JP2009535046A - P15ヘアピン構造及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】配列番号3及び配列番号3のアンチセンス配列などのヌクレオチド配列を有し、細胞中で転写されたときに、遺伝子的に組換えられたTGB−3ウイルス配列が、二重鎖の自己相補的なRNA分子を生成できる遺伝子的に組換えられたTGB−3ウイルス配列。
【選択図】図2
Description
−本発明方法で遺伝子組換えされた核酸配列、又はこのような組換え配列のフラグメントを含んで成り、植物又は植物細胞中で活性な1又は2以上の調節塩基配列にリンクされた核酸構成体を作製し、
−該植物細胞を前記核酸構成体で形質変換し、かつ
−必要であれば、形質変換された植物細胞から遺伝子組換え植物を再生する。
−本発明方法で得られる組換え核酸配列を含んで成る、又はこのような組換え配列を含んで成るフラグメントを含んで成る核酸構成体を作製し、好ましくは植物に活性な1又は2以上の調節塩基配列にリンクされかつ配列番号1、配列番号3及び配列番号5から成る群から選択される核酸配列を含んで成る核酸構成体を作製し、
―サトウダイコン植物を、前記核酸構成体で形質変換し、かつ
−必要であれば、形質変換されたサトウダイコン植物細胞から形質変換されたサトウダイコン植物を再生する。
1)少なくとも約10の連続ヌクレオチド(nt)、好ましくは少なくとも15又は20、より好ましくは少なくとも50,100,150,200,300,350、あるいは更に好ましくは約400の連続ヌクレオチド(nt)で、これらはp15 BNWT WT配列(配列番号7)の少なくとも一部と約75から約100%の配列同一性を有するセンスヌクレオチド配列(例えば(組替え)配列番号3又はそのフラグメントである)、及び
2)このセンスヌクレオチド配列に対して十分相補的であるアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列又は核酸配列を有するRNA分子を生成する。
発現した(転写されたが翻訳されていない)RNA分子は、十分な量で発現(転写)したときは、センス及びアンチセンスヌクレオチド配列間の塩基対形成による二重鎖RNAステムを有する人工的なヘアピンRNA構造のような、二重鎖自己相補的RNA分子を形成できる。「十分な量」とは、PTGS,好ましくは完全な遺伝子サイレンシングを起こさせるために十分な量を意味する。
−好ましくはサトウダイコン植物である植物の細胞中に、遺伝子組替えTGB−3ウイルス配列(DNA構成体)及び/又は同じ物を含んで成るベクターを導入して形質変換された植物細胞を得ることを含んで成り、
二重鎖RNA分子を形成できるRNA分子の前記植物細胞中での発現が、前記植物又は植物細胞中のRNA2の全て、及び特に(BNYW)TGB−3移動蛋白質の発現を変え、更に前記植物又は植物細胞中の同じRNA上に位置する他のウイルス蛋白質の発現を変えられれば好都合である。
−植物、好ましくはサトウダイコン植物の細胞中に、遺伝子組替えTGB−3ウイルス配列(DNA構成体)及び/又は本発明の同じ成分を含んで成るベクターを導入して形質変換された植物細胞を得ることを含んで成り、二重鎖RNA分子を形成できるRNA分子の前記植物細胞中での発現が、転写後の遺伝子サイレンシングの機構を開始する。
微小注入及び微小発射に利用されている。更にアグロバクテリウム族のバクテリアを植物細胞の形質変換に利用できる。
−対象とする拡散のヌクレオチド配列の少なくとも一部と75%から100%の配列同一性を有する少なくとも10個の連続ヌクレオチド配列のセンスヌクレオチド配列と、少なくとも10個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約15nt、20nt、より好ましくは少なくとも50nt、更に好ましくは少なくとも約100nt、特に好ましくは少なくとも約150nt、より一層好ましくは少なくとも約200nt、250nt、300nt、更に好ましくは少なくとも350nt又は400ntを含み、更に前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも約10個の連続ヌクレオチドの相補体と約75から約100%の配列同一性を有するアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するRNA分子中に転写できるDNA領域をクローニングして、これにより、RNAが、T7−ポリメラーゼ特異的プロモータに限定されない、インビトロの転写反応中でDNA依存RNAポリメラーゼによる認識のために適したプロモータのコントロール下で、例えばヘアピンRNA構造を形成させる、センス及びアンチセンスヌクレオチド配列の領域間の塩基対形成により二重鎖RNAを生成できる前記クローニングを行い、
−特に好適なDNA依存性RNAポリメラーゼ、及びRNA分子を生成するために必要な試薬を加えることによりインビトロの転写反応を行わせ、
−RNA分子を単離する。
[実施例1]
[BNYW抵抗性トランス遺伝子の植物の特性化]
蛋白質BNP15-Ala4(配列番号3でエンコードする)を発現させる3種のトランス遺伝子の植物のベータ・ブルガリス(Beta vulgaris)の系列を作製した。3系列のうち2系列がBNYWに対する抵抗性を有していた。
[P15ヘアピン構成体]
(組替え)P15配列を生じさせるPTGSの機能性を調べるために、ペチュニアイントロン又はサトウダイコンイントロンが介在する、センス及びアンチセンス方向の遺伝子組替えP15遺伝子(例えば(組替え)配列番号3)を含むバイナリアグロバクテリウムを構築した。
[実験プロトコル]
テトラゴニア・エクスペンサ(Tetragonia expensa)、ベータ・マクロカルパ(Beta macrocarpa)及びベータ・ブルガリス(Beta vulgaris)の葉状物質(BNYW人工葉接種を保持する植物)をBNYW(RNA1及びRNA2を提供するStras 1234又はStras 12)に浸透(infiltration)させ感染させた。プロトコルについては後述を参照。構成体については前述を参照。
ベータ・マクロカルパ 10μL接種溶液/葉
ベータ・ブルガリス 25μL接種溶液/葉
テトラゴニア・エクスペンサ 25μL接種溶液/葉
ニコチナ・ベンサミナ 20μL接種溶液/葉
[BNYWの繁殖に対するhp15mRNA発現の効果]
A.ペチュニアイントロンを有する構成体
次の実施例は、本発明のhp15構成体を使用してサトウダイコン中で得られた結果を記載するものである。
上記実験を、イントロンの長さのみが異なる構成体2及び3を使用して、更に多数のサトウダイコンを使用して行った。
フランスのピチビエ周辺で見い出されるPタイプのBNYWは、5個のプラスーセンスRNAから成っている。この損傷は、サトウダイコンを高度に発病させる。p26蛋白質の発現は、リゾマニア・シンプトンを悪化させると信じられている(非特許文献26)。
[本発明のhp15構成体は、皮質細胞中のウイルス繁殖を阻止する]
BNYW(A,B,Pタイプ)の存在及び拡散を、天然の抵抗性源での感受性2倍体サトウダイコン育成ライン4D6834(「4D」)(ホーリー1−4アクセッション(「Ho」)及びベータ・ブルガリssp.マリチナWB42(「Bm」))、及び本発明で形質変換したサトウダイコンで調べた。
[総括的な結論]
前記実施例から、本発明の病原菌誘導のhp15抵抗性は、非常に強力なBNYW単離体に対しても高度に効果的であると結論付けることができる。
[感染土壌中で生育した形質変換植物のELSAスクリーニング]
構成体:ベクターpS138(図11)をPEG直接遺伝子形質変換用に使用し、ベクターpS143(図12)をアグロバクテリウムで生じる形質変換用に使用した。両プラスミドは、図1A及び1Bに示すように、短いイントロン配列(91bp)を有するP15−4(BNP15−Ala4)ヘアピン構成体を含む。該構成体では、P15−4センス配列は配列番号3に対応し、P14−4アンチセンス配列は配列番号12に対応し、イントロンは配列番号11に対応する。
Claims (37)
- a)配列番号3及び配列番号3のアンチセンス配列を含んで成るヌクレオチド配列、
b)配列番号3のフラグメント及び配列番号3の該フラグメントのアンチセンス配列を含んで成るヌクレオチド配列、
c)組換えられた配列番号3及び該組換えられた配列番号3のアンチセンス配列を含んで成るヌクレオチド配列、及び
d)組換えられた配列番号3のフラグメント及び該組換えられた配列番号3のフラグメントのアンチセンス配列を含んで成るヌクレオチド配列、
から成る群から選択される配列を含んで成る遺伝子的に組換えられたTGB−3ウイルス配列であって、
細胞中で転写されたときに、前記遺伝子的に組換えられたTGB−3ウイルス配列が、二重鎖の自己相補的なRNA分子を生成できることを特徴とする遺伝子的に組換えられたTGB−3ウイルス配列。 - センス及びアンチセンス配列が、1つの核酸配列に含まれる請求項1記載のTGB−3ウイルス配列。
- センス及びアンチセンス配列間に配置されたイントロンフラグメントを更に含んで成り、細胞中で転写されたときに、前記TGB−3ウイルス配列が、ヘアピンRNA分子を形成できる請求項1又は2に記載のTGB−3ウイルス配列。
- イントロンフラグメントが、植物遺伝子から誘導される請求項3に記載のTGB−3ウイルス配列。
- 植物遺伝子が、ビート遺伝子である請求項4記載のTGB−3ウイルス配列。
- イントロンフラグメントが、高度に転写された遺伝子である請求項3に記載のTGB−3ウイルス配列。
- 高度に転写された遺伝子が、リボゾームRNA遺伝子である請求項6に記載のTGB−3ウイルス配列。
- 高度に転写された遺伝子が、高度に転写されたサトウダイコン遺伝子である請求項6に記載のTGB−3ウイルス配列。
- 前記組換えられた配列番号3配列中で、配列番号3配列の翻訳開始及び/又は停止コドンが組換えられて、翻訳を阻害するようにした請求項1〜8までのいずれか1項に記載のTGB−3ウイルス配列。
- 配列番号9又は配列番号13を含んで成る請求項1〜9までのいずれか1項に記載のTGB−3ウイルス配列。
- 配列番号9又は配列番号13から成る請求項1〜10までのいずれか1項に記載のTGB−3ウイルス配列。
- 請求項1〜11までのいずれか1項に記載の遺伝子的に組換えられたTGB−3ウイルス配列を含んで成ることを特徴とするベクター。
- 植物細胞中で活性な1又は2以上の調節塩基配列に結合した請求項12に記載のベクター。
- 請求項12又は13のベクターにより発現した二本鎖の自己相補的RNA分子。
- 植物又は植物細胞中で活性な1又は2以上の調節塩基配列にリンクされた、請求項1から11までのいずれか1項に記載の遺伝子的に修飾したTGB−3ウイルス配列を含んで成る核酸構成物を生産する工程、及び
該核酸構成体で植物細胞を形質変換し、これにより植物又は植物細胞中のウイルスに対する抵抗力を与えることを含んで成る植物又は植物細胞中のウイルスに抵抗性を付与する工程を含んで成る方法。 - ウイルスが、リンゴステムピッティングウイルス、ブリーベリースコーチウイルス、ジャガイモMウイルス、ホワイトクローバーモザイクウイルス、シンビディウムモザイクウイルス、オオムギ班葉モザイクウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、ピーナッツクランプウイルス、ビートソイルボーンウイルス及びBNYWウイルスから成る群から選択される請求項15に記載の方法。
- 植物又は植物細胞における全RNA2、又はTGB−3移動蛋白質の転写後の遺伝子サイレンシングを起こすための方法であって、
植物又は植物細胞中で活性な1又は2以上の調節塩基配列にリンクされた、請求項1から11までのいずれか1項に記載の遺伝子的に修飾したTGB−3ウイルス配列を含んで成る核酸構成物を生産する工程、及び
該核酸構成物で植物細胞を形質変換し、これにより二重鎖RNA分子を形成できるRNA分子の前記植物細胞中での発現が、転写後の遺伝子サイレンシングの機構を起こさせる工程を含んで成る方法。 - 植物細胞が、気孔細胞である請求項17に記載の方法。
- 植物が、リンゴ、ブルーベリー、ジャガイモ、クローバー、蘭、ピーナッツ及びサトウダイコンから成る群から選択される請求項17又は18に記載の方法。
- 形質変換された植物細胞から遺伝子導入植物を再生するようにした請求項17から19までのいずれか1項に記載の方法。
- 調節塩基配列が、植物中で活性なプロモータ配列又は終了配列を含んで成る請求項17から20までのいずれか1項に記載の方法。
- プロモータ配列が、構造性配列又は外来配列である請求項21に記載の方法。
- プロモータ配列が、35Sカリフラワーモザイクウイルスプロモータ、及びポリユビキチン・シロイヌナズナ・プロモータ(polyubiquitin Arabidopsis thaliana promoter)から成る群から選択される請求項21に記載の方法。
- プロモータ配列が、植物の根組織中で活性なプロモータである請求項21に記載の方法。
- プロモータ配列が、サトウダイコンの根組織中で活性なプロモータである請求項24に記載の方法。
- 植物の根組織中で活性な前記プロモータが、ペロスポニア・アンデルソニー(Persponia andersonii)からのヘモグロビン遺伝子のパープロモータ(par promoter)である請求項24に記載の方法。
- 植物又は植物細胞中で活性な1又は2以上の調節塩基配列にリンクされた、請求項1から11までのいずれか1項に記載の遺伝子的に修飾したTGB−3ウイルス配列を有する核酸構成物を含んで成り、更に請求項12又は13に記載のベクター、又は請求項14に記載の二重鎖の自己相補的なRNA分子を含んで成るウイルス抵抗性の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
- ウイルスが、リンゴステムピッティングウイルス、ブリーベリースコーチウイルス、ジャガイモMウイルス、ホワイトクローバーモザイクウイルス、シンビディウムモザイクウイルス、ジャガイモXウイルス、オオムギ班葉モザイクウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、ピーナッツクランプウイルス、ビートソイルボーンウイルス及びBNYWウイルスから成る群から選択される請求項27に記載の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
- 植物が、リンゴ、ブルーベリー、ジャガイモ、クローバー、蘭、ピーナッツ及びサトウダイコンから成る群から選択される請求項27又は28に記載の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
- 調節塩基配列が、植物中で活性なプロモータ配列又は終了配列を含んで成る請求項27から29までのいずれか1項に記載の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
- プロモータが、植物の根組織中で活性である請求項30に記載の遺伝子組換え植物。
- 前記プロモータが、ペロスポニア・アンデルソニー(Persponia andersonii)からのヘモグロビン遺伝子のパープロモータ(par promoter)である請求項30又は31に記載の遺伝子組換え植物。
- 前記遺伝子組換え植物がサトウダイコンで、遺伝子組換え植物細胞がサトウダイコン細胞である請求項27から32までのいずれか1項に記載の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
- 調節塩基配列が、構成的配列又は外来配列である請求項27から33までのいずれか1項に記載の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
- プロモータが、35Sカリフラワーモザイクウイルスプロモータ、及びポリユビキチン・シロイヌナズナ・プロモータから成る群から選択される請求項27から34までのいずれか1項に記載の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
- 前記組織が、果実、茎、根、塊茎及び種から成る群から選択される請求項27から35までのいずれか1項に記載の遺伝子組換え植物細胞から誘導される遺伝子組換え植物組織。
- 再生可能な構造が、角質、芽又は胚から選択される請求項27から35までのいずれか1項に記載の遺伝子組換え植物細胞から得られる遺伝子組換え再生可能構造。
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