KR101555517B1 - 콩에서 외래 단백질 발현을 위한 ｓｙｃｍｖ 유래의 재조합 발현 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로모터 및 전장 (full length) SYCMV 핵산 서열을 포함하고, 상기 전장 SYCMV 서열 중 외피 단백질 코딩 유전자 내에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 SYCMV 유래의 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터에 FMDV (foot-and-mouth disease virus) 01Campos strain의 항원 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 식물체 내에서 외래 유전자 과발현 방법, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 외래 유전자가 과발현된 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 과발현된 식물체 및 이의 종자 및 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 SYCMV 유전자를 제공한다.

Description

콩에서 외래 단백질 발현을 위한 ＳＹＣＭＶ 유래의 재조합 발현 벡터 및 이의 용도 {Recombinant expression vector from SYCMV useful for foreign protein expression in soybean and uses thereof}

본 발명은 콩에서 외래 단백질 발현을 위한 SYCMV (soybean yellow common mosaic virus) 유래의 재조합 발현 벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 프로모터 및 전장 (full length) SYCMV 핵산 서열을 포함하고, 상기 전장 SYCMV 서열 중 외피 단백질 코딩 유전자 내에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 SYCMV 유래의 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터에 FMDV (foot-and-mouth disease virus) 01Campos strain의 항원 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 식물체 내에서 외래 유전자 과발현 방법, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 외래 유전자가 과발현된 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 과발현된 식물체 및 이의 종자 및 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 SYCMV 유전자에 관한 것이다.

콩은 전 세계에서 경제적으로 매우 중요한 작물이다. 우리가 항상 섭취하는 음식과 사료용으로 많이 이용되고 있으며, 더욱이 최근에는 바이오 디젤의 원료로서 많은 연구가 진행되고 있다. 따라서 전 세계 연구원들은 콩이 가지고 있는 수많은 유용 유전자의 발굴과 연구로 인한 품종 개발에 집중하고 있으며, 특허를 통한 원천기술을 선점하기 위해 노력하고 있다.

최근 유전공학적 변형작물을 이용한 고부가가치의 치료용 단백질 등의 생산에 대한 많은 연구가 진행되고, 유용물질의 생산성 향상에 관한 여러 가지 방법들이 연구되고 있다. 현재 바이오산업이 발전함에 따라서, 식물을 생산공장으로 활용하여 다양한 유용 단백질을 생산하고, 대규모 재배가 가능하다는 점을 이용하여 고부가가치의 유용 단백질을 값싸게 대량으로 생산할 수 있는 기술에 대한 기대가 커지고 있다.

하지만 이처럼 외래유전자를 도입하여 신기능의 작물을 개발함에 있어서 외래유전자 도입에 따른 효과를 가시적으로 얻기 위해서는 도입 유전자의 안정적인 발현 및 발현량 증대뿐만 아니라, 목적 유전자가 도입된 돌연변이체가 필요하고, 돌연변이체를 얻기 위해서는 형질전환 기술이 반드시 필요하다. 그러나 불행히도 콩에서는 아직 대량으로 형질전환할 수 있는 기술이 전무하다. 따라서 콩에서 유용 단백질을 생산하기 위해서는 대량의 효율적인 형질전환이 가능하고, 콩에서 사용할 수 있는 효과적인 바이러스 벡터가 반드시 필요하다. 콩에서 사용할 수 있는 벡터의 개발을 위해서는 콩에 발생하는 새로운 바이러스의 탐색이 필요하다. 모든 바이러스들은 각각의 병원성과 기주 범위 또한 침묵현상 억제자 (silencing suppressor)의 효율이 모두 다르므로 끊임없이 효율적인 벡터의 탐색과 연구가 반드시 필요하다. 또한 바이러스로 인한 기주의 병징이 나타나지 않게 하는 것이 중요하다. 이것은 바이러스에 대한 수많은 품종별 병징 조사를 통하여 정상적으로 바이러스의 증식은 이루어지면서 병징이 나타나지 않는 품종을 선별함으로써 해결할 수 있다.

콩에서 재조합 단백질 발현 벡터로 사용할 수 있는 바이러스의 발굴을 위해서는 기존에 보고된 바이러스만을 가지고는 한계가 있다. 이는 많은 연구원들이 이미 벡터로서의 가능성 여부에 대한 연구를 대부분 끝마쳤기 때문에 지속적인 새로운 바이러스의 탐색이 필요하다. SYCMV (soybean yellow common mosaic virus)는 단일 가닥 양성 RNA 게놈 (single strand positive RNA genome)을 갖는 최근 국내에서 처음 발견된 바이러스로 아직 그 연구가 미진한 상태이며, 형질전환을 통해 경제적으로 가치있는 유용 단백질을 발현하는 콩 식물체 및 기능성 콩의 생산에 SYCMV 유래의 재조합 벡터가 사용될 수 있는지 검증이 필요하다.

한편, 한국등록특허 제1122955호에는 '콩 모자이크 바이러스의 감염성 클론을 이용한 식물체 내에서의 외래 유전자 과발현 방법'이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제0982593호에는 '오이 모자이크 바이러스의 감염성 클론을 이용한 식물체내에서의 외래 유전자 과발현 방법'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 콩에서 외래 단백질 발현을 위한 SYCMV 유래의 재조합 발현 벡터에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 형질전환 효율이 매우 낮아 유용 단백질 발현을 위한 돌연변이체의 생산이 어려운 콩의 형질전환을 위해, 콩에서 분리된 SYCMV (soybean yellow common mosaic virus)를 이용하여 재조합 발현 벡터를 구축하였고, 상기 재조합 발현 벡터에 FMDV (foot-and-mouth disease virus) 01Campos strain의 항원 결정기를 삽입하여 형질전환시킨 식물체에서 FMDV 01Campos strain의 항원 결정기가 발현되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 프로모터 및 전장 (full length) SYCMV (soybean yellow commom mosaic virus) 핵산 서열을 포함하고, 상기 전장 SYCMV 서열 중 외피 단백질 코딩 유전자 내에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 SYCMV 유래의 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터 내의 외피 단백질 코딩 유전자의 3'-말단에 FMDV (foot-and-mouth disease virus) 01Campos strain의 항원 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 FMDV 단편이 삽입된 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입하고, 외래 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입 또는 형질전환하는 단계를 포함하는 SYCMV 감염성 클론을 이용한 식물체 내에서의 외래 유전자 과발현 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입하고, 외래 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입 또는 형질전환하는 단계를 포함하는 SYCMV 감염성 클론을 이용한 외래 유전자가 과발현된 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 과발현된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 SYCMV 유전자를 제공한다.

본 발명에 따르면, SYCMV를 이용한 재조합 발현 벡터를 콩(soybean)의 형질전환에 이용하여 유용 유전자들을 이용한 콩의 새로운 품종 육성을 기대할 수 있으며 특허를 통한 원천기술 확보에도 유용할 것으로 기대된다. 또한, 유용한 외래 유전자를 콩에서 발현시킴으로써 현재 세계적으로 활용되는 콩의 기능적 유용성에서 나아가 경제적으로 가치 있는 유용 단백질을 발현하는 콩 식물체 및 기능성 콩을 생산하는데 이바지할 것으로 여겨진다.

도 1은 콩에서 분리한 새로운 바이러스인 SYCMV (soybean yellow common mosaic virus)의 모식도를 나타낸다.
도 2는 SYCMV를 이용하여 제작한 감염성 클론의 모식도를 나타낸다.
도 3은 SYCMV 표준 균주 (SYCMV type strain) 및 SYCMV 감염성 클론을 콩에 접종하여 병원성을 조사한 결과를 나타낸다.
도 4는 RT-PCR을 이용하여 SYCMV를 접종한 콩 잎에서 SYCMV를 검출한 결과를 나타낸다. 레인 1: 버퍼 접종, 레인 2: SYCMV 즙액 (sap) 접종, 레인 3: SYCMV 감염성 클론 (pSYCMVT7-full) 접종.
도 5는 SYCMV 재조합 발현 벡터의 MCS (multiple cloning site)를 나타낸다.
도 6은 돌콩에서 SYCMV 외래 단백질 발현 벡터를 이용한 FMDV (foot-and-mouth disease virus) O1Campos strain의 항원 결정기 단백질 발현을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로모터 및 전장 (full length) SYCMV (soybean yellow commom mosaic virus) 핵산 서열을 포함하고, 상기 전장 SYCMV 서열 중 외피 단백질 코딩 유전자 내에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 SYCMV 유래의 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 시험관 내 전사 또는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 T7 프로모터, SP6 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 T7 프로모터, SP6 프로모터 또는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 단편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.

본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 발현 벡터에서, 전장 SYCMV 핵산 서열은 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 발현 벡터에서, 상기 제한효소 부위는 외래 유전자를 인-프레임(in-frame)으로 삽입할 수 있는 부위로서, 외피 단백질 (coat protein) 코딩 유전자 내에 위치할 수 있으며, 바람직하게는 외피 단백질 코딩 유전자의 3'-말단에 위치할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 외피 단백질 코딩 유전자의 3'-말단에 위치한 MCS (multiple cloning site)의 BsrGI, MluI, SpeI 또는 SalI 사이트, 또는 외피 단백질 코딩 유전자의 3'-말단에 위치한 SacII 사이트 및 3' UTR에 위치하는 BsrGI 사이트일 수 있으며, 가장 바람직하게는 외피 단백질 코딩 유전자의 3'-말단에 위치한 MCS (multiple cloning site)의 BsrGI, MluI, SpeI 또는 SalI 사이트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 콩 황반 모자이크 바이러스 (soybean yellow mottle mosaic virus; SYMMV)와 같은 카르모바이러스 (carmovirus)에 속하는 순무 주름 바이러스 (Turnip crinkle virus; TCV)에서 강력한 RNA 침묵의 억제자로 P38 단백질인 외피 단백질이 알려져 있다. 따라서 RNA 침묵 억제자의 기능을 막기 위해, 외래 유전자를 외피 단백질 코딩 유전자 내에 삽입하는 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 발현 벡터 내의 외피 단백질 코딩 유전자의 3'-말단에 FMDV (foot-and-mouth disease virus) 01Campos strain의 항원 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 FMDV 단편이 삽입된 재조합 발현 벡터를 제공할 수 있으며, 재조합 발현 벡터 내의 외피 단백질 코딩 유전자의 3'-말단에 삽입 가능한 유전자는 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 발현 벡터 내에 삽입 가능한 유전자는 식물체 내에서 발현되기를 원하는 유용 유전자로서, 이에는 제초제 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 또는 과실의 품질에 영향을 주는 유전자, 스크리닝 가능한 표식 유전자, 환경 또는 스트레스 저항성 유전자 등이 포함될 수 있다. 더욱 상세하게는 제초제 글리포세이트 (Glyphosate)의 저항성 유전자인 5-EPSP 신타아제 (5-Enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase), 제초제 비알라포스(바스타) (bialaphos(Basta))의 저항성 유전자인 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (phosphinothricin acetyltransferase), 바이러스 저항성 단백질인 외피 단백질 (coat protein)을 코딩하는 유전자, 해충 저항성 유전자인 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis)로부터 분리한 Bt 독소 (Bt toxin) 생성 유전자, 과실 완숙 방지를 위한 ACC 디아미나아제 (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase) 유전자, 바이러스 저항성 식물을 용이하게 선발할 수 있는 식물체 세포의 괴사유발 유전자인 INF1 (Phytophthora infestans elicitin gene) 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 발현 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계; 및

외래 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 SYCMV 감염성 클론을 이용한 식물체 내에서의 외래 유전자 과발현 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 SYCMV 감염성 클론을 이용한 식물체 내에서의 외래 유전자 과발현 방법은 외래 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 아그로박테리움 침윤 (agro-infiltration) 방법 또는 매개 생물 등의 매개 없이 병든 잎의 즙액이나 바이러스액을 직접 피접종 식물조직에 인공적으로 접종하는 식물 바이러스 접종법인 럽-접종 (rub-inoculation) 방법이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 '아그로박테리움 침윤 (Agro-infiltration)'이라는 용어는 식물체 내로 유전자를 도입하여 발현시키거나 식물체 내에서 원하는 단백질을 생산하기 위한 방법을 의미한다. 이동시키고자 하는 유전자를 가진 아그로박테리움의 현탁액을 바늘이 없는 주사기를 사용해서 압력을 줌으로써 식물의 잎에 주입하여 식물체 세포로 원하는 유전자를 이동시키는 방법이다. 이는 전통적인 식물 형질전환과 비교하면 신속하고 편리하다는 장점이 있다.

본 발명에서 사용되는 '럽-접종(rub-inoculation)'이라는 용어는 식물체 내로 유전자를 도입하는 방법 중의 하나로 즙액 (sap) 접종, 도말 접종 또는 기계적 접종 (mechanical inoculation)이라고도 부른다. 이 방법은 일반적으로 카보런덤 (carborundum)과 같은 마찰제로 식물체에 상처를 낸 후, 도입하고자 하는 유전자를 가진 접종액 (벡터)을 상처 낸 식물체에 접촉시켜 식물체 내로 유전자를 도입하는 방법이다. 그밖에 바늘을 다발로 만들어 병든 잎을 접종엽면과 겹쳐서 찌르는 자침(刺針) 접종, 병든 잎을 겹쳐서 예리한 칼날로 절단한 후에 마찰제를 미리 처리한 접종엽면에 절단면을 직접 칠하는 신속법, 즙액을 가압분무하는 방법 등이 있다. 자침법이나 신속법은 즙액 접종이 곤란한 활성화하기 어려운 바이러스 접종에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 발현 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계; 및

외래 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물체 내에서 외래 유전자 과발현 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자가 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 아그로박테리움 튜머파시엔스의 Ti 플라스미드와 함께 존재 시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101, pBIN19, pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin) 또는 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 아그로박테리움 매개 형질전환법 또는 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움 매개 형질전환법 또는 유전자 밤바드먼트를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 외래 유전자는 전장 SYCMV 서열 중 외피 단백질 코딩 유전자 내에 삽입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, SYCMV에 의해 감염되는 식물체는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 콩 (대두)이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 발현 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계; 및

외래 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 SYCMV 감염성 클론을 이용한 외래 유전자가 과발현된 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 SYCMV 감염성 클론을 이용한 외래 유전자가 과발현된 식물체의 제조 방법은 아그로박테리움 침윤 (agro-infiltration) 방법 또는 럽-접종 (rub-inoculation) 방법이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 발현 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계; 및

외래 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자가 과발현된 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 외래 유전자가 과발현된 식물체의 제조 방법에서, 각 단계는 외래 유전자의 과발현 방법에서 기재한 바와 같다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 과발현된 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 상기 SYCMV에 의해 감염된 식물체 또는 SYCMV 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 콩 (대두)이다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 SYCMV 유전자를 제공한다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 콩 ( soybean )에서 분리한 새로운 바이러스인 SYCMV

콩 (soybean)으로부터 SYCMV (Soybean yellow common mosaic virus)를 국내에서 처음으로 분리하여, 바이러스의 전체 염기서열을 분석하였다. SYCMV는 한가닥의 RNA 게놈을 가지고 있으며 총 4,152bp의 염기로 이루어져 있다. 전체 ORF는 4개로 구성되어 있으며, 5'-UTR과 3'-UTR은 각각 77bp와 122bp 이다. ORF1 (nt 78-566)은 18kDa의 단백질을 코딩하고 있으며, 소베모바이러스 (Sobemovirus)에 속하는 종들과 낮은 서열 유사성을 가지고 있다. 두 번째 ORF2a (nt 524-2248)는 63kDa의 단백질을 코딩하며, N-말단 부위에 두 개의 트랜스맴브레인 도메인 (transmembrane domain)을 가지고 있다. 이 단백질은 단백질 분해효소 (serine protease)와 바이러스의 게놈 연결 단백질 (viral genome-linked protein)을 포함하고 있는 다기능단백질 (polyprotein)이다. ORF2b(nt 1852-3417)는 RNA 중합효소 (RNA-dependent RNA polymerase)를 코딩하고 있으며, GDD 모티프 (motif)를 가지고 있다. 마지막 ORF3 (nt 3227-4030)는 CP(coat protein) 단백질을 코딩한다 (도 1).

실시예 2. SYCMV 를 이용한 감염성 클론의 제작

SYCMV의 재조합 발현 벡터로서의 가능성을 알아보기 위해 아래와 같이 감염성 클론 (infectious clone)을 제작하였다. 바이러스의 5' 말단 부위에 T7 프로모터를 결합시켰으며, 각각 두 부분으로 나누어서 클로닝 한 후에 최종적으로 pUC19 벡터에 결합하였다. SYCMV를 이용한 감염성 클론의 제작은 PCR을 이용하여 두 개의 겹쳐지는 (overlapping) 단편을 XbaⅠ 부위를 중심으로 제작하였다. 두 개의 단편은 각각 5'-단편과 3'-단편으로 구성되며, 각각 2.4kb와 1.9kb의 크기를 가진다. 5'-단편은 SYCMV-T7-SmaI-U (5'-AAAGTCGACAATACGACTCACTATAGGGAGACAAAATATAAGAACAAAGAGTCTG-3'; 서열번호 2) 프라이머와 SYCMV-C24 (5'-TCGACCATTTCAACGGGAGTAA-3'; 서열번호 3) 프라이머로 증폭하였으며, SmaI 부위와 T7 프로모터를 가지고 있다. 3'-단편은 SYCMV-N23 (5'-CAGTTTGTTGCTCTTTGTGTTA-3'; 서열번호 4) 프라이머와 SYCMV-End-PstI-L (5'-AAACTGCAGACATTTGGATTACGCTCCATTTC-3'; 서열번호 5) 프라이머로 증폭하였으며, PstI 부위를 가지고 있다 (도 2).

SYCMV의 감염성 클론은 PstI을 이용하여 한 가닥의 플라스미드로 만든 후에, T7-RNA 중합효소를 이용하여 RNA를 합성한 후 합성된 RNA를 접종원으로 사용하였다. 콩은 파종한 지 10일이 지난 후 2개의 본엽에 접종을 하였다. 도 3에서와 같이 (a)는 버퍼를 접종 (Mock)하였으며, (b)는 SYCMV 표준 균주 (SYCMV type strain)를 접종하였고, (c)는 SYCMV 감염성 클론 (pSYCMVT7-full)을 접종하였다. 접종 일주일 이후부터 서서히 병징이 나타나기 시작하였으며, 15일이 지난 후에는 명확한 병징을 확인할 수 있었는데, 버퍼를 접종한 콩에서는 병징이 전혀 보이지 않았으며, SYCMV 표준 균주와 SYCMV 감염성 클론을 접종한 콩에서는 명확한 병징을 확인할 수 있었다 (도 3). 또한 접종한 바이러스가 식물체 내에서 정상적으로 복제와 이동을 하는지 RT-PCR을 통해 확인한 결과, 바이러스를 접종하지 않은 윗잎에서도 바이러스가 검출되었다. 따라서 SYCMV 즙액 (sap)을 접종한 것과 SYCMV 감염성 클론을 접종한 식물 모두에서 바이러스가 정상적으로 작동한다는 것을 알 수 있었다 (도 4).

실시예 3. pSYCMV 를 이용한 외래 단백질 발현 벡터로서의 가능성 조사

pSYCMV를 이용하여 외래 단백질 발현 벡터로서의 가능성을 조사하기 위해 SYCMV의 5' 말단 부위에 35S 프로모터를 연결시켰으며, 3' 말단 부위에는 Rz-NOS를 결합시켜 바이너리 벡터인 pPZP211에 클로닝하였다 (도 6). 외래 유전자로 FMDV (foot-and-mouth disease virus) O1Campos strain의 항원 결정기 일부 서열을 삽입하고자 하였으며, 오버랩 PCR을 통해서 DNA 서열을 합성하였다. 항원 결정기 서열은 기존에 보고된 문헌에서 인용되었으며, FMDV O1C VP1의 아미노산 서열순서 135-160으로부터 최종 단백질 산물을 발현한다 (P. ZAMORANO et al., Virology, 212:614-621, 1995). CP 종결 코돈의 바로 앞에 외래 유전자를 삽입하기 위해서 CP에 위치하는 Sac II 사이트부터 3' UTR에 위치하는 BsrGⅠ 사이트까지의 DNA 서열도 외래 유전자 앞과 뒤에 추가로 합성하였으며, 클로닝 과정에서 기존의 Sac II 사이트부터 BsrGⅠ 사이트까지의 서열을 제거한 후 합성한 서열을 삽입하였다 (도 5). SYCMV 외래 유전자 단백질 발현 벡터인 pSYCMV-FMDV 클론을 아그로박테리움 (Agrobacterium)에 형질전환을 하였으며 아세토시린곤 (Acetocyringon)을 이용하여 바이너리벡터 (binary vector) 내에 위치한 병원성 유전자 (vir gene)을 활성화시킨 후에 주사기를 사용하여 돌콩의 잎 뒷면에 접종하였다. 접종할 때는 대조구로 버퍼 (buffer) 및 pSYCMV-full을 접종하였다. 접종 후 약 2주가 지나면서 pSYCMV-FMDV와 pSYCMV-full을 접종한 식물에서 바이러스 병징이 조금씩 나타나기 시작하였다.

pSYCMV-FMDV를 접종한 식물에서 외래 단백질 발현 여부를 확인하기 위해서 웨스턴 블럿을 수행하였다. 그 결과 대조구에서는 단백질 발현을 확인할 수 없었으며, pSYCMV-FMDV를 접종한 식물에서 원하는 크기의 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6). 돌콩의 초생엽에 pSYCMV-FMDV를 접종한 후 상엽인 trifoliate leaves를 각각 웨스턴 블럿으로 확인해 본 결과, 네 번째 trifoliate leaves에서 예상 크기의 단백질이 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 바이러스가 기주를 감염하고 복제를 통해서 증식하는 과정과 단백질을 발현하는 과정에 있어서 충분한 시간이 요구되기 때문이다. 따라서, 약 접종 2주 후에 생성되는 네 번째 trifoliate leaves 정도에서 충분히 복제된 바이러스의 RNA로부터 단백질의 원활한 발현이 야기되는 것으로 생각된다. 이러한 결과를 미루어 봤을 때, SYCMV가 외래 단백질 발현 벡터로서 이용될 수 있다는 것을 보여준다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Recombinant expression vector from SYCMV useful for foreign protein expression in soybean and uses thereof <130> PN13125 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4152 <212> DNA <213> Soybean yellow common mosaic virus <400> 1 acaaaatata agaacaaaga gtctggatct ttgtaccttt gtgccaccta agctggtatt 60 ggtttatcac acaacgtatg accgacacag tcgtcgtgaa cttttcactg atccgaaccc 120 ggtgcgtgga acgctttggc gtgaattccc tcccagttgg aagacatttc attggttctg 180 aggaaattcc taccggcatc gatttcgttg agcggtcttt tcaggttacg gcctttggga 240 attattcggt tcctgagaga agcagagtta gattgataga ctgcccggtg tcgtgcgagg 300 ggacttttaa gttcgaccct gtacccctgt ggctatccat caactgccga gtttgtcaaa 360 ctgaggctaa ccttatcatc aaccaggagt tggtgcctgg gtatagtgaa aacagcaagt 420 tcgtgttttg tgacaccgaa gggagacctt tgcgaatcag aacacgaaga ggcattcagc 480 ctagccgatt ttaccaccag gaagaaaaga ccatttgtca gtcatgcgtc atccagggct 540 gtttgcgtac acgctcttgg tcgtgaacat ggcaagcttt gctatactcc tagattcgtt 600 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ttttcctact cagcgaagtt gagggtctag agaacattac tcccgttgaa 2340 atggtcgagc ttggtctctg tgatcctgtc agactttttg tgaagcaaga accacacgcc 2400 tcccgcaagg ttaaagaggg caggttcagg ctcatttcgt ctgtctcact ggttgatcaa 2460 cttgttgagc gcatgctttt cgggaagcag aatcagttag agatagctga gtgggagaat 2520 ataccgtcga aacctggaat gggcctttct ttagagaggc aggccaggtc gctgtttgat 2580 gacttgagga tcaagcattc tcgttgtcca gctgccgagg ccgacatatc gggttttgac 2640 tggtctgtgc aagactggga gttatgggct gatgttgaga tgagaatagt tctgggcggc 2700 tttggagaca agttgtctcg agctgccagg aacaggttct cgtgcttcat gaactcagtc 2760 ttccagttgt ctgatggcac actgatcgag caacagcagc ctggaataat gaagtccggg 2820 tcttactgca cctcatccac caactccaga attcgatgcc ttatggctga gctaattggc 2880 tccccctggt gcattgccat gggtgacgat tcagttgagg ggtgggtcga gagtgctaag 2940 gacaagtaca aggaattggg gcatgtgtgc aaggactaca agccttgcca aaccgacatt 3000 gaaggctctc tctacgaagt tgaattctgt tctcacgtag tgaggcaaag ccgctgttgg 3060 ttgaactcat ggcctaagac cctgttcaag tacttgtctg agggtaagtg gttttatgaa 3120 gatctggagc gagagctctg gtcgtctccc cactggcccc ggatccggca gtatgtagtg 3180 gacaatactc catcggtcca caaaaccata aaaccaagtc ctagttatgg cgaagaggct 3240 aaccaaacag cagctagcca aggccatagc gaacactttg gaaccacctt caggagctca 3300 accccggaag aggaggaacc gaagcaggcg tcgttctgct gcgatgcagc ctcggcctat 3360 ccaggctggg gtatccatgg cccctattgc tcaggggact atggtgcgtc ttcgtgagcc 3420 gtcaatgcgg acgactggag gcatcacgac tcttactcac tctgagcttt cgacagagct 3480 ctcagttacg agcacgatcg ttgttgcctc cgagctagtg atgccctact cagtgggcac 3540 ttggctgaga ggagtggctt ccaactggtc taagtacgct tggatctcag tgaggtatac 3600 ttacctcccc gcctgtcctt ccgacacggc gggcaccatt catatgggtt ttcaatatga 3660 tatggcagat actgtgcccg tatccgttaa ccagctttcc aatctgcgtg gctacgtgtc 3720 cgggcaggtc tggtcgggtt cgtccggctt gtgtttcatc aatggaacca agtgtctgga 3780 cacttcttcc gctatctcca ctactttgga tgtgagtaag cttggtaaga agtggtaccc 3840 gtacaagact agcactgact acacgaccgc agtaggtgtg gatgctaaca tcgcgactcc 3900 tctggtacca gcaaggctag taatagctat gctggatgga acgagtacca ccgcggtaaa 3960 tgctggacgc ctttacgtta cgtacaccat tcagttggtc gagcctatcg cctcagcctt 4020 gaacaactga gaagttgtaa aacatcctcc tcatccttcg gaaagatgag tgagtaattc 4080 acaacccgcg aggttttgga aggtaatctc gttaaaacct ttcacgctag aaatggagcg 4140 taatccaaat gt 4152 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 aaagtcgaca atacgactca ctatagggag acaaaatata agaacaaaga gtctg 55 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 tcgaccattt caacgggagt aa 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cagtttgttg ctctttgtgt ta 22 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 aaactgcaga catttggatt acgctccatt tc 32

Claims (15)

1. 프로모터 및 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 전장 (full length) SYCMV (soybean yellow commom mosaic virus) 핵산 서열을 포함하고, 상기 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 전장 SYCMV 서열 중 3227번째부터 4030번째 염기서열에 해당하는 외피 단백질 코딩 유전자의 4027번과 4028번 사이에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 SYCMV 유래의 재조합 발현 벡터.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항의 재조합 발현 벡터 내의 외피 단백질 코딩 유전자의 4027번과 4028번 사이에 FMDV (foot-and-mouth disease virus) 01Campos strain의 항원 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 FMDV 단편이 삽입된 재조합 발현 벡터.
5. 제1항의 재조합 발현 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계; 및
   외래 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 SYCMV 감염성 클론을 이용한 식물체 내에서의 외래 유전자 과발현 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 방법은 아그로박테리움 침윤 (agro-infiltration) 방법 또는 럽-접종 (rub-inoculation) 방법인 것을 특징으로 하는 SYCMV 감염성 클론을 이용한 식물체 내에서의 외래 유전자 과발현 방법.
7. 제1항의 재조합 발현 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계; 및
   외래 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물체 내에서 외래 유전자 과발현 방법.
8. 삭제
9. 제5항 또는 제7항에 있어서, 상기 식물체는 콩인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항의 재조합 발현 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계; 및
    외래 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 SYCMV 감염성 클론을 이용한 외래 유전자가 과발현된 식물체의 제조 방법.
11. 제1항의 재조합 발현 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계; 및
    외래 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자가 과발현된 식물체의 제조 방법.
12. 제10항 또는 제11항의 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 과발현된 식물체.
13. 제12항에 있어서, 상기 식물체는 콩인 것을 특징으로 하는 식물체.
14. 제12항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
15. 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 SYCMV 유전자.

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