JP2010185849A - 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生理活性物質の検出あるいは濃度測定を行う対象の測定試料とLALとの混和液における凝集開始時間を検出し、この凝集開始時間によって生理活性物質の検出あるいは濃度測定を行う。測定試料とLALとの混和液を例えば磁性攪拌子を用いて攪拌することにより、ゲル粒子を生成せしめ、ゲル粒子により散乱されるレーザー光の散乱光強度を測定する。そして、この散乱光強度の揺らぎの周波数分布を取得し、この周波数分布形状の時間的変化に基づいて、測定試料とLALとの混和液における凝集開始時間を検出する。
【選択図】図2
Description
子計測法)、あるいは、攪拌比濁法が提案されている。
前記試料とLALとの混和後において、前記試料とLALとの混和液中に光を入射するとともに該入射光の前記混和液による散乱光の強度を取得し、
前記散乱光の強度の揺らぎの周波数分布の時間的変化に基づいて前記混和液における凝集開始時刻を検出し、
該凝集開始時刻より前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは濃度を測定することを特徴とする。
リアルタイムに検知することで、より精度良くゲル粒子の成長過程を検知することが可能となる。その結果、より精度良く、より早期に、反応系の凝集開始時刻を検出することができる。そして、予め、反応系の凝集開始時刻と所定生理活性物質の濃度との関係を調べておくことにより、より精度良く、より迅速に、試料とLALとの混和液中の所定生理活性物質の測定を行うことが可能となる。
消失し、それらが凝集して大きくなり始めた時点をもって凝集開始時刻を検出することができ、より精度よく、凝集が開始した時刻である凝集開始時刻を検出することができる。
なうことが可能となる。
前記試料とLALとの混和液を光の入射可能に保持し、前記生理活性物質とLALとの反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記混和液保持手段中の混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記入射光の前記混和液による散乱光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から取得される前記散乱光の強度の揺らぎにおける周波数分布の時間的変化に基づいて前記混和液における凝集開始時刻を検出する凝集開始時刻検出手段と、
前記凝集開始時刻検出手段によって検出された凝集開始時刻より前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは濃度を導出する導出手段と、
を備えることを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置であってもよい。
前記散乱光の強度の揺らぎの自己相関関数を取得し、
該自己相関関数の形状の時間的変化に基づいて前記混和液における凝集開始時刻を検出するようにしてもよい。
前記自己相関関数の形状において、遅延時間の短い所定領域における脈動が消失した時刻をもって、前記凝集開始時刻としてもよい。
また、前記自己相関関数の形状において、遅延時間の短い所定領域における脈動が消失するとともに、該所定領域より遅延時間の長い領域において脈動が出現した時刻をもって、前記凝集開始時刻としてもよい。
また、前記所定領域は、遅延時間が1msec以下の領域としてもよい。
前記自己相関関数の形状における緩和係数が時間の経過とともに一旦減少して増加する際の時刻をもって、前記凝集開始時刻としてもよい。また、前記自己相関関数の形状における緩和係数が時間の経過とともに一旦減少して増加する際の最小値となる時刻をもって、前記凝集開始時刻としてもよい。
LALとエンドトキシンとが反応してゲルが生成される過程はよく調べられている。すなわち、図5に示すように、エンドトキシンがLAL中のセリンプロテアーゼであるC因子に結合すると、C因子は活性化して活性型C因子となる、活性型C因子はLAL中の別のセリンプロテアーゼであるB因子を水解して活性化させ活性化B因子とする。この活性化B因子は直ちにLAL中の凝固酵素の前駆体を水解して凝固酵素とし、さらに、この凝固酵素がLAL中のコアギュロゲンを水解してコアギュリンを生成する。そして、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成し、LAL全体がこれに巻き込まれてゲル化すると考えられている。
測定する比濁法や光散乱法と比較すると、短時間で低濃度の所定生理活性物質を測定することができる。
が電気的に接続されている。なお、演算結果を表示する表示装置(不図示)がさらに接続されるようにしてもよい。
ている。なお、ここでいう瞬間とは、30〜60秒程度の時間を示している。
次に本発明における実施例2について説明する。本実施例における凝集開始時刻は、自己相関係数の緩和係数が急激に減少して増加する挙動を示した際における、緩和係数が最小値となる時刻として検出される。なお、本実施例における測定系は図1に示す測定系1と同等である。
reference standard endotoxinを5mLのLAL reagent water(以下、「LRW」ともいう。)で溶解して、2000EU/mLのエンドトキシン溶液を調製し、原液とした。この原液をLRWでさらに溶解し、0.001から100EU/mLの希釈系列を調製した。また、LAL試薬にはリムルスES−IIシングルテストワコー(和光純薬工業(株)製)を用いた。
200μLのエンドトキシン試料をLAL試薬ES−IIのガラス・チューブに加え、5秒間ボルテックスにて攪拌した。その後直ちに7mmφのガラス製試料セル(キュベット)に移し変え、測定系1を用いて測定した。なお、試料セルは予め250℃、2時間以上で感熱滅菌したものを用いた。
上記測定において取得された、散乱光強度の揺らぎの自己相関関数に関し、緩和係数の時間的変化を測定した結果を図3に示す。ここで、緩和係数は、例えば図2に示したような自己相関関数のグラフの横軸を対数軸ではなく線形軸とした場合の、自己相関関数の減少部分の傾きを示している。図3より、反応開始後の時間経過とともに緩和時間は増加するが、ある時刻に急激に減少することが分かる。上記測定を様々な濃度のエンドトキシンを含む試料について行ったところ、この緩和係数の不連続な減少は、測定試料のエンドトキシン濃度によらず必ず出現することが判った。また、エンドトキシンとLALとの反応開始後この現象が起こるまでの時間は試料におけるエンドトキシン濃度に依存しているこ
とが判った。本実施例においては緩和係数が急激に減少した時刻(緩和係数が最小値となった時刻)を凝集開始時刻として捉えることとした。
2・・・光源
3・・・入射光学系
4・・・試料セル
5・・・出射光学系
6・・・受光素子
7・・・増幅回路
8・・・ノイズ除去フィルタ
9・・・コリレータ
10・・・演算装置
11・・・攪拌子
12・・・マグネチックスターラー
Claims (17)
- 試料中に存在する生物由来の生理活性物質とカブトガニの血球抽出物であるLALとを反応させることで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記試料とLALとの混和後において、前記試料とLALとの混和液中に光を入射するとともに該入射光の前記混和液による散乱光の強度を取得し、
前記散乱光の強度の揺らぎの周波数分布の時間的変化に基づいて前記混和液における凝集開始時刻を検出し、
該凝集開始時刻より前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは濃度を測定することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法。 - 前記散乱光の強度の揺らぎの自己相関関数を取得し、
該自己相関関数の形状の時間的変化に基づいて前記混和液における凝集開始時刻を検出することを特徴とする請求項1に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。 - 前記自己相関関数の形状において、遅延時間の短い所定領域における脈動が消失した時刻をもって、前記凝集開始時刻とすることを特徴とする請求項2に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記自己相関関数の形状において、遅延時間の短い所定領域における脈動が消失するとともに、該所定領域より遅延時間の長い領域において脈動が出現した時刻をもって、前記凝集開始時刻とすることを特徴とする請求項2に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記所定領域は、遅延時間が1msec以下の領域であることを特徴とする請求項3または4に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記自己相関関数における緩和係数が時間の経過とともに一旦減少して増加する際の時刻をもって、前記凝集開始時刻とすることを特徴とする請求項2に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記自己相関関数における緩和係数が時間の経過とともに一旦減少して増加する際の最小値となる時刻をもって、前記凝集開始時刻とすることを特徴とする請求項6に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記散乱光の強度を取得する際には、前記混和液を攪拌することを特徴とする請求項1から7のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−D−グルカンであることを特徴とする請求項1から8のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 試料中に存在する生物由来の生理活性物質とカブトガニの血球抽出物であるLALとを反応させることで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定装置であって、
前記試料とLALとの混和液を光の入射可能に保持し、前記生理活性物質とLALとの反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記混和液保持手段中の混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記入射光の前記混和液による散乱光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から取得される前記散乱光の強度の揺らぎにおける周波数分布の時間的変化に基づいて前記混和液における凝集開始時刻を検出する凝集開始時刻検出手段と、
前記凝集開始時刻検出手段によって検出された凝集開始時刻より前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは濃度を導出する導出手段と、
を備えることを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置。 - 前記凝集開始時刻検出手段は、
前記散乱光の強度の揺らぎの自己相関関数を取得し、
該自己相関関数の形状の時間的変化に基づいて前記混和液における凝集開始時刻を検出することを特徴とする請求項10に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。 - 前記凝集開始時刻検出手段は、
前記自己相関関数の形状において、遅延時間の短い所定領域における脈動が消失した時刻をもって、前記凝集開始時刻とすることを特徴とする請求項11に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。 - 前記凝集開始時刻検出手段は、
前記自己相関関数の形状において、遅延時間の短い所定領域における脈動が消失するとともに、該所定領域より遅延時間の長い領域において脈動が出現した時刻をもって、前記凝集開始時刻とすることを特徴とする請求項11に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。 - 前記所定領域は、遅延時間が1msec以下の領域であることを特徴とする請求項12または13に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
- 前記凝集開始時刻検出手段は、
前記自己相関関数における緩和係数が時間の経過とともに一旦減少して増加する際の時刻をもって、前記凝集開始時刻とすることを特徴とする請求項11に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。 - 前記凝集開始時刻検出手段は、
前記自己相関関数における緩和係数が時間の経過とともに一旦減少して増加する際の最小値となる時刻をもって、前記凝集開始時刻とすることを特徴とする請求項11に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。 - 前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−D−グルカンであることを特徴とする請求項10から16のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
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