JP2010043928A - バイオチップの製造方法およびバイオチップ - Google Patents

Abstract

【課題】生体試料に悪影響を与えることなく、かつ、正確な生体検査が可能なバイオチップの製造方法を提供する。
【解決手段】第１基板（１００）に試料を設けるべき反応流路（１１０）を形成する工程、反応流路との間に隔壁が介在するように、接着剤を充填するための接着剤流路（１２０）を第１基板（１００）と第２基板（２００）とに形成する工程、第２基板（２００）に接着剤を注入するための注入孔（２２１）を設ける工程、第１基板（１００）と第２基板（２００）とを密着させる工程、注入孔（２２１）から接着剤（３１０）を注入する工程、接着剤（３１０）を硬化させる工程を備える。
【選択図】図６

Description

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応によりプライマーを増幅するＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）の実施等に適したバイオチップの製造方法およびバイオチップに関する。

従来、基礎研究や臨床分野における使用を目的として、ＤＮＡやタンパク質等の生体分子が特定の分子と特異的に結合するという性質を利用したマイクロチップ（以下、「バイオチップ」という。）が広く開発されている。バイオチップは、僅かな生体分子の検体量で検査が行えるため反応効率が良く、迅速に生体分子を特定するためのツールとして注目されている。

このようなバイオチップの製造に関して、例えば、特開２００８−８８８０号公報には、熱可塑性プラスチップフィルムを接着剤で接合する製造方法が記載されている（特許文献１）。フィルムや基板は微細加工技術を適用しやすく、バイオチップやマイクロチップの製造に適している。

ここで、ＤＮＡの溶液のなかから、自分の望んだ特定のＤＮＡ断片だけを選択的に増幅して、わずかなＤＮＡ断片から確実に生体反応を引き起こさせることができる原理および手法として、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」ともいう。）が知られている。このＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅に用いる装置（以下、「ＰＣＲチップ」という。）としては、特表２００５−５１９３８１号公報に記載されているように、小型チューブを複数個まとめて利用するものが開発されている（特許文献２、段落番号０００２）。このＰＣＲチップについても、微細加工が必要であることからフィルムや基板を貼り合わせて製造することが好ましいと考えられる。

ただし、接着剤はＤＮＡと反応を生じる場合があるため、基板同士を接合してバイオチップを製造する際にはできれば接着剤を使用することを避けたい。このような、接着剤を使用せずに基板同士を接合する技術としては、特開平１０−２７４６３８号公報に開示されているように、超音波ウェルダーを用いて局所的に加熱する方法や活性化接合法が開発されていた（特許文献３、段落００１４、図２）。
特開２００８−８８８０号公報 特表２００５−５１９３８１号公報 特開平１０−２７４６３８号公報

しかしながら、超音波ウェルダー法や活性化接合法は、局所的とはいえども高温になるため、例えば、ＰＣＲチップなど、基板の接合前にＤＮＡ断片等の試料を封入する必要があるバイオチップでは、接合処理の高温でＤＮＡが反応しなくなってしまう可能性があり、このような接合法は利用できない。生体試料に悪影響を与えないような温度での接合となると、やはり接着剤を利用せざるを得ない。

一方、接着剤を利用した接合方法では、接合時に接着剤が反応流路に溢れ出ると、幾つかの不都合を発生するおそれがあった。まず、反応流路にはみ出た接着剤がＤＮＡと反応してしまう可能性がある。また、仮にＤＮＡに対して不活性な接着剤を利用したとしても、反応流路に接着剤が漏れ出ると反応流路の体積に影響を与えてしまう。バイオチップでは、生体分子の検体量が僅かであるため、反応流路の僅かな体積変化が定量検査における誤差の要因となってしまうのである。

そこで本発明の目的の一つは、生体試料に悪影響を与えることなく、かつ、正確な生体検査が可能なバイオチップの製造方法を提供することである。

上記課題を解決するために、本発明のバイオチップの製造方法は、第１の基板および第２の基板を接合して構成されるバイオチップの製造方法であって、該第１の基板に試料を設けるべき反応流路を形成する工程と、該第１の基板または該第２の基板の少なくとも一方に接着剤を充填するための接着剤流路を形成する工程と、該第１の基板または該第２の基板のいずれか一方に該接着剤流路に接着剤を注入するための注入孔を設ける工程と、該第１の基板と該第２の基板とを密着させる工程と、該注入孔から該接着剤を注入する工程と、該接着剤を硬化させる工程と、を備えたことを特徴とする。

上記課題を解決するために、本発明のバイオチップは、接合された２つの基板により構成されるバイオチップであって、試料を設けるべき反応流路を備える第１の基板と、該第１の基板と接合される第２の基板と、を備え、該第１の基板または該第２の基板の少なくとも一方には接着剤を充填するための接着剤流路が形成されており、該第１の基板には、該反応流路と該接着剤流路との間に該接着剤流路に充填された接着剤が該反応流路に流れることを防止する隔壁が設けられており、該第１の基板または該第２の基板のいずれか一方には、該接着剤流路に接着剤を注入するための注入孔が設けられていることを特徴とする。

かかる発明によれば、第１の基板に形成される反応流路との間に隔壁が介在するように接着剤流路が形成されているので、第１の基板および第２の基板が接合後に注入孔から接着剤が注入されて接着剤流路に接着剤が充填されていっても、接着剤流路と反応流路との間の隔壁が障壁となって反応流路に接着剤が流れ込むことを防止する。よって、接着剤が試料やＤＮＡ溶液と反応したり、接着剤のはみ出しにより反応流路の容積を変化させたりすることが防止される。

ここで、前記第１の基板または前記第２の基板のいずれか一方に、前記接着剤流路に充填する接着剤を吸引するための吸引孔を形成する工程をさらに備えることは好ましい。すなわち、第１の基板または前記第２の基板のいずれか一方には、前記接着剤流路に充填する接着剤を吸引するための吸引孔が設けられている。かかる構成によれば、例え充填させる接着剤の粘度との兼ね合いで接着剤流路の流路抵抗が高いものであっても、吸引孔から吸引することで接着剤流路全長に亘って接着剤を充填することができ、減圧雰囲気にする必要がない。

ここで、前記第１の基板において、前記第２の基板との接合面に前記接着剤に対する所定の非親和性を付与する工程をさらに備えることは好ましい。かかる構成によれば、第２の基板と接する第１の基板の接合面は接着剤に対して非親和性を示すことになるので、流路を超えて接着剤がはみ出すことを防止可能である。

また、前記第２の基板において、前記第１の基板との接合面に前記接着剤に対する所定の非親和性を付与する工程をさらに備えることは好ましい。かかる構成によれば、第１の基板と接する第２基板の接合面は接着剤に対して非親和性を示すことになるので、流路を超えて接着剤がはみ出すことを防止可能である。

さらに接着剤流路において、少なくとも底面に前記接着剤に対する所定の親和性を付与する工程をさらに備えることは好ましい。かかる構成によれば、接着剤流路は少なくとも底面において接着剤に対し親和性を示すので、接着剤流路に沿って接着剤を流し易くなる。

ここで、前記接着剤流路の側面に、前記接着剤に対する所定の非親和性を付与する工程をさらに備えることは好ましい。かかる構成によれば、接着剤の固化時に接着剤の収縮による引っ張り応力が第１の基板の接着剤流路底面と第２の基板との間にのみ作用し、接着剤流路の側壁に作用することがない。このため、接着剤の収縮に伴う強い引っ張り応力による基板の反りや破壊を防止することが可能である。

ここで、前記第１の基板と前記第２の基板とを密着させる工程の前に、前記反応流路に前記試料を付着させる工程をさらに備えることは好ましい。かかる工程によれば、ＰＣＲチップなど、試料を封入した状態で提供されるバイオチップを提供可能である。

ここで、前記接着剤流路を形成する工程では、前記第１の基板と前記第２の基板とに略半円形状の溝を形成するものであり、前記第１の基板と前記第２の基板とを密着させることにより断面が略円形状の前記接着剤流路が形成されることは好ましい。すなわち、前記第１の基板および前記第２の基板が接合されることにより断面が略円形状の前記接着剤流路が形成されているバイオチップである。かかる構成によれば、接着剤流路の断面が略円形状であるため、接着剤の収縮に伴う応力が均一にかかり、基板の反りや破壊を効果的に防止可能である。

以下、本発明の好適な実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。
以下の実施形態における部材の形状、材料や、製造方法における条件は例示に過ぎず、実施形態に例示のものに限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で任意に変形可能である。

（定義）
本明細書における用語を以下のように定義する。
「試料」：生体高分子（糖質、蛋白質（酵素やペプチド）、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）等）を含む有機化合物をいうが、無機化合物を除外するものではない。

「バイオチップ」：試料を定着させ、所定の溶液との生化学反応を生じさせるための装置をいい、少なくともＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅するための装置（ＰＣＲチップ）を含む。

「基板」：流路や孔を設けることが可能な部材であり、その平面形状や厚み等の外形には限定はなく、平面形状が矩形であっても多角形であっても円（楕円）形状であってもよい。また、必ずしも平板状である必要はなく曲面状を呈していてもよい。但し、流路に充填された接着剤を固化可能なようにエネルギーを透過または伝達しうる材料であることが好ましい。

「反応流路」：試料を付着させるための部位をいい、試料に生化学反応を生じさせるための所定の溶液を供給可能に構成されていればよく、必ずしも溶液が流れるように構成されている必要はない。

「接着剤流路」：接着剤を充填させるための部位をいい、接着剤を充填可能であればよく、必ずしも注入孔および吸引孔が設けられている必要はない。

「接着剤」：流路に充填され固化することによって第１の基板と第２の基板とを接着する材料であり、無機系、有機系、合成系のいずれであるかを問わない。また光硬化型、熱硬化型、光/熱硬化型のいずれであるかを問わない。特に比較的低い温度（例えば常温）でも硬化しうることが好ましい。

「親和性」「非親和性」：使用する接着剤に対する部材表面の濡れ性をいい、相対的に接着剤によく濡れる性質を「親和性がある」といい、接着剤をはじく性質を「非親和性がある」または「親和性がない」という。部材表面に対する接着剤の接触角で定量的に計測可能である。

「エネルギー」：接着剤を硬化させるために与えられるパワーであり、光を含む電磁波で与えられる場合や熱を直接伝達する場合を含む。

（実施形態１）
実施形態１は、断面が円形状の接着流路を有するＰＣＲチップおよびその製造方法に関する。

（構造）
図１〜図３に、本実施形態１のＰＣＲチップの構造を示す。図１は第１基板と第２基板とを離した状態での斜視図、図２は第１基板の構造を示す三面図、図３は第２基板の構造を示す三面図である。図２（ａ）は第１基板の平面図、図２（ｂ）は平面図の２ｂ−２ｂ断面における断面図、図２（ｃ）は平面図の２ｃ−２ｃ断面における断面図、図２（ｄ）は平面図の２ｄ−２ｄ断面における断面図である。図３（ａ）は第２基板の平面図、図３（ｂ）は平面図の３ｂ−３ｂ断面における断面図、図３（ｃ）は平面図の３ｃ−３ｃ断面における断面図、図３（ｄ）は平面図の３ｄ−３ｄ断面における断面図である。

図１に示すように、ＰＣＲチップ１は、第１基板１００と第２基板２００とを接合して構成される。第１基板１００および第２基板２００の材料としては、適度な耐熱性および機械的強度、並びに、生体高分子である試料や反応流路に供給される溶液に影響を与えない化学的安定性を有していればよい。

製造時の耐熱性については、充填させた接着剤を固化させるためにエネルギーを付与する場合には、少なくともその熱に対して耐性があることが要求される。使用時の耐熱性については、使用条件によって種々に変わるが、当該ＰＣＲチップ１では、ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅する際に繰り返し供給される１００℃近い熱に対して耐性があることが要求される。製造時の機械的強度については、製造時のハンドリングにおいて損傷せず、接着剤を注入および吸引する際にも影響を受けず、かつ、接着剤が固化して体積が収縮することにより発生する引っ張り応力に抗して損傷を受けず、かつ、反りを生じないことが必要である。使用時の機械的強度については、使用時の熱の断続的な供給に対して反りを生じないことが要求される。なお、後に注入される接着剤を光（例えば紫外線）により硬化させる場合には、少なくとも光を照射する側の基板については、硬化用の光の波長に対してある程度の光透過性が必要である。以上のような条件を満たす基板材料としては、シクロオレフィン、ポリプロピレン等が挙げられる。第１基板１００および第２基板２００の厚みはＰＣＲチップの仕様に応じて選択可能であるが、典型的には１．０〜０．５ｍｍである。

図１および図２に示すように、第１基板１００には、反応流路１１０と接着剤流路１２０とが形成されている。反応流路１１０は、試料を付着させ、ＤＮＡ溶液を流通させる領域であり、供給領域１１１と排出領域１１２とを備えており、流路の中ほどに後述する試料を付着させるようになっている。接着剤流路１２０は、後述する接着剤を充填するための領域であり、接着剤が注入される注入領域１２１と、オプショナルで接着剤を吸引するための吸引領域１２２と、を備えている。接着剤流路１２０の全長は、後述する接着剤の粘度、接着剤の注入圧力、吸引圧力との兼ね合いで定まる。また接着剤の注入箇所の数および吸引箇所の数によっても変動する。

図２（ｂ）、図２（ｃ）、図２（ｄ）に示すように、第１基板１００の反応流路１１０は断面形状が矩形状である所定の深さの溝として形成されているが、断面形状を半円形状としてもよい。接着剤流路１２０は断面が半円形状の溝として形成されている。断面が半円形状の第１基板１００の接着剤流路１２０は第２基板２００と接合されることにより、第２基板２００の接着剤流路２２０と整合して断面が略円形状の接着剤流路（以下、第１基板１００と第２基板２００とが接合されることにより密封されて形成される流路を「接着剤流路３００」と称する。）を形成するようになっている。接着剤流路の断面が略円形状であると、接着剤の収縮に伴う応力が均一にかかり、基板の反りや破壊を効果的に防止可能である。反応流路１１０の深さおよび幅は付着させる試料に対して適正な溶液量となるように調整すべきである。

接着剤流路１２０の幅および深さは、第１基板１００の厚みと充填する接着剤の粘度や硬化時の引っ張り応力に応じて種々に調整すべきである。すなわち、使用する接着剤を流路全長に亘って確実に充填するための流路抵抗を備えるべきであるし、第１基板１００と第２基板２００とを接合するために十分な引っ張り応力を発生させる接着剤の量が充填可能なように調整される。但し、基板の反りを防止し、機械的強度を保つため、基板の厚みの１／２を超えない程度の深さにすべきである。接着剤に十分な引っ張り応力を発生させて基板の反りを引っ張り応力で矯正するためには、基板の厚みの１／３程度が好適である。

第２基板２００には、図１および図３に示すように、供給口２１１、排出口２１２、および接着剤流路２２０が形成されている。第２基板２００は第１基板１００と接合されることにより、上記反応流路１１０および接着剤流路１２０を密封するようになっている。供給口２１１および排出口２１２は、第１基板１００と接合されることにより第１基板１００の反応流路１１０における供給領域１１１および排出領域１１２とそれぞれ対向するようになっている。接着剤流路２２０は、接着剤を充填するための領域であり、接着剤が注入される注入孔２２１と、オプショナルで接着剤を吸引するための吸引孔２２２と、を備えている。注入孔２２１および吸引孔２２２は、第１基板１００と接合されることにより第１基板１００の接着剤流路１２０における注入領域１２１および吸引領域１２２とそれぞれ対向するようになっている。接着剤流路２２０の全長は、後述する接着剤の粘度、接着剤の注入圧力、吸引圧力との兼ね合いで定まる。また注入孔の数および吸引孔の数によっても変動する。

図３（ｂ）、図３（ｃ）、図３（ｄ）に示すように、第２基板２００の接着剤流路２２０は断面が半円形状の溝として形成されている。接着剤流路２２０は上述したように第１基板１００と接合されることにより第１基板の接着剤流路１２０と整合して、断面が略円形状の接着剤流路３００を形成するようになっている。接着剤流路２２０の幅および深さは、第１基板１００について説明したように第２基板２００の厚みと充填する接着剤の粘度や硬化時の引っ張り応力に応じて種々に調整することが可能である。なお、第２基板２００には第１基板１００の反応流路１１０に対向する位置に流路構造を設けてもよい。

図１〜図３から明らかなように、第１基板１００と第２基板２００とが接合されることにより、反応流路１１０と接着剤流路３００との間に隔壁が形成されることになる。この隔壁が障壁となって反応流路１１０に接着剤が流れ込むことが防止される。

（製造方法）
次に図４〜図６を参照しながら本実施形態１におけるＰＣＲチップの製造方法を説明する。図４〜図６は、図１〜図３で説明した第１基板１００および第２基板２００を、反応流路１１０、接着剤流路１２０および２２０、注入孔２２１、並びに吸引孔２２２を含めて模式的に示した製造工程断面図である。

本実施形態におけるＰＣＲチップの製造方法は、以下の工程を備える。
（１）第１基板１００に試料を設けるべき反応流路１１０を形成する工程、
（２）第１基板１００に接着剤を充填するための接着剤流路１２０を形成する工程、
（３）接着剤流路１２０に接着剤に対する所定の親和性を付与する工程、
（４）第１基板１００において、第２基板２００との接合面に接着剤に対する所定の非親和性を付与する工程、
（５）反応流路１１０に試料１３６を付着させる工程、
（６）第２基板２００に、接着剤を充填するための接着剤流路１２０を形成する工程、
（７）第２基板２００において、接着剤流路３００に接着剤を注入するための注入孔２２１を設ける工程、
（８）第２基板２００に、接着剤流路３００に充填する接着剤を吸引するための吸引孔２２２を形成する工程、
（９）接着剤流路２２０に接着剤に対する所定の親和性を付与する工程、
（１０）第２基板２００において、第１基板１００との接合面に接着剤に対する所定の非親和性を付与する工程、
（１１）第１基板１００と第２基板２００とを密着させる工程、
（１２））注入孔２２１から接着剤３１０を注入する工程、および
（１３）接着剤３１０を硬化させる工程。

図４は上記（１）〜（５）の各工程を説明する第１基板１００の製造工程断面図である。図５は上記（６）〜（１０）の各工程を説明する第２基板２００の製造工程断面図である。図６は上記（１１）〜（１３）の各工程を説明する接合された第１基板１００および第２基板２００の製造工程断面図である。上記各工程の順序は一例に過ぎず、必ずしも上記工程断面図の順序で処理される必要はない。製造工程の簡略化やコストダウンの観点から工程の順序を入れ替えたり、複数の工程を同時に実行したりすることが可能である。

＜第１基板：反応流路形成工程および接着剤流路形成工程＞
図４（ａ）に示すように、第１基板１００に反応流路１１０と接着剤流路１２０とを形成する。図４（ａ）では反応流路１１０と接着剤流路１２０とを同時に形成するように図示されているが、流路形成方法が異なる場合には順次流路を形成していくことになる。

本実施形態１では、流路形状を設けた金型を用いて反応流路１１０と接着剤流路１２０とを同時に射出成形する。射出成形を適用する理由は、第１基板１００と第２基板２００とを接合した際に断面が略円形状の接着剤流路３００となるように、第１基板１００に断面が略半円形状の接着剤流路１２０を好適に形成できるからである。例えば、反応流路１１０および接着剤流路１２０の形状を放電加工等の方法を適用して金属に形成して金型を作成する。そして既述のシクロオレフィン、ポリプロピレン等の樹脂を軟化する温度に加熱し、上記金型に所定の射出圧(例えば、10〜3000kgf/c)を加えて押込んで型に充填して成形する。

＜第１基板：親和性付与工程＞
図４（ｂ）に示すように、オプショナルで、射出成形された第１基板１００の流路形成面に対し、親和性を付与するための表面処理を行う。第１基板１００の材料そのものが接着剤に対して十分な親和性を示す場合にはこの工程のように改めて表面処理を行う必要はない。

親和性を有するか否かは、流通させる流動体の性質によって変動する。一般に極性を有する分子（水など）を主体的に含む流動体に対しては、極性基（カルボニル基や水酸基等）が表面に配置される表面に対して親和性を示し、配置されていない表面に対して非親和性を示す。逆に極性を有しない分子（油など）を主体的に含む流動体に対しては、極性基が表面に配置されていない表面に対して親和性を示し、配置されている表面に対して非親和性を示す。実際には、表面と流動体との接触角を測定することにより、親和性の程度を相対的に判断すべきものである。

親和性を調整するための表面処理については、公知技術を種々に適用可能である。例えば、図４（ｂ）に示すようにフッ素化合物または酸素ガスを含んだ導入ガス１３０を減圧雰囲気下または大気圧雰囲気下でプラズマ照射する。基板材料として無機材料を用いた場合、このようなプラズマ放電により未反応基が発生し、未反応基が酸化されてカルボニル基や水酸基等の極性基が発生する。このような極性基は水性の接着剤に対しては親和性を付与することが可能である。一方、基板材料として有機材料を用いた場合であってフッ素系化合物が酸素よりも多いと、上記反応と並行してフッ素系化合物が有機材料表面に入り込み、有機系の接着剤に対して親和性を付与することが可能である。基板材料が接着剤に対して非親和性を示していたとして、この工程により少なくとも接着剤流路１２０の底面に親和性が付与される。

＜第１基板：非親和性付与工程＞
図４（ｃ）に示すように、オプショナルで、第１基板１００において、第２基板２００との接合面に接着剤に対する所定の非親和性を付与する。接着剤流路１２０と反応流路１１０との間の隔壁の幅が十分あったり密着性がよかったりして接着剤が反応流路１１０に流入するおそれが無い場合には当該工程は必要ない。

第１基板１００の接着剤流路１２０内面の親和性を保ちながら、第２基板２００との接触面を非親和性にする方法としては、接着剤流路１２０にマスクをしてから非親和性を与える表面処理をする方法が考えられる。また、第２基板２００との接触面となる第１基板１００の表面に非親和性を示す材料を塗布したり、上記表面処理により形成された親和性を示す分子（基）を取り除いたりすることが考えられる。例えば、図４（ｃ）に示すように、ローラ１３２を用いて非親和性を示す材料、例えばフッ素化合物を第１基板１００の表面に塗布する。この工程により、少なくとも接着剤流路１２０と反応流路１１０との間の隔壁の頂部が非親和性を有することとなる。

＜第１基板：試料付着工程＞
図４（ｄ）に示すように、反応流路１１０の所定位置にＰＣＲ法のための試料１３６を付着させる。試料１３６はＰＣＲ法では増幅対象（テンプレート）となるＤＮＡである。この工程は、予め試料をチップ内に付着させておくべき場合に必要となる処理であり、製造時に付着させる必要がないチップでは不要な工程である。また、この付着工程は、試料１３６に影響を与えない限り、先の工程において付着しておいてもよい。

＜第２基板：反応流路形成工程および接着剤流路形成工程＞
図５（ａ）に示すように、第２基板２００に接着剤流路２２０を形成する。図４（ａ）で示した上記第１基板における接着剤流路形成と同様に、流路形状を設けた金型を用いた射出成形により接着剤流路２２０を形成する。例えば、接着剤流路２２０の形状を金属に形成して金型を作成する。そして既述のシクロオレフィン、ポリプロピレン等の樹脂を軟化する温度に加熱し、上記金型に所定の射出圧(例えば、10〜3000kgf/c)を加えて押込んで型に充填して成形する。

＜第２基板：注入孔および吸引孔形成工程＞
図５（ｂ）に示すように、第２基板２００の接着剤流路２２０の所定位置に接着剤を充填するための注入孔２２１を成形する。同時に、図５（ｂ）に示すように、第２基板２００の接着剤流路２２０の所定位置に接着剤を吸引するための吸引孔２２２をオプショナルで形成する。吸引しなくても接着剤の接着剤流路２２０への充填が可能であれば、吸引孔２２２を必ずしも形成する必要はない。吸引孔２２２を形成する場合には、注入孔２２１と同じ工程ができようできるため、同時に形成することが生産効率上有利である。孔形成方法としてはドリルやエッチング等の公知技術を適用すればよい。なお、注入孔２２１および吸引孔２２２は、第２基板２００側に設ける必要はなく、いずれか一方または双方とも第１基板１００側に設けてもよい。

＜第２基板：親和性付与工程＞
図５（ｃ）に示すように、オプショナルで、射出成形された第２基板２００の流路形成面に対し、親和性を付与するための表面処理を行う。第２基板２００の材料そのものが接着剤に対して十分な親和性を示す場合にはこの工程のように改めて表面処理を行う必要はない。図４（ｂ）で説明した上記第１基板に対する親和性付与工程と同様に、親和性を調整するための表面処理については、公知技術を種々に適用することが可能である。

＜第２基板：非親和性付与工程＞
図５（ｄ）に示すように、オプショナルで、第２基板２００において、第１基板１００との接合面に接着剤に対する所定の非親和性を付与する。接着剤が第１基板１００の反応流路１１０に流入するおそれが無い場合には当該工程は必要ない。図４（ｃ）で説明した上記第１基板に対する非親和性付与工程と同様に、第２基板２００において第１基板１００との接触面を非親和性に加工する。この工程により、少なくとも接着剤流路２２０の内部を除き第１基板１００との接合面が非親和性を有することとなる。

＜密着工程＞
図６（ａ）に示すように、第１基板１００と第２基板２００とを密着させる。密着させる際に、第１基板１００の供給領域１１１、排出領域１１２、注入領域１２１、および吸引領域１２２が、第２基板２００の供給口２１１、排出口２１２、注入孔２２１、および吸引孔２２２に、それぞれ対向するような向きで接合する。本実施形態では流路および孔の開口位置が幾何学的に平面対称となっているので、特に向きに留意する必要はない。少なくとも第１基板１００の接着剤流路１２０と第２基板２００の接着剤流路２２０とが適正位置で整合することにより、断面が略円形状の接着剤流路３００が形成されるように密着させる。第１基板１００と第２基板２００とを密着させたら、接着剤注入時の応力により両基板が離間しないように治具３０１および３０２で密着した第１基板１００および第２基板２００を両側から加圧する。加圧の程度は、接着剤注入時に発生する応力に対抗し、かつ、その後の接着剤硬化によって基板に反りが生じない程度の圧力とする。治具３０１および３０２は接着剤の注入孔２２１および吸引孔２２２に対応する位置に接着剤注入用のノズル３０４および接着剤吸引用のノズル３０６を挿入するための開口を設けておく必要がある。また接着剤を光で硬化させる場合には接着剤硬化用の光を照射する側の治具を透明な材料、例えば石英ガラスで形成しておくことが好ましい。

＜接着剤注入工程＞
図６（ｂ）（ｃ）に示すように、第２基板２００の注入孔２２１から接着剤３１０を注入する。まず図６（ｂ）に示すように、接着剤注入用のノズル３０４を注入孔２２１に挿入し、オプショナルで、接着剤吸引用のノズル３０６を吸引孔２２２に挿入する。接着剤が治具に接触しないように接着剤流路３００の中程までノズル３０４の先端を挿入することが好ましい。

次いで図６（ｃ）に示すように接着剤注入用のノズル３０４から接着剤流路３００に接着剤３１０を注入する。使用可能な接着剤３１０の条件としては、接着剤の粘度（粘性係数）、硬化時に収縮により発生する引っ張り応力、硬化に光または熱といったエネルギーが必要な場合には硬化に必要な光の波長や温度等がある。

接着剤３１０の粘度は接着剤流路３００における接着剤の流動性に影響を与える。粘度が低いほど流れやすい。粘度の上限は、接着剤流路３００の流路抵抗との兼ね合いで定まり、接着剤流路３００の注入領域から吸入領域までの全長に亘って充填可能な程度であることを要する。注入に係る送液圧力が高いほど接着剤の粘度が高くてもよく、また、オプショナルで本実施形態のように吸引する場合には、吸引圧力が高いほど接着剤の粘度が高くでもよい。

引っ張り応力はＰＣＲチップの使用時に加えられる周期的な熱の印加により基板に生じうる反りの力に十分抗するような大きさとする。例えば接着剤硬化に伴い発生する単位面積当たりの引っ張り応力をＰａ、熱サイクルで基板に発生する単位面積当たりの反りの力をＰｂとすれば、Ｐａ≧１０Ｐｂ、とするような接着剤を選択することが好ましい。逆に接着剤そのものの収縮率が大きすぎる場合には硬化時に流路の側壁を破壊する可能性があるため、収縮率が大きすぎないことも必要である。収縮率が大きすぎる場合には例えば接着剤流路３００に詰まらない程度の微細なビーズを混入させて収縮率を適正な範囲になるよう調整する。

接着剤３１０の硬化に光や熱を要する場合には、硬化に必要な光の波長や温度が試料１３６に影響を与えないことを要する。例えば試料１３６にＤＮＡが含まれる場合、一般に光の波長が３００ｎｍより短いとＤＮＡ錯を切断する可能性があるので、３００ｎｍ以上の波長で硬化する接着剤であることを要する。また、試料１３６に含まれるＤＮＡは１００℃より高い温度で反応を生じたり切断されたりすることが多いため、１００℃以下の温度で硬化することが好ましく、７０℃以下で硬化することがさらに好ましく、理想的には生体高分子に影響を与えない温度、例えば常温で硬化する接着剤であることがさらに好ましい。

以上のような条件を満たす接着剤３１０としては、例えば協立化学産業（株）の接着剤、「ワードロック」（商品名）Ｎｏ．ＸＶＬ−９０等が挙げられる。図６（ｄ）に示すように、上記条件を満たす接着剤３１０を接着剤流路３００の全長に亘って充填し終わったら、ノズル３０４およびノズル３０６を引き抜く。

＜接着剤硬化工程＞
図６（ｄ）に示すように、接着剤３１０が光硬化型である場合には、治具３０１および３０２で第１基板１００と第２基板２００とを圧着させたまま、所定の光３０８を照射して接着剤３１０を硬化させる。例えば、試料１３６に影響を与えない３００ｎｍ以上の波長を有する紫外線を照射する。第１基板１００と第２基板２００とを密着させるに足りる引っ張り応力を発生する程度にまで接着剤３１０が硬化したら、治具３０１および３０２を取り外す。以上で、ＰＣＲチップ１の製造工程が終了する。

以上、本実施形態１のＰＣＲチップおよびその製造方法によれば、以下の利点を有する。
（１）反応流路１１０との間に隔壁が介在するように接着剤流路３００が形成されているので、接着剤３１０が充填される際に反応流路１１０へ接着剤３１０が流れ込むことが防止される。このため、接着剤が反応流路へはみ出すことによって反応流路の容積を変動させて定量検査に誤差を生じたり気泡を生じて反応流路に流通させる溶液の流通を阻害したりすることが防止できる。また試料に含まれるＤＮＡに影響を与える性質を有する接着剤も、上記接着剤に要求される条件を満たしている限り使用することができるため、接着剤選択の範囲を拡げることができる。

（２）第２基板２００に吸引孔２２２を形成するので、接着剤流路３００に注入する接着剤３１０の粘度が高いものであっても、接着剤流路３００の流路抵抗に抗して接着剤３１０を充填することができる。このため、接着剤３１０の選択範囲を拡げ、また、接着剤流路３００の流路抵抗を下げるための措置（例えば減圧雰囲気にすること）を必要とすることができる。

（３）第１基板１００および第２基板２００において対向する基板との接合面に非親和性を付与してあるので、注入圧力が高すぎたり接着剤３１０の粘度が低すぎたりしても接着剤流路３００を超えて反応流路１１０に接着剤３１０がはみ出すことを防止可能である。粘度が低い接着剤３１０を使用することも可能であるという点で、接着剤選択の余地を拡げることができる。

（４）接着剤流路３００に接着剤３１０に対する親和性を付与したので、接着剤流路３００の流路抵抗を下げ、接着剤３１０を充填しやすくなる。接着剤３１０の粘度が高くても接着剤３１０を充填できるという点で、接着剤選択の余地を拡げることができる。

（５）第１基板１００と第２基板２００とに略半円形状の溝が形成され、両基板を密着させることにより断面が略円形状の接着剤流路３００を形成するので、接着剤３１０の収縮に伴う引っ張り応力が均一にかかり、基板の反りや流路の破壊を効果的に防止可能である。

（実施形態２）
実施形態２は、断面が矩形状の接着流路を有するＰＣＲチップおよびその製造方法に関する。上記実施形態１と同様の構成については同じ符号を付すものとし、上記実施形態１と同様の説明が当てはまる。

図７および図８に、本実施形態２のＰＣＲチップの構造を示す。図７は実施形態２の第１基板１００Ｂの構造を示す三面図、図８は実施形態２の第２基板２００Ｂの構造を示す三面図である。図７（ａ）は第１基板１００Ｂの平面図、図７（ｂ）は平面図の７ｂ−７ｂ断面における断面図、図７（ｃ）は平面図の７ｃ−７ｃ断面における断面図、図７（ｄ）は平面図の７ｄ−７ｄ断面における断面図である。図８（ａ）は第２基板２００Ｂの平面図、図８（ｂ）は平面図の８ｂ−８ｂ断面における断面図、図８（ｃ）は平面図の８ｃ−８ｃ断面における断面図、図８（ｄ）は平面図の８ｄ−８ｄ断面における断面図である。

本実施形態２のＰＣＲチップは、上記実施形態１と同様、第１基板１００Ｂと第２基板２００Ｂとを接合して構成される。基板材料についても上記実施形態１の第１基板１００および第２基板２００と同様である。

図７に示すように、第１基板１００Ｂには、反応流路１１０と接着剤流路１２０Ｂとが形成されている。反応流路１１０については上記実施形態１と同様である。接着剤流路１２０Ｂは、接着剤を充填するための領域であり、平面形状については、上記実施形態１と同様に、接着剤が注入される注入領域１２１と、オプショナルで接着剤を吸引するための吸引領域１２２と、を備えている。接着剤流路１２０Ｂの全長は、後述する接着剤の粘度、接着剤の注入圧力、吸引圧力との兼ね合いで定まる。また接着剤の注入箇所の数および吸引箇所の数によっても変動する。

図７（ｂ）、図７（ｃ）、図７（ｄ）に示すように、接着剤流路１２０Ｂは、上記実施形態１と異なり、断面が矩形状の溝として形成されている。接着剤流路１２０Ｂの幅および深さは、第１基板１００Ｂの厚みと充填する接着剤の粘度や硬化時の引っ張り応力に応じて種々に調整される。すなわち、使用する接着剤を流路全長に亘って確実に充填するための流路抵抗を備えるべきであるし、第１基板１００Ｂと第２基板２００Ｂとを接合するために十分な引っ張り応力を発生させる接着剤の量が充填可能なように調整される。但し、基板の反りを防止し、機械的強度を保つため、基板の厚みの１／２を超えない程度の深さにすべきである。接着剤に十分な引っ張り応力を発生させて基板の反りを引っ張り応力で矯正するためには、基板の厚みの１／３程度が好適である。

図８に示すように、第２基板２００Ｂには、供給口２１１および排出口２１２が形成される点で上記実施形態１と同じであるが、接着剤流路が形成されない点で上記実施形態１と異なる。すなわち、当該第２基板２００Ｂは第１基板１００Ｂと接合されることにより、上記接着剤流路１２０Ｂを密封する蓋として機能するように構成されている。また、第２基板２００Ｂには、接合時に第１基板１００Ｂの接着剤流路１２０Ｂの注入領域１２１に対応する位置に接着剤が注入される注入孔２２１と、接着剤流路１２０Ｂの吸引領域１２２に対応する位置にオプショナルで接着剤を吸引するための吸引孔２２２と、を備えている。

図７および図８から明らかなように、第１基板１００Ｂと第２基板２００Ｂとが接合されることにより、反応流路１１０と接着剤流路１２０Ｂとの間に隔壁が形成されることになる。この隔壁が障壁となって反応流路１１０に接着剤が流れ込むことが防止される。

本実施形態２におけるＰＣＲチップの製造方法は、以下の工程を備える。
（１）第１基板１００Ｂに試料を設けるべき反応流路１１０を形成する工程、
（２）第１基板１００Ｂに反応流路１１０との間に隔壁が介在するように、接着剤を充填するための接着剤流路１２０Ｂを形成する工程、
（３）接着剤流路１２０Ｂに接着剤に対する所定の親和性を付与する工程、
（４）第１基板１００Ｂにおいて、第２基板２００Ｂとの接合面に接着剤に対する所定の非親和性を付与する工程、
（５）反応流路１１０に試料１３６を付着させる工程、（６）第２基板２００Ｂにおいて、第１基板１００Ｂの接着剤流路１２０Ｂに接着剤を注入するための注入孔２２１を設ける工程、
（７）第２基板２００Ｂに、第１基板１００Ｂの接着剤流路１２０Ｂに充填する接着剤を吸引するための吸引孔２２２を形成する工程、
（８）第２基板２００において、第１基板１００との接合面に接着剤に対する所定の非親和性を付与する工程、
（９）第１基板１００と第２基板２００とを密着させる工程、
（１０）注入孔２２１から接着剤３１０を注入する工程、および
（１１）接着剤３１０を硬化させる工程。

本実施形態２におけるＰＣＲチップには第２基板２００Ｂに接着剤流路を設けないため、上記実施形態１の製造方法のうち、第２基板における接着剤流路形成工程、および、第２基板の接着剤流路に親和性を付与する工程は不要である。上記各工程の順序は一例に過ぎず、必ずしも上記工程断面図の順序で処理される必要はない。製造工程の簡略化やコストダウンの観点から工程の順序を入れ替えたり、複数の工程を同時に実行したりすることが可能である。

上記製造工程のうち、次の工程を除いて、上記実施形態１と同様に考えられる。
上記（１）の第１基板１００Ｂに反応流路１１０を形成する工程および（２）の第１基板１００Ｂに接着剤流路１２０Ｂを形成する工程では、金型を用いた射出成形を用いることもできるが、コスト削減の観点からは、フォトリソグラフィ法等を適用して反応流路１１０および接着剤流路１２０Ｂを形成することが好ましい。例えば、第１基板１００Ｂの流路形成面にレジストを塗布し、マスクを介して反応流路１１０および接着剤流路１２０Ｂの形状に露光し現像し、エッチングをして、所定の幅および深さの反応流路１１０および接着剤流路１２０Ｂを形成する。

上記（１０）の第２基板２００Ｂの注入孔２２１から接着剤３１０を注入する工程では、図６（ｂ）で説明したノズル３０４および３０６を第１基板１００Ｂの接着剤流路１２０Ｂにまで届くような深度に挿入する。接着剤注入の詳細については上記実施形態１と同様である。

以上、本実施形態２によれば、上記実施形態１と同様の作用効果を奏する他、接着剤流路１２０Ｂを第１基板Ｂのみに設け、しかも金型を用いないので、比較的安価にＰＣＲチップを製造することができる。

（変形例）
本発明は、上記実施形態に限定されることなく種々に変形して適用することが可能である。すなわち、上記実施形態１および２を通じて説明されたＰＣＲチップの構造や製造方法は、具体的な使用目的に応じて適宜に変更を加えることができ、上記実施形態の記載に限定されるものではない。そして、そのような変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。

例えば、上記実施形態１では第１基板１００と第２基板２００とに接着剤流路を設け、上記実施形態２では第１基板１００Ｂに接着剤流路を設けていたが、第２基板のみに接着剤流路を設けるように構成してもよい。この場合、第１基板には反応流路のみが設けられることになる。

また、上記実施形態では、オプショナルであると説明したように、第２基板２００（２００Ｂ）に吸引孔２２２からの吸引をしなくてもよいし、吸引孔２２２を設けなくてもよい。吸引孔２２２を設けない場合、接着剤の充填に伴い接着剤流路空間の気体の逃げ道が無くなってしまうので、接着剤を充填する工程を減圧（真空）雰囲気下で行うことが好ましい。

また、接着剤流路に設ける注入孔および吸引孔の個数は任意であり、それぞれを複数設けてもよい。特に接着剤の粘度と接着剤流路の流路抵抗の兼ね合いから、接着剤流路の全長に亘って接着剤が流れない場合には、複数の注入孔から接着剤を注入したり、複数の吸引孔から接着剤を吸引したりしてもよい。

さらに、上記実施形態では、接着剤流路１２０（１２０Ｂ）および２２０の内面全体に親和性を付与していたが、親和性を付与する領域は接着剤流路の底面のみとし、接着剤流路の側面（側壁）には非親和性を付与するようにすることは好ましい。このようにすれば、接着剤の固化時に接着剤の収縮による引っ張り応力が第１基板１００（１００Ｂ）の接着剤流路底面と第２の基板との間にのみ作用し、接着剤流路の側壁に作用することがない。このため、接着剤の収縮に伴う強い引っ張り応力により接着剤流路の側壁が反ったり破壊されたりすることを防止することが可能である。なお、接着剤流路の側壁に非親和性を付与する工程としては、上記接合面に非親和性を付与する工程において塗布する非親和性を示す材料の塗布量を多めに調整し、接合面のみならず接着剤流路の側面にまで非親和性材料が及ぶようにすることが考えられる。

実施形態に係る第１基板と第２基板とを離した状態でのＰＣＲチップの斜視図 実施形態１に係る第１基板の構造を示す三面図であり、図２（ａ）は第１基板の平面図、図２（ｂ）は平面図の２ｂ−２ｂ断面における断面図、図２（ｃ）は平面図の２ｃ−２ｃ断面における断面図、図２（ｄ）は平面図の２ｄ−２ｄ断面における断面図 実施形態１に係る第２基板の構造を示す三面図であり、図３（ａ）は第２基板の平面図、図３（ｂ）は平面図の３ｂ−３ｂ断面における断面図、図３（ｃ）は平面図の３ｃ−３ｃ断面における断面図、図３（ｄ）は平面図の３ｄ−３ｄ断面における断面図 実施形態１に係る第１基板１００の各工程を説明する製造工程断面図 実施形態１に係る第２基板２００の各工程を説明する製造工程断面図 実施形態１に係る接合された第１基板１００および第２基板２００の各工程を説明する製造工程断面図 実施形態２の第１基板１００Ｂの構造を示す三面図であり、図７（ａ）は第１基板１００Ｂの平面図、図７（ｂ）は平面図の７ｂ−７ｂ断面における断面図、図７（ｃ）は平面図の７ｃ−７ｃ断面における断面図、図７（ｄ）は平面図の７ｄ−７ｄ断面における断面図 実施形態２の第２基板２００Ｂの構造を示す三面図であり、図８（ａ）は第２基板２００Ｂの平面図、図８（ｂ）は平面図の８ｂ−８ｂ断面における断面図、図８（ｃ）は平面図の８ｃ−８ｃ断面における断面図、図８（ｄ）は平面図の８ｄ−８ｄ断面における断面図

符号の説明

１…ＰＣＲチップ、１００、１００Ｂ…第２基板、１１０…反応流路、１１１…供給領域、１１２…排出領域、１２０、１２０Ｂ、２２０、３００…接着剤流路、１２１…注入領域、１２２…吸引領域、１３０…導入ガス、１３２…ローラ、１３６…試料、２００、２００Ｂ…第２基板、２１１…供給口、２１２…排出口、２２１…注入孔、２２２…吸引孔、３０１…治具、３０４、３０６…ノズル、３０８…光、３１０…接着剤

Claims (11)

1. 第１の基板および第２の基板を接合して構成されるバイオチップの製造方法であって、
   該第１の基板に試料を設けるべき反応流路を形成する工程と、
   該第１の基板または該第２の基板の少なくとも一方に接着剤を充填するための接着剤流路を形成する工程と、
   該第１の基板または該第２の基板のいずれか一方に該接着剤流路に接着剤を注入するための注入孔を設ける工程と、
   該第１の基板と該第２の基板とを密着させる工程と、
   該注入孔から該接着剤を注入する工程と、
   該接着剤を硬化させる工程と、を備えたこと
   を特徴とするバイオチップの製造方法。
2. 前記第１の基板または前記第２の基板のいずれか一方に、前記接着剤流路に充填する接着剤を吸引するための吸引孔を形成する工程をさらに備える、
   請求項１に記載のバイオチップの製造方法。
3. 前記第１の基板において、前記第２の基板との接合面に前記接着剤に対する所定の非親和性を付与する工程をさらに備える、
   請求項１または２に記載のバイオチップの製造方法。
4. 前記第２の基板において、前記第１の基板との接合面に前記接着剤に対する所定の非親和性を付与する工程をさらに備える、
   請求項１乃至３のいずれか一項に記載のバイオチップの製造方法。
5. 前記接着剤流路において、少なくとも底面に前記接着剤に対する所定の親和性を付与する工程をさらに備える、
   請求項１乃至４のいずれか一項に記載のバイオチップの製造方法。
6. 前記接着剤流路の側面に、前記接着剤に対する所定の非親和性を付与する工程をさらに備える、
   請求項５に記載のバイオチップの製造方法。
7. 前記第１の基板と前記第２の基板とを密着させる工程の前に、
   前記反応流路に前記試料を付着させる工程をさらに備える、
   請求項１乃至６のいずれか一項に記載のバイオチップの製造方法。
8. 前記接着剤流路を形成する工程では、
   前記第１の基板と前記第２の基板とに略半円形状の溝を形成するものであり、
   前記第１の基板と前記第２の基板とを密着させることにより断面が略円形状の前記接着剤流路が形成される、
   請求項１乃至７のいずれか一項に記載のバイオチップの製造方法。
9. 接合された２つの基板により構成されるバイオチップであって、
   試料を設けるべき反応流路を備える第１の基板と、
   該第１の基板と接合される第２の基板と、を備え、
   該第１の基板または該第２の基板の少なくとも一方には接着剤を充填するための接着剤流路が形成されており、
   該第１の基板には、
   該反応流路と該接着剤流路との間に該接着剤流路に充填された接着剤が該反応流路に流れることを防止する隔壁が設けられており、
   該第１の基板または該第２の基板のいずれか一方には、
   該接着剤流路に接着剤を注入するための注入孔が設けられている、
   ことを特徴とするバイオチップ。
10. 前記第１の基板または前記第２の基板のいずれか一方には、
    前記接着剤流路に充填する接着剤を吸引するための吸引孔が設けられている、
    請求項９に記載のバイオチップ。
11. 前記第１の基板および前記第２の基板が接合されることにより断面が略円形状の前記接着剤流路が形成されている、
    請求項９または１０に記載のバイオチップ。

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