JP2010101875A - Device and method for injecting sample in supercritical fluid chromatography - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料注入装置及び試料溶液注入方法に関し、特にそのクロマトグラム測定精度及び分取精製の生産性の改善に関する。 The present invention relates to a sample injection device and a sample solution injection method in supercritical fluid chromatography, and more particularly to improvement of the chromatogram measurement accuracy and productivity of preparative purification.
二酸化炭素（ＣＯ２）等を用いた超臨界流体クロマトグラフィー(Supercritical fluid chromatography:SFC)は有機溶媒を用いる液体クロマトグラフィー(Liquid chromatography:LC)の代わりに利用できる分離精製法として注目されている。ＳＦＣは流体の粘性が低く、カラム効率を低下させることなく流速を上げて短時間で分離を行うことが可能である。特に光学異性体の分離、高分子オリゴマーの重合単位での分離で使用され、環境負荷が小さく、ランニングコストが安価、溶媒除去のための後工程も少なく酸化しやすい物質や熱に不安定な物質にも適している。
このようなＳＦＣは海外では環境保全の観点からも注目されている。
ところで、検出感度が低いサンプルのため大量注入する場合、あるいは分取を行う場合には、試料溶液を数〜数十ｍＬのオーダーでカラムに導入することもある。このような例が図１に示されている。
Supercritical fluid chromatography (SFC) using carbon dioxide (CO2) or the like is attracting attention as a separation and purification method that can be used in place of liquid chromatography (LC) using an organic solvent. SFC has a low fluid viscosity and can perform separation in a short time by increasing the flow rate without reducing the column efficiency. Especially used for separation of optical isomers, separation of polymer oligomers by polymerized units, low environmental impact, low running cost, few downstream processes for solvent removal, and easily oxidizable or heat unstable materials Also suitable for.
Such SFC has attracted attention overseas from the viewpoint of environmental conservation.
By the way, when a large amount is injected because of a sample having low detection sensitivity, or when fractionation is performed, the sample solution may be introduced into the column on the order of several to several tens of mL. Such an example is shown in FIG.
同図に示す分取ＳＦＣ装置は、超臨界流体を供給する超臨界流体供給部１２と、補助溶媒を供給するモディファイア供給部１４と、超臨界流体と補助溶媒を混合するアキュムレーター１６と、試料インジェクタ３６を含む試料注入部１８と、カラム３８を含む試料分離部２０と、検出部２２と、自動背圧調整弁２４とを備える。
そして、前記超臨界流体供給部１２は、二酸化炭素ボンベ２６と、該ボンベ２６から供給される二酸化炭素を昇圧送給するポンプ２８及び定温化する循環恒温槽３０とを備える。また、前記モディファイア供給部１４は、モディファイア溶媒容器３２と、モディファイアを昇圧送給するポンプ３４を備える。そして、各供給部１２，１４からの超臨界流体及び補助溶媒は、各ポンプ２８，３４の流量比に応じた組成比の流体となり、アキュムレーター１６で混合され、移動相として試料注入部１８に供給される。
試料は通常、有機溶媒等の液体に溶解された試料溶液の状態で供給され、試料インジェクタ３６のサンプルループに満たされる。その後、試料インジェクタの高圧バルブを切り換えることにより、サンプルループが移動相の流路内に導入され、結果として前記試料溶液が流路内に導入される。このとき、試料溶液が配管内を満たし、移動相流路に試料バンドを形成する。これにより、その後、試料溶液は前記試料バンドとしてカラムトップに到達するため、カラムトップにおける試料溶液濃度は必然的に極めて高くなる。
The preparative SFC apparatus shown in the figure includes a supercritical fluid supply unit 12 that supplies a supercritical fluid, a modifier supply unit 14 that supplies an auxiliary solvent, an accumulator 16 that mixes the supercritical fluid and the auxiliary solvent, A sample injection unit 18 including a sample injector 36, a sample separation unit 20 including a column 38, a detection unit 22, and an automatic back pressure adjustment valve 24 are provided.
The supercritical fluid supply unit 12 includes a carbon dioxide cylinder 26, a pump 28 that boosts and feeds the carbon dioxide supplied from the cylinder 26, and a circulating thermostatic chamber 30 that performs constant temperature. The modifier supply unit 14 includes a modifier solvent container 32 and a pump 34 that pressurizes and feeds the modifier. Then, the supercritical fluid and the auxiliary solvent from each of the supply units 12 and 14 become a fluid having a composition ratio corresponding to the flow rate ratio of each of the pumps 28 and 34, and are mixed by the accumulator 16 to the sample injection unit 18 as a mobile phase. Supplied.
The sample is usually supplied in the state of a sample solution dissolved in a liquid such as an organic solvent and filled in the sample loop of the sample injector 36. Thereafter, by switching the high-pressure valve of the sample injector, the sample loop is introduced into the flow path of the mobile phase, and as a result, the sample solution is introduced into the flow path. At this time, the sample solution fills the pipe and forms a sample band in the mobile phase flow path. Thereby, since the sample solution subsequently reaches the column top as the sample band, the sample solution concentration at the column top inevitably becomes extremely high.
すなわち、上記のような従来システムの場合、カラムにおいて、本来は各ポンプ２８，３４の流量比に応じた組成比の流体で試料の展開が行なわれるべきところ、溶出力の強い試料溶液の溶媒濃度が高くなるため、一部試料の保持時間が短くなる。ゆえに、カラムから溶出するピークはリーディングし、ピークの立ち上がりから、立下がりまでの時間が長くなってしまうことがあった。このようなリーディングは、導入する試料溶液が増えるにしたがって顕著となり、同一絶対量の試料を、少量の溶媒に溶解させて導入した場合には分離したピークが得られるものの、同試料を多量の溶媒に溶解させて導入するとピークが不分離となってしまう場合があった。
したがって、カラムに導入時における移動相に対する試料溶液の濃度を調整し、ピークの立ち上がり及び立下がり時間を短くすることは、ＳＦＣにおける測定精度の向上に繋がるものとして、その解決手段が検討されてきた。また、分取精製の観点においても、前記リーディングが解消すれば高濃度の回収物が得られることとなり、別途条件を調整して分離時間を短縮すれば、生産性を劇的に向上させることが可能となる。さらに、試料成分を高濃度で回収することができれば、その後の蒸散、濃縮等の工程を大幅に短縮することも可能となる。
That is, in the case of the conventional system as described above, the sample should be developed with a fluid having a composition ratio corresponding to the flow rate ratio of each pump 28, 34 in the column. Therefore, the holding time of some samples is shortened. Therefore, the peak eluting from the column is leading, and the time from the rise of the peak to the fall may be long. Such reading becomes more prominent as the sample solution to be introduced increases. When the same absolute amount of sample is dissolved and introduced in a small amount of solvent, a separated peak is obtained. When dissolved and introduced in, the peak may not be separated.
Therefore, adjusting the concentration of the sample solution with respect to the mobile phase at the time of introduction into the column and shortening the rise and fall times of the peak will lead to the improvement of measurement accuracy in SFC, and its solution has been studied. . Also, from the viewpoint of preparative purification, if the reading is resolved, a high concentration of recovered material can be obtained. If the separation time is shortened by adjusting the conditions separately, productivity can be dramatically improved. It becomes possible. Furthermore, if sample components can be recovered at a high concentration, the subsequent steps such as transpiration and concentration can be greatly shortened.
このような問題を解決する手段として、例えば、サンプルを注入する注入器（シリンジポンプ）を補助溶媒のポンプラインに接続し、サンプルの溶解溶媒の影響を極力少なくする方法が開示されている（特許文献１）。しかしながら、この方法は、補助溶媒の流量が低いと、試料の導入に時間がかかってしまうため、結果的にピークが広がってしまい、分取時間を大きくとらなければならなかった。
また、特許文献２には、試料導入ポンプを別途設け、試料を注入する方法が開示されている。この方法によれば、圧力変動を伴わずに試料溶解溶媒を補助溶媒に代えて移動相に供給することができるため、分離に悪影響を与える移動相の組成比変化を防ぐことができる。一般的に補助溶媒比率は０．１〜１．０％程度と主たる移動相に対して相当に低いため、主たる移動相を送液するポンプに対して、流量の少ない安価なポンプを試料導入用に用いることも可能ではあるが、リーディングが十分に抑制された測定を行なうには高価な高速高耐圧ポンプを設置しなければならず、性能の高いＳＦＣシステムの構築には多大なコストを要するものであった。
As a means for solving such a problem, for example, a method is disclosed in which an injector (syringe pump) for injecting a sample is connected to a pump line of an auxiliary solvent so as to minimize the influence of the dissolution solvent of the sample (patent) Reference 1). However, in this method, when the flow rate of the auxiliary solvent is low, it takes a long time to introduce the sample. As a result, the peak spreads, and it is necessary to increase the fractionation time.
Patent Document 2 discloses a method of injecting a sample by separately providing a sample introduction pump. According to this method, since the sample dissolution solvent can be supplied to the mobile phase instead of the auxiliary solvent without causing pressure fluctuation, it is possible to prevent a change in the composition ratio of the mobile phase that adversely affects the separation. In general, the auxiliary solvent ratio is about 0.1 to 1.0%, which is considerably low with respect to the main mobile phase. Therefore, an inexpensive pump with a small flow rate is used for sample introduction compared to the pump that sends the main mobile phase. Although it is possible to use it for measurement, an expensive high-speed high-pressure pump must be installed to perform reading with sufficiently suppressed reading, and construction of a high-performance SFC system requires a great deal of cost Met.
本発明はこれらの問題に鑑みてなされたものであり、超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料分離ピークのリーディングが少なく、クロマトグラフ測定精度及び分取精製の生産性に優れた超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料注入装置及び試料注入方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of these problems, and there are few readings of sample separation peaks in supercritical fluid chromatography, and samples in supercritical fluid chromatography excellent in chromatographic measurement accuracy and preparative purification productivity. An object is to provide an injection apparatus and a sample injection method.
前記課題を解決するために本発明者等が鋭意検討を行なった結果、超臨界流体供給部から供給される超臨界流体と、モディファイア供給部から供給される補助溶媒（モディフィア）とを混合して移動相とし、移動相がカラムトップに至るまでの流路において、該流路の上流から下流にバイパス流路を設置し、バイパス流路に移動相を流しながら主流路より試料溶液を注入することによって、カラムトップにおける試料溶液濃度を低下せしめ、延いては分離ピークのリーディングの抑制が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies by the present inventors in order to solve the above problems, a supercritical fluid supplied from a supercritical fluid supply unit and an auxiliary solvent (modifier) supplied from a modifier supply unit are mixed. In the flow path until the mobile phase reaches the column top, a bypass flow path is installed from upstream to downstream of the flow path, and the sample solution is injected from the main flow path while flowing the mobile phase through the bypass flow path. As a result, it was found that the concentration of the sample solution at the column top was lowered, and consequently, the reading of the separation peak was suppressed, and the present invention was completed.
すなわち、本発明にかかる試料注入装置は、超臨界流体を供給する超臨界流体供給部と、前記超臨界流体を含む移動相中へ試料溶液を注入する試料インジェクタを含む試料注入部と、カラムを含む試料分離部とを備え、
超臨界流体供給部より送出される超臨界流体を含む移動相が試料インジェクタを経てカラムへ至る流路が配された超臨界流体クロマトグラフィー装置における試料注入装置であって、
前記流路において、前記試料インジェクタを迂回するバイパス流路が設置されていることを特徴とする。
前記装置において、前記バイパス流路上に、該バイパス流路における移動相の流量を制御する高圧バルブを備えることが好適である。
前記装置において、前記バイパス流路上に、該バイパス流路における移動相の流量を制御する可変式リストリクタを備えることが好適である。
前記装置において、前記バイパス流路上に、該バイパス流路における移動相の流量を制御する温度調節器を備えることが好適である。
前記装置において、前記バイパス流路上に、該バイパス流路へ溶媒を供給する液体インジェクタを備えることが好適である。
That is, a sample injection apparatus according to the present invention includes a supercritical fluid supply unit that supplies a supercritical fluid, a sample injection unit that includes a sample injector that injects a sample solution into the mobile phase including the supercritical fluid, and a column. A sample separation unit including
A sample injection device in a supercritical fluid chromatography apparatus in which a mobile phase containing a supercritical fluid delivered from a supercritical fluid supply unit is provided with a flow path leading to a column via a sample injector,
In the flow path, a bypass flow path that bypasses the sample injector is provided.
In the apparatus, it is preferable that a high pressure valve for controlling a flow rate of a mobile phase in the bypass channel is provided on the bypass channel.
In the apparatus, it is preferable that a variable restrictor for controlling a flow rate of a mobile phase in the bypass channel is provided on the bypass channel.
In the apparatus, it is preferable that a temperature controller for controlling a flow rate of a mobile phase in the bypass channel is provided on the bypass channel.
In the apparatus, it is preferable that a liquid injector for supplying a solvent to the bypass channel is provided on the bypass channel.
また、本発明にかかる試料注入方法は、超臨界流体を含む移動相に注入した試料溶液を、移動相流路に導通したカラムにおいて分離する超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料注入方法であって、
前記移動相流路の主流路と、その上下流を接続するバイパス流路とを通じてカラムへ移動相を供給する工程と、
前記バイパス流路によって迂回された主流路へ試料溶液を注入する工程と、
を含むことを特徴とする。
前記方法は、前記バイパス流路において、移動相の流量を制御することが好適である。
前記方法は、試料溶液を注入する工程において、前記バイパス流路から試料の溶出力の低い溶媒を注入することが好適である。
The sample injection method according to the present invention is a sample injection method in supercritical fluid chromatography, in which a sample solution injected into a mobile phase containing a supercritical fluid is separated in a column connected to the mobile phase flow path,
Supplying the mobile phase to the column through the main flow path of the mobile phase flow path and a bypass flow path connecting the upstream and downstream thereof;
Injecting a sample solution into the main channel bypassed by the bypass channel;
It is characterized by including.
In the method, it is preferable to control the flow rate of the mobile phase in the bypass channel.
In the method, injecting a sample solution, it is preferable to inject a solvent having a low sample dissolution power from the bypass channel.
本発明によれば、設置が容易で、且つ安価な構成によって超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料分離ピークのリーディングを低減し、その測定精度及び分取精製の生産性を著しく改善することができる。 According to the present invention, the reading of the sample separation peak in supercritical fluid chromatography can be reduced by an easy-to-install and inexpensive structure, and the measurement accuracy and productivity of preparative purification can be remarkably improved.
本発明にかかる試料注入装置は、超臨界流体を供給する超臨界流体供給部と、補助溶媒を供給するモディファイア供給部と、試料インジェクタを含む試料注入部と、カラムを含む試料分離部を備えた一般的な超臨界流体クロマトグラフィー装置において、超臨界流体供給部より送出される超臨界流体が、試料インジェクタを経てカラムへ至る流路に設置される。前記流路は、試料インジェクタが設置された主流路と、試料インジェクタを迂回するように主流路の上下流を接続するバイパス流路とを有する。
本発明にかかる装置への試料注入に際しては、前記主流路及びバイパス流路の両方を通じてカラムへ移動相を供給し続けながら、主流路に設置された試料インジェクタから試料溶液を注入することが好ましい。
A sample injection apparatus according to the present invention includes a supercritical fluid supply unit that supplies a supercritical fluid, a modifier supply unit that supplies an auxiliary solvent, a sample injection unit that includes a sample injector, and a sample separation unit that includes a column. In a typical supercritical fluid chromatography apparatus, a supercritical fluid delivered from a supercritical fluid supply unit is installed in a flow path leading to a column through a sample injector. The flow path has a main flow path in which a sample injector is installed and a bypass flow path that connects upstream and downstream of the main flow path so as to bypass the sample injector.
When injecting the sample into the apparatus according to the present invention, it is preferable to inject the sample solution from the sample injector installed in the main channel while continuing to supply the mobile phase to the column through both the main channel and the bypass channel.
本発明にかかる超臨界流体クロマトグラフィー装置における試料注入装置の構成を具体的に説明する。
本発明にかかる試料注入装置を備えた超臨界流体クロマトグラフィー装置の構成例を図２に示す。同図に示す超臨界流体クロマトグラフィー装置は、超臨界流体を供給する超臨界流体供給部１２と、補助溶媒を供給するモディファイア供給部１４と、超臨界流体と補助溶媒を混合するアキュムレーター１６と、試料インジェクタ３６を含む試料注入部１８と、カラム３８を含む試料分離部２０と、検出部２２と、自動背圧調整弁２４とを備える。
そして、前記超臨界流体供給部１２は、二酸化炭素ボンベ２６と、該ボンベ２６から供給される二酸化炭素を昇圧送給するポンプ２８及び定温化する循環恒温槽３０とを備える。また、前記モディファイア供給部１４は、モディファイア溶媒容器３２と、モディファイアを昇圧送給するポンプ３４を備える。そして、各供給部１２，１４からの超臨界流体及び補助溶媒は、各ポンプ２８，３４の流量比に応じた組成比の流体となり、アキュムレーター１６で混合され、移動相として試料注入部１８に供給される。試料注入部１８において、前記移動相流路は主流路及び、該主流路の上下流を接続するバイパス流路４０によって構成され、主流路に試料を注入するための試料インジェクタ３６が設置されている。
The configuration of the sample injection device in the supercritical fluid chromatography device according to the present invention will be specifically described.
A configuration example of a supercritical fluid chromatography apparatus equipped with a sample injection device according to the present invention is shown in FIG. The supercritical fluid chromatography apparatus shown in the figure includes a supercritical fluid supply unit 12 that supplies a supercritical fluid, a modifier supply unit 14 that supplies an auxiliary solvent, and an accumulator 16 that mixes the supercritical fluid and the auxiliary solvent. A sample injection unit 18 including a sample injector 36, a sample separation unit 20 including a column 38, a detection unit 22, and an automatic back pressure adjusting valve 24.
The supercritical fluid supply unit 12 includes a carbon dioxide cylinder 26, a pump 28 that boosts and feeds the carbon dioxide supplied from the cylinder 26, and a circulating thermostatic chamber 30 that performs constant temperature. The modifier supply unit 14 includes a modifier solvent container 32 and a pump 34 that pressurizes and feeds the modifier. Then, the supercritical fluid and the auxiliary solvent from each of the supply units 12 and 14 become a fluid having a composition ratio corresponding to the flow rate ratio of each of the pumps 28 and 34, and are mixed by the accumulator 16 to the sample injection unit 18 as a mobile phase. Supplied. In the sample injection unit 18, the mobile phase flow path is constituted by a main flow path and a bypass flow path 40 connecting the upstream and downstream of the main flow path, and a sample injector 36 for injecting a sample into the main flow path is installed. .
本発明において試料は、有機溶媒等の液体に溶解された試料溶液の状態で供給され、試料インジェクタ３６のサンプルループに満たされる。その後、試料インジェクタ３６の高圧バルブを切り換えることにより、サンプルループが移動相の流路内に導入され、結果として前記試料溶液が流路内に導入される。
前記試料溶液注入時において、超臨界流体供給部１２より供給される超臨界流体と、モディファイア供給部１４より供給される補助溶媒は、アキュムレーター１６において混合された移動相として、試料インジェクタ３６が設置された主流路と、バイパス流路４０の両方に供給される。この構成により、主流路のサンプルループ内の試料溶液と、バイパス流路に供給される移動相（超臨界流体及び補助溶媒）の混合流体がカラム３８へ導入され、カラムトップにおける試料溶液の濃度を下げることができる。よって、試料を溶解する溶媒によるピークのリーディングを防ぎ、ピークの立ち上がりから立ち下がりまでの時間を短縮し、試料分取の生産性を著しく向上することが可能となる。
カラム３８によって分離された試料成分は、背圧調整弁２４から溶出され、これをフラクションコレクタ等で収集することにより分取することができる。
In the present invention, the sample is supplied in the form of a sample solution dissolved in a liquid such as an organic solvent and filled in the sample loop of the sample injector 36. Thereafter, by switching the high pressure valve of the sample injector 36, the sample loop is introduced into the flow path of the mobile phase, and as a result, the sample solution is introduced into the flow path.
When the sample solution is injected, the supercritical fluid supplied from the supercritical fluid supply unit 12 and the auxiliary solvent supplied from the modifier supply unit 14 are mixed by the sample injector 36 as a mobile phase mixed in the accumulator 16. It is supplied to both the installed main flow path and the bypass flow path 40. With this configuration, a mixed fluid of the sample solution in the sample loop of the main channel and the mobile phase (supercritical fluid and auxiliary solvent) supplied to the bypass channel is introduced into the column 38, and the concentration of the sample solution at the column top is reduced. Can be lowered. Therefore, it is possible to prevent the reading of the peak due to the solvent that dissolves the sample, shorten the time from the rise to the fall of the peak, and remarkably improve the productivity of the sample sorting.
The sample component separated by the column 38 is eluted from the back pressure regulating valve 24 and can be collected by collecting it with a fraction collector or the like.
次に、本発明にかかる試料注入装置における試料溶液の注入方法について説明する。
図３は、図２に示す本発明にかかる超臨界流体クロマトグラフィー装置の本発明に相当する試料注入部１８において、試料溶液が注入される段階を模式的に表したものである。
図３（ａ）は、アキュムレーター１６を経た移動相が主流路及びバイパス流路４０を通ってカラムへ流れる様子を示している。図中の矢印は移動相の流れる方向、斜線は移動相を表す。
図３（ｂ）は、（ａ）に試料溶液を注入した直後の様子を示している。すなわち、試料インジェクタ３６のサンプルループ内の試料溶液が移動相に供給されると、流路内が試料溶液で満たされ、図中に黒く示す試料バンドが形成される。従来の装置では、試料溶液がこのようなバンド状態でカラムトップへ導入されるため、試料を溶解している溶媒の影響を大きく受け、測定時にリーディングが生じることがあった。
一方、本発明にかかる装置においては、図３（ｃ）に示すように、試料バンドがバイパス流路４０の合流点に至ると、該バイパス流路より流入する移動相と試料溶液が混合され、両者が共にカラムへ導入されることになるため、カラムトップにおける試料溶液の濃度が従来に比べ大幅に低減される。このような機序に基づき、本発明にかかる試料注入装置によって、試料を溶解している溶媒に起因するリーディングを抑制することが可能となる。
Next, a sample solution injection method in the sample injection apparatus according to the present invention will be described.
FIG. 3 schematically shows a stage in which a sample solution is injected in the sample injection section 18 corresponding to the present invention of the supercritical fluid chromatography apparatus according to the present invention shown in FIG.
FIG. 3A shows a state in which the mobile phase that has passed through the accumulator 16 flows to the column through the main channel and the bypass channel 40. The arrows in the figure indicate the direction in which the mobile phase flows, and the diagonal lines indicate the mobile phase.
FIG. 3B shows a state immediately after the sample solution is injected into FIG. That is, when the sample solution in the sample loop of the sample injector 36 is supplied to the mobile phase, the flow path is filled with the sample solution, and a sample band shown in black in the figure is formed. In the conventional apparatus, since the sample solution is introduced into the column top in such a band state, it is greatly affected by the solvent dissolving the sample, and reading may occur during measurement.
On the other hand, in the apparatus according to the present invention, as shown in FIG. 3 (c), when the sample band reaches the confluence of the bypass channel 40, the mobile phase and the sample solution flowing in from the bypass channel are mixed, Since both are introduced into the column, the concentration of the sample solution at the column top is greatly reduced compared to the conventional case. Based on such a mechanism, the reading due to the solvent dissolving the sample can be suppressed by the sample injection device according to the present invention.
また、本発明にかかる超臨界流体クロマトグラフィー装置における試料注入装置は、前記バイパス流路４０に移動相の流路抵抗調整手段を設置し、バイパス流路から主流路の試料溶液に合流する移動相の流量を制御することもできる。バイパス流路における移動相流量を制御した分、主流量の流量が変化するため、カラムへ供給される移動相の流量は一定となる。また、本手段によって、主流路に供給される試料溶液に対する移動相の流量を調節することができるため、クロマトグラム測定条件、試料及びその溶媒の種類や量等に応じた濃度の試料溶液をカラムへ導入することが可能となる。
本発明における前記流路抵抗調整手段としては、例えば図４（ａ）〜（ｃ）に示す構造を挙げることができる。
なお、図４は、図２の試料注入部１８において、試料インジェクタ３６を備えた主流路を迂回するバイパス流路４０上に、（ａ）〜（ｃ）の各流路抵抗調整手段を設置したことを示している。
In the sample injection device in the supercritical fluid chromatography device according to the present invention, a mobile phase flow resistance adjusting means is installed in the bypass flow path 40, and the mobile phase merges with the sample solution in the main flow path from the bypass flow path. It is also possible to control the flow rate. Since the flow rate of the main flow rate is changed by the amount of control of the mobile phase flow rate in the bypass flow path, the flow rate of the mobile phase supplied to the column is constant. In addition, since the flow rate of the mobile phase relative to the sample solution supplied to the main channel can be adjusted by this means, the sample solution having a concentration corresponding to the chromatogram measurement conditions, the type and amount of the sample and its solvent, etc. It becomes possible to introduce to.
Examples of the flow path resistance adjusting means in the present invention include the structures shown in FIGS.
In FIG. 4, in the sample injection unit 18 of FIG. 2, the flow path resistance adjusting means (a) to (c) are installed on the bypass flow path 40 that bypasses the main flow path provided with the sample injector 36. It is shown that.
図４（ａ）は、１ ｉｎ ６ ｏｕｔ高圧バルブ４２を、バイパス流路４０に２台向き合わせて設置し、流路抵抗の異なる配管６本を各高圧バルブの６つのｏｕｔポートにそれぞれ接続したものである。すなわち、各高圧バルブのｉｎポートは、バイパス流路に接続されている。このように設置された２台の高圧バルブ４２は、それぞれ付属のモーターにより６つのバルブ位置を切り換えることが可能であり、２台を同期して作用させることで流路抵抗の異なる６つの流路を自動選択することができる。すなわち、流路抵抗の異なる６つの流路を選択することにより、バイパス流路４０から主流路に流入する移動相の流量として、実施するクロマトグラム測定に適した条件を決定することができる。 In FIG. 4A, two 1 in 6 out high pressure valves 42 are installed facing the bypass flow path 40, and six pipes having different flow path resistances are connected to the six out ports of each high pressure valve. Is. That is, the in port of each high pressure valve is connected to the bypass flow path. The two high-pressure valves 42 installed in this way can switch the position of the six valves by an attached motor, respectively, and the six flow paths having different flow resistances can be obtained by synchronizing the two units. Can be selected automatically. That is, by selecting six channels having different channel resistances, conditions suitable for the chromatogram measurement to be performed can be determined as the flow rate of the mobile phase flowing from the bypass channel 40 into the main channel.
図４（ｂ）は、バイパス流路４０内に流路抵抗調整手段として、可変式リストリクタ４４を設置したものである。アキュムレーター１６において混合され、バイパス流路４０に供給された移動相は、可変式リストリクタの絞り弁開度によって調整された流量で試料溶液が導入された主流路へ供給される。このような可変式リストリクタとしては、流路抵抗の調整をより容易とする点から、特に自動可変式の絞り弁の適用が好ましい。 FIG. 4B shows a variable restrictor 44 installed as a flow path resistance adjusting means in the bypass flow path 40. The mobile phase mixed in the accumulator 16 and supplied to the bypass channel 40 is supplied to the main channel into which the sample solution has been introduced at a flow rate adjusted by the throttle valve opening of the variable restrictor. As such a variable restrictor, it is particularly preferable to apply an automatic variable throttle valve from the viewpoint of facilitating the adjustment of flow path resistance.
図４（ｃ）は、バイパス流路４０に流路抵抗調整手段として、温度調節器４６を設置したものである。超臨界流体クロマトグラフィーにおいては、移動相として超臨界流体が大きな比率を占めている。超臨界流体は、温度により粘性が大きく変化する性質を有しているため、この粘性変化を流路抵抗として利用することができる。このような温度調節器としては、特にヒーターを用い、加温に伴う流体粘性の変化度合いを調整することによって流路抵抗を制御することが好ましい。 FIG. 4C shows a case where a temperature controller 46 is installed in the bypass channel 40 as channel resistance adjusting means. In supercritical fluid chromatography, a supercritical fluid accounts for a large proportion as a mobile phase. Since the supercritical fluid has a property that the viscosity largely changes depending on the temperature, this viscosity change can be used as the flow path resistance. As such a temperature controller, it is preferable to control the flow path resistance by adjusting the degree of change in fluid viscosity accompanying heating, particularly using a heater.
さらに、本発明にかかる超臨界流体クロマトグラフィー装置おいては、上記した移動相の流路抵抗調整手段のほかに、バイパス流路４０から移動相中へ別途溶媒を注入し、これを試料溶液とともにカラムへ導入することによって、試料溶液による測定への影響を抑えることもできる。
図４（ｄ）は、主流路における試料インジェクタ３６とは別に、バイパス流路４０上に液体インジェクタ４８を設置した装置を示している。本発明において、主流路に設置した試料インジェクタ３６は、試料溶液注入用として使用するものであるが、バイパス流路４０に設置した液体インジェクタ４８は、試料の溶出力が弱い溶媒を導入するために設置されたものである。
例えば、液体インジェクタ４８のサンプルループを、試料インジェクタ３６のサンプルループの２倍とし、そのループ内には測定試料の溶出力が弱い溶媒を充填しておく。液体インジェクタ４８のサンプルループ内の溶媒の１／４が移動相へ流れ出すタイミングで、主流路の試料インジェクタ３６を作動させ、試料溶液の導入を開始する。すると、試料インジェクタ３６のサンプルループの試料溶液が全て移動相へ流れ出すタイミングは、液体インジェクタ４８のサンプルループ内の溶媒の３／４が流出したタイミングとなり、それ以降は液体インジェクタ４８のサンプルループ内の溶媒の１／４が、カラムへ向けて流れ出すことになる。すなわち、試料インジェクタ３６より注入された試料溶液の前後及び注入中に溶出力の弱い溶媒が一緒にカラムへ導入されることとなり、カラムトップにおける試料を溶解している溶媒によるリーディングが抑制される。
Furthermore, in the supercritical fluid chromatography apparatus according to the present invention, in addition to the above-described flow path resistance adjusting means of the mobile phase, a solvent is separately injected from the bypass flow path 40 into the mobile phase, and this is combined with the sample solution. By introducing into the column, the influence on the measurement by the sample solution can be suppressed.
FIG. 4D shows an apparatus in which a liquid injector 48 is installed on the bypass channel 40 separately from the sample injector 36 in the main channel. In the present invention, the sample injector 36 installed in the main channel is used for sample solution injection, but the liquid injector 48 installed in the bypass channel 40 introduces a solvent having a weak sample elution power. It is installed.
For example, the sample loop of the liquid injector 48 is set to be twice the sample loop of the sample injector 36, and the loop is filled with a solvent having a weak dissolution power of the measurement sample. At the timing when 1/4 of the solvent in the sample loop of the liquid injector 48 flows out to the mobile phase, the sample injector 36 in the main flow path is activated and the introduction of the sample solution is started. Then, the timing at which all the sample solution in the sample loop of the sample injector 36 flows into the mobile phase is the timing at which 3/4 of the solvent in the sample loop of the liquid injector 48 flows out, and thereafter the timing in the sample loop of the liquid injector 48 1/4 of the solvent will flow out towards the column. That is, a solvent having a weak dissolution power is introduced into the column together with before and after the sample solution injected from the sample injector 36 and during the injection, and reading by the solvent dissolving the sample at the column top is suppressed.
また、本発明にかかる超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料注入方法は、超臨界流体を含む移動相に注入した試料溶液を、移動相流路に導通したカラムにおいて分離する超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料注入方法であって、前記移動相流路の主流路と、その上下流を接続するバイパス流路とを通じてカラムへ移動相を供給する工程と、前記バイパス流路によって迂回された主流路へ試料溶液を注入する工程とを含むものである。
本方法の具体例としては、例えば、前述の本発明にかかる試料注入装置における試料溶液の注入方法を挙げることができる。すなわち、本方法は、図３（ａ）〜（ｃ）に示すように、バイパス流路４０によって迂回された主流路、すなわち、試料インジェクタ３６に相当する部分に試料溶液を注入することを意図している。そして、前記試料溶液の注入工程においては、移動相が主流路とこれをバイパス流路の両方に供給されていることが好ましい。このような試料注入方法とすることによって、試料注入前、試料注入中、試料注入後の全てに亘り、主流路及びバイパス流路を通じて移動相を一定の流量でカラムへ送り続けることができ（図３（ａ）〜（ｃ））、クロマトグラム測定におけるリーディングの原因である試料バンドの形成を抑制することができる。また、移動相に補助溶媒を添加する場合においても、移動相中の超臨界流体と補助溶媒の組成比を、試料注入前、試料注入中、試料注入後に亘って一定に維持することができる。
Further, the sample injection method in supercritical fluid chromatography according to the present invention includes a sample injection in supercritical fluid chromatography in which a sample solution injected into a mobile phase containing a supercritical fluid is separated in a column connected to the mobile phase flow path. A method of supplying a mobile phase to a column through a main flow path of the mobile phase flow path and a bypass flow path connecting the upstream and downstream thereof, and supplying a sample solution to the main flow path bypassed by the bypass flow path Injecting.
As a specific example of this method, for example, a sample solution injection method in the above-described sample injection device according to the present invention can be mentioned. That is, this method intends to inject the sample solution into the main flow path bypassed by the bypass flow path 40, that is, the portion corresponding to the sample injector 36, as shown in FIGS. ing. In the sample solution injection step, the mobile phase is preferably supplied to both the main channel and the bypass channel. By adopting such a sample injection method, the mobile phase can be continuously sent to the column at a constant flow rate through the main channel and the bypass channel throughout the sample injection, during the sample injection, and after the sample injection (see FIG. 3 (a) to (c)), it is possible to suppress the formation of a sample band which is a cause of reading in chromatogram measurement. Further, even when the auxiliary solvent is added to the mobile phase, the composition ratio of the supercritical fluid and the auxiliary solvent in the mobile phase can be kept constant before, during, and after the sample injection.
本発明にかかる試料注入方法においては、前記バイパス流路において、移動相の流量を制御することが好適である。流量の制御は、例えば、図４の（ａ）〜（ｃ）に示すような流路抵抗調整手段をバイパス流路上に備えることによって為すことができる。バイパス流路において移動相の流量を制御することにより、カラムへ導入される試料溶液の濃度を調整し、より適切な分離条件でクロマトグラム測定を行なうことができる。 In the sample injection method according to the present invention, it is preferable to control the flow rate of the mobile phase in the bypass channel. The flow rate can be controlled, for example, by providing a channel resistance adjusting means as shown in FIGS. 4A to 4C on the bypass channel. By controlling the flow rate of the mobile phase in the bypass channel, the concentration of the sample solution introduced into the column can be adjusted, and chromatogram measurement can be performed under more appropriate separation conditions.
また、本発明にかかる試料注入方法において、バイパス流路から移動相へ試料の溶出が弱い溶媒を注入することが好適である。前記溶媒の注入は、例えば、図４の（ｄ）に示すような、液体インジェクタ４８の設置により行なうことができる。特に、主流路における試料溶液の注入時に、バイパス流路から試料の溶出力が弱い溶媒を別途注入することにより、試料溶液に起因するリーディングが抑制される。 In the sample injection method according to the present invention, it is preferable to inject a solvent having a weak sample elution from the bypass channel to the mobile phase. The injection of the solvent can be performed, for example, by installing a liquid injector 48 as shown in FIG. In particular, when the sample solution is injected into the main channel, the reading due to the sample solution is suppressed by separately injecting a solvent having a weak sample dissolution power from the bypass channel.
本発明において試料溶液とは、カラムにおいて分離する試料が適当な溶媒に溶解／分散されたものを示す。本発明において使用する溶媒の種類に制限はないが、一般に、メタノール、エタノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、水等を好適に用いることができる。
また、本発明において、試料溶液を注入する手段としては、液体クロマトグラフィーにおいて一般的に使用されるループインジェクタを用いることが好ましい。
In the present invention, the sample solution refers to a solution in which a sample to be separated in a column is dissolved / dispersed in an appropriate solvent. Although there is no restriction | limiting in the kind of solvent used in this invention, In general, methanol, ethanol, 2-propanol, acetone, acetonitrile, ethyl acetate, water, etc. can be used conveniently.
In the present invention, it is preferable to use a loop injector generally used in liquid chromatography as a means for injecting the sample solution.
なお、ＨＰＬＣの場合、移動相に液体を使用するため、測定試料は予め移動相に溶解／分散させて系内へ注入することができる。このような場合、試料溶解溶媒と移動相の試料成分の溶出力は同等となるため、カラムにおける試料成分のバンド幅は、試料の注入量のみに依存することとなる。
一方、ＳＦＣに用いられる移動相は通常、常温、大気圧下では気体であり、試料を移動相に溶解／分散させておくことができない。そのため、一般的に、試料を溶解／分散させる溶媒として、使用する移動相（超臨界流体）と相溶性のある有機溶媒が用いられている。しかし、このような場合、試料溶解溶媒と移動相の試料成分の溶出力に差異が生じ、これが試料成分のバンド幅に影響をもたらすこととなる。
In the case of HPLC, since a liquid is used for the mobile phase, the measurement sample can be previously dissolved / dispersed in the mobile phase and injected into the system. In such a case, since the dissolution power of the sample dissolution solvent and the sample component of the mobile phase are equivalent, the bandwidth of the sample component in the column depends only on the injection amount of the sample.
On the other hand, the mobile phase used for SFC is usually a gas at normal temperature and atmospheric pressure, and the sample cannot be dissolved / dispersed in the mobile phase. Therefore, in general, an organic solvent compatible with the mobile phase (supercritical fluid) to be used is used as a solvent for dissolving / dispersing the sample. However, in such a case, a difference occurs between the dissolution power of the sample dissolution solvent and the sample component of the mobile phase, which affects the bandwidth of the sample component.
クロマトグラフィーにおけるピーク幅を広げる要因としては、試料溶液の注入量、カラムへの過剰な負荷（オーバーロード）などが挙げられるが、前記した試料溶解溶媒と移動相の溶出力もまた大きな要因である。
溶媒の溶出力は、溶媒の特性に対する試料成分、固定相、移動相の関係によって表され、ＨＰＬＣにおいては、例えば溶媒の溶解パラメータδ、溶媒和パラメータ、水素結合形成能力などが用いられる。
ＳＦＣの場合は、移動相の密度が前記溶出力の重要なパラメータとなる。超臨界流体の密度は、圧力や温度の調節によって気体から液体に近い状態にまで変化させることが可能ではあるが、基本的に液体よりも低い（表１：気体、液体、超臨界流体の密度の比較）。そのため、ほとんどの場合では、試料を溶解／分散する有機溶媒の方が、超臨界流体の移動相よりも溶出力が高くなる。
したがって、ＳＦＣでは、移動相よりも溶出力の高い溶媒に溶解／分散された試料がカラム上端部で該溶媒と共に速く移動し、ピーク幅を広げてしまう傾向があった。特に、分取クロマトグラフィーのように試料溶液を大量に注入する条件では、ピークのブロードニングが生じやすくなり、分離に多大な影響が及ぶ。
このような問題に対し、本発明においては、移動相を送液しながらインラインで試料溶液を移動相（超臨界流体）へ注入し、カラムトップにおける試料溶液濃度を低下せしめたのである。
なお、既に述べたように、ＨＰＬＣにおいては、試料を溶解／分散する溶媒の種類や組成比の調整によりピークのブロードニングを抑えることが可能である。したがって、本発明にかかる方法は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）に適用することが特に好ましい。
Factors that widen the peak width in chromatography include the amount of sample solution injected, excessive load on the column (overload), and the like. The dissolution power of the sample dissolution solvent and mobile phase is also a major factor.
Solvent output of the solvent is represented by the relationship of the sample component, stationary phase, and mobile phase with respect to the characteristics of the solvent. In HPLC, for example, the solubility parameter δ of the solvent, the solvation parameter, the ability to form hydrogen bonds, and the like are used.
In the case of SFC, the density of the mobile phase is an important parameter for the dissolution power. The density of the supercritical fluid can be changed from a gas to a liquid state by adjusting the pressure and temperature, but is basically lower than the liquid (Table 1: Density of gas, liquid, and supercritical fluid) comparison). Therefore, in most cases, the organic solvent in which the sample is dissolved / dispersed has a higher dissolution power than the mobile phase of the supercritical fluid.
Therefore, in SFC, the sample dissolved / dispersed in a solvent having a higher dissolution power than the mobile phase tends to move faster together with the solvent at the upper end of the column and widen the peak width. In particular, under conditions in which a large amount of sample solution is injected as in preparative chromatography, peak broadening is likely to occur, which greatly affects separation.
In order to solve such a problem, in the present invention, the sample solution is injected into the mobile phase (supercritical fluid) in-line while feeding the mobile phase, thereby reducing the concentration of the sample solution at the column top.
As already described, in HPLC, peak broadening can be suppressed by adjusting the type and composition ratio of the solvent in which the sample is dissolved / dispersed. Therefore, the method according to the present invention is particularly preferably applied to supercritical fluid chromatography (SFC).
図５は、ＳＦＣ系の配管内における試料溶液（Ｓａｍｐｌｅ）と移動相（超臨界流体（ＣＯ２）及び補助溶媒）の組成比を模式的に示した図である。図中の矢印は試料溶液及び移動相の流動方向を示す。
図５の（ａ）〜（ｃ）は従来の超臨界流体クロマトグラフィーにおける試料溶液導入後の配管内の組成比である。
（ａ）は、移動相の流動する配管内に通常の試料インジェクタから試料溶液を注入した際の様子を表している。すなわち、注入された試料溶液は配管内にバンドを形成する。試料溶液は該バンド状態のままカラムへ至るため、試料溶液流入時のカラムトップにおける試料溶液の濃度は高くなり、試料成分の分離測定に支障をきたしてしまう。
FIG. 5 is a diagram schematically showing the composition ratio between the sample solution (Sample) and the mobile phase (supercritical fluid (CO 2 ) and auxiliary solvent) in the SFC piping. The arrows in the figure indicate the flow directions of the sample solution and the mobile phase.
(A) to (c) in FIG. 5 are composition ratios in the pipe after introducing the sample solution in the conventional supercritical fluid chromatography.
(A) represents the state at the time of inject | pouring a sample solution from a normal sample injector in the piping through which a mobile phase flows. That is, the injected sample solution forms a band in the pipe. Since the sample solution reaches the column in the band state, the concentration of the sample solution at the column top when the sample solution flows in becomes high, which hinders the separation measurement of the sample components.
（ｂ）は、サンプルを注入する注入器（シリンジポンプ）を補助溶媒のポンプラインに接続し、サンプルの溶解溶媒の影響を極力少なくした方法（米国特許番号６，５７６，１２５号公報）を適用した際の様子を表している。前記方法では、注入された試料溶媒が補助溶媒と同一の流速でカラムに到達する。試料注入に必要な時間は、補助溶媒の流量に依存する。補助溶媒の流量は、全体の流量に比べて非常に低いため、試料注入に必要な時間は極端に長い。したがって、注入時間を短くするためには補助溶媒流量を高くする必要があるが、そうすると系における補助溶媒の組成比が変化し、カラムの分離条件が大きく変わってしまう。すなわち、この方法では試料注入時間と分離条件が相互に作用するため、配管における試料溶液及び移動相の組成比の調整により分離ピーク形状を改善する場合、調整における自由度は大幅に制限されてしまう。
なお、この方法では、試料注入時にのみ補助溶媒の流量を高くすることも考えられるが、高圧高流量のポンプを要する上、通常の高圧ポンプ性能を考慮すれば、注入時間を大幅に短縮することは困難である。
(B) applies a method (US Pat. No. 6,576,125) in which an injector (syringe pump) for injecting a sample is connected to the auxiliary solvent pump line to minimize the influence of the dissolved solvent of the sample. It shows the situation when it was done. In the method, the injected sample solvent reaches the column at the same flow rate as the auxiliary solvent. The time required for sample injection depends on the flow rate of the auxiliary solvent. Since the flow rate of the auxiliary solvent is very low compared to the overall flow rate, the time required for sample injection is extremely long. Therefore, in order to shorten the injection time, it is necessary to increase the auxiliary solvent flow rate. However, in this case, the composition ratio of the auxiliary solvent in the system changes, and the separation conditions of the column greatly change. That is, in this method, the sample injection time and the separation conditions interact with each other. Therefore, when the separation peak shape is improved by adjusting the composition ratio of the sample solution and the mobile phase in the piping, the degree of freedom in adjustment is greatly limited. .
In this method, it is possible to increase the flow rate of the auxiliary solvent only at the time of sample injection, but it requires a high-pressure and high-flow rate pump, and if the normal high-pressure pump performance is taken into consideration, the injection time can be greatly shortened. It is difficult.
（ｃ）は、試料導入ポンプを別途設け、試料を注入する方法（特開２００６−６４５６６号公報）を適用した際の様子を表している。この方法も前記と同様、補助溶媒側流路に試料溶液を注入するものであるため、配管内の組成比は（ｂ）と同じ模式図となる。なお、この方法においても、前記理由から試料注入時のみ補助溶媒／試料溶液導入ポンプの流量を高くすることは難しい。 (C) shows a state where a sample introduction pump is separately provided and a method of injecting a sample (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-64566) is applied. Similarly to the above, this method also injects the sample solution into the auxiliary solvent side channel, so that the composition ratio in the pipe is the same schematic diagram as in (b). Even in this method, it is difficult to increase the flow rate of the auxiliary solvent / sample solution introduction pump only at the time of sample injection for the reason described above.
（ｄ）は、本発明の方法を適用した際の配管内の様子である。すなわち、移動相中に試料溶液が導入された主流路側の組成と、移動相を流通するバイパス側の組成が合流し、図５の（ｄ）−１に示す組成が形成される。（ｄ）−２は、（ｄ）−１の補助溶媒を合わせて表した実組成比を表している。同図に示すように、本発明では、主流路側においてもバイパス側においても流量の調整を必要としないため、試料溶液の注入に高圧高流量ポンプを用いることなく測定に好適な組成比を達成することができる。 (D) is a state in the pipe when the method of the present invention is applied. That is, the composition on the main channel side where the sample solution is introduced into the mobile phase and the composition on the bypass side that flows through the mobile phase merge to form the composition shown in FIG. (D) -2 represents the actual composition ratio expressed together with the auxiliary solvent of (d) -1. As shown in the figure, the present invention does not require flow rate adjustment on either the main flow path side or the bypass side, so that a composition ratio suitable for measurement is achieved without using a high-pressure high-flow pump for sample solution injection. be able to.
以下に、本発明の実施例を挙げるが、これらは本発明を限定するものではない。
＜実施例１＞
図２に示す構成の超臨界流体クロマトグラフィー装置を用い、クロマトグラム測定を行なった。バイパス流路４０は、試料インジェクタ３６の上流及び下流にＴジョイントを設け、配管で接続したものとした。二酸化炭素ポンプ２８による二酸化炭素流量を４５ｍＬ／ｍｉｎ、モディファイアポンプ３４による補助溶媒（メタノール）流量を５ｍＬ／ｍｉｎとしてそれぞれ送液し、該組成比の移動相が等分配比で試料インジェクタ３６とバイパス流路４０それぞれに流れるように、バイパス管を選択・設置した。前記移動相送液状態で、インジェクタ３６より試料溶液１０００μＬを注入した。その後、通常の動作により、試料についてクロマトグラム測定を行なった。結果を図６に示す。
なお、試料溶液は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル１．５ｍｇ／ｍＬメタノール溶液を使用した。カラム３８は、内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍの充填カラムであり、充填剤はシリカを用いた。
図６（ａ）は、実施例１の測定結果および下記比較例１の測定結果を重ねて示したグラフであり、図６（ｂ）は（ａ）のピーク立ち上がり、立ち下がり部分を拡大したものである。図６に示すとおり、バイパス流路を備えた本発明にかかる装置を用いることにより、バイパスを備えない装置を用いた比較例１に比して、ピークの立ち上がりから立ち下がりまでの時間が１．６分から１．２５分と約２２％短縮された。
したがって、本発明にかかる超臨界流体クロマトグラフィー装置は、容易且つ安価な構成によってクロマトグラムにおけるリーディングを抑制することができ、測定精度及び分離能において優れたものであることが明らかである。
Examples of the present invention will be given below, but these do not limit the present invention.
<Example 1>
Chromatogram measurement was performed using the supercritical fluid chromatography apparatus having the configuration shown in FIG. The bypass flow path 40 was provided with T joints upstream and downstream of the sample injector 36 and connected by piping. The carbon dioxide flow rate by the carbon dioxide pump 28 is 45 mL / min, the auxiliary solvent (methanol) flow rate by the modifier pump 34 is 5 mL / min, and the mobile phase having the composition ratio is bypassed from the sample injector 36 at an equal distribution ratio. A bypass pipe was selected and installed to flow in each of the flow paths 40. In the mobile phase feeding state, 1000 μL of the sample solution was injected from the injector 36. Then, the chromatogram measurement was performed about the sample by normal operation | movement. The results are shown in FIG.
The sample solution used was a 1.5 mg / mL methanol solution of ethyl p-hydroxybenzoate. The column 38 was a packed column having an inner diameter of 20 mm and a length of 250 mm, and silica was used as the filler.
FIG. 6A is a graph showing the measurement result of Example 1 and the measurement result of Comparative Example 1 below. FIG. 6B is an enlarged view of the peak rising and falling portions of FIG. It is. As shown in FIG. 6, by using the apparatus according to the present invention having a bypass flow path, the time from the rise to the fall of the peak is 1. It was shortened by about 22% from 6 minutes to 1.25 minutes.
Therefore, it is clear that the supercritical fluid chromatography apparatus according to the present invention can suppress reading in the chromatogram with an easy and inexpensive configuration, and is excellent in measurement accuracy and resolution.
＜比較例１＞
図１に示す一般的な超臨界流体クロマトグラフィー装置、すなわち、バイパス流路を備えない装置を用いた以外は実施例１と同様の条件で操作及びクロマトグラム測定を行なった。
<Comparative Example 1>
The operation and chromatogram measurement were performed under the same conditions as in Example 1 except that the general supercritical fluid chromatography apparatus shown in FIG. 1, that is, an apparatus without a bypass channel was used.
＜比較例２＞
図１に示す一般的な超臨界流体クロマトグラフィー装置を用い、クロマトグラム測定を行なった。二酸化炭素ポンプ２８による二酸化炭素流量を６０ｍＬ／ｍｉｎ、モディファイアポンプ３４による補助溶媒（メタノール）流量を５ｍＬ／ｍｉｎとしてそれぞれ送液し、該組成比の移動相によりシステム内が満たされた状態でインジェクタ３６より試料溶液１０００μＬを注入した。その後、通常の操作により、試料についてクロマトグラム測定を行なった。結果を図７に示す。
なお、試料溶液は、カフェイン０．３ｍｇ／ｍＬメタノール溶液を使用した。カラム３８は、内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍの充填カラムであり、充填剤はシリカを用いた。
図７に示すとおり、一般的な超臨界クロマトグラフィー装置を用いて測定したクロマトグラムは、ピークトップに対して前方にピークが広がるピークリーディングが顕著に現れた。このときのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの時間は４５秒であった。
<Comparative example 2>
Chromatogram measurement was performed using the general supercritical fluid chromatography apparatus shown in FIG. The carbon dioxide flow rate by the carbon dioxide pump 28 is 60 mL / min, the auxiliary solvent (methanol) flow rate by the modifier pump 34 is 5 mL / min, and the injector is filled with the mobile phase having the composition ratio. From 36, 1000 μL of the sample solution was injected. Then, the chromatogram measurement was performed about the sample by normal operation. The results are shown in FIG.
The sample solution used was a caffeine 0.3 mg / mL methanol solution. The column 38 was a packed column having an inner diameter of 20 mm and a length of 250 mm, and silica was used as the filler.
As shown in FIG. 7, in the chromatogram measured using a general supercritical chromatography apparatus, peak reading in which the peak spreads forward with respect to the peak top appears remarkably. The time from the peak rising to the falling at this time was 45 seconds.
＜比較例３＞
比較例２において、試料注入３０秒前からモディファイアポンプ３４の流量を０．１ｍL／ｍｉｎに減少させ、カラム３８内を低モディファイア溶媒濃度の状態とした以外は同様に操作及びクロマトグラム測定を行なった。
比較例３の測定結果は、比較例２とほぼ同じであり、改善は認められなかった。
したがって、カラム内を低モディファイアの試料が保持され易い条件としても、リーディングは緩和されないことが明らかとなった。
<Comparative Example 3>
In Comparative Example 2, the operation and chromatogram measurement were performed in the same manner except that the flow rate of the modifier pump 34 was reduced to 0.1 mL / min 30 seconds before the sample injection, and the inside of the column 38 was in a low modifier solvent concentration state. I did it.
The measurement result of Comparative Example 3 was almost the same as Comparative Example 2, and no improvement was observed.
Therefore, it has been clarified that the reading is not relaxed even when the low modifier sample is easily held in the column.
＜比較例４＞
図８に示す構成の超臨界流体クロマトグラフィー装置を用い、クロマトグラム測定を行なった。前記装置は、図１のインジェクタ３６に代えて試料導入用ポンプ５０の流出口をＴジョイント５２によってカラム上流流路へ接続したものである。すなわち、試料溶液５４は試料導入用ポンプ５０に吸い上げられ、その流出口から移動相で満たされた流路へと導入される。具体的には、上記比較例２と同様の試料溶液を試料導入用ポンプ流量４ｍL／ｍｉｎとして１５秒間送液することにより、１０００μＬの試料溶液が流路へ導入された。二酸化炭素ポンプ２８及びモディファイアポンプ３４による二酸化炭素及び補助溶媒（メタノール）の流量はそれぞれ６０ｍＬ／ｍｉｎ、５ｍＬ／ｍｉｎとした。結果を図９に示す。このときのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの時間は、５８秒であった。
<Comparative example 4>
Chromatogram measurement was performed using a supercritical fluid chromatography apparatus having the configuration shown in FIG. In this apparatus, the outlet of the sample introduction pump 50 is connected to the column upstream flow path by a T joint 52 instead of the injector 36 of FIG. That is, the sample solution 54 is sucked up by the sample introduction pump 50 and introduced from the outlet to the flow path filled with the mobile phase. Specifically, 1000 μL of the sample solution was introduced into the flow path by feeding the same sample solution as in Comparative Example 2 above for 15 seconds at a sample introduction pump flow rate of 4 mL / min. The flow rates of carbon dioxide and auxiliary solvent (methanol) by the carbon dioxide pump 28 and the modifier pump 34 were 60 mL / min and 5 mL / min, respectively. The results are shown in FIG. The time from the peak rising to the falling at this time was 58 seconds.
＜比較例５＞
比較例４において、試料導入用ポンプ流量を８ｍＬ／ｍｉｎとして７．５秒間送液し、１０００μＬの試料溶液を流路へ導入した以外は同様に操作及びクロマトグラム測定を行なった。結果を図１０に示す。このときのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの時間は４７秒であった。
したがって、試料の導入をポンプを用いて行なうことにより、ピークの緩慢な立ち上がりは改善された。しかしながら、一方で比較例４、５のいずれにおいてもピークの頂点に飽和が認められた。これは、試料導入用ポンプの流量が低く、試料のカラム導入に時間がかかったためと考えられる。
以上の結果から、試料導入にポンプを使用することにより、リーディングの緩和は可能であるが、ピークの立ち上がりから立ち下がりまでの時間を短縮するには、短時間での試料導入を要することが明らかである。したがって、このような試料導入には高速送液が可能な高圧高流量ポンプが必須であり、その設置にかかるコストを考慮してもポンプの使用は非効率的であると考えられた。
<Comparative Example 5>
In Comparative Example 4, the operation and chromatogram measurement were performed in the same manner except that the sample introduction pump flow rate was 8 mL / min, the solution was fed for 7.5 seconds, and 1000 μL of the sample solution was introduced into the flow path. The results are shown in FIG. At this time, the time from the peak rising to the falling was 47 seconds.
Therefore, the slow rise of the peak was improved by introducing the sample using a pump. However, on the other hand, in any of Comparative Examples 4 and 5, saturation was observed at the peak apex. This is probably because the flow rate of the sample introduction pump was low and it took time to introduce the sample into the column.
From the above results, it is clear that reading can be reduced by using a pump for sample introduction, but it is necessary to introduce the sample in a short time to shorten the time from the rise to the fall of the peak. It is. Therefore, a high-pressure, high-flow pump capable of high-speed liquid feeding is essential for such sample introduction, and the use of the pump was considered inefficient even in consideration of the cost for installation.
＜比較例６＞
図８に示す構成の超臨界流体クロマトグラフィー装置を用い、クロマトグラム測定を行なった。二酸化炭素ポンプ２８による二酸化炭素流量を６０ｍＬ／ｍｉｎ、モディファイアポンプ３４による補助溶媒（メタノール）流量を５ｍＬ／ｍｉｎとしてそれぞれ送液し、試料溶液導入３０秒前からモディファイアポンプ３４の流量を０．１ｍL／ｍｉｎに減少させた。試料溶液の導入は、試料導入用ポンプ５０の流量を８ｍL／ｍｉｎとして７．５秒間送液することにより、１０００μＬを流路へ導入した。試料溶液の構成は比較例２と同様のものとした。結果を図１１に示す。
<Comparative Example 6>
Chromatogram measurement was performed using a supercritical fluid chromatography apparatus having the configuration shown in FIG. The carbon dioxide flow rate by the carbon dioxide pump 28 is 60 mL / min, the auxiliary solvent (methanol) flow rate by the modifier pump 34 is 5 mL / min, and the flow rate of the modifier pump 34 is 0. 30 seconds before the sample solution is introduced. Reduced to 1 mL / min. For introducing the sample solution, 1000 μL was introduced into the flow path by feeding the sample introduction pump 50 at a flow rate of 8 mL / min for 7.5 seconds. The configuration of the sample solution was the same as in Comparative Example 2. The results are shown in FIG.
＜比較例７＞
比較例６において、図８の試料導入用ポンプ５０の流量を１６ｍＬ／ｍｉｎとして３．８秒間送液し、１０００μＬの試料溶液を流路へ導入した以外は同様に操作及びクロマトグラム測定を行なった。結果を図１２に示す。
ピークの立ち上がりから立ち下がりまでの時間は、図１１において４３秒であり、図１２において４１秒であった。したがって、試料導入用ポンプによる試料溶液供給と、カラム内低モディファイア条件を併用することで、リーディング及びピークの飽和状態は他の比較例に比べて改善されたが、依然として試料導入用ポンプとして高圧高流量ポンプが必要であることは明白であり、またモディファイア組成比プログラムが必要となるため、さらに試料供給が煩雑となることが分かった。
<Comparative Example 7>
In Comparative Example 6, the operation and chromatogram measurement were performed in the same manner except that the flow rate of the sample introduction pump 50 in FIG. 8 was set to 16 mL / min and the solution was fed for 3.8 seconds and 1000 μL of the sample solution was introduced into the flow path. . The results are shown in FIG.
The time from the rise to the fall of the peak was 43 seconds in FIG. 11 and 41 seconds in FIG. Therefore, the combined use of the sample solution supply by the sample introduction pump and the low modifier condition in the column improved the leading and peak saturation states compared to other comparative examples, but it still remains as a high pressure sample introduction pump. It was clear that a high flow pump was necessary, and a modifier composition ratio program was required, which further complicated the sample supply.
以上の結果から、比較例の試料導入方法では充分満足な結果が得られないことが明らかになった。
＜実施例２＞
図２に示す超臨界流体クロマトグラフィー装置を用い、比較例２と同一の分離条件、分離システムにおいて本発明を適用した。すなわち、二酸化炭素ポンプ２８による二酸化炭素流量を６０ｍＬ／ｍｉｎ、モディファイアポンプ３４による補助溶媒（メタノール）流量を５ｍＬ／ｍｉｎとしてそれぞれ送液し、該組成比の移動相が等分配比で試料インジェクタ３６とバイパス流路４０それぞれに流れるように、バイパス管を選択・設置した。前記移動相送液状態で、インジェクタ３６より試料溶液としてカフェイン０．３ｍｇ／ｍＬメタノール溶液１０００μＬを注入した。カラム３８は、内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍの充填カラムであり、充填剤はシリカを用いた。
図１３は、実施例２及び比較例２の測定結果を重ねて示したグラフである。図１３に示すとおり、バイパス流路を備えることによって、高圧高流量のポンプを使用しなくとも、ピークの立ち上がりから立ち下がりまでの時間は４５秒から３６秒と大幅に短縮した。
これらの結果から、本発明にかかる試料注入装置は、ピークのリーディングを大幅に抑制し、且つ、高圧高流量ポンプにより高流量で短時間に試料導入を行なったものに相当する効果を有することが明らかである。
From the above results, it was revealed that the sample introduction method of the comparative example cannot obtain a sufficiently satisfactory result.
<Example 2>
Using the supercritical fluid chromatography apparatus shown in FIG. 2, the present invention was applied under the same separation conditions and separation system as in Comparative Example 2. That is, the carbon dioxide flow rate by the carbon dioxide pump 28 is 60 mL / min, the auxiliary solvent (methanol) flow rate by the modifier pump 34 is 5 mL / min, and the sample injector 36 has a mobile phase with the same composition ratio and a uniform distribution ratio. The bypass pipe was selected and installed so as to flow in each of the bypass flow paths 40. In the mobile phase feeding state, 1000 μL of caffeine 0.3 mg / mL methanol solution was injected from the injector 36 as a sample solution. The column 38 was a packed column having an inner diameter of 20 mm and a length of 250 mm, and silica was used as the filler.
FIG. 13 is a graph showing the measurement results of Example 2 and Comparative Example 2 in an overlapping manner. As shown in FIG. 13, by providing the bypass flow path, the time from the rise to the fall of the peak was significantly reduced from 45 seconds to 36 seconds without using a high-pressure and high-flow rate pump.
From these results, it can be seen that the sample injection device according to the present invention greatly suppresses the reading of the peak and has an effect equivalent to that obtained by introducing the sample at a high flow rate in a short time with a high-pressure high-flow pump. it is obvious.
１２ 超臨界流体供給部
１４ モディファイア供給部
１６ アキュムレーター
１８ 試料注入部
２０ 試料分離部
２２ 検出部
２４ 自動背圧調整弁
２６ 二酸化炭素ボンベ
２８ 二酸化炭素ポンプ
３０ 循環恒温槽
３２ モディファイア溶媒容器
３４ モディファイアポンプ
３６ 試料インジェクタ
３８ カラム
４０ バイパス流路
４２ 高圧バルブ
４４ 可変式リストリクタ
４６ 温度調節器
４８ 液体インジェクタ
５０ 試料導入用ポンプ
５２ Ｔジョイント
５４ 試料溶液
DESCRIPTION OF SYMBOLS 12 Supercritical fluid supply part 14 Modifier supply part 16 Accumulator 18 Sample injection part 20 Sample separation part 22 Detection part 24 Automatic back pressure control valve 26 Carbon dioxide cylinder 28 Carbon dioxide pump 30 Circulating thermostat 32 Modifier solvent container 34 Modify A pump 36 Sample injector 38 Column 40 Bypass passage 42 High pressure valve 44 Variable restrictor 46 Temperature regulator 48 Liquid injector 50 Sample introduction pump 52 T joint 54 Sample solution
Claims (8)
超臨界流体供給部より送出される超臨界流体を含む移動相が試料インジェクタを経てカラムへ至る流路が配された超臨界流体クロマトグラフィー装置における試料注入装置であって、
前記流路において、前記試料インジェクタを迂回するバイパス流路が設置されていることを特徴とする試料注入装置。 A supercritical fluid supply unit for supplying a supercritical fluid, a sample injection unit including a sample injector for injecting a sample solution into a mobile phase including the supercritical fluid, and a sample separation unit including a column,
A sample injection device in a supercritical fluid chromatography apparatus in which a mobile phase containing a supercritical fluid delivered from a supercritical fluid supply unit is provided with a flow path leading to a column via a sample injector,
The sample injection apparatus according to claim 1, wherein a bypass channel that bypasses the sample injector is installed in the channel.
前記移動相流路の主流路と、その上下流を接続するバイパス流路とを通じてカラムへ移動相を供給する工程と、
前記バイパス流路によって迂回された主流路へ試料溶液を注入する工程と、
を含むことを特徴とする試料注入方法。 A sample injection method in supercritical fluid chromatography, in which a sample solution injected into a mobile phase containing a supercritical fluid is separated in a column connected to the mobile phase flow path,
Supplying the mobile phase to the column through the main flow path of the mobile phase flow path and a bypass flow path connecting the upstream and downstream thereof;
Injecting a sample solution into the main channel bypassed by the bypass channel;
A sample injection method comprising:
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