmans A.H.et al.,Cancer Immunol.Immunother.,2002,51:492−498;Krastev Z.et al.,Hepatogastroenterology,2003,50:1647−1649,Radny P,et al.,Br J Cancer 2003,89:1620−1626)。
IL2は、CD4+CD25+T細胞とも呼ばれるレギュラトリーT細胞(Treg)の発達と制御に重要である(Thornton A.M.et al.,J.Immunol.,2004,172:6519−6523)。IL2/IL2受容体経路は、IL2、IL2RαまたはIL2Rβのような経路の一構成要素を遺伝子欠失させると、マウスが深刻なリンパ増殖と自己免疫疾患によって早期に死ぬことから、優秀な免疫システムにとって基本となるものである。一般に、Tregは、インビトロでT細胞の増殖を抑制するために、そしてインビボにおいて自己−およびアロ抗原、腫瘍抗原および感染性因子に対する免疫応答を抑制するために重要である(Shevach,E.M.,2002,Nat.Rev.Immunol.2:389)。Tregは、アテローム性動脈硬化症の発症に影響を及ぼす(AitOufella,H.et al.,Nat.Med.,2006,12:178)。
Matterらは、たとえば、放射活性の、または赤外線感受性のマーカーによりラベル化されたフィブロネクチンED−B特異的抗体を用いてApoE−/−マウス(アテローム性動脈硬化症のモデル)におけるアテローム性動脈硬化プラークを表示するための画像法について記述した(Matter C.M.et al.,Circulation Research,2004,24:1225−1233を参照)。しかし、Matterらにより提案された、L19をベースとした融合タンパクの中でもインターロイキン12(IL12)を融合したL19ヒトモノクローナル抗体が、最終的に前述のアテローム性動脈硬化プラークに対して臨床的に効果的であるという、臨床段階における漠然とした見解は、他の者の科学的指摘とは合致しない(Davenport P. et al.,Am.J.Pathology,2003,20:264−269;Zhao L.et al.,JBC,2002,277:35350−35356;Lee T.S. et al.,Atheroscler.Throm.Vasc.Biol.,1999,19:737−742;Zhou R.H.et al.,J.Atheroscler.Thromb.,2001,8:30−32;Hauer A.D. et al.,Circulation,2005,16:1054−1062を参照)。したがって、アテローム性動脈硬化プラークにおけるIL12の存在が、タイプ1ヘルパーT細胞型サイトカイン産生パターンの鍵誘導因子であると確認され、そしてそれは、Matterらの提案とは著しく対照的なのだが、アテローム性動脈硬化症の発症を予防、治癒するというよりもむしろその発症に寄与していると考えられる。特に、Davenportらは、ApoE−/−マウスにおけるIL12のノックアウトがプラーク形成の著しい減少へと導くことを示した。この結果は、Zhaoらによって支持され、彼らは(アポリポタンパクEあるいは低比重リポタンパク受容体の欠如という背景の下)、マウスの12/15−リポキシゲナーゼの標的遺伝子破壊、あるいは過剰発現技術を用いて、固形飼料を8ヶ月与えたマウスにおいて大動脈病変の50%の減少を確認した(コレステロール量に差異はない)。これらのマウスの培養されたマクロファージにおいて彼らは、IL12産生の75%〜90%の著しい減少を発見した。Leeらは、Apo−E欠如マウスの大動脈のプラークのマクロファージにおけるIL12の発現を調べ、そしてこれらのマウスにおけるIL12の毎日の投与は、アテローム性動脈硬化症を促進させることを見出した。同様に、Zhouらは、急性心筋梗塞の患者において血清中のIL−12レベルが上昇するが、不安定狭心症の患者では上昇しないことを見出したが、それらはIL12がCADの発症に関与していることを示している。最終的に、これらの指摘は、HauerらにマウスにおけるIL12の生物学的活性を完全に阻害するワクチン技術の計画を促した。LDL受容体欠如マウス(LDLr−/−;アテローム性動脈硬化症についての別の動物モデル)への、IL12の生物学的活性に対するワクチンの接種により、アテローム性動脈硬化の68.5%もの著しい減少が生じた。
Subramanya Upadhyaらによる刊行物(2004;Apo−E欠如マウスにおける、インターロイキン−2のアテローム生成における効果およびインターロイキン−2抗体の抗アテローム性動脈硬化効果,Angiology,Vol.55 No.3,289−294ページ)では、アテローム性動脈硬化を増強する働きがあるインターロイキン−2による動脈硬化促進効果を実証している。さらに抗IL−2抗体はアテローム性動脈硬化に対して予防効果がある。
上記の観点から、前述のアテローム性動脈硬化プラークに対する特定の治療に用いられる組成物および/または医薬への早急な必要性があり、そして科学的データが示すところによると、IL12あるいは標的とされたIL12は明らかにこの治療に関する問題への可能な解決手段とは考えられない。
したがって、本発明に内在する技術的課題は、ヒトおよび動物におけるアテローム性動脈硬化プラーク、およびそれに関連する他の病気の特定の治療および予防のための新規医薬を提供することにより、上記で言及した問題を克服することである。
その課題は、特許請求の範囲および明細書に記載されたとおりの実施形態により解決される。
本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療および予防のための医薬の製造における、少なくとも一つの標的部分および少なくとも一つのエフェクター部分を含む融合タンパク質の使用であって、当該標的部分が、特異的にED−Bフィブロネクチンを認識し、および当該エフェクター部分が、サイトカインまたはその生物学的に活性のあるフラグメントである、融合タンパク質の使用に関する。
好ましい実施形態において、標的部分はフィブロネクチンのエキストラドメインB(ED−B)と結合する。
具体的には、アテローム性動脈硬化症の治療および予防のための医薬の製造における、少なくとも一つの標的部分および少なくとも一つのエフェクター部分を含む融合タンパク質の使用であって、当該標的部分が、フィブロネクチンのエキストラドメイン B(ED−B)を特異的に認識し、および当該エフェクター部分が、サイトカインまたはその中の生物学的に活性のあるフラグメントである、融合タンパク質の使用が提供される。
本明細書で使用される用語「融合タンパク質」は、人工的なタンパク性の構造物に関するものであり、そして、その起源および/または特別な機能によって定義される、少なくとも二つの異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を意味する。さらに、本発明の融合タンパク質という用語は、また、核酸、糖、および放射活性および蛍光標識マーカーのような、非タンパク質分子部分を含む融合タンパク質を含む。
さらに、本発明に従って使用される用語「標的部分」は、受容体、抗原またはそれらのフラグメントのような、所望の標的分子の少なくとも一部分と選択的に結合するすべての分子、または分子の一群を意味する。前述の標的部分の例は、ホルモン、神経伝達物質、抗体ならびにそのフラグメントおよび抗体模倣薬を含む。
本明細書で使用される表現「フラグメント」または「生物学的に活性のあるフラグメント」は、標的への活性または生物学的および薬理的活性のような所望の効果が維持される限り、分子の一部分、または分子もしくは分子群の部分の組み合わせを意味する。
本発明の好ましい実施形態によれば、上記で定義されたような使用において、標的部分は、抗体またはそのフラグメントである。
本発明で使用される用語「抗体」は、特に限定されず、たとえば、完全長の抗体、天然の抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体、完全なIgG抗体、少なくとも二つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体(たとえば二重特異性抗体)を含む。
前述の用語「抗体」は、さらに最も広い意味で使用され、特に、それらが所望の生物学的標的活性を示す限り、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体(たとえば二重特異性抗体)、およびそれらの抗体フラグメントを含む。
本明細書で使用される用語「抗体フラグメント」は、所望の生物学的標的活性を示す限り、完全な抗体の一部分を含み、好ましくは、その抗体結合領域または可変領域もしくはそのCDR領域を含む。
そのような抗体フラグメントの例は、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFvフラグメント、二重特異性抗体、ミニボディー、リニアー抗体、一本鎖抗体分子、小免疫タンパク質(small immunoproteins)(SIPs),「scFv」、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体および多価抗体を含む。
特に好ましい実施形態によれば、標的部分は、ヒトリコンビナント抗体L19またはそのフラグメントもしくはその誘導体である。
別の実施形態によれば、標的部分は、BC−1抗体またはそのフラグメントもしくはその誘導体である。
好ましい実施形態によれば、L19抗体または抗体フラグメントは,scFv、SIP、IgG、またはFab形態であり、好ましくは、scFv形態である。
抗体または抗体フラグメントは、単量体または多量体、たとえば二量体の状態で存在し得る。多量体は、ホモマーまたはヘテロマーであってもよい。多量体は、共有結合によって、または非共有結合性の会合によって形成されてもよい。たとえば、scFv形態のL19−IL2は、非共有結合性のホモダイマーを形成する。別の例は、L19−SIPであって、共有結合性のホモマー二量体を形成する。
具体的には、抗体または抗体フラグメントは、L19のCDR領域を含み、および/または、L19抗体の少なくとも一つのVh鎖、および少なくとも一つのVl鎖を含む。
本発明の好ましい実施態様において、L19抗体またはL19抗体フラグメントの重鎖は配列番号1に従った配列を有し、および/または前述の抗体の軽鎖は、配列番号2に従った配列を有する。
別の好ましい実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、L19抗体またはL19抗体フラグメントCDR領域を含む。特に、L19のCDRの配列は、配列番号8から13に示される。
別の好ましい実施形態によれば、上記で定義された使用において、抗体または抗体フラグメントの重鎖および軽鎖は、抗体リンカーによって結合されている。
本明細書で使用される用語「抗体リンカー」は、特に限定されるものではなく、アミノ酸、ペプチドまたは脂肪族性もしくは芳香族性有機分子のような、当技術分野で知られているいずれの抗体リンカーであってもよい。そのようなリンカーの例は、欧州特許第0573551号明細書、欧州特許第0623679号明細書、および欧州特許第0318554号明細書に記載されている。
上記で定義された使用の特定の実施例において、抗体リンカーは、配列番号3に従った配列を有する。
「抗体模倣薬」は、標的に特異的に結合し、抗体および抗体フラグメントとは異なる、タンパクの骨格(frameworks)(「骨格(scaffolds)」)に基づいた結合分子として知られている。そのような骨格(scaffolds)は、Binz et al.,2005,Nat.Biotechnol.23,1257−1268に記載されている。ED−Bフィブロネクチンに特異的に結合する抗体模倣薬は、Grabulovski et al.,J.Biol.Chem.,2007,282:3196−3204に記載されている。
本発明によれば、用語「エフェクター部分」は、特に限定されず、インターロイキン−12(IL12)を除いた、当技術分野で知られているすべてのサイトカインを意味する。そのようなサイトカインの例は、IL1αおよびIL1β、IL2からIL11またはIL13からIL22のようなインターロイキン(IL)、IFN−α、IFN−β、またはIFN−γのようなインターフェロン(IF)、および腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)である。
本発明での上記で定義された使用のさらなる実施態様において、サイトカインは、IL12を除いたインターロイキンまたは生物学的に活性のあるフラグメントもしくはそれらの誘導体である。
本発明の好ましい実施態様によれば、上記で定義された使用におけるサイトカインは、インターロイキン−2(IL2)またはそのフラグメントもしくはその誘導体である。好ましくは、インターロイキン−2は、ヒトのものである。
本発明の別の実施形態によれば、上記で定義された使用におけるサイトカインは、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)またはそのフラグメントもしくはその誘導体である。好ましくは、TNFαは、ヒトのものである。
本発明の一実施例によれば、インターロイキン−2は、配列番号4に従った配列を有する。
本発明の一実施例によれば、TNFαは、配列番号6、または配列番号7に従った配列を有する。
本発明の好ましい実施形態によれば、融合タンパク質は、L19−IL2を含み、そして、(N末端からC末端の方向で)配列番号1、配列番号3、配列番号2、配列番号5、および配列番号4、を順に付加した配列を有する。
別の実施態様によれば、融合タンパク質L19−TNFアルファは、以下の要素の連続を含む:(N末端からC末端への方向に)配列番号1、配列番号3、配列番号2、配列番号5、および配列番号6。別の実施形態において、融合タンパク質L19−TNFアルファは、以下の要素の連続を含む:(N末端からC末端への方向に)配列番号1、配列番号3、配列番号2、配列番号5、および配列番号7。
本発明の一実施形態において、上記で定義された使用における融合タンパク質は、(a)N末端の標的部分およびC末端のエフェクター部分、または(b)N末端のエフェクター部分およびC末端の標的部分を持つ。
本発明の別の実施形態によれば、標的部分は、癌胎児性ED−Bフィブロネクチンと特異的に結合する。
上記で定義された使用の別の実施形態において、標的部分とエファクター部分は、融合タンパク質リンカーによって結合されている。この融合タンパク質リンカーの好ましい実施形態は、配列番号5に記載されている。
本明細書で使用される用語「融合タンパク質リンカー」は、特に制限されず、アミノ酸、ペプチドまたは脂肪族性もしくは芳香族性有機分子のような、本発明に従った標的部分およびエフェクター部分を結合するのに使用できる全てのリンカーを含めてもよい。融合タンパク質リンカーの具体例は、欧州特許第0573551号明細書、欧州特許第0623679号明細書、および欧州特許第0318554号明細書に記載されている。
本発明の別の態様は、患者中のアテローム性動脈硬化プラークおよびそれに関連する病気の治療方法であって、前述の患者に本発明に従って融合タンパク質を投与する段階を含む、治療方法に関する。
本発明の融合タンパク質は、典型的には、一またはそれ以上の、薬理的に許容される担体、緩衝液または塩のような、助剤との併用で投与されてもよい。
本発明の組成物の投与経路は、特定の限定を示さず、そして、たとえば、皮下投与または静脈内投与であり得る。好ましい投与経路は、皮下適用および静脈内適用である。本発明で使用される「患者」という語は、哺乳動物、特にヒトを含む。
本発明の、IL2を有する融合タンパク質は、ヒト患者への一回投与につき約0.5から60Mio IU IL2当量(0.835mgから10.02mgの融合タンパク質に対応する)投与してもよく、好ましくは、ヒト患者への一回投与につき5から60Mio IU IL2当量(0.835mgから10.02mgの融合タンパク質に対応する)である。治療は、ivまたはscのいずれかで、非経口で、繰り返して投与してもよい(たとえば、1日目、3日目、5日目そして22日目に投与する、または可能な限り毎日投与する)。異なる適用計画は、完全な臨床的利益を得るためには必要である。予防は、アテローム性動脈硬化症を発症する危険性のあるヒトに対して、同様の方法を適用することによりなし得る。
本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療および予防のための医薬の製造における、少なくとも一つの標的部分と、少なくとも一つのエフェクター部分を含む融合タンパク質であって、当該標的部分がED−Bフィブロネクチンを特異的に認識し、特にフィブロネクチンのエキストラドメインB(ED−B)に結合する融合タンパク質を提供する。ED−Bの発現は、ヒトおよび動物の体において非常にわずかの組織および/または部位でのみ見られ得るため、そして、それは、健康で成熟したヒトの器官の大部分で発現していないので、本発明の使用は、これらの組織および/または部位を標的とする、高い特異性を有する医薬の製造を有利に可能とする。したがって、本発明に従った融合タンパク質の使用を通じて、得られた医薬は、エフェクター部分を所望の組織または部位へ輸送することを可能にする。フィブロネクチンのED−Bへの、融合タンパク質の驚くほど高い特異性のため、サイトカインIL2またはTNFα、特にIL2のような、適切なエフェクター部分の使用により、標的とされた組織および/または部位の、直接的および非常に効率的な治療を可能とする医薬が提供される。
たとえば、フィブロネクチンのED−Bに特異的なホモダイマーscFv L19抗体と接合することによって、アテローム性動脈硬化プラーク微小環境における、IL2のようなサイトカインの目標濃度は、サイトカインの治療指数を高め、そして同時に、その毒性副作用を減らし、それにより、アテローム性動脈硬化プラークおよびそれに関連したさらなる疾患の治療および予防のための価値ある臨床ツールを提供する。
本発明は、以下の実施例にさらに記載されており、それらに制限されるものではない。
実施例1:融合タンパク質L19−IL2を用いたApoEマウスの治療
アテローム性動脈硬化の進行、心筋イベント、およびの死亡率の評価のため、6ヶ月齢から7ヶ月齢のApoEマウスに、標準固形飼料および高脂肪食を与えた。融合タンパク質L19−IL2を、滅菌済みのリン酸緩衝生理食塩水に溶かして、i.v.注射で、106IU/kg IL2当量で、3回/週、適用した。血液を、後眼窩採血(retro−orbital bleeding)により採取した。実験経過を示す図は、図1に記載されている。
これらの実験結果は、意外にも、L19−IL2を加えるとプラーク形成の減少につながることが分かったことを示す(図3)。
アテローム性動脈硬化の進行、心筋イベント、およびの死亡率の評価のため、6ヶ月齢から7ヶ月齢のApoEマウスに、標準固形飼料および高脂肪食を与えた。融合タンパク質L19−IL2を、滅菌済みのリン酸緩衝生理食塩水に溶かして、i.v.注射で、106IU/kg IL2当量で、3回/週、適用した。血液を、後眼窩採血(retro−orbital bleeding)により採取した。実験経過を示す図は、図1に記載されている。
これらの実験結果は、意外にも、L19−IL2を加えるとプラーク形成の減少につながることが分かったことを示す(図3)。
実施例2:心臓の組織学
心臓の組織学におけるL19−IL2融合タンパク質の影響を決定するために、L19−IL2で処置した動物およびコントロールの動物の両方の心臓の、梗塞の領域、単核細胞の浸潤および閉塞した冠動脈を分析した。この目的のため、組織サンプルを液体窒素中で瞬間凍結(snap−frozen)し、OCTに包埋し、免疫組織化学的検査のために−80℃で保管した。この目的のために、5〜10μMの組織切片を固定し、標準的な免疫組織化学的手法に従ってそれぞれの抗体を用いて染色した。
組織学的実験は、コントロールとL19−IL2で処置した動物との間で有意差がないことを実証している。
心臓の組織学におけるL19−IL2融合タンパク質の影響を決定するために、L19−IL2で処置した動物およびコントロールの動物の両方の心臓の、梗塞の領域、単核細胞の浸潤および閉塞した冠動脈を分析した。この目的のため、組織サンプルを液体窒素中で瞬間凍結(snap−frozen)し、OCTに包埋し、免疫組織化学的検査のために−80℃で保管した。この目的のために、5〜10μMの組織切片を固定し、標準的な免疫組織化学的手法に従ってそれぞれの抗体を用いて染色した。
組織学的実験は、コントロールとL19−IL2で処置した動物との間で有意差がないことを実証している。
実施例3:血清のパラメーター
これらの血清学的実験によれば、コントロール群およびL19−IL2を適用した群の両者において、トロポニンのレベル(心筋梗塞の高感度かつ高特異性の標識)に差がないことを示している。
これらの血清学的実験によれば、コントロール群およびL19−IL2を適用した群の両者において、トロポニンのレベル(心筋梗塞の高感度かつ高特異性の標識)に差がないことを示している。
Claims (13)
- アテローム性動脈硬化の治療および予防のための医薬の製造における、少なくとも一つの標的部分および少なくとも一つのエフェクター部分を含む融合タンパク質の使用であって、当該標的部分がED−Bフィブロネクチンを特異的に認識し、そして、当該エフェクター部分がサイトカインまたはその生物学的に活性のあるフラグメントである、前記使用。
- 前記標的部分が、フィブロネクチンのエキストラドメインB(ED−B)に結合する、請求項1に記載の使用。
- 前記標的部分が、抗体またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項1または2に記載の使用。
- 前記標的部分が、ヒトリコンビナント抗体L19またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項2または3に記載の使用。
- 前記抗体または抗体フラグメントが、L19のCDR領域を含み、および/または、L19抗体の少なくとも一つのVhと少なくとも一つのVlを含む、請求項3または4に記載の使用。
- 前記抗体の重鎖および軽鎖が、抗体リンカーによって結合されている、請求項2〜5のいずれか一項に記載の使用。
- 前記抗体リンカーが、配列番号3に従う配列を有する、請求項2〜6のいずれか一項に記載の使用。
- 前記サイトカインが、インターロイキンまたはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用。
- 前記サイトカインが、インターロイキン−2(IL2)またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項8に記載の使用。
- 前記インターロイキン−2が、配列番号4に従う配列を有する、請求項9に記載の使用。
- 前記融合タンパク質が
(a)N末端の標的部分およびC末端のエフェクター部分、または、
(b)N末端のエフェクター部分およびC末端の標的部分
を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。 - 前記標的部分および当該エフェクター部分が、融合タンパク質リンカーによって結合されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載の使用。
- 前記融合タンパク質リンカーが、配列番号5に従う配列を有する、請求項12に記載の使用。
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